Summary
Como las mitocondrias son sólo un pequeño porcentaje de la célula de la planta, tienen que ser purificado para una gama de estudios. Las mitocondrias pueden ser aisladas de una variedad de órganos de la planta de homogeneización, seguido de centrifugación gradiente diferencial y densidad para obtener una fracción altamente purificada mitocondrial.
Abstract
Las mitocondrias son organelos esenciales involucrados en numerosas vías metabólicas en las plantas, en particular la producción de trifosfato de adenosina (ATP) de la oxidación de compuestos reducidos como nicotinamida adenina dinucleótido (NADH) y flavina adenina dinucleótido (FADH2). La anotación completa del genoma de Arabidopsis thaliana ha establecido como el más ampliamente utilizado sistema de modelo de planta, y así la necesidad de purificar las mitocondrias de una variedad de órganos (hojas, raíz o flor) es necesaria aprovechar las herramientas que ya están disponibles para Arabidopsis estudiar biología mitocondrial. Las mitocondrias están aisladas por la homogeneización del tejido usando una variedad de enfoques, seguido por una serie de pasos de centrifugación diferencial produce un pellet mitocondrial cruda que más se purifica mediante gradiente de densidad coloidal continua centrifugación. Posteriormente se retira el material coloidal densidad por múltiples pasos de centrifugación. A partir de 100 g de tejido foliar fresco, 2-3 mg de mitocondrias puede rutinariamente obtener. Experimentos respiratorios en las mitocondrias Mostrar tasas típicas de 100-250 nmol O2 min-1 mg proteína mitocondrial total-1 (tasa de NADH-dependiente) con la capacidad de utilizar diferentes sustratos e inhibidores para determinar que sustratos son ser oxidados y la capacidad de las alternativa y citocromo oxidasas terminales. Este protocolo describe un método de aislamiento de las mitocondrias de las hojas de Arabidopsis thaliana mediante gradientes de densidad coloidal continua y un eficiente mediciones respiratoria de las mitocondrias planta purificada.
Introduction
La historia de la investigación mitocondrial planta va detrás más de 100 años1. Las mitocondrias intactas se aisló por primera vez en la temprana década de 1950 utilizando centrifugación diferencial. La aparición de un gradiente de densidad coloidal en la década de 1980 permitió que las mitocondrias ser purificada sin sufrir ajuste osmótico. Mientras que las mitocondrias purificadas gradiente son convenientes para la mayoría de los casos, debido a la sensibilidad de la espectrometría de masas, contaminantes aún relativamente de menor importancia pueden ser detectados y pueden ser asignados inadecuadamente una localización mitocondrial2. El uso de electroforesis de flujo libre puede quitar ambos plastidic y peroxisoma contaminación3, pero sin flujo de electroforesis es una técnica altamente especializada y no es necesaria para la gran mayoría de los estudios. Además, cuando determinar la ubicación de una proteína debe ser recordado doble o múltiples objetivos de proteínas ocurre en las células. Más de 100 proteínas específicas duales se describen para cloroplastos/plástidos y mitocondrias4y un número de proteínas dirigida a las mitocondrias y los peroxisomas también se conocen5. Además, la reubicación de proteínas bajo estímulos específicos, por ejemplo, el estrés oxidativo, es un tema emergente en la biología de la célula6. Por lo tanto, debe ser considerado en el contexto de la biología que estudia la localización de las proteínas, y una variedad de métodos se utilizan para determinar y verificar la ubicación2.
Las mitocondrias son generalmente aisladas de los tejidos vegetales por homogeneización, un equilibrio es necesario entre rompiendo la pared celular para liberar las mitocondrias y no dañar las mitocondrias. Tradicionalmente con patata y coliflor, homogeneización implica el uso de aparatos domésticos licuadora/exprimidor para hacer un extracto líquido en un tampón con varios componentes para mantener la actividad. Aislamiento de mitocondrias de hojas de guisante, (un material popular para aislamiento mitocondrial utilizando plantas de semillero jóvenes (~ 10 días), utiliza una batidora para lyse las células como el material de la hoja es suave. Con la disponibilidad de líneas de knock-out insertional T-DNA de Arabidopsis thaliana , la necesidad de ser capaz de purificar las mitocondrias para llevar a cabo estudios funcionales ha requerido el desarrollo de métodos para aislar mitocondrias de hoja, raíz o flor tejido. En general los métodos desarrollados para otras plantas trabajaban bien7, con la gratificación que moler del material necesario para ser optimizado. Para Arabidopsis esto puede lograrse en una variedad de maneras (véase abajo) y difiere entre tipos de tejidos (raíz versus shoot). El uso de la gradiente continuo también puede ser optimizado como la densidad de las mitocondrias de distintos órganos o etapas de desarrollo medio pueden migran diferentemente. Así, para la separación máxima la densidad del gradiente puede ser refinada para lograr la mejor separación.
Una vez purificada la mitocondria puede utilizarse para una variedad de estudios, incluyendo los experimentos de absorción de proteína y tRNA, ensayos de actividad enzimática, las medidas de la cadena respiratoria y mancha blanca /negra occidental análisis. Las mitocondrias aisladas pueden utilizarse también para los análisis de espectrometría de masas de la abundancia de la proteína. Objetivo reacción múltiple monitoreo análisis (MRM) permite la cuantificación de definido de las proteínas, pero requieren el desarrollo de los ensayos significativos. En cambio, cuantificación por dimetil u otro isótopo etiquetas8, proporciona un enfoque de descubrimiento en la identificación de las diferencias en el proteoma completo que puede utilizarse para descubrir nuevos conocimientos biológicos.
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Protocol
Este protocolo se utiliza para el aislamiento de las mitocondrias intactas de Arabidopsis thaliana órganos cultivados en suelo mediante gradientes de densidad coloidal continua. Después de la recolección de material todos los procedimientos se llevan a cabo a 4 ° C.
1. preparación del tampón de lavado, medio y soluciones de gradiente
- Preparar 300 mL de pulido medio (menos ascorbato y cisteína) y 200 mL de tampón de lavado x 2 según la tabla 1 un día antes del aislamiento, mantenerlos en frío a 4 ° C.
Nota: Agregar ascorbato de sodio y L-cisteína (base libre) a una concentración final de 17,84 m y 20,36 m, respectivamente, en el medio de moliendo en la mañana de la aislamiento. Si se utilizan las mitocondrias para inmunoblot o azul nativo-poliacrilamida gel análisis de electroforesis (BN-PAGE), hacer 2 x solución de lavado sin BSA. - Preparación de gradientes en la mañana del aislamiento mitocondrial (figura 1 y tabla 1).
- Hacer las soluciones gradiente pesadas y ligeras en dos vasos; 35 mL de cada uno es suficiente para dos tubos de gradiente.
- Lavar las cámaras del pourer del gradiente y tubería peristáltica de PVC con agua desionizada y asegurar un flujo uniforme a través del tubo de todos los tubos.
- Colocar 2 tubos de centrífuga (50 mL) en un ángulo leve en el hielo con las salidas de tubería peristáltica de PVC pegada en el interior de los tubos para asegurar que la solución gradiente corre por el lado de los tubos.
- Cierre la conexión entre las cámaras internas y externas (palanca negra hacia abajo). Coloque el pourer del gradiente en un agitador magnético con una barra de agitación pequeño en la cámara interior.
- Verter la solución gradiente pesado de 35 mL en la cámara interior (cámara con salida de la tubería). Pipetear en los tubos de dos centrífuga colocados en hielo hasta la mitad queda con la velocidad de la bomba peristáltica para rápido (300 mL/h) la solución gradiente fuerte.
- Verter la solución de gradiente ligero 35 mL en el externa (cámara sin salida de la tubería). Abra la conexión entre las cámaras (palanca de empuje negro para arriba hasta la mitad) y permite soluciones mezclar suavemente. Mezclar las soluciones con el agitador magnético.
- Que las soluciones se ejecute lentamente (60 mL/h) hasta que toda la mezcla degradada ha salido de las cámaras dando por resultado dos 0 - 4.4% (w/v) tubos de relleno de degradado de polivinilpirrolidona (PVP). Mantener los gradientes en el hielo hasta que esté listo para usar en paso 2.12.
Nota: Una vez que el gradiente se ha preparado, diluir 2 x medio de lavado 1 x con agua desionizada prechilled y mantenga frío a 4 ° C.
2. homogeneización y aislamiento mitocondrial
- Cortar tejido entero roseta de 4 - semanas de edad plantas Arabidopsis cultivadas en suelo con tijeras, por lo menos 80 plantas será requeridas para 1 preparación.
Nota: 10-14 días agua culturas, mínimo 5 preparación de macetas o 2 semana de edad plántulas cultivadas en placas de agar de Murashige y Skoog Basal sal mezcla (MS), mínimas de 4 platos, también pueden ser utilizadas. - Colocar la mitad del material vegetal que ha sido cortado en trozos pequeños en un mortero grande previamente refrigerado 4 ° C con 75 mL de medio de molienda (tabla 1) y moler extensivamente durante varios minutos hasta que no se quedan grandes piezas de tejido.
- Humedezca previamente 4 capas de material de la filtración (22-25 μm tamaño de poro) con pulido medio y filtrar el homogeneizado las 4 capas de material de la filtración a través de un embudo de plástico en un erlenmeyer de 500 mL.
- Moler la mitad restante de tejido con otro 75 mL de medio de molienda.
- Combinar homogenados en los materiales de filtración y tanto como posible homogeneizado a través del filtro.
- Moler el tejido restante restante en el material de filtración otra vez con lo restantes 150 mL de pulido medio, filtro otra vez en el frasco cónico de 500 mL.
- Centrifugar el homogeneizado filtrado en 8 tubos de centrífuga plástico de 50 mL previamente enfriada a 2.500 x g a 4 ° C en un rotor de ángulo fijo durante 5 minutos.
- Vierta el sobrenadante en tubos de centrífuga limpio (50 mL; evitar perturbar el sedimento verde) y centrifugar a 17.500 x g a 4 ° C por 20 min en un rotor de ángulo fijo.
- Deseche todo pero < 3 mL del sobrenadante por aspiración (o retirar suavemente sin perturbar el pellet). Con cuidado Resuspender el precipitado en el sobrenadante residual con un pequeño pincel fino.
- Añadir 10 mL de 1 x de tampón de lavado a cada tubo y combinar 4 tubos en tubo de centrífuga limpio 1 (es decir, resultante en 2 tubos).
- Rellenar estos tubos con tampón de lavado 1 x 50 mL y repetir pasos 2.7-2.9.
- Piscina crudos pellets mitocondriales en 1 tubo con un gotero y dispersan uniformemente con el pincel fino (puede usarse una pequeña cantidad de tampón de lavado pero el volumen final debe ser menos de 3 mL para caber en la parte superior del gradiente). Suavemente la capa la suspensión mitocondrial con un gotero en los 2 continua 0 - 4.4% (w/v) PVP gradientes.
- Equilibrar los tubos por peso (1 x de tampón de lavado) y centrifugar a 40.000 x g a 4 ° C durante 40 minutos Asegúrese de que la rotura se ha apagado. Las mitocondrias se migrarán a una banda cerca del fondo del tubo, o pueden estar presentes en la solución de pesado en la parte inferior del tubo (identificado por una banda turbia, amarillenta; Figura 2).
- Retire con cuidado la superior 5 cm de la solución por encima de la banda mitocondrial por la aspiración.
- Distribuir la solución restante que contiene la mitocondria en 2 tubos limpios y llenan de 1 x de tampón de lavado. Distribuir uniformemente el gradiente de densidad coloidal y mitocondrias que cubre la boca del tubo con una película plástica de la parafina y invirtiendo varias veces. Centrifugar 15 min a 31.000 x g a 4 ° C con el frenado lento.
Nota: Antes de la centrifugación, asegúrese de que las mitocondrias y el gradiente de densidad coloidal restante se distribuyen uniformemente. De lo contrario, el gradiente de densidad coloidal puede concentrarse en la parte inferior del tubo y prevenir la granulación de las mitocondrias. - Eliminar el sobrenadante por aspiración, llene el tubo de lavado 1 x 50 mL de tampón e invertir otra vez para asegurar una mezcla. Centrifugar 15 min a 31.000 x g a 4 ° C con el frenado lento.
- Aspirar el sobrenadante y recoger los pellets mitocondriales en tan pequeña un volumen (~ 500 μl) como sea posible usando una pipeta con modificada 200 μL puntas (cortadas la punta un poco por encima de su extremo para aumentar su apertura). Coloque las mitocondrias en un tubo de 1,5 mL y mantener en hielo para su uso inmediato o tienda a-80 ° C.
Nota: Si las mitocondrias se utilizará para la electroforesis del gel de la sulfato-poliacrilamida de sodio dodecyl (SDS-PAGE), BN-PAGE, o análisis del immunoblot, usan 1 x de tampón de lavado sin BSA para el lavado final (es decir, paso 2.15 y 2.16). - Determinar la concentración de proteínas de las mitocondrias mediante el método de Bradford.
Nota: Para alícuotas de BN-PAGE centrifugar a 4 ° C y pellets tienda a-80 ° C hasta su uso. Para mediciones de consumo de oxígeno, pueden utilizarse sólo las mitocondrias recién aisladas.
3. mediciones de consumo de oxígeno
Nota: El consumo de oxígeno por recién aislada planta mitocondrias pueden analizarse con un electrodo de oxígeno de Clark-tipo, permitiendo la determinación de la integridad mitocondrial, citocromo c vía actividad y actividad de la vía alternativa.
- Instalación del software
- Instalar licencia oxígeno control de software en el equipo utilizado para las mediciones de consumo de oxígeno.
- Preparación de medio de la respiración, sustratos, soluciones químicas y el electrodo de oxígeno de Clark-tipo
- Preparar el medio de la respiración (300 mM sacarosa, 10 mM NaCl, 5 m m KH2PO4, 2 mM de MgSO4, 0.1% (p/v) de albúmina sérica bovina (BSA), TES (pH 7.2) de 10 mM) utilizado para los ensayos de consumo de oxígeno.
- Preparación de sustratos, inhibidores y efectores utilizados para medir la respiración mitocondrial (tabla 2). Puede ser preparados antes y almacenados a-20 ° C.
Nota: Neutralizar el pH de soluciones ácidas tales como ácidos orgánicos a pH 7,0 con NaOH antes de uso. - Caliente el medio de la respiración a la misma temperatura que la cámara de ensayo (25 ° C).
- Montar el electrodo de oxígeno de Clark-tipo como se describe en el protocolo del fabricante.
- Colocar 1 mL de agua saturada de aire (agua saturada de aire se obtiene agitando vigorosamente una pequeña cantidad de agua desionizada en un matraz cónico grande) en la cámara de medición. Para encender el agitador, haga clic en el botón "Velocidad de agitado". Haga clic en el botón "On" y seleccione la velocidad del agitador a 65 rpm. Haga clic en "Aceptar" para continuar. Agitar continuamente el agua a 25 ° C.
- Calibración del electrodo de oxígeno
- Caliente el agua que se utilizarán para la calibración a la misma temperatura que la cámara de ensayo (25 ° C).
- Espere a que la corriente estabilizar y calibrar el electrodo de oxígeno.
- Para iniciar la calibración del electrodo de oxígeno, haga clic en el botón "Calibrate", seleccione "Calibración de fase líquida" y "Agua saturada de aire".
- (Calibración del oxígeno (fase líquida) - paso 1 de 5) abrirá una ventana nueva. Seleccione el canal para calibrar (el canal de) que la caja de control del electrodo está conectada) e introducir variables (juego "Temperatura de la cámara" a 25 ° C y la "Presión atmosférica" a 101,32 kPa). Haga clic en "Aceptar" para continuar.
- En el siguiente paso (paso 2 de 5), configurar la velocidad del agitador (65 rpm) y haga clic en "Aceptar" para continuar.
- En el paso 3 de 5, esperar la señal llegar a una meseta. El término "Meseta alcanzado, presione OK para continuar" aparecerá en la caja. Haga clic en "Aceptar" para continuar.
- En el paso 4 de 5, establecer cero oxígeno en la cámara mediante la adición de Ditionito de sodio 5 mg. Haga clic en "Aceptar" para continuar.
Nota: Una disminución en la concentración de oxígeno debe ser visible en el rastro y debe llegar a 0. - En el último paso de calibración (paso 5 de 5), esperar la señal llegar a una meseta. El término "Meseta alcanzado, presione OK para continuar" aparecerá en la caja. Haga clic en "Aceptar" para continuar.
- Haga clic en "Guardar calibración" para guardar la calibración. Se abrirá una nueva ventana. Haga clic en "Aceptar" para confirmar para guardar la nueva calibración de la caja de control de oxígeno.
Nota: Después de la calibración, el etiquetado "oxígeno (nmol/mL)" aparecerán en el eje y. - Después de la calibración, limpiar la cámara de medición de enjuague la cámara con agua (al menos 5 - 10 veces) para asegurar la limpieza apropiada. Coloque 1 mL del medio de la respiración en la medición de la cámara y permitir que la membrana se equilibre durante unos minutos hasta que la huella del consumo de oxígeno es lineal.
- Adaptar la escala de la huella de consumo de oxígeno para obtener una visión de buena pendiente. Haga clic en "Zoom XY" e introduzca variables (posición "Oxígeno" 0 - 300 y el "tiempo eje" 0 - 45 minutos).
- Determinación de la integridad mitocondrial
- Con el émbolo abierto, añadir 970 μl de medio de respiración de aire saturado a la cámara de reacción.
- Añadir 30 mitocondrias μl aislado o 150 μg de la proteína mitocondrial total determinada después de aislamiento de las mitocondrias (proteína total debe incluirse en los cálculos luego) a la cámara de reacción mediante una pipeta con una punta de corte.
- Agitar la suspensión mitocondrial continuamente con un agitador magnético de la barra (65 rpm) a 25 ° C para aire-saturar la solución.
- Sellar la cámara con el émbolo, haga clic en "Iniciar grabación" para registrar el consumo de oxígeno y permite el seguimiento de consumo de oxígeno estabilizar (1-2 min).
- Determinar la tasa de consumo de oxígeno manualmente después de añadir 10 mM ascorbato y 25 μm citocromo c durante 5 minutos obtener la tasa de "antes de detergente".
Nota: Para la adición de sustratos, inhibidores y efectores directamente en el rastro de la etiqueta, haga clic en el botón "Agregar evento Mark" e introduzca la correspondiente designación de etiqueta. Haga clic en "Aceptar" para continuar. - Determinar la tasa de consumo de oxígeno manualmente por 3 min después de añadir el detergente de 0,05% (v/v) para dar el tipo "después de detergente". Haga clic en "Detener grabación".
- Haga clic en el botón "Tabla de tasas de cambio". 2 cursores aparecerán como líneas verticales en la pantalla graph. Haga clic y arrastre el par de cursores de tasa a las posiciones necesarias en el rastro para definir el intervalo de frecuencia. Mover el intervalo de frecuencia a lo largo de la traza usando los cursores izquierdo tasa. Establecer el intervalo de frecuencia utilizando el cursor de derecha tasa. El oxígeno monitoreo software automáticamente dibuja una línea de mejor ajuste entre los dos cursores mientras se mueven los cursores de intervalo de velocidad a lo largo de la traza.
- Una vez definido el intervalo de la tasa deseada y la posición, introduce el índice en la tabla con un clic derecho en 1 de los 2 cursores y seleccionar "Añadir velocidad a mesa". Haga clic en el botón "Agregar" para confirmar para mostrar el índice en la tabla de índice principal.
- Calcular la integridad mitocondrial dividiendo la tasa de "antes de detergente" la tasa "después de detergente", expresada como un porcentaje y restar de 100.
- Determinación de la respiración mitocondrial
- Con el émbolo abierto, añadir 970 μl del medio de la respiración de aire saturado a la cámara de reacción. Añadir 500 μm ATP y mitocondrias μl aislado 30 o 150 μg de la proteína mitocondrial total usando una pipeta con una punta cortada al medio de la respiración en la cámara de reacción.
- Agitar la suspensión mitocondrial continuamente con un agitador magnético de la barra (65 rpm) a 25 ° C.
- Cerca de émbolo, haga clic en "Iniciar grabación" para registrar el consumo de oxígeno y esperar 1-2 min para la tasa de consumo de oxígeno se estabilice (cuando la huella del consumo de oxígeno es lineal). Añadir succinato 5 mM. Registro de la tasa de consumo de oxígeno durante unos 2 minutos.
Nota: Para la adición de sustratos, inhibidores y efectores directamente en el rastro de la etiqueta, haga clic en el botón "Agregar evento Mark" e introduzca la correspondiente designación de etiqueta. Haga clic en "Aceptar" para continuar. - Añadir 1 mM adenosina difosfato (ADP). Continúan registrando la tasa de consumo de oxígeno durante 2 minutos.
- Añadir 1 mM NADH. Registro de la tasa de consumo de oxígeno durante 4-8 minutos. Esta tasa es la capacidad de la respiración a través de la citocromo oxidasa.
- Añadir 1 mM cianuro de potasio (KCN) (o 2.5 myxothiazol μm o 5 μm antimycin A) para inhibir la vía de citocromo c y continuar a grabar durante unos 2 minutos observar el consumo de oxígeno a través de la oxidasa alternativa.
- Añadir 5 mM Ditiotreitol (DTT) y piruvato de 10 mM para activar completamente la oxidasa alternativa. Continuar a grabar durante 5-7 min: es la capacidad de la oxidasa alternativa.
- Añadir 500 μm n-propil galato (nPG) y grabación de 2 minutos. Esto evalúa la tasa de consumo de oxígeno residual que no puede ser químicamente inhibido. Reste esta tasa de las otras tasas registradas, ya que no es probable ser mitocondrial en origen. Consumo de oxígeno sigue produciendo después de la inhibición de la citocromo c y camino AOX (por KCN y nPG) es muy probable que venga de peroxidasas presentes como contaminantes en la mitocondria aislada9.
- Haga clic en "Detener grabación".
- Haga clic en el botón "Tabla de tasas de cambio" introduce la tasa de la tabla con un clic derecho en uno de los dos cursores y seleccionar "Añadir a la tabla de tasas". Haga clic en el botón "Agregar" para confirmar para mostrar el índice en la tabla de índice principal.
Nota: Cuando agrega efectores disuelto en solventes orgánicos (por ej., antimicina A, nPG, myxothiazol), la cámara y el émbolo debe ser aclarados con etanol y agua entonces para asegurar la limpieza apropiada.
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Representative Results
Mediante este protocolo, hemos podido detectar diferentes proteínas mitocondriales por SDS-PAGE e immunoblotting. Como se muestra en la Figura 3A, la proteína aislada de tejido de la cultura del agua es suficiente para detectar una banda débil (2 μg). Intensidad de la señal aumenta proporcionalmente a las cantidades cargadas. De las mitocondrias aisladas de tejidos cultivados en placas (figura 3B), la respuesta al estrés de luz alta tratamiento en diferentes genotipos puede ser analizada por inmunodetección con anticuerpos de la oxidasa alternativa.
La integridad de las mitocondrias, actividad de citocromo c vía y vía alternativa puede medirse utilizando muestras mitocondriales recientemente aisladas. La integridad mitocondrial es bien conservada durante el procedimiento de aislamiento descrito (Figura 4A). Agregar diferentes sustratos, inhibidores y efectores a mitocondrias aisladas, consumo de oxígeno a través de la vía de citocromo c y la vía de la oxidasa alternativa está influenciado (Figura 4B).
Figura 1: configuración para la preparación de los gradientes de. Izquierda: Tubos de centrífuga (50 mL) con un ligero ángulo colocan en hielo con PVC tubería peristáltica tomas grabadas en el interior de los tubos; Medio: Bomba peristáltica; Derecho: Vertedor de gradiente sobre un agitador magnético que contiene el gradiente fuerte (cámara interior) y soluciones de gradiente (cámara exterior) de la luz. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: purificación de la mitocondria de Arabidopsis dispara utilizando un continuo gradiente de densidad coloidal de PVP/28% de 4.4% (w/v) 0 -. La banda verde oscurezca es el tilacoides y otras contaminaciones como se indica en la parte superior de las soluciones de gradiente. Fracción mitocondrial apareció como una banda de blanco-verdoso más cerca a la parte inferior del tubo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: separación de proteínas mitocondriales por SDS-PAGE y la inmunodetección con anticuerpos específicos. (A) las mitocondrias aisladas de dos semanas de edad cultivados en agua de thaliana de Arabidopsis salvajes tipo (Columbia-0, Col 0) las plantas fueron sometidas a SDS-PAGE y sondeadas con los anticuerpos contra la subunidad de NADH: ubiquinona oxidorreductasa (S4 Ndufs4, At5g67590). Peso molecular los marcadores sin manchas fueron cargados en el carril externo del gel y del tamaño de diez bandas representativas figuran en el kilo Daltons (kDa). La masa molecular aparente de la proteína Ndufs4 detectada es 18 kDa. Abundancia de proteína se muestra en relación con el valor de 2 μg de proteínas totales. (B) dos semanas de edad plántulas cultivadas en B5 de Gamborg medios con agar sacarosa y 0.8% al 3% (w/v) (w/v) fueron expuestos a 750 µE m-2 s-1 destacar (HL) y cosechadas después de 6 h. mitocondrias fueron purificadas y proteínas mitocondriales fueron separadas por SDS-PAGE y sondeado con los anticuerpos contra la oxidasa alternativa (AOX). Se indica la presencia de una proteína AOX immunodetectable con una masa molecular aparente de 34 kDa. Abundancia de proteína se muestra en relación con el valor de control (2 μg). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Representante rastros de consumo de O2 por aislada planta mitocondrias. (A) las mitocondrias aisladas de plantas de tipo salvaje de Arabidopsis thaliana (Col-0) como se indicó anteriormente se analizaron para la integridad de la membrana externa antes de las mediciones de consumo de oxígeno. Se utilizaron 30 μl de mitocondrias aisladas (μg 150 total proteína mitocondrial). Integridad mitocondrial se determinó como el 90% como se describió anteriormente. Oxígeno (B) las mediciones de consumo se realizaron con 30 μl de aislaron mitocondrias (μg 150 total proteína mitocondrial) de las plantas de tipo salvaje de Arabidopsis thaliana . Se determinan total respiración mitocondrial y la vía AOX. De estos datos, se puede determinar el consumo de oxígeno a través de la vía de citocromo c y camino AOX. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Pulido medio | |
| Producto químico | Concentración |
| Sacarosa | 0,3 M |
| pirofosfato tetrasódico (Na4P2O7 · 10 H2O) | 25 mM |
| Sal disódica de EDTA | 2 mM |
| Fosfato de potasio monobásico (KH2PO4) | 10 mM |
| Polivinilpirrolidona (PVP40) | 1% (p/v) |
| Albúmina de suero bovino (BSA) | 1% (p/v) |
| Agua desionizada | |
| Ajustar el pH a 7.5 (usando ácido clorhídrico) | |
| Nota: para el ascorbato de sodio 1,06 g pulido de medio, de la 300 mL (concentración final: 17,84 mM) y 0,74 g cisteína (concentración final: 20,36 mM) se agregan justo antes de usar. Compruebe el pH después de añadir y ajustar a 7.5 con 1 M NaOH si es necesario. | |
| Tampón de lavado 2 X | |
| Producto químico | Concentración |
| Sacarosa | 0,6 M |
| TES | 20 mM |
| Albúmina de suero bovino (BSA) | 0,2% (p/v) |
| Agua desionizada | |
| Ajustar el pH a 7.5 (con NaOH) | |
| Gradientes de | |
| Solución de gradiente pesada (4.4% (w/v) PVP) | 2 tubos de gradiente |
| Tampón de lavado 2 X | 17,5 mL |
| Gradiente de densidad colloidial | 9,8 mL |
| PVP-40 (20% (p/v)) | 7,7 mL |
| Solución ligera gradiente (0% (w/v) PVP) | 2 tubos de gradiente |
| Tampón de lavado 2 X | 17,5 mL |
| Gradiente de densidad colloidial | 9,8 mL |
| Agua desionizada | 7,7 mL |
Tabla 1: Composición de buffers y degradados que se utiliza para el aislamiento de las mitocondrias.
| Abreviatura | Concentración de las soluciones madre | Almacenamiento de información | Concentración final | Volumen añadido de reacción de 1 ml | |
| Sustratos de | |||||
| Citocromo c | CyT c | 2,5 mM (H2O) | -20 ° C | 25 ΜM | 10 μl |
| NADH | NADH | 0,1 M (H2O) | -20 ° C | 1 mM | 10 μl |
| Succinato de | Succ | 500 mM (H2O) | -20 ° C | 5 mM | 10 μl |
| Inhibidores de la | |||||
| Antimicina A | AA | 1 mM (EtOH) | -20 ° C | 5 ΜM | 5 μl |
| Cianuro de | KCN | 100 mM (H2O) | 4 ° C | 1 mM | 10 μl |
| Myxothiazol | MIXO | 500 μM (en EtOH) | -20 ° C | 2.5 ΜM | 5 μl |
| n-propil galato | nPG | 100 mM (EtOH) | -20 ° C | 500 ΜM | 5 μl |
| Efectores | |||||
| ADP | ADP | 100 mM (H2O) | -20 ° C | 1 mM | 10 μl |
| Ascorbato de | ASC | 500 mM (H2O) | Hacer fresco en el día de uso | 10 mM | 20 μl |
| ATP | ATP | 100 mM (H2O) | -20 ° C | 500 ΜM | 5 μl |
| Dithiotreitol | TDT | 1 M (H2O) | Hacer fresco en el día de uso | 10 mM | 10 μl |
| Piruvato | Pyr | 1 M (H2O) | -20 ° C | 10 mM | 10 μl |
| Detergente | 10% (v/v) (H2O) | 4 ° C | 0,05% (v/v) | 5 μl | |
Tabla 2: Lista de sustratos, inhibidores y efectores utilizados para las mediciones de consumo de oxígeno.
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Discussion
Por lo general, aislamiento de mitocondrias de Arabidopsis deja rendimientos encima de 3 mg de mitocondrias de aproximadamente 80-100 3 - 4 semana - viejas plantas, aunque a menudo se logra rendimientos de más de 5 mg con fondo pulido. El rendimiento varía con condiciones de crecimiento y disminuye dramáticamente como hojas marchitaron, aunque las mitocondrias estructura parece mantenerse bien durante la senescencia9. Una de las características más importantes para obtener un buen rendimiento es el método de molienda para lisar las células para liberar las mitocondrias. Mientras que un número de aparato mecánico molienda están disponible para su compra, para Arabidopsis moler en un mortero y una maja logra consistentemente buenos resultados en términos de rendimiento, como descompone mediante lisis de las células con poco daño a los organelos. Mecánicas amoladoras son rápidos, que requieren optimización y la cantidad de molienda requerido puede variar según el tejido. Con un mortero y maja, es a menudo conveniente y más eficiente si el tejido es cortado o cortado con un cuchillo o tijeras antes de molerlo. Como se indica, todas las medidas que llevará a cabo a 4 ° C y todo el procedimiento desde el final de la molienda para obtener un pellet lavado de mitocondrias purificadas debe tomar aproximadamente 4 horas. Como rastros de detergentes u otros reactivos en tubos o vertedores gradiente pueden disminuir considerablemente el rendimiento, todos los componentes utilizados en estos procedimientos son lavados sin detergente y no usa en otros procedimientos. Finalmente, es importante que las mitocondrias están suficientemente separadas de las otras fracciones en el gradiente para que puedan ser quitados y ser lavado. Si están demasiado cerca de la parte inferior del tubo, significa que la mezcla de las soluciones ligeras y pesadas debe ser regular, para permitir que más de la solución pesada a echar antes de mezclar. Por el contrario, si la banda aparece difusa y es alta en el tubo, mezcla de necesidades que se produzca un poco antes.
El método descrito aquí se puede usar para el aislamiento de las mitocondrias de Arabidopsis flor y raíz tejido11,12. Para las raíces, es conveniente crecer en cultivo hidropónico y necesita 100 g de peso fresco para obtener cantidades de 2 mg de mitocondrias. Para moler las raíces deben cortarse en trozos pequeños antes de moler en un mortero y una maja, y aumento de rendimientos pueden obtenerse por afilar el tejido de la raíz, en un mortero o en una licuadora. Para tejido floral donde la función mitocondrial es a menudo mejorada13, moler con un mortero y Maja funciona bien, pero la cantidad limitada de material significa que una gran cantidad de plantas debe ser cultivada para cosechar el tejido. Las mitocondrias han sido aisladas de una variedad de órganos de Arabidopsis usando métodos similares o ligeras modificaciones14,15 y de arroz (Oryza sativa)16.
Las limitaciones del método descrito son i) la gran cantidad de semillas necesarias para el aislamiento mitocondrial ii) sólo tejidos específicos de Arabidopsis y el arroz en este método de aislamiento, iii) pequeñas cantidades de varios contaminantes (tales como proteínas peroxisomales) todavía existieron en las mitocondrias purificadas. Las mitocondrias obtenidas usando los métodos descritos anteriormente son convenientes para una variedad de estudios, que van desde estudios de absorción de oxígeno para análisis de espectrometría de masas cuantitativa de la abundancia de la proteína. Las mitocondrias purificadas degradadas todavía contiene pequeñas cantidades de diversos contaminantes, tales como proteínas peroxisomal3. Una comparación con las listas de organelas definidas puede usarse para determinar los cambios en las proteínas mitocondriales, como la cantidad de contaminación por proteínas no mitocondriales es pequeña (< 10%) y se comparan las muestras similares, por lo que el tipo y grado de proteínas no mitocondrial es similar. Análisis de la abundancia de proteínas por SDS-PAGE u otros enfoques basados en gel pueden llevarse a cabo con relativamente pequeñas cantidades de mitocondrias (2-20 μg), usando diferentes cantidades de mitocondrias para comprobar la linealidad de la detección de anticuerpos (figura 3). Mientras que porin (voltaje dependiente anión canal (VDAC)) se utiliza a menudo como un control de carga para la cuantificación, en nuestra experiencia la abundancia relativamente grande de esta proteína puede significar que la respuesta no es lineal si se cargan grandes cantidades de proteína en el gel , por lo que siempre debe verificar la linealidad de la respuesta de anticuerpos al utilizar estos controles de carga. La importancia de este enfoque de aislamiento de las mitocondrias es que a diferencia de los gradientes que utilizan sacarosa como el material para formar el gradiente de densidad, gradientes de densidad coloidal no requieren ajuste osmótico de las mitocondrias purificadas como se requiere con sacarosa. Esto significa que hay menos posibilidades de ruptura de las mitocondrias purificadas y después del lavado para retirar el material coloidal de la densidad, puede ser utilizados directamente en una variedad de pruebas o aplicaciones.
Manchas blancas de tejido, donde se detectan proteínas mitocondriales de extractos totales de la hoja o tejido, son un atractivo enfoque para medir la cantidad de proteínas mitocondriales en ese tejido. Dado el volumen generalmente bajo de las mitocondrias en comparación con otros organelos, la detección de la proteína mitocondrial en el tejido todo extractos deben interpretarse con cierta cautela, como proteína mitocondrial puede estar más allá de la detección en estos enfoques. Controles cuidados, donde las mitocondrias purificadas son al junto a extractos de tejido para migración idéntica y linealidad de detección, deben llevarse a cabo para tener confianza en estos enfoques.
Con la ayuda de un electrodo de oxígeno de Clark-tipo, cambios en la presión parcial de oxígeno de una solución pueden ser medidos. El electrodo real consiste en un cátodo de platino y un ánodo de plata, que son conectadas por un puente de KCl y cubierto por un papel empapado en electrolito (papel de fumar) y una membrana permeable al oxígeno (membrana de politetrafluoretileno). Una tensión de 600-700 mV conduce a la reducción de oxígeno, dando una relación lineal entre la concentración de oxígeno y la tensión. Electrodos de oxígeno están disponibles comercialmente de diferentes empresas. Cada empresa tendrá sus propias instrucciones sobre el montaje y la instalación del electrodo de oxígeno. Sin embargo, en general la plata ánodo y el cátodo de platino del disco del electrodo deben limpiarse con la ayuda de un electrodo de limpieza kit o una pluma del borrador antes del montaje. Es importante asegurarse de que no forma burbujas de aire durante el montaje (por ejemplo, entre la membrana de politetrafluoroetileno y el papel de cigarrillo). Después del montaje, el disco del electrodo debe ser conectados a la cámara con el cátodo de platino hacia arriba en la base de la cámara de reacción. La cámara sí mismo está rodeada por una chaqueta de agua asegurando el control de la temperatura. Es muy importante que la cámara siempre queda llena de agua, ya que la membrana se seca y crack lo contrario. Además, la membrana no debe ser tocada por pipetas o jeringas, al agregar compuestos a la cámara, para evitar desgarros.
Antes del ensayo, el medio de la respiración debe ser calentado a la misma temperatura que la cámara de ensayo (en la mayoría de los casos 25 ° C) y la membrana se debe equilibrar en tampón de respiración durante unos minutos. Después de ensayos de cierre el émbolo para el consumo de oxígeno, la adición de moléculas efectoras debe realizarse utilizando jeringas no desechables microlitro (por ejemplo micro jeringas) o gel desechable, puntas de pipeta de carga. Si utiliza jeringas micro, tiene que asegurarse de que la jeringa se enjuaga bien con 100% de etanol y agua entre adiciones, para evitar contaminar soluciones. Esto se aplica también para el lavado de la cámara entre mediciones. Los reactivos más utilizados en los análisis de consumo de oxígeno son solubles en agua y pueden extraerse fácilmente múltiples enjuagándose con agua (aproximadamente cinco veces) entre las mediciones. Sin embargo, algunos productos químicos utilizados para los ensayos sólo son solubles en nPG, myxothiazol y solventes orgánicos, como la antimicina A. Por lo tanto, la cámara debe enjuagarse con un disolvente orgánico (etanol al 50% (v/v)) entre ensayos para eliminar residuos de estas moléculas y luego con agua (aproximadamente 5 veces) para agotar los residuos.
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Disclosures
Los autores no declaran conflicto de intereses.
Acknowledgments
Este estudio fue apoyado por un australiano Consejo centro de excelencia en la investigación en planta de energía CE140100008 de biología, un australiano Consejo futuro beca de investigación (FT130100112) y MWM, una beca de investigación de Feodor Lynen (Alexander von Humboldt Fundación, Alemania) a JS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ADP | Sigma-Aldrich | A2754 | Chemical |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | Chemical, dissolve in ethanol |
| AOX antibody | from Tom Elthon | Elthon et al., 1989 | |
| Ascorbate | Sigma-Aldrich | A0157 | Ascorbate Oxidase from Cucurbita sp. |
| ATP | Sigma-Aldrich | A26209 | Chemical |
| Bovine serum albumin (BSA) | Bovogen | BSAS 1.0 | Chemical |
| Clarity western ECL substrate | Bio-Rad Laboratories | 1705061 | Chemical |
| Criterion Stain-Free Precast Gels 8-16% 18 Wells | Bio-Rad Laboratories | 5678104 | Chemical |
| Cyanide | Sigma-Aldrich | 60178 | Chemical |
| Cytochrome c | Sigma-Aldrich | C3131 | Chemical |
| Difco Agar, granulated | BD Biosciences | 214530 | Chemical |
| Dithiotreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | Chemical |
| EDTA disodium salt | Sigma-Aldrich | E5134 | Chemical |
| Gamborg B-5 Basal Medium | Austratec | G398-100L | Chemical |
| Gamborg Vitamin Solution (1000x) | Austratec | G219-100ML | Chemical |
| Goat Anti-Mouse IgG (H + L)-HRP Conjugate | Bio-Rad Laboratories | 1706516-2ml | Chemical |
| Goat Anti-Rabbit IgG (H + L)-HRP Conjugate | Bio-Rad Laboratories | 1706515-2ml | Chemical |
| L-Cysteine | Sigma | C7352-100G | Chemical |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 230391 | Chemical |
| Murashige & Skoog Basal Salt Mixture (MS) | Austratec | M524-100L | Chemical |
| Myxothiazol | Sigma-Aldrich | T5580 | Chemical, dissolve in ethanol |
| NADH | Sigma-Aldrich | N8129 | Chemical |
| Ndufs4 antibody | from Etienne Meyer | Meyer et al., 2009 | |
| n-Propyl gallate | Sigma-Aldrich | P3130 | Chemical, dissolve in ethanol |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | Chemical, colloidal density gradient |
| Polyvinylpyrrolidone (PVP40) | Sigma-Aldrich | PVP40 | Chemical |
| Potassium cyanide | Sigma-Aldrich | 60178 | Chemical |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | Chemical |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | Chemical |
| Sodium chloride | Chem-Supply | SA046 | Chemical |
| Sodium dithionite | Sigma-Aldrich | 157953 | Chemical |
| Sodium L-ascorbate | Sigma | A4034-100G | Chemical |
| Succinate | Sigma-Aldrich | S2378 | Chemical |
| Sucrose | Chem-Supply | SA030 | Chemical |
| TES | Sigma-Aldrich | T1375 | Chemical |
| Tetrasodium pyrophosphate (Na4P2O7 · 10H2O) | Sigma-Aldrich | 221368 | Chemical |
| Trans-Blot Turbo RTA Midi Nitrocellulose Transfer Kit | Bio-Rad Laboratories | 1704271 | Chemical |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | X100 | Chemical, detergent |
| Western Blocking Reagent | Sigma | 11921681001 | Chemical |
| Balance | Mettler Toledo | XS204 | Equipment |
| Beakers | Isolab | 50 mL | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-26XP | Equipment |
| Centrifuge tubes | Nalgene | 3117-9500 | Equipment |
| Circulator | Julabo | 1124971 | Attached to oxygen electrode chamber |
| Conical flask | Isolab | 500 mL | |
| Dropper | 3 mL | ||
| Fixed angle rotor | Beckman Coulter | JA25.5 | Equipment |
| Funnel | Per Alimenti | 14 cm | For filtering |
| Gradient pourer | Bio-Rad | 165-4120 | For preparation of gradients |
| Magnetic Stirrer ATE | VELP Scientifica | F20300165 | Equipment |
| Miracloth | VWR | EM475855-1R | Filtration material |
| Mortar and pestle | Jamie Oliver | Granite, 6 Inch | Equipment |
| O2view | Hansatech Instruments | Oxygen monitoring software | |
| Oxygraph Plus System | Hansatech Instruments | 1187253 | Clark-type oxygen electrode |
| Paintbrush | Artist first choice | 1008R-12 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | plastic paraffin film |
| Peristaltic pump | Gilson | F155001 | For preparation of gradients |
| PVC peristaltic tubing | Gilson | F117930 | For preparation of gradients |
| Water bath | VELP Scientifica | OCB | Equipment |
References
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