Summary
미토 콘 드리 아 식물 세포의 단지 작은 백분율은, 그들은 연구의 범위에 대 한 정화 될 필요가 있다. 미토 콘 드리 아 균질, 매우 순화 된 미토 콘 드리 아 분수를 차동 및 밀도 그라데이션 원심 분리 뒤 다양 한 식물 기관에서에서 격리할 수 있습니다.
Abstract
미토 콘 드리 아에는 필수적인 세포 식물, 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 (NADH), 플 라빈 아데닌 등 감소 화합물의 산화에서 아데노신 3 인산 염 (ATP)의 가장 주목할 만한 생산에서에서 수많은 대사 경로에 관여 디뉴클레오티드 (FADH2)입니다. 애기 thaliana 게놈의 완전 한 주석으로 가장 널리 사용 되는 식물 모델 시스템, 따라서 필요 기관 (잎, 뿌리, 또는 꽃)의 다양 한에서 미토 콘 드리 아를 정화 도구를 활용 하는 데 필요한 그것을 설립 했다 그 지금 애기 미토 콘 드 리아 생물학을 공부 하기 위해 사용할 수 있습니다. 다음 일련의 차등 원심 분리 단계 연속 콜 로이드 밀도 그라디언트를 사용 하 여를 정화 하 고 더는 원유 미토 콘 드리 아 펠 릿 생산 방식의 다양 한을 사용 하 여 조직의 균질 하 여 미토 콘 드리 아 격리 원심 분리입니다. 콜 로이드 밀도 자료 이후 여러 원심 분리 단계에서 제거 됩니다. 100g의 신선한 잎 조직에서 시작, 미토 콘 드리 아의 2-3 mg 얻어질 수 있다 정기적으로. 이 미토 콘 드리이 아 호흡 실험 다양 한 기판 및 억제제를 사용 하 여 결정 수를 100-250 nmol O2 분-1 mg 총 미토 콘 드리 아 단백질-1 (NADH 의존 율)의 전형적인 속도 표시 기판에 산화 되는 대안 및 시 토 크롬 터미널 oxidases의 용량. 이 프로토콜 연속 콜 로이드 밀도 기울기 및 정화 식물 미토 콘 드리 아의 효율적인 호흡 측정을 사용 하 여 애기 thaliana 잎에서 미토 콘 드리 아의 격리 방법을 설명 합니다.
Introduction
식물 미토 콘 드리 아 연구의 역사는 100 년1다시 갑니다. 그대로 미토 콘 드리 아 처음 1950 년대 초에 고립 되었다 차등 원심 분리를 사용 하 여. 1980 년대에 콜 로이드 밀도 기울기의 출현 삼투성 조정 고통 없이 정화를 미토 콘 드리 아 수 있습니다. 그라데이션 순화 된 미토 콘 드리 아 질량 분석의 감도 때문에, 대부분의 목적을 위해 적당 한 동안 심지어 상대적으로 경미한 오염 물질 검출 될 수 있다 하 고 부적절 하 게 미토 콘 드리 아 위치2를 할당 될 수 있습니다. 둘 다 plastidic 제거 무료 흐름 전기 이동 법의 사용과 peroxisome 오염3, 하지만 무료 흐름 전기 이동 법은 고도로 전문화 된 기술 및 연구의 대부분에 대 한 필요 하지 않습니다. 또한, 그 듀얼 또는 단백질의 여러 대상으로 기억 필요 단백질의 위치를 확인할 때 셀에 발생 합니다. 100 개 이상의 듀얼 타겟된 단백질 엽록체/plastids 그리고 미토 콘 드리 아4, 미토 콘 드리 아를 표적으로 하는 단백질의 숫자에 대 한 설명 그리고 peroxisomes5알려져도 있습니다. 또한, 특정 자극, 예를 들면 산화 긴장에서 단백질의 재 위치 세포 생물학6신흥 테마입니다. 따라서, 단백질의 위치, 공부 하는 생물학의 문맥에서 고려 될 필요가 고 다양 한 접근법을 결정 하 고 위치2확인 사용 됩니다.
미토 콘 드리 아는 일반적으로 균질 하 여 식물 조직에서 분리, 균형 열 출시 미토 콘 드리 아, 세포 벽을 깨는 사이 미토 콘 드리 아를 손상 되지 필요 합니다. 전통적으로, 감자와 콜리플라워, 균질 액체 추출 버퍼 활동을 유지 하기 위해 다양 한 구성 요소를 만들기 위해 가정용 믹서 기/과즙 짜는 기구를 사용 됩니다. 완두콩 잎에서 미토 콘 드리 아의 격리 (젊은 묘 (~ 10 일)를 사용 하 여 미토 콘 드리 아 격리에 대 한 인기 있는 소재 잎 소재는 부드러운 세포를 lyse를 믹서 기를 이용 한다. 애기 thaliana T-DNA insertional 노크 아웃 라인의 가용성, 미토 콘 드리 아 기능 연구를 수행을 정화 수 필요 잎, 뿌리 또는 꽃에서 미토 콘 드리 아를 분리 하는 방법의 개발을 필요한가 조직입니다. 전반적으로 다른 식물에 대 한 개발 방법을 잘7, 최적화 하는 데 필요한 재료의 연 삭 임시 수입으로 일했다. 애기가 다양 한 방법 (아래 참조)에 달성 될 수 있다 및 조직 유형 (촬영 대 루트) 사이 다릅니다. 연속 그라디언트를 사용 하 여 또한 다른 장기에서 미토 콘 드리 아의 밀도로 최적화 될 수 있습니다 또는 발달 단계 의미 그들은 다르게 마이그레이션할 수 있습니다. 따라서, 최대 분리에 대 한 그라데이션 밀도 최고의 분리를 달성 하기 위해 정제 된 수 있습니다.
일단 정화는 미토 콘 드리 아 연구, 단백질 및 tRNA 통풍 관 실험, 효소 활동 분석 실험, 호흡 수 측정 서쪽 오 점 분석 등의 다양 한 사용할 수 있습니다. 고립 된 미토 콘 드리 아 단백질 풍부의 질량 분석 분석에 사용할 수 있습니다. 타겟 단백질, 정의 하지만 중요 한 분석 결과 개발 필요 여러 반응 감시 (MRM) 분석의 정량화에 대 한 수 있습니다. 반면, 디 메 틸 또는 다른 동위 원소 라벨8, 부 량 차이 식별 하는 전체 프로테옴 소설을 생물 학적 통찰력을 발견 하는 데 사용할 수 있습니다 걸쳐 발견 접근법을 제공 합니다.
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Protocol
이 프로토콜은 애기 thaliana 장기 지속적인 콜 로이드 밀도 그라디언트를 사용 하 여 토양에 성장에서 그대로 미토 콘 드리 아의 절연에 사용 됩니다. 자료의 수집에 따라 모든 절차는 4 ° c.에 실시
1. 매체, 워시 버퍼, 그리고 그라데이션 솔루션을 연 삭의 준비
- 300 mL (마이너스 하는데와 시스테인) 중간과 표 1 당 2 x 워시 버퍼의 200 mL는 격리 이전 1 일 연 삭의 준비, 4 ° c.에서 그들을 차가운 유지
참고: 추가 나트륨 하는데 및 L-시스테인 (무료 자료) 17.84 m m와 20.36 m m의 최종 농도를 각각, 고립의 아침에 연 삭 매체. 미토 콘 드리 아 사용 하는 경우 서쪽 오 점 또는 블루 아메리카 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (BN-페이지) 분석, BSA 없이 워시 버퍼 x 2. - (그림 1 및 표 1) 미토 콘 드 리아 격리의 아침에 그라디언트를 준비 합니다.
- 두 비 커; 무 겁 고 가벼운 그라데이션 솔루션 만들기 각 35 mL 두 그라데이션 튜브에 대 한 충분 하다.
- 그라데이션 pourer 이온된 수와 PVC 연동 튜브의 챔버를 세척 하 고 모든 배관에서 배관 통해도 흐름을 보장.
- 장소 2 원심 분리기 튜브 (50 mL) PVC 연동 튜빙 콘센트와 얼음에 약간의 각도에서 튜브의 측면 아래로 그라데이션 솔루션 실행 되도록 튜브의 내부에 녹화.
- 내부 및 외부 챔버 (검은 레버 아래로) 사이의 연결을 닫습니다. 내부 챔버에 작은 파문 바 자력에 그라데이션 pourer를 놓습니다.
- 내부 챔버 (튜빙 콘센트와 챔버)에 35 mL 무거운 그라데이션 솔루션을 부 어. 절반 (300 mL/h)를 빨리 준비가 연동 펌프 속도와 남아 때까지 얼음에 배치 하는 두 개의 원심 분리기 튜브에 무거운 그라데이션 솔루션을 분배.
- 외부 챔버 (튜빙 콘센트 없이 챔버)에 35 mL 빛 그라데이션 솔루션을 부 어. 챔버 (중간을 밀어 검은 레버) 사이의 연결을 열고 부드럽게 혼합 솔루션을 허용 합니다. 자력 교 반기를 사용 하 여 솔루션을 믹스.
- 느리게 실행 솔루션을 허용 (60 mL/h)까지 모든 그라데이션 믹스 2 인 실에서 적절는 0-4.4% (w/v) polyvinylpyrrolidone (PVP) 그라데이션 채워진 튜브. 단계 2.12에서 사용 하 여 준비까지 얼음에 그라디언트를 유지.
참고: 그라디언트, 준비 되 면 희석 세척 매체 prechilled-이온된 수와 4 ° c.에 계속 감기 1 x x 2
2. 균질 및 미토 콘 드리 아 절연
- 가 위로 토양에서 자란 4 주 된 애기 식물에서 전체 장미 티슈를 잘라, 적어도 80 식물 1 준비에 필요한 것입니다.
참고: 10-14 일 이전 물 문화, 최소 5 냄비/준비, 또는 2 주 오래 된 묘 목 4 판의 최소 重 & Skoog 기저 소금 혼합물 (MS) 한 천 배지에서 자란도 사용할 수 있습니다. - 사전 냉각된 4 ° C 대형 박격포와 유 봉 75 mL 분쇄 매체 (표 1)의에 작은 조각으로 절단 된 공장 설비 재료의 절반을 배치 하 고 조직의 더 큰 조각 남아 때까지 몇 분 동안 광범위 하 게 갈기.
- 미리 분쇄 매체와 여과 재료 (22-25 µ m 기 공 크기)의 4 층을 습식 및 500 mL 원뿔 플라스 크에 여과 소재의 플라스틱 퍼 널을 통해 4 층을 통해 homogenate를 필터링.
- 분쇄 매체의 또 다른 75 mL와 조직의 절반 남은 갈기.
- Homogenates 여과 재료에서를 결합 하 고 필터링을 통해 가능한 homogenate 만큼.
- 매체, 500 mL 원뿔 플라스 크에 다시 필터를 연 삭의 나머지 150 mL와 함께 다시 여과 재료에 남아 있는 나머지 조직 갈기.
- 5 분 동안 고정된 각도 터에 4 ° C에서 2500 x g에 8 미리 냉장된 50ml 플라스틱 원심 분리기 튜브에 필터링 된 homogenate 원심
- 깨끗 한 원심 분리기 튜브는 상쾌한 붓고 (50ml; 녹색 펠 렛을 방해 하지 않도록) 및 고정된 각도 터에서 20 분에 17500 x g 4 ° C에서 원심 분리기.
- 삭제 모든 하지만 < 열망 하 여 상쾌한의 3 mL (또는 부드럽게 부 어는 펠 렛을 방해 하지 않고). 부드럽게 작은 좋은 붓을 사용 하 여 잔여 상쾌한에 펠 릿을 resuspend.
- 각 튜브를 워시 버퍼 x 1의 10 mL를 추가 하 고 4 튜브 1 깨끗 한 원심 분리기 튜브에 결합 하 여 (즉, 2 관 인 함).
- 이러한 튜브 50 mL에 1 x 워시 버퍼를 반복 단계 2.7-2.9.
- 수영장 1 원유 미토 콘 드리 아 펠 릿 dropper를 사용 하 여 튜브와 좋은 붓으로 균등 하 게 분산 (작은 양의 워시 버퍼를 사용할 수 있습니다 그러나 마지막 볼륨 있어야 그라데이션 위에 맞게 3 mL 미만). 부드럽게 2 연속 0-4.4% (w/v) PVP 그라디언트에 스포이드와 함께 미토 콘 드리 아 서 스 펜 션 레이어.
- 무게 (워시 버퍼 x 1를 사용 하 여) 튜브를 균형 하 고 40 분 휴식 꺼져 확인 4 ° C에서 40000 x g에서 원심. 미토 콘 드리 아, 튜브의 아래쪽 밴드에 마이그레이션됩니다 또는 (흐림, 노란 밴드;으로 식별 하는 튜브의 하단에 무거운 솔루션에 있을 수 있습니다. 그림 2)입니다.
- 조심 스럽게 포부에 의해 미토 콘 드 리아 밴드 위에 솔루션의 상위 5 cm를 제거.
- 나머지 솔루션 2 깨끗 한 튜브에는 미토 콘 드리 아를 포함 하 고 워시 버퍼 x 1을 채우십시오. 플라스틱 파라핀 영화와 튜브의 입 및 여러 번 반전 하 여 콜 로이드 밀도 그라데이션 및 미토 콘 드리 아 균등 하 게 배포 합니다. 천천히 브레이크와 4 ° C에서 31000 x g 에서 15 분 동안 원심 분리기.
참고: 원심, 전에 미토 콘 드리 아 및 나머지 콜 로이드 밀도 그라데이션 고르게 배포 됩니다 있는지 확인 합니다. 그렇지 않으면, 콜 로이드 밀도 그라데이션 튜브의 하단에 집중 하 고는 미토 콘 드리 아의 산을 방지 수 있습니다. - 포부, 채우기 1 x 세척과 튜브 버퍼링 하는 최대 50 mL와 혼합 되도록 다시 반전 하 여는 상쾌한을 제거 합니다. 천천히 브레이크와 4 ° C에서 31000 x g에서 15 분 동안 원심 분리기.
- 상쾌한 발음 하 고 가능한 수정 200 µ L 팁 (오픈 증가를 그것의 끝 위에 끝을 조금 잘라)는 피 펫을 사용 하 여 볼륨 (~ 500 µ L)는 미토 콘 드리 아 펠 릿에 작은 수집. 1.5 mL 튜브에는 미토 콘 드리 아를 놓고 즉시 사용 하거나-80 ° c.에 게 얼음에 계속
참고: 미토 콘 드리 아 나트륨 라우릴 황산 polyacrylamide 젤 전기 영동 (SDS-PAGE) 사용 될 것입니다, BN-페이지, 또는 immunoblot 분석을 사용 하 여 BSA 없이 워시 버퍼 x 1 최종 세척 (즉, 단계 2.15, 2.16)에 대 한. - 브래드 퍼 드 메서드를 사용 하 여 미토 콘 드리 아의 단백질 농도 결정 합니다.
참고: BN 페이지 원심 분리기 aliquots 4 ° C, 및 사용까지-80 ° C에 게 펠 릿에 대 한. 산소 소비량 측정을 위해 유일한 갓 고립 된 미토 콘 드리 아를 사용할 수 있습니다.
3. 산소 소비 측정
참고: 산소 소비는 갓 식물 미토 콘 드리 아 클락 형 산소 전극, 미토 콘 드리 아 intactness, 시 토 크롬 c 통로 활동, 및 대체 경로 활동 활성화와 함께 분석할 수 있습니다 고립.
- 소프트웨어 설치
- 라이센스 산소 모니터링 산소 소비 측정을 위해 사용 하는 컴퓨터에 소프트웨어를 설치 합니다.
- 호흡 매체, 기판, 화학 소재 솔루션, 그리고 클락 형 산소 전극의 준비
- 호흡 매체 (300 m m 자당, 10 mM NaCl, 5mm KH2포4, 2 mM MgSO4, 0.1% (w/v) 소 혈 청 알 부 민 (BSA), 10mm TES (pH 7.2)) 산소 소비 분석 실험에 대 한 사용을 준비 합니다.
- 기질, 억제제, 그리고 미토 콘 드리 아 호흡 (표 2)를 측정 하는 데 사용 하는 이펙터를 준비 합니다. 이러한 이전 준비 하 고 수-20 ° c.에 저장
참고: 중화 pH 7.0에 유기 산 같은 산 성 솔루션의 pH NaOH를 사용 하 여 사용 하기 전에. - 호흡 매체 분석 결과 챔버 (25 ° C)으로 동일한 온도를 따뜻하게.
- 클락-타입 산소 전극 제조 업체의 프로토콜에 설명 된 대로 조립 한다.
- 1 공기 포화 물 (공기 포화 물 적극적으로 큰 원뿔 플라스 크에 작은 양의 이온된 수를 흔드는 여 취득) 측정 챔버에 배치 합니다. 활동가에 전환 "교 반기 속도" 버튼을 클릭 합니다. "On" 버튼을 클릭 하 고 65 rpm 교 반기 속도 설정 합니다. 계속 하려면 "확인"을 클릭 합니다. 25 ° c.에 물을 지속적으로 저 어
- 산소 전극의 보정
- 따뜻한 물 분석 결과 챔버 (25 ° C)으로 동일한 온도 보정에 사용 됩니다.
- 안정화 하 고 보정 산소 전극 전류를 기다립니다.
- 산소 전극의 보정을 시작 하려면 "보정" 버튼을 클릭, 선택 "액체 단계 보정," 그리고 "공기 포화 물."
- 새 창 (산소 교정 (액체 단계)-5 중 1 단계)을 열 것 이다. (전극 제어 상자에 연결 되어 채널)을 보정 및 변수 (25 ° C에 "챔버 온도"와 "대기압" 101.32 kPa 설정) 입력 채널을 선택 합니다. 클릭 "OK"를 계속 합니다.
- 다음 단계 (2 단계 5) 설치 교 반기 속도 (65 rpm) 하 고 계속 하려면 "확인"을 클릭 합니다.
- 5 3 단계에서 고원에 도달 하는 신호를 기다립니다. 용어는 "고원 도달, 계속 하려면 확인을 눌러" 상자에 표시 됩니다. 계속 하려면 "확인"을 클릭 합니다.
- 5의 4 단계에서 5 mg 나트륨 dithionite 추가 하 여 챔버에 제로 산소를 설정 합니다. 계속 하려면 "확인"을 클릭 합니다.
참고: 산소 농도 감소 추적에 표시 되어야 하 고 0를 도달 한다. - 교정 (5/5 단계)의 마지막 단계에서 고원에 도달 하는 신호를 기다립니다. 용어는 "고원 도달, 계속 하려면 확인을 눌러" 상자에 표시 됩니다. 계속 하려면 "확인"을 클릭 합니다.
- 보정 하기 "교정 저장"을 클릭 합니다. 새 창이 열립니다. "확인" 산소 제어 상자에 대 한 새로운 보정을 저장 하려면 확인을 클릭 합니다.
참고: 성공적인 교정 후 라벨 "산소 (nmol/mL)"는 y 축에 표시 됩니다. - 교정, 후 적절 한 청소를 보장 하기 위해 물으로 챔버 (5-10 배 이상)을 rinsing 하 여 측정 챔버를 청소. 호흡 측정으로 매체의 장소 1 mL 챔버 고 산소 소비 추적 선형 될 때까지 몇 분 동안 equilibrate를 막.
- 좋은 슬로프 뷰를 산소 소비 추적의 규모를 적응. "확대 XY"를 클릭 하 고 입력 변수 (0-"산소"를 설정 300 및 "시간 축" 0-45 분).
- 미토 콘 드 리아 무결성의 결정
- 플런저 오픈, 970 µ L 공기 포화 호흡 매체 반응 챔버를 추가할.
- 미토 콘 드리 아 절연 (총 단백질 나중 계산에 포함 될 필요가) 후 결정으로 30 µ L 고립 된 미토 콘 드리 아 또는 총 미토 콘 드리 아 단백질의 150 µ g을 추가 컷 팁을 피 펫을 사용 하 여 반응 챔버를.
- 지속적으로 사용 하 여 자력 (65 rpm) 바 25 ° C에서 공기 포화 솔루션 미토 콘 드리 아 현 탁 액을 저 어.
- 플런저와 챔버 인감, 산소 소비, 기록 "녹화 시작"을 클릭 하 고 산소 소비 추적 안정 (1-2 분)을 허용.
- 10mm 하는데와 "하기 전에 세제" 속도를 5 분 동안 25 µ M 시 토 크롬 c 를 추가한 후 수동으로 산소 소비 속도 결정 합니다.
참고: 기질, 억제제, 그리고 직접 추적에에서 이펙터의 추가를, "이벤트 마크 추가" 버튼을 클릭 하 고 해당 레이블 지정을 입력 합니다. 계속 하려면 "확인"을 클릭 합니다. - "세제" 후 속도 게 0.05% (v/v) 세제를 추가한 후 수동으로 3 분 동안 산소 소비 속도 결정 합니다. "녹음 중지"를 클릭
- "변경 테이블 요금" 버튼을 클릭 합니다. 2 커서 그래프 화면에서 세로 선으로 표시 됩니다. 클릭 하 고 끌어 속도 커서의 쌍 속도 간격을 정의 하는 추적에 필요한 위치. 왼쪽된 속도 커서를 사용 하 여 추적 따라 속도 간격을 이동 합니다. 바로 속도 커서를 사용 하 여 자체 속도 간격을 설정 합니다. 자동으로 소프트웨어를 모니터링 하는 산소 추적 따라 속도 간격 커서를 이동 하는 동안 두 개의 커서 사이 적합의 라인을 그립니다.
- 일단 원하는 속도 간격 및 위치, 정의 1 2 커서의 오른쪽 클릭으로 테이블에 속도 입력 하 고 "속도 테이블에 추가 합니다." 선택 주요 비용 테이블에는 속도 표시를 확인 하려면 "추가" 버튼을 클릭 합니다.
- 미토 콘 드 리아 무결성을 백분율로 표시 "세제" 후 속도 의해 속도 "세제" 전에 나누어 계산 하 고 100에서 빼기.
- 미토 콘 드리 아 호흡의 결정
- 플런저 오픈, 함께 반응 챔버를 공기 포화 호흡 매체의 970 µ L를 추가 합니다. 500 µ M ATP와 30 µ L 고립 된 미토 콘 드리 아 또는 반응 챔버에 호흡 매체 컷 팁는 피 펫을 사용 하 여 총 미토 콘 드리 아 단백질의 150 µ g을 추가 합니다.
- 25 ° c.에 바 (65 rpm) 자력을 사용 하 여 지속적으로 미토 콘 드리 아 현 탁 액을 저 어
- 플런저를 닫습니다, 그리고 산소 소비를 기록 하 고 (때 산소 소비 추적 선형) 안정 산소 소비 속도 대 한 1-2 분 기다립니다 "녹화 시작"을 클릭 합니다. 5mm 호박을 추가 합니다. 약 2 분에 대 한 산소 소비량의 속도 기록 합니다.
참고: 기질, 억제제, 그리고 직접 추적에에서 이펙터의 추가를, "이벤트 마크 추가" 버튼을 클릭 하 고 해당 레이블 지정을 입력 합니다. 계속 하려면 "확인"을 클릭 합니다. - 1mm 아데노신 diphosphate (ADP)를 추가 합니다. 계속 2 분에 대 한 산소 소비량의 속도 기록.
- 1mm NADH를 추가 합니다. 4-8 분에 대 한 산소 소비량의 속도 기록 합니다. 이 속도 시 토 크롬 산화 효소를 통해 호흡의 용량입니다.
- 1mm 칼륨 청산가 리 (KCN) 또는 2.5 µ M myxothiazol (5 µ M antimycin A) 시 토 크롬 c 통로 억제 하기 위해 추가 하 고 약 2 분 대체 산화 효소를 통해 산소 소비를 관찰 기록 하는 계속 해 서.
- 5 m m dithiothreitol (DTT)와 10 mM pyruvate 완전히 대체 산화 효소를 활성화를 추가 합니다. 5-7 분 대 기록에 계속: 대체 산화 효소의 용량입니다.
- 500 µ M n-틸 gallate (nPG), 추가 하 고 2 분에 대 한 기록. 이 화학적 저해 될 수 없는 잔여 산소 소비 속도 평가 합니다. 미토 콘 드리 아 기원에 될 것입니다 기록, 다른 가격에서이 속도를 뺍니다. 산소 소비 여전히 발생 하는 시 토 크롬 c 와 (KCN, nPG)에 의해 AOX 통로의 억제 후 매우 고립 된 미토 콘 드리 아9오염으로 현재 peroxidases에서 온 것입니다.
- "녹음 중지"를 클릭
- "요금 변경 테이블" 단추를 클릭 하 고 두 개의 커서 중 하나에 오른쪽 클릭으로 테이블에 속도 입력 하 고 "속도를 테이블 추가"를 선택. 주요 비용 테이블에는 속도 표시를 확인 하려면 "추가" 버튼을 클릭 합니다.
참고: 때 유기 용 매에 녹아 이펙터를 추가 (예., antimycin A, nPG, myxothiazol), 약 실 및 플런저 에탄올으로 씻어 해야 합니다 및 다음 적절 한 청소를 보장 하기 위해 물.
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Representative Results
이 프로토콜을 사용 하 여, SDS 페이지와 immunoblotting 다른 미토 콘 드리 아 단백질을 감지할 수 있었습니다. 그림 3A에서 같이, 물 문화 조직에서 분리 된 단백질은 희미 한 밴드 (2 µ g) 검출 충분 합니다. 신호 강도 로드 금액에 비례하여 증가 합니다. 절연 판 (그림 3B), 높은 가벼운 스트레스에 대 한 응답에 성장 하는 조직에서 미토 콘 드리 아에 대 한 대체 산화 효소 항 체와 immunodetection에 의해 다른 genotypes 치료를 분석할 수 있습니다.
미토 콘 드리 아 시 토 크롬 c 통로 활동, 대체 통로의 intactness 갓 고립 된 미토 콘 드리 아 샘플을 사용 하 여 측정할 수 있습니다. 미토 콘 드 리아은 잘 보존 된 설명된 격리 절차 (그림 4A)입니다. 고립 된 미토 콘 드리 아에 다른 기질, 억제제 및 이펙터를 추가, 시 토 크롬 c 통로 대체 산화 효소 통로 통해 산소 소비는 영향을 (그림 4B).
그림 1: 그래디언트의 준비에 대 한 설치. 왼쪽: 약간의 각도와 원심 분리기 튜브 (50 mL) 얼음에 PVC 연동 튜빙 콘센트 녹화; 튜브의 내부에 배치 중간: 연동 펌프; 오른쪽: 그라데이션 pourer 무거운 그라데이션 (내부 챔버) 및 빛 그라데이션 (외부 챔버) 솔루션을 포함 하는 자력의 위에. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 애기에서 미토 콘 드리 아의 정화를 연속 사용 하 여 촬영 0-4.4% (w/v) PVP/28% 콜 로이드 밀도 그라데이션. 어두운 녹색 밴드는 thylakoids 이며 그라데이션 솔루션의 상단에 표시 된 대로 다른 오염. 미토 콘 드리 아 분수 가까이 튜브의 하단에 흰색-녹색 악대로 나타났다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: SDS 페이지 및 특정 항 체를 사용 하 여 immunodetection에 의해 미토 콘 드리 아 단백질의 분리. (A) 미토 콘 드리 아 2 주 오래 된 물 교양 애기 thaliana 야생에서 절연 입력 (컬럼비아-0, 0 열) 식물 SDS-PAGE를 받게 되었고 NADH: ubiquinone oxidoreductase 소 단위 S4 (에 대하여 제기 하는 항 체를 조사 Ndufs4, At5g67590)입니다. 분자량 흠 없는 마커 젤의 외부 레인에 로드 된 그리고 10 대표 밴드의 크기는 킬로 Daltons (kDa)에 표시 됩니다. 검색 하는 Ndufs4 단백질의 명백한 분자 질량 18 kDa 이다. 단백질 풍부 2 µ g 총 단백질의 값을 기준으로 표시 됩니다. (B) 2 주 오래 된 묘 목 성장에 Gamborg의 b 5 미디어 3% (w/v) 자당 및 0.8 %agar (w/v) 750 µE m-2의 -1 에 노출 됐다 (HL)를 강조 표시 하 고 6 헤 후 수확 및 미토 콘 드리 아 단백질은 미토 콘 드리 아 순화 했다 SDS 페이지를 구분 하 고 항 체 대체 산화 효소 (AOX)에 대 한 제기와 조사. 34 kDa의 명백한 분자 질량 immunodetectable AOX 단백질의 존재 표시 됩니다. 단백질 풍부한 제어 (2 µ g)의 값을 기준으로 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 절연 하 여 O2 소비량의 대표적인 흔적 공장 미토 콘 드리 아. (A) 미토 콘 드리 아 위에서 설명한 대로 애기 thaliana 야생-타입 식물 (열-0)에서 고립 산소 소비 측정 전에 외부 막 무결성에 대 한 분석 했다. 고립 된 미토 콘 드리 아 (150 µ g 총 미토 콘 드리 아 단백질)의 30 µ L은 사용 했다. 미토 콘 드 리아 무결성은 위에서 설명한 대로 90%로 결정 했다. (B) 산소 소비 측정의 30 µ L를 사용 하 여 수행 된 미토 콘 드리 아 (150 µ g 총 미토 콘 드리 아 단백질) 애기 thaliana 야생-타입 식물에서 고립. 총 미토 콘 드리 아 호흡 AOX 통로 결정 했다. 이러한 데이터에서 시 토 크롬 c 통로 AOX 통로 통해 산소 소비를 확인할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 분쇄 매체 | |
| 화학 | 농도 |
| 자당 | 0.3 M |
| tetrasodium 파이 인산 (Na4P2O7 · 10 H2O) | 25 m m |
| EDTA disodium 소금 | 2 mM |
| 칼륨 인산 이수소 (KH2PO4) | 10 m m |
| Polyvinylpyrrolidone (PVP40) | 1% (w/v) |
| 소 혈 청 알 부 민 (BSA) | 1% (w/v) |
| 이온된 수 | |
| 7.5 (HCl을 사용 하 여) pH 조정 | |
| 참고: 300 mL 분쇄 매체, 1.06 g 나트륨 하는데 대 한 (최종 농도: 17.84 m m)와 0.74 g 시스테인 (최종 농도: 20.36 mM) 사용 직전에 추가 됩니다. 추가 후 pH를 확인 하 고 필요한 경우 7.5 1 M NaOH로 조정. | |
| 2 X 워시 버퍼 | |
| 화학 | 농도 |
| 자당 | 0.6 M |
| TES | 20 mM |
| 소 혈 청 알 부 민 (BSA) | 0.2% (w/v) |
| 이온된 수 | |
| 7.5 (NaOH를 사용 하 여) pH 조정 | |
| 그라데이션 | |
| 무거운 그라데이션 솔루션 (4.4% (w/v) PVP) | 2 그라데이션 튜브 |
| 2 X 워시 버퍼 | 17.5 mL |
| Colloidial 밀도 그라데이션 | 9.8 mL |
| PVP-40 (20% (w/v)) | 7.7 mL |
| 빛 그라데이션 솔루션 (0% (w/v) PVP) | 2 그라데이션 튜브 |
| 2 X 워시 버퍼 | 17.5 mL |
| Colloidial 밀도 그라데이션 | 9.8 mL |
| 이온된 수 | 7.7 mL |
표 1: 구성 버퍼 및 그라디언트 미토 콘 드리 아 격리에 대 한 사용의.
| 약어 | 재고 솔루션의 농도 | 스토리지 | 최종 농도 | 볼륨 1 ml 반응에 대 한 추가 | |
| 기판 | |||||
| 시 토 크롬 c | Cyt c | 2.5 m m (H2O) | -20 ° C | 25 Μ M | 10 μ |
| NADH | NADH | (H2O)에서 0.1 m M | -20 ° C | 1mm | 10 μ |
| 호박 | Succ | 500 m m (H2O) | -20 ° C | 5 mM | 10 μ |
| 억제제 | |||||
| Antimycin A | AA | 1 m m (EtOH) | -20 ° C | 5 Μ M | 5 μ |
| 청산가 리 | KCN | 100 m m (H2O) | 4 ° C | 1mm | 10 μ |
| Myxothiazol | Myxo | (에 EtOH) 500 μ M | -20 ° C | 2.5 Μ M | 5 μ |
| n-틸 gallate | nPG | (에 EtOH) 100 mM | -20 ° C | 500 Μ M | 5 μ |
| 이펙터 | |||||
| ADP | ADP | 100 m m (H2O) | -20 ° C | 1mm | 10 μ |
| 하는데 | Asc | 500 m m (H2O) | 사용 당일 신선한 게 | 10 m m | 20 μ |
| ATP | ATP | 100 m m (H2O) | -20 ° C | 500 Μ M | 5 μ |
| Dithiotreitol | DTT | (에서 H2O) 1 M | 사용 당일 신선한 게 | 10 m m | 10 μ |
| Pyruvate | Pyr | (에서 H2O) 1 M | -20 ° C | 10 m m | 10 μ |
| 세제 | (H2O)에 10% (v/v) | 4 ° C | 0.05% (v/v) | 5 μ | |
표 2: 기판, 저 해제 및 산소 소비 측정을 위해 사용 하는 이펙터의 목록입니다.
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Discussion
일반적으로, 애기에서 미토 콘 드리 아의 분리 5 밀리 그램 보다 큰 수익률 자주 철저 한 연 삭으로 얻을 수 있지만 약 80-100 3-4 주 오래 된 식물에서에서 미토 콘 드리 아의 3 mg을 수익률 나뭇잎. 수확량은 성장 조건에 따라 달라진 다 고 미토 콘 드리 아 구조 노화9동안 잘 유지 될 것으로 보인다 비록 senesce, 나뭇잎으로 극적으로 감소. 좋은 수확량을 얻기 위해 가장 중요 한 기능 중 하나는 미토 콘 드리 아를 풀어 놓는 세포를 lyse 연 삭 하는 방법입니다. 다양 한 기계 연 삭 장치 구입을 위해 사용할 수 있지만, 애기에 대 한 박격포와 유 봉에서 연 삭 달성 한다 수확량, 측면에서 지속적으로 좋은 결과를으로 세포에 약간 손상 된 세포 lyses. 기계 그 라인 더 빠른 동안, 그들은 최적화를 요구 하 고 필요한 연 삭의 금액은 조직에 따라 다를 수 있습니다. 박격포와 유 봉, 그것은 종종 편리 하 고 보다 효율적인 조직 슬라이스 경우 또는 연 삭 전에 칼 이나가 위 컷. 명시 된 바와 같이, 모든 단계 4 ° C에서 실시 하 고 순화 된 미토 콘 드리 아의 세척된 펠 렛을 얻기에 연 삭의 끝에서 모든 절차 약 4 시간 소요 됩니다. 세제 또는 튜브 또는 그라데이션 pourers에 다른 시 약의 수 극적으로 생산량을 줄일 수,이 절차에서 사용 된 모든 구성은 세제 없이 세척 하 고 다른 절차에 사용 되지. 마지막으로,는 미토 콘 드리 아를 충분히 제거 하 고 씻어 있도록 그라데이션에 다른 분수에서 구분이 중요 하다. 만약 그들이 너무 튜브의 아래쪽, 그것을 혼합 하기 전에 부 어 무거운 솔루션의 더 많은 수 있도록 조정 될 필요가 빛과 무거운 솔루션을 혼합 하 여 의미 합니다. 반대로, 밴드 확산이 표시 되는 튜브에 높은 경우 조금 일찍 발생 하는 요구를 혼합.
여기에 설명 된 메서드는 애기 꽃과 루트 조직11,12에서 미토 콘 드리 아의 격리에 대 한 쉽게 사용할 수 있습니다. 뿌리, 그것이 수경 문화에서 성장과 100 g 2 밀리 그램 양의 미토 콘 드리 아를 신선한 무게의 필요를 편리 합니다. 뿌리를 연 삭에 대 한 박격포와 유 봉에서 분쇄 하기 전에 작은 조각으로 절단 해야 하 고 증가 수확량 루트 조직, 믹서 기 또는 박격포와 유 봉에서 다시 연마 하 여 얻을 수 있습니다. 어디 미토 콘 드 리아 기능은 종종 향상 된13, 박격포와 연 삭 및 유 봉, 하지만 잘 작동 재료의 제한 된 양을 즉 꽃 조직에 대 한 많은 양의 식물 조직 수확 성장 될 필요가 있다. 미토 콘 드리 아 애기 기관의 유사한 메서드 또는 약간의 수정14,15 를 사용 하 여 다양 한 및 쌀 (Oryza sativa)16에서 격리 되었습니다.
위에서 설명한 방법의 한계는 i) 애기와 쌀이 분리 방법, iii) (와 같은 다양 한 오염 물질의 소량 적용 특정 조직 ii)만 미토 콘 드리 아 격리에 필요한 씨앗의 대용량 peroxisomal 단백질) 순화 된 미토 콘 드리 아에서 아직도 존재 했다. 위에서 설명한 방법을 사용 하 여 얻은 미토 콘 드리 아 연구, 산소 통풍 관 연구에서 단백질 풍부의 양적 질량 분석 분석에 이르기까지 다양 한을 위해 적당 하다. 그라데이션 순화 된 미토 콘 드리 아 여전히 peroxisomal 단백질3등 다양 한 오염 물질의 소량을 포함 됩니다. 비-미토 콘 드리 아 단백질에 의해 오염의 금액은 작은 미토 콘 드리 아 단백질에 변화를 결정 하 정의 된 세포 기관이 목록을 비교를 사용할 수 있습니다 (< 10%)과 유사한 샘플 비교, 그래서 유형 및 정도 비-미토 콘 드리 아 단백질 비슷합니다. SDS 페이지 또는 다른 젤-기반 접근 단백질 풍부의 분석은 상대적으로 적은 양의 미토 콘 드리 아 (2-20 µ g), 항 체 (그림 3)에 의해 탐지의 선형성을 확인 하려면 다양 한 양의 미토 콘 드리 아를 사용 하 여 수행할 수 있습니다. Porin (전압 의존 음이온 채널 (VDAC))은 부 량 로드 제어로 주로 사용 됩니다, 하는 동안 우리의 경험에이 단백질의 비교적 큰 풍부 의미할 수 있다 응답 아니다는 것을 자주 많은 양의 단백질 젤에 로드 하는 경우에 선형 그래서 항 체 응답의 선형성 같은 로드 컨트롤을 사용할 때 확인 항상 한다. 미토 콘 드리 아를 격리의이 접근의 중요성은 밀도 기울기 형성 물자로 자당을 사용 하는 그라디언트, 달리 콜 로이드 밀도 기울기 할 요구 하지 순화 된 미토 콘 드리 아의 삼 투 다시 조정으로 필요한 경우 자당입니다. 즉, 더 적은 기회 파열 순화 된 미토 콘 드리 아의 세척 후 콜 로이드 밀도 재료를 제거 하, 그들은 다양 한 분석 실험 또는 응용 프로그램에서에서 직접 사용할 수 있습니다.
조직도 말, 미토 콘 드리 아 단백질 전체 잎 또는 조직 추출에서 탐지는, 그 조직에서 미토 콘 드리 아 단백질의 양을 측정 하는 매력적인 접근 있습니다. 다른 세포에 비해 미토 콘 드리 아의 일반적으로 낮은 볼륨을 감안할 때, 미토 콘 드리 아 단백질 같은 접근에서 넘어 있을 수 있습니다 전체 조직에 미토 콘 드리 아 단백질의 검출 몇 가지 주의와 해석 요구를 추출 합니다. 어디 순화 된 미토 콘 드리 아 조직 추출 동일한 마이그레이션 및 탐지의 선형성을 보장 하기 위해 함께 electrophoresed는, 주의 컨트롤, 자신감을가지고 같은 방법을 실시 해야 합니다.
클락-타입 산소 전극의 도움으로, 솔루션의 산소 부분 압력에 있는 변화를 측정할 수 있습니다. 백 금 음극과 KCl 교량에 의해 연결 되 고 전해질 습 종이 (담배 종이)와 산소 투과성 막 (소계 막)은 양극 실제 전극에 의하여 이루어져 있다. 600-700 mV의 전압의 산소, 산소 농도 전압 사이의 선형 관계를 주는 감소에 지도 한다. 산소 전극 다른 회사에서 상업적으로 사용할 수 있습니다. 각 회사는 어셈블리 및 산소 전극의 설치에 관한 지침을 해야 합니다. 그러나, 일반적은 양극과 전극 디스크의 플래티넘 음극 전극 청소 키트 또는 어셈블리 전에 지우개 펜의 도움으로 청소 해야 합니다. 그것은 어셈블리 (예: 소계 막과 담배 종이 사이의) 동안 공기 방울 형성 하지 않습니다 확인 해야 합니다. 조립 후 전극 디스크 플래티넘 음극 반응 챔버의 기지에서 위쪽으로 향하게 된 챔버에 연결 해야 합니다. 자체 챔버 온도 제어를 보장 물 재킷에 의해 포위 된다. 그것은 매우 중요 하다는 챔버는 항상 전체 왼쪽 물, 막 건조 하 고 그렇지 않으면 균열 때문. 마찬가지로, 막 해야 안 수에 의해 감동 펫 이나 주사기 화합물을 찢는 피하기 위해 챔버에 추가할 때.
분석 결과, 이전의 분석 결과 약 실로 동일한 온도에 호흡 매체를 따뜻하게 (대부분의 경우 25 ° C) 막 몇 분 동안 호흡 버퍼에 equilibrate를 허용 한다. 후 산소 소비를 위한 플런저를 닫는 분석 실험, 비 일회용 microliter 주사기 (예: 마이크로 주사기) 또는 일회용 젤 피 펫 팁을 로드를 사용 하 여 효과 기 분자의 추가 실행 한다. 마이크로 주사기를 사용 하 여 주사기 100% 에탄올와 재고 솔루션을 오염 방지 하려면 추가 사이 물으로 철저히 씻어 서 지켜질 수 있다. 이 또한 측정 사이 챔버의 세척에 대 한 적용 됩니다. 산소 소비 분석 실험에서 사용 하는 대부분 시 약 물에 용 해 되며 측정 사이 물 (약 5 배)로 여러 rinsing 하 여 쉽게 제거할 수 있습니다. 그러나, 일부 화학 물질 분석에 사용 되는 antimycin A와 같은 유기 용 매, myxothiazol, 및 nPG에 녹는 있습니다. 따라서, 챔버 (약 5 시간) 잔류물 고갈 그리고 물이 분자의 잔여 자취를 제거 하는 분석 실험 사이 유기 용 매 (에탄올 50% (v/v))으로 씻어 서 수 필요 합니다.
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Disclosures
저자는 관심의 충돌을 선언합니다.
Acknowledgments
이 연구는 오스트레일리아 연구 위원회 센터의 우수 공장 에너지 생물학 CE140100008는 호주 연구 협의회 미래 친교 (FT130100112) Feodor Lynen 연구 친교 (알렉산더 폰 훔볼트 MWM, 하에 의해 지원 되었다 재단, 독일) js.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ADP | Sigma-Aldrich | A2754 | Chemical |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | Chemical, dissolve in ethanol |
| AOX antibody | from Tom Elthon | Elthon et al., 1989 | |
| Ascorbate | Sigma-Aldrich | A0157 | Ascorbate Oxidase from Cucurbita sp. |
| ATP | Sigma-Aldrich | A26209 | Chemical |
| Bovine serum albumin (BSA) | Bovogen | BSAS 1.0 | Chemical |
| Clarity western ECL substrate | Bio-Rad Laboratories | 1705061 | Chemical |
| Criterion Stain-Free Precast Gels 8-16% 18 Wells | Bio-Rad Laboratories | 5678104 | Chemical |
| Cyanide | Sigma-Aldrich | 60178 | Chemical |
| Cytochrome c | Sigma-Aldrich | C3131 | Chemical |
| Difco Agar, granulated | BD Biosciences | 214530 | Chemical |
| Dithiotreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | Chemical |
| EDTA disodium salt | Sigma-Aldrich | E5134 | Chemical |
| Gamborg B-5 Basal Medium | Austratec | G398-100L | Chemical |
| Gamborg Vitamin Solution (1000x) | Austratec | G219-100ML | Chemical |
| Goat Anti-Mouse IgG (H + L)-HRP Conjugate | Bio-Rad Laboratories | 1706516-2ml | Chemical |
| Goat Anti-Rabbit IgG (H + L)-HRP Conjugate | Bio-Rad Laboratories | 1706515-2ml | Chemical |
| L-Cysteine | Sigma | C7352-100G | Chemical |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 230391 | Chemical |
| Murashige & Skoog Basal Salt Mixture (MS) | Austratec | M524-100L | Chemical |
| Myxothiazol | Sigma-Aldrich | T5580 | Chemical, dissolve in ethanol |
| NADH | Sigma-Aldrich | N8129 | Chemical |
| Ndufs4 antibody | from Etienne Meyer | Meyer et al., 2009 | |
| n-Propyl gallate | Sigma-Aldrich | P3130 | Chemical, dissolve in ethanol |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | Chemical, colloidal density gradient |
| Polyvinylpyrrolidone (PVP40) | Sigma-Aldrich | PVP40 | Chemical |
| Potassium cyanide | Sigma-Aldrich | 60178 | Chemical |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | Chemical |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | Chemical |
| Sodium chloride | Chem-Supply | SA046 | Chemical |
| Sodium dithionite | Sigma-Aldrich | 157953 | Chemical |
| Sodium L-ascorbate | Sigma | A4034-100G | Chemical |
| Succinate | Sigma-Aldrich | S2378 | Chemical |
| Sucrose | Chem-Supply | SA030 | Chemical |
| TES | Sigma-Aldrich | T1375 | Chemical |
| Tetrasodium pyrophosphate (Na4P2O7 · 10H2O) | Sigma-Aldrich | 221368 | Chemical |
| Trans-Blot Turbo RTA Midi Nitrocellulose Transfer Kit | Bio-Rad Laboratories | 1704271 | Chemical |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | X100 | Chemical, detergent |
| Western Blocking Reagent | Sigma | 11921681001 | Chemical |
| Balance | Mettler Toledo | XS204 | Equipment |
| Beakers | Isolab | 50 mL | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-26XP | Equipment |
| Centrifuge tubes | Nalgene | 3117-9500 | Equipment |
| Circulator | Julabo | 1124971 | Attached to oxygen electrode chamber |
| Conical flask | Isolab | 500 mL | |
| Dropper | 3 mL | ||
| Fixed angle rotor | Beckman Coulter | JA25.5 | Equipment |
| Funnel | Per Alimenti | 14 cm | For filtering |
| Gradient pourer | Bio-Rad | 165-4120 | For preparation of gradients |
| Magnetic Stirrer ATE | VELP Scientifica | F20300165 | Equipment |
| Miracloth | VWR | EM475855-1R | Filtration material |
| Mortar and pestle | Jamie Oliver | Granite, 6 Inch | Equipment |
| O2view | Hansatech Instruments | Oxygen monitoring software | |
| Oxygraph Plus System | Hansatech Instruments | 1187253 | Clark-type oxygen electrode |
| Paintbrush | Artist first choice | 1008R-12 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | plastic paraffin film |
| Peristaltic pump | Gilson | F155001 | For preparation of gradients |
| PVC peristaltic tubing | Gilson | F117930 | For preparation of gradients |
| Water bath | VELP Scientifica | OCB | Equipment |
References
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