Summary
Come i mitocondri sono solo una piccola percentuale della cellula vegetale, hanno bisogno di essere purificato per una serie di studi. I mitocondri possono essere isolati da una varietà di organi vegetali di omogeneizzazione, seguita da centrifugazione in gradiente di differenziale e densità per ottenere una frazione altamente purificata mitocondriale.
Abstract
I mitocondri sono organelli essenziali coinvolto in numerose vie metaboliche in piante, in particolare la produzione di adenosina trifosfato (ATP) dall'ossidazione di composti ridotti come nicotinamide adenindinucleotide (NADH) e la flavin adenina dinucleotide (FADH2). L'annotazione completa del genoma di Arabidopsis thaliana ha stabilito come il più diffuso sistema pianta modello, e così la necessità di purificare i mitocondri da una varietà di organi (foglia, radice o fiore) è necessaria per utilizzare pienamente gli strumenti che sono ora disponibili per Arabidopsis studiare biologia mitocondriale. I mitocondri sono isolati di omogeneizzazione del tessuto utilizzando una varietà di approcci, seguita da una serie di passaggi di centrifugazione differenziale producendo un pellet mitocondriale grezza che viene ulteriormente purificato mediante gradiente di densità colloidale continuo centrifugazione. Il materiale di densità colloidale viene successivamente rimosso da più passaggi di centrifugazione. A partire da 100 g di tessuto fogliare fresco, 2-3 mg di mitocondri possono essere ottenuti ordinariamente. Respiratori esperimenti su questi mitocondri visualizzare i tassi tipici di 100-250 nmol O2 min-1 mg proteina mitocondriale totale-1 (tasso di NADH-dipendente) con la possibilità di utilizzare vari substrati e inibitori per determinare quali substrati sono sono ossidati e la capacità delle alternative e citocromo ossidasi terminale. Questo protocollo descrive un metodo di isolamento dei mitocondri da foglie di Arabidopsis thaliana usare gradienti di densità colloidale continuo e un'efficiente misure respiratoria dei mitocondri pianta purificata.
Introduction
La storia della ricerca mitocondriale pianta ripercorre 100 anni1. I mitocondri intatti in primo luogo sono stati isolati all'inizio del 1950 mediante centrifugazione differenziale. L'avvento di un gradiente di densità colloidale nel 1980 ha permesso i mitocondri per essere purificata senza subire regolazione osmotica. Mentre gradienti mitocondri purificati sono adatti per la maggior parte degli scopi, a causa della sensibilità della spettrometria di massa, contaminanti anche relativamente minore possono essere rilevati e possono essere assegnati in modo inappropriato un mitocondriale posizione2. L'uso del libero flusso elettroforesi può rimuovere entrambi plastidic e peroxisome contaminazione3, ma il libero fluire l'elettroforesi è una tecnica altamente specializzata e non è richiesto per la stragrande maggioranza degli studi. Inoltre, si verifica quando determinazione della posizione di una proteina che deve essere ricordato che dual o targeting più delle proteine nelle cellule. Oltre 100 proteine mirate dual sono descritti per cloroplasti/plastidi e mitocondri4e un numero di proteine mirati ai mitocondri e peroxisomes sono noti anche5. Inoltre, la ri-localizzazione delle proteine sotto stimoli specifici, ad es. stress ossidativo, è un tema emergente nella cellula biologia6. Così, la posizione di proteine deve essere considerato nel contesto della biologia ha studiato, e una varietà di approcci sono utilizzati per determinare e verificare la posizione2.
I mitocondri sono in genere isolati dai tessuti vegetali di omogeneizzazione, è necessario un equilibrio tra rottura aprire la parete cellulare per rilasciare i mitocondri e non danneggiare i mitocondri. Tradizionalmente, con patate e cavolfiori, omogeneizzazione comporta l'uso di apparecchi domestici frullatore/spremiagrumi per rendere un estratto liquido in un buffer con vari componenti per mantenere attività. Isolamento dei mitocondri dalle foglie di pisello, (un materiale popolare per isolamento mitocondriale utilizzando giovani semenzali (~ 10 giorni), utilizza un frullatore per lisare le cellule come il materiale di foglia è morbido. Con la disponibilità di linee di knock-out inserzionali Arabidopsis thaliana T-DNA, la necessità di essere in grado di purificare i mitocondri per svolgere studi funzionali ha reso necessario lo sviluppo di metodi per isolare i mitocondri da foglia, radice o fiore tessuto. Nel complesso i metodi sviluppati per altre piante funzionato ben7, con il perquisite macinazione del materiale necessario per essere ottimizzato. Per Arabidopsis questo può essere realizzato in una varietà di modi (Vedi sotto) e differisce tra tipi di tessuto (radice contro sparare). L'uso del gradiente continuo può essere ottimizzata anche che la densità dei mitocondri da diversi organi o stadi di sviluppo significa che essi possono migrare in modo diverso. Così, per la massima separazione la densità della sfumatura può essere raffinata per garantire per ottenere una migliore separazione.
Una volta purificato i mitocondri possono essere utilizzati per una varietà di studi, compresi gli esperimenti di assorbimento proteico e tRNA, analisi di attività dell'enzima, catena respiratoria misurazioni e analisi western blot. Mitocondri isolati possono anche essere utilizzati per analisi di spettrometria di massa dell'abbondanza di proteine. Reazione più monitoraggio analisi (MRM) consente per la quantificazione della definite proteine, ma richiedono sviluppo di significative analisi mirate. Al contrario, quantificazione di dimetil o altro isotopo etichette8, fornisce un approccio di scoperta nell'identificare le differenze attraverso l'intero proteoma che può essere utilizzato per scoprire nuove conoscenze biologiche.
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Protocol
Questo protocollo viene utilizzato per l'isolamento dei mitocondri intatti da organi di Arabidopsis thaliana coltivati su terreno con pendenze di densità colloidale continuo. La raccolta del materiale di seguito tutte le procedure sono effettuate a 4 ° C.
1. preparazione di macinatura media, lavare, soluzioni tampone e gradienti
- Preparare 300 mL di macinazione medio (meno ascorbato e cisteina) e 200 mL di tampone di lavaggio x 2 per ogni tabella 1 un giorno prima l'isolamento, tenerli freddo a 4 ° C.
Nota: Aggiungere ascorbato di sodio e la L-cisteina (base libera) a una concentrazione finale di 17,84 e 20,36 mM, rispettivamente, al mezzo di macinazione la mattina dell'isolamento. Se i mitocondri sono da utilizzarsi per la macchia occidentale o blu nativo-poliacrilammide gel analisi elettroforesi (BN-PAGE), compongono il tampone di lavaggio senza BSA: 2x. - Preparare le sfumature sulla mattina di isolamento mitocondriale (Figura 1 e tabella 1).
- Rendere le soluzioni sfumature leggera e pesante in due bicchieri; 35 mL di ciascuno è sufficiente per due tubi di gradiente.
- Lavare gli alloggiamenti del gradiente versatore e tubazione peristaltica del PVC con acqua deionizzata e garantire anche il flusso attraverso la tubazione da tutta la tubazione.
- Posto 2 provette da centrifuga (50 mL) con una leggera angolazione su ghiaccio con le prese di tubazione peristaltica PVC nastro adesivo all'interno dei tubi per garantire che la soluzione gradiente corre lungo il lato dei tubi.
- Chiudere la connessione tra le camere interne ed esterne (leva nera verso il basso). Versatore gradiente posto su un agitatore magnetico con una piccola ancoretta nella camera interna.
- Versare la soluzione di sfumatura pesante 35 mL nella camera interna (sezione con presa di tubatura). Dispensare la soluzione di sfumatura pesante nelle provette due centrifuga posizionate su ghiaccio fino a metà rimanente con il tasso di pompa peristaltica impostato su veloce (300 mL/h).
- Versare la soluzione di gradienti luce 35 mL nella camera esterna (camera senza presa di tubatura). Aprire la connessione tra le camere (leva di Spinta nero fino a metà) e consentono soluzioni di mescolare delicatamente. Mescolare le soluzioni con l'agitatore magnetico.
- Consentire le soluzioni eseguire lentamente (60 mL/h) fino a quando tutto il mix di gradiente è stata erogata dalle camere due con conseguente 0 - 4,4% (p/v) polivinilpirrolidone (PVP) sfumatura tubi. Mantenere le pendenze su ghiaccio fino al momento di utilizzare nel passo 2.12.
Nota: Una volta che il gradiente è stato preparato, diluire 2 x lavaggio medio a 1x con acqua deionizzata a prechilled e mantenere fredda a 4 ° C.
2. omogeneizzazione e isolamento mitocondriale
- Tagliare il tessuto intero Rosetta da 4 - settimana-vecchi piante di Arabidopsis coltivate sul suolo con le forbici, almeno 80 impianti sarà richiesti per 1 prep.
Nota: 10-14 giorno vecchio acqua culture, minimo 5 pentole/prep, o 2 - settimana-vecchi piantine coltivate su piastre di agar di Murashige e Skoog basale miscela sale (MS), minimi di 4 piatti, possono anche essere utilizzati. - Mettere la metà del materiale vegetale che è stato tagliato in piccoli pezzi in un pre-raffreddata 4C ° grande mortaio e pestello con 75 mL di smeriglio (tabella 1) e macinare estesamente per alcuni minuti fino a quando non sono lasciati senza grossi pezzi di tessuto.
- Pre-bagnato 4 strati di materiale di filtrazione (dimensione dei pori di 22-25 µm) con macinatura media e filtrare omogeneato attraverso i 4 strati di materiale di filtrazione attraverso un imbuto di plastica in una beuta da 500 mL.
- Macinare la restante metà del tessuto con un altro 75 mL di mezzo di macinazione.
- Combinare gli omogeneati dei materiali di filtrazione e filtrare quanto più possibile omogeneato attraverso.
- Macinare il tessuto restante restante sul materiale di filtrazione nuovamente con i restanti 150 mL di macinatura media, filtro nuovamente nella beuta da 500 mL.
- Centrifugare l'omogenato filtrata in 8 provette da centrifuga plastica pre-refrigerati 50 mL a 2.500 x g a 4 ° C in un rotore ad angolo fisso per 5 min.
- Versare il supernatante in provette da centrifuga pulita (50 mL; evitare di disturbare la pastiglia verde) e centrifugare a 17.500 x g a 4 ° C per 20 min in un rotore ad angolo fisso.
- Eliminare tutti, ma < 3 mL di surnatante dall'aspirazione (o versare delicatamente senza disturbare il pellet). Risospendere delicatamente nel surnatante residuo utilizzando un piccolo pennello fine.
- Aggiungere 10 mL di tampone di lavaggio 1X in ogni provetta e combinare 4 tubi in provetta pulita 1 (cioè, con conseguente 2 tubi).
- Riempire questi tubi con tampone di lavaggio 1X a 50 mL e ripetere i passaggi 2,7-2,9.
- Piscina pellet mitocondriale grezza in 1 tubo con un contagocce e disperdere uniformemente con il pennello fine (una piccola quantità di tampone di lavaggio possono essere utilizzate ma il volume finale deve essere meno di 3 mL per adattarsi sopra il gradiente). Delicatamente strato la sospensione mitocondriale con un contagocce sui 2 gradienti PVP di continuo 0 - 4,4% (p/v).
- Tubi in equilibrio di peso (con tampone di lavaggio 1X) e centrifugare a 40.000 x g a 4 ° C per 40 min. Accertarsi che la rottura è disattivata. I mitocondri migreranno a una banda nella parte inferiore del tubo, o possono essere presenti nella soluzione pesante nella parte inferiore del tubo (identificato da una banda di schiarita, giallastra; Figura 2).
- Rimuovere con cautela la parte superiore 5 cm della soluzione sopra la banda di mitocondriale dall'aspirazione.
- Distribuire la soluzione rimanente contenente i mitocondri in 2 provette pulite e riempire con tampone di lavaggio 1X. Distribuire uniformemente il gradiente di densità colloidale e mitocondri che copre la bocca del tubo con una pellicola di plastica paraffina ed invertendo più volte. Centrifuga per 15 min a 31.000 x g a 4 ° C con frenata lenta.
Nota: Prima di centrifugazione, assicurarsi che i mitocondri e il gradiente di densità colloidale rimanenti sono distribuiti uniformemente. In caso contrario, il gradiente di densità colloidale può concentrarsi nella parte inferiore del tubo e prevenire d'appallottolamento dei mitocondri. - Eliminare il surnatante tramite aspirazione, riempire il tubo con lavaggio 1X buffer fino a 50 mL e invertire nuovamente per garantire la miscelazione. Centrifuga per 15 min a 31.000 x g a 4 ° C con frenata lenta.
- Aspirare il supernatante e raccogliere i pellet mitocondriali in come piccolo un volume (~ 500 µ l) possibile utilizzando una pipetta iclusi modificate 200 µ l (tagliare la punta un po' sopra alla fine per aumentare la sua apertura). Disporre i mitocondri in una provetta da 1,5 mL e tenere il ghiaccio per uso immediato o conservare a-80 ° C.
Nota: Se i mitocondri verranno utilizzati per elettroforesi del gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide (SDS-PAGE), BN-PAGE o analisi di immunoblot, utilizzano lavaggio 1X senza BSA per i lavaggi finali (cioè, passo 2.15 e 2.16). - Determinare la concentrazione di proteine dei mitocondri mediante il metodo di Bradford.
Nota: Per le aliquote di centrifuga BN-PAGE a 4 ° C e negozio di pellet a-80 ° C fino all'utilizzo. Per misure del consumo di ossigeno, possono essere utilizzati soli mitocondri di recente isolati.
3. misure del consumo di ossigeno
Nota: Consumo di ossigeno da appena isolato pianta i mitocondri possono essere analizzati con un elettrodo di Clark-tipo ossigeno, permettendo la determinazione della integrità mitocondriale, attività di via del citocromo c e l'attività della via alternativa.
- Installazione del software
- Installare con licenza ossigeno monitoraggio software sul computer utilizzato per misure del consumo di ossigeno.
- Preparazione del mezzo di respirazione, substrati, soluzioni chimiche stock e l'elettrodo di Clark-tipo ossigeno
- Preparare il supporto di respirazione (300mm saccarosio, 10 millimetri di NaCl, 5 mM KH2PO4, 2mm MgSO4, 0,1% (p/v) albumina di siero bovino (BSA), 10 mM TES (pH 7,2)) usato per i test di consumo di ossigeno.
- Preparazione di substrati, inibitori e gli effettori utilizzati per misurare la respirazione mitocondriale (tabella 2). Questi può essere preparati in precedenza e conservati a-20 ° C.
Nota: Neutralizzare il pH di soluzioni acide quali acidi organici a pH 7.0 usando NaOH prima dell'uso. - Riscaldare il mezzo di respirazione alla stessa temperatura come la camera di dosaggio (25 ° C).
- Assemblare l'elettrodo di Clark-tipo ossigeno come descritto nel protocollo del produttore.
- Posizionare 1 mL aria satura d'acqua (acqua aria satura è ottenuta agitando vigorosamente una piccola quantità di acqua deionizzata in una beuta da grande) nella camera di misurazione. Per accendere l'agitatore, fare clic sul pulsante "Velocità dell'agitatore". Fare clic sul pulsante "On" e impostare la velocità dell'agitatore a 65 giri/min. Fare clic su "OK" per continuare. Mescolare continuamente l'acqua a 25 ° C.
- Calibrazione dell'elettrodo di ossigeno
- Riscaldare l'acqua che verrà utilizzato per la taratura alla stessa temperatura come la camera di dosaggio (25 ° C).
- Attendere che la corrente stabilizzare e calibrare l'elettrodo di ossigeno.
- Per avviare la calibrazione dell'elettrodo ossigeno, fare clic sul pulsante "Calibra", selezionare "Calibrazione di fase liquida", quindi "Aria saturi acqua."
- Una nuova finestra si aprirà (ossigeno calibrazione (fase liquida) - passaggio 1 di 5). Selezionare il canale da calibrare (il canale che la casella di controllo dell'elettrodo è collegata a) e immettere le variabili (set "Temperatura della camera" a 25 ° C e "Pressione atmosferica" a 101.32 kPa). Fare clic su "OK" per continuare.
- Nel prossimo passo (passo 2 di 5), imposta la velocità dell'agitatore (65 giri) e fare clic su "OK" per continuare.
- Nel passaggio 3 di 5, attendere il segnale a raggiungere un plateau. Il termine "Plateau raggiunto, premere OK per continuare" verrà visualizzato nella casella. Fare clic su "OK" per continuare.
- Nel passaggio 4 di 5, stabilire zero ossigeno nella camera aggiungendo Ditionito di sodio 5 mg. Fare clic su "OK" per continuare.
Nota: Un calo di concentrazione di ossigeno dovrebbe essere visibile nella traccia e dovrebbe raggiungere 0. - Nell'ultimo passaggio di calibrazione (passaggio 5 di 5), attendere il segnale a raggiungere un plateau. Il termine "Plateau raggiunto, premere OK per continuare" verrà visualizzato nella casella. Fare clic su "OK" per continuare.
- Fare clic su "Salvare la calibrazione" per salvare la calibrazione. Si aprirà una nuova finestra. Fare clic su "OK" per confermare per salvare la nuova taratura per la casella di controllo di ossigeno.
Nota: Dopo la calibrazione di successo, l'etichettatura "ossigeno (nmol/mL)" verrà visualizzato sull'asse y. - Dopo la calibrazione, è necessario pulire la camera di misurazione risciacquando la camera con acqua (almeno 5 - 10 volte) per garantire una corretta pulizia. Posizionare 1 mL di terreno di respirazione in misura dell'alloggiamento e consentire la membrana equilibrare per pochi minuti fino a quando la traccia del consumo di ossigeno è lineare.
- Adattare la scala della traccia del consumo di ossigeno per ottenere una vista di buona pendenza. Fare clic su "Zoom XY" e immettere le variabili ("Ossigeno" impostato su 0 - 300 e il "asse di tempo" a 0 - 45 min).
- Determinazione dell'integrità mitocondriale
- Con stantuffo aperto, aggiungere 970 µ l di terreno di respirazione di aria satura della camera di reazione.
- Aggiungere 30 µ l isolato mitocondri o 150 µ g di proteina mitocondriale totale come determinato dopo isolamento mitocondri (proteine totali deve essere incluso nei calcoli in seguito) alla camera di reazione usando una pipetta con una punta di taglio.
- Mescolare la sospensione mitocondriale continuamente con un agitatore magnetico bar (65 giri) a 25 ° C di aria-saturare la soluzione.
- Tenuta la camera con lo stantuffo, fare clic su "Start Recording" per registrare il consumo di ossigeno e consentire la traccia del consumo di ossigeno stabilizzare (1-2 min).
- Determinare il tasso di consumo di ossigeno manualmente dopo l'aggiunta di ascorbato di 10 mM e 25 µM citocromo c per 5 min ottenere la tariffa "prima di detersivo".
Nota: Per identificare l'aggiunta di substrati, inibitori e gli effettori direttamente nella traccia, fare clic sul pulsante "Aggiungi evento Mark" e inserite la denominazione di etichetta corrispondente. Fare clic su "OK" per continuare. - Determinare il tasso di consumo di ossigeno manualmente per 3 min dopo l'aggiunta di detersivo di 0,05% (v/v) per dare la tariffa "dopo detersivo". Scegliere "Interrompi registrazione".
- Fare clic sul pulsante "Tabella dei tassi di cambiamento". 2 cursori verranno visualizzati come linee verticali sullo schermo grafico. Fare clic e trascinare la coppia di cursori di tasso per le posizioni richieste nella traccia per definire l'intervallo di frequenza. Spostare l'intervallo di frequenza lungo l'analisi utilizzando il cursore di sinistra tasso. Impostare l'intervallo di frequenza se stessa utilizzando il cursore di destra tasso. L'ossigeno automaticamente il software di monitoraggio consente di disegnare una retta di regressione tra i due cursori spostando i cursori di intervallo di velocità lungo la traccia.
- Una volta che è stato definito l'intervallo di frequenza desiderato e la posizione, immettere il tasso nella tabella con un clic destro su 1 i 2 cursori e selezionare "Aggiungi tasso al tavolo." Fare clic sul pulsante "Aggiungi" per confermare per visualizzare il tasso sul tavolo principale tasso.
- Calcolare l'integrità mitocondriale dividendo la tariffa "prima di detersivo" per il "dopo detersivo" tasso, espresso in percentuale e sottrarre 100.
- Determinazione della respirazione mitocondriale
- Con stantuffo aperto, aggiungere 970 µ l di terreno di respirazione di aria satura della camera di reazione. Aggiungere 500 µM ATP e 30 µ l isolato mitocondri o 150 µ g di proteina mitocondriale totale utilizzando una pipetta con una punta di taglio per il mezzo di respirazione nella camera di reazione.
- Mescolare la sospensione mitocondriale continuamente con un agitatore magnetico bar (65 giri) a 25 ° C.
- Chiudere lo stantuffo, fare clic su "Start Recording" per registrare il consumo di ossigeno ed attendere 1-2 min per tasso di consumo di ossigeno stabilizzare (quando la traccia di consumo di ossigeno è lineare). Aggiungere succinato di 5 mM. Registrare il tasso di consumo di ossigeno per circa 2 min.
Nota: Per identificare l'aggiunta di substrati, inibitori e gli effettori direttamente nella traccia, fare clic sul pulsante "Aggiungi evento Mark" e inserite la denominazione di etichetta corrispondente. Fare clic su "OK" per continuare. - Aggiungere 1 mM dell'adenosina difosfato (ADP). Continuare a registrare il tasso di consumo di ossigeno per 2 min.
- Aggiungere 1 mM NADH. Registrare il tasso di consumo di ossigeno per 4-8 min. Questa tariffa è la capacità di respirazione tramite citocromo ossidasi.
- Aggiungere 1 mM cianuro di potassio (KCN) (o 2,5 µM myxothiazol o 5 µM antimycin A) per inibire il citocromo c via e continuare a registrare per circa 2 min osservare il consumo di ossigeno tramite le ossidasi alternativa.
- Aggiungere 5 mM dithiothreitol (DTT) e piruvato di 10 mM per attivare completamente l'ossidasi alternativa. Continuare a registrare per 5-7 min: questa è la capacità dell'ossidasi alternativa.
- Aggiungere 500 µM n-propyl gallate (nPG) e registrare per 2 min. Questo valuta Tasso di consumo di ossigeno residuo che non può essere inibita chimicamente. Sottrarre questo tasso dai altri tassi registrati, come non è probabile essere mitocondriale in origine. Consumo di ossigeno ancora in corso dopo inibizione del citocromo c e via di AOX (di KCN e nPG) è molto probabile che provengono da perossidasi presenti come contaminanti nei mitocondri isolati9.
- Scegliere "Interrompi registrazione".
- Fare clic sul pulsante "Tabella tariffe di cambiamento" e immettere il tasso nella tabella con un clic destro su uno dei due cursori e selezionare "Aggiungi tasso di tabella". Fare clic sul pulsante "Aggiungi" per confermare per visualizzare il tasso sul tavolo principale tasso.
Nota: Quando l'aggiunta di effettori dissolte in solventi organici (ad es., Antimicina A, nPG, myxothiazol), la camera e il pistone deve essere risciacquati con etanolo e poi l'acqua per garantire una corretta pulizia.
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Representative Results
Usando questo protocollo, siamo stati in grado di rilevare diverse proteine mitocondriali di SDS-PAGE e immunoblotting. Come mostrato in Figura 3A, la proteina isolata dal tessuto di coltura di acqua è sufficiente per rilevare una debole banda (2 µ g). L'intensità del segnale aumenta in proporzione agli importi caricati. Per i mitocondri isolati dai tessuti coltivati sulle piastre (Figura 3B), la risposta allo stress di luce alta trattamento in diversi genotipi può essere analizzato da immunodetection con gli anticorpi ossidasi alternativa.
L'integrità dei mitocondri, attività di via del citocromo c e via alternativa può essere misurato utilizzando campioni di recente isolati mitocondriali. L'integrità mitocondriale è ben conservato durante la procedura di isolamento descritto (Figura 4A). L'aggiunta di diversi substrati, inibitori e gli effettori di mitocondri isolati, consumo di ossigeno attraverso il citocromo c pathway e ossidasi alternativa pathway è influenzato (Figura 4B).
Figura 1: programma di installazione per la preparazione dei gradienti. A sinistra: Provette per centrifuga (50 mL) con una leggera angolazione posti su ghiaccio con PVC tubo peristaltico Outlet registrato all'interno dei tubi; Medio: Pompa peristaltica; Destra: Versatore gradiente sulla cima di un agitatore magnetico contenente la sfumatura pesante (camera interna) e soluzioni di luce sfumatura (alloggiamento esterno). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: purificazione dei mitocondri da Arabidopsis spara utilizzando un continuo 0 - gradiente di densità colloidale PVP/28% di 4,4% (p/v). La banda verde scura è il tilacoidi e altre contaminazioni, come indicato nella parte superiore delle soluzioni gradiente. Frazione mitocondriale è apparso come una banda bianco-verdastro più vicino alla parte inferiore del tubo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: separazione delle proteine mitocondriali di SDS-PAGE e immunorivelazione utilizzando anticorpi specifici. (A) i mitocondri isolati dai due-settimana-vecchio acqua-coltivati Arabidopsis thaliana selvatici digitare (Columbia-0, Col-0) piante erano sottoposti a SDS-PAGE e sondati con anticorpi contro la subunità di NADH: ubiquinone ossidoreduttasi (S4 Ndufs4, At5g67590). Peso molecolare non macchiati marcatori sono stati caricati sulla corsia esterna del gel e la dimensione di dieci bande di rappresentante sono indicati in chilo Dalton (kDa). L'apparente massa molecolare della proteina Ndufs4 rilevata è 18 kDa. Abbondanza di proteina è mostrato rispetto al valore di 2 µ g di proteina totale. (B) due-settimana-vecchio piantine coltivate su B5 di Gamborg media con 3% (p/v) agar saccarosio e dello 0,8% (p/v) sono stati esposti a 750 µE m-2 s-1 evidenziare (HL) e raccolte dopo 6 h. i mitocondri sono stati purificati e le proteine mitocondriali sono stati separate da SDS-PAGE e sondato con anticorpi contro ossidasi alternativa (AOX). La presenza di una proteina AOX immunodetectable con una massa molecolare evidente di 34 kDa è indicata. Abbondanza di proteina è mostrato rispetto al valore del controllo (2 µ g). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Rappresentante tracce di consumo di O2 di isolato pianta mitocondri. (A) i mitocondri isolati da piante di Arabidopsis thaliana selvaggio-tipo (Col-0), come indicato in precedenza sono stati analizzati per l'integrità della membrana esterna prima di misure del consumo di ossigeno. 30 µ l di mitocondri isolati (150 µ g totale proteina mitocondriale) sono stati usati. L'integrità mitocondriale è stata determinata come 90% come descritto sopra. Ossigeno (B) consumo sono state effettuate utilizzando 30 µ l di isolato mitocondri (150 µ g totale proteina mitocondriale) da piante di Arabidopsis thaliana selvaggio-tipo. Totale respirazione mitocondriale e della via AOX sono stati determinati. Da questi dati, consumo di ossigeno attraverso il citocromo c pathway e AOX pathway può essere determinato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Rettifica Media | |
| Prodotto chimico | Concentrazione |
| Saccarosio | 0,3 M |
| pirofosfato di tetrasodio (Na4P2O7 · 10 H2O) | 25 mM |
| Sale disodico EDTA | 2 mM |
| Potassio fosfato monobasico (KH2PO4) | 10 mM |
| Polivinilpirrolidone (PVP40) | 1% (p/v) |
| Albumina di siero bovino (BSA) | 1% (p/v) |
| Acqua deionizzata | |
| Aggiustare il pH a 7,5 (usando HCl) | |
| Nota: per macinatura media, ascorbato di sodio 1,06 g 300 mL (concentrazione finale: 17,84 mM) e 0,74 g cisteina (concentrazione finale: 20,36 mM) vengono aggiunti solo prima dell'uso. Controllare il pH dopo l'aggiunta e regolare a 7.5 con 1 M NaOH se necessario. | |
| Tampone di lavaggio di 2 X | |
| Prodotto chimico | Concentrazione |
| Saccarosio | 0,6 M |
| TES | 20 mM |
| Albumina di siero bovino (BSA) | 0,2% (w/v) |
| Acqua deionizzata | |
| Aggiustare il pH a 7,5 (usando NaOH) | |
| Gradienti | |
| Soluzione di sfumatura pesante (4,4% (p/v) PVP) | 2 tubi di gradiente |
| Tampone di lavaggio di 2 X | 17,5 mL |
| Gradiente di densità colloidial | 9,8 mL |
| PVP-40 (20% (p/v)) | 7,7 mL |
| Soluzione leggera sfumatura (0% (p/v) PVP) | 2 tubi di gradiente |
| Tampone di lavaggio di 2 X | 17,5 mL |
| Gradiente di densità colloidial | 9,8 mL |
| Acqua deionizzata | 7,7 mL |
Tabella 1: Composizione del buffer e le sfumature utilizzate per l'isolamento dei mitocondri.
| Abbreviazione | Concentrazione delle soluzioni di riserva | Deposito | Concentrazione finale | Volume aggiunto per reazione di 1 ml | |
| Substrati | |||||
| Citocromo c | Cyt c | 2,5 mM (in H2O) | -20 ° C | 25 ΜM | 10 μl |
| NADH | NADH | 0.1 M (in H2O) | -20 ° C | 1 mM | 10 μl |
| Succinato | Succ | 500 mM (in H2O) | -20 ° C | 5 mM | 10 μl |
| Inibitori | |||||
| Antimycin A | AA | 1 mM (in EtOH) | -20 ° C | 5 ΜM. | 5 μl |
| Cianuro | KCN | 100 mM (in H2O) | 4 ° C | 1 mM | 10 μl |
| Myxothiazol | Myxo | 500 μM (in EtOH) | -20 ° C | 2,5 ΜM | 5 μl |
| n-Propyl gallate | nPG | 100 mM (in EtOH) | -20 ° C | 500 ΜM | 5 μl |
| Effettori | |||||
| ADP | ADP | 100 mM (in H2O) | -20 ° C | 1 mM | 10 μl |
| Ascorbato | ASC | 500 mM (in H2O) | Fanno fresco il giorno di utilizzo | 10 mM | 20 μl |
| ATP | ATP | 100 mM (in H2O) | -20 ° C | 500 ΜM | 5 μl |
| Ditiotreitolo | DTT | 1 M (in H2O) | Fanno fresco il giorno di utilizzo | 10 mM | 10 μl |
| Piruvato | Pyr | 1 M (in H2O) | -20 ° C | 10 mM | 10 μl |
| Detergente | 10% (v/v) (in H2O) | 4 ° C | 0,05% (v/v) | 5 μl | |
Tabella 2: Elenco dei substrati, inibitori e gli effettori utilizzati per misure del consumo di ossigeno.
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Discussion
In genere, isolamento dei mitocondri da Arabidopsis lascia rendimenti a 3 mg di mitocondri da circa 80-100 3 - 4 - settimana-vecchi impianti, anche se rese superiori a 5 mg possono essere realizzate spesso con accurata macinazione. Il rendimento varia con le condizioni di crescita e diminuisce drammaticamente come foglie ratti senesce, anche se i mitocondri struttura sembra essere ben mantenuto durante la senescenza9. Una delle caratteristiche più importanti per ottenere una buona resa è il metodo di macinazione per lisare cellule per rilasciare i mitocondri. Mentre un numero di dispositivo meccanico di macinazione è disponibile per l'acquisto, per Arabidopsis rettifica in un mortaio e pestello raggiunge costantemente buoni risultati in termini di rendimento, come Lisi delle cellule con poco danno di organelli. Mentre smerigliatrici meccaniche sono veloci, che richiedono ottimizzazione e l'importo della rettifica necessaria può variare a seconda del tessuto. Con un mortaio e pestello, è spesso conveniente e più efficace se il tessuto è affettato o tagliati con un coltello o forbici prima della macinazione. Come indicato, tutti i passaggi devono essere effettuate a 4 ° C e l'intera procedura da fine macinazione per ottenere un pellet lavato dei mitocondri purificati dovrebbe richiedere circa 4 h. Come tracce di detergenti o altri reagenti su tubi o gradienti versatori possono ridurre drasticamente il rendimento, tutti i componenti utilizzati in queste procedure sono lavati senza detersivo e non utilizzati in altre procedure. Infine, è importante che i mitocondri sono sufficientemente separati dalle altre frazioni sul gradiente per consentire loro di essere rimosso e lavato. Se sono troppo vicino al fondo del tubo, vuol dire che la miscelazione delle soluzioni leggeri e pesanti deve essere regolato, per consentire più della soluzione pesante da versare prima della miscelazione. Al contrario, se la band appare diffusa ed è alta nel tubo, miscelazione deve verificarsi un po' prima.
Il metodo descritto qui può essere facilmente utilizzato per l'isolamento dei mitocondri da Arabidopsis fiore e radice del tessuto11,12. Per le radici, è conveniente crescere in coltura idroponica e bisogno di 100 g di peso fresco di ottenere quantità di 2mg di mitocondri. Per la molatura radici deve essere tagliato in piccoli pezzi prima di essere rettificati in un mortaio e pestello, e rendimenti di aumento possono essere ottenuti dalla macinazione nuovamente il tessuto di radice, sia in un mortaio e un pestello in un frullatore. Per il tessuto floreale dove la funzione mitocondriale è spesso rafforzata13, rettifica con un mortaio e pestello funziona bene, ma la quantità limitata di materiale significa che una grande quantità di piante ha bisogno di essere coltivata per la raccolta del tessuto. I mitocondri sono stati isolati da una varietà di organi di Arabidopsis usando metodi simili o lievi modifiche14,15 e dal riso (Oryza sativa)16.
Le limitazioni del metodo sopra descritto sono i) grandi quantità di semi necessarie per l'isolamento mitocondriale, ii) solo i tessuti specifici da Arabidopsis e riso applicata in questo metodo di isolamento, iii) piccole quantità di vari contaminanti (ad esempio proteine peroxisomal) esistevano ancora nei mitocondri purificati. I mitocondri ottenuti utilizzando i metodi descritti sopra sono adatti per una varietà di studi, che vanno dagli studi di assorbimento di ossigeno per analisi di spettrometria di massa quantitativa dell'abbondanza di proteine. Gradienti mitocondri purificati conterrà ancora piccole quantità di vari contaminanti, quali proteine peroxisomal3. Un confronto con gli elenchi definiti organello può essere utilizzato per determinare cambiamenti nelle proteine mitocondriali, purché la quantità di contaminazione da proteine non-mitocondriali è piccola (< 10%) e campioni simili vengono confrontati, quindi il tipo e il grado di proteine non-mitocondriali è simile. Analisi dell'abbondanza di proteine da SDS-PAGE o altri approcci basati su gel possono essere effettuate con quantità relativamente piccole di mitocondri (2-20 µ g), utilizzando quantità variabili di mitocondri per verificare la linearità di rilevazione di anticorpi (Figura 3). Mentre porin (canale anionico dipendente dalla tensione (VDAC)) è spesso usato come un controllo di carico per la quantificazione, nella nostra esperienza la relativamente grande abbondanza di questa proteina può significare che la risposta spesso non è lineare se grandi quantità di proteine vengono caricati sul gel , quindi la linearità della risposta dell'anticorpo devono sempre essere controllati quando si utilizzano tali controlli di caricamento. Il significato di questo approccio di isolamento dei mitocondri è che a differenza di sfumature che utilizzano saccarosio come il materiale per creare il gradiente di densità, gradienti di densità colloidale non richiedono osmotico riaggiustamento dei mitocondri purificati come richiesto con saccarosio. Questo significa che c'è meno possibilità di rottura dei mitocondri purificati e dopo il lavaggio per rimuovere il materiale di densità colloidale, può essere utilizzati direttamente in una varietà di applicazioni o saggi.
Macchie di tessuto, dove le proteine mitocondriali sono rilevati dagli estratti di tessuto o foglia interi, sono un approccio attraente per misurare la quantità di proteine mitocondriali in quel tessuto. Dato il volume generalmente basso dei mitocondri rispetto ad altri organelli, la rivelazione della proteina mitocondriale sul tessuto intero estratti deve essere interpretato con una certa cautela, come proteina mitocondriale può essere effettuato oltre il rilevamento di tali approcci. Attenti controlli, dove i mitocondri purificati sono electrophoresed insieme a estratti di tessuto per garantire identiche migrazione e linearità di rilevazione, necessario essere effettuato ad per avere fiducia in tali approcci.
Con l'aiuto di un elettrodo di Clark-tipo ossigeno, cambiamenti nella pressione parziale di ossigeno di una soluzione possono essere misurati. L'elettrodo effettivo è costituito da un catodo di platino e un anodo di argento, che sono collegate da un ponte di KCl e coperti da un elettrolita-inumidito carta (carta da sigarette) e una membrana permeabile all'ossigeno (membrana di politetrafluoroetilene). Una tensione di 600-700 mV conduce alla riduzione di ossigeno, dando una relazione lineare tra tensione e concentrazione di ossigeno. Elettrodi di ossigeno sono disponibili in commercio da aziende diverse. Ogni azienda avrà la propria istruzioni per quanto riguarda il montaggio e l'installazione dell'elettrodo ossigeno. Tuttavia, in generale argento anodo e catodo di platino del disco elettrodo devono essere puliti con l'aiuto di un elettrodo pulizia kit o una penna per cancellare prima del montaggio. È importante garantire che non formano bolle d'aria durante il montaggio (ad es. tra il diaframma di politetrafluoroetilene e la carta di sigaretta). Dopo l'assemblaggio, il disco di elettrodo deve essere assegnato alla sezione con il platino catodo rivolto verso l'alto alla base della camera di reazione. La camera stessa è circondata da una camicia d'acqua garantendo il controllo della temperatura. È estremamente importante che la camera è sempre lasciata piena d'acqua, poiché la membrana sarà seccarsi e screpolarsi altrimenti. Allo stesso modo, la membrana non deve essere toccata da pipette o siringhe quando si aggiungono composti alla camera, per evitare di strappare.
Prima del dosaggio, il mezzo di respirazione deve essere riscaldato alla stessa temperatura come la camera di dosaggio (nella maggioranza dei casi 25 ° C) e la membrana dovrebbe essere permesso di equilibrare nel buffer di respirazione per qualche minuto. Dopo lo stantuffo per consumo di ossigeno di chiusura assays, l'aggiunta di molecole effettrici dovrebbe essere effettuato utilizzando siringhe riutilizzabili microliter (ad es. micro siringhe) o caricamento puntali monouso del gel. Se utilizza micro siringhe, dev'essere garantito che la siringa è accuratamente sciacquata con acqua tra aggiunte, per evitare di contaminare le soluzioni di riserva e di etanolo al 100%. Questo vale anche per il lavaggio della camera tra misurazioni. La maggior parte dei reagenti utilizzati nelle analisi del consumo di ossigeno sono solubili in acqua e possono essere facilmente rimosso risciacquando più con acqua (circa cinque volte) tra le misurazioni. Tuttavia, alcuni prodotti chimici utilizzati per le analisi sono solo solubili in nPG, myxothiazol e solventi organici, come antimycin A. Pertanto, la camera deve essere sciacquata con un solvente organico (50% (v/v) etanolo) tra i test per rimuovere le tracce residue di queste molecole e poi con acqua (circa cinque volte) per vuotare i residui.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.
Acknowledgments
Questo studio è stato sostenuto da un australiano ricerca Consiglio centro di eccellenza in pianta energia biologia CE140100008, un australiano Consiglio futuro assegno di ricerca (FT130100112) di MWM e un assegno di ricerca di Feodor Lynen (Alexander von Humboldt Fondazione, Germania) a JS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ADP | Sigma-Aldrich | A2754 | Chemical |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | Chemical, dissolve in ethanol |
| AOX antibody | from Tom Elthon | Elthon et al., 1989 | |
| Ascorbate | Sigma-Aldrich | A0157 | Ascorbate Oxidase from Cucurbita sp. |
| ATP | Sigma-Aldrich | A26209 | Chemical |
| Bovine serum albumin (BSA) | Bovogen | BSAS 1.0 | Chemical |
| Clarity western ECL substrate | Bio-Rad Laboratories | 1705061 | Chemical |
| Criterion Stain-Free Precast Gels 8-16% 18 Wells | Bio-Rad Laboratories | 5678104 | Chemical |
| Cyanide | Sigma-Aldrich | 60178 | Chemical |
| Cytochrome c | Sigma-Aldrich | C3131 | Chemical |
| Difco Agar, granulated | BD Biosciences | 214530 | Chemical |
| Dithiotreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | Chemical |
| EDTA disodium salt | Sigma-Aldrich | E5134 | Chemical |
| Gamborg B-5 Basal Medium | Austratec | G398-100L | Chemical |
| Gamborg Vitamin Solution (1000x) | Austratec | G219-100ML | Chemical |
| Goat Anti-Mouse IgG (H + L)-HRP Conjugate | Bio-Rad Laboratories | 1706516-2ml | Chemical |
| Goat Anti-Rabbit IgG (H + L)-HRP Conjugate | Bio-Rad Laboratories | 1706515-2ml | Chemical |
| L-Cysteine | Sigma | C7352-100G | Chemical |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 230391 | Chemical |
| Murashige & Skoog Basal Salt Mixture (MS) | Austratec | M524-100L | Chemical |
| Myxothiazol | Sigma-Aldrich | T5580 | Chemical, dissolve in ethanol |
| NADH | Sigma-Aldrich | N8129 | Chemical |
| Ndufs4 antibody | from Etienne Meyer | Meyer et al., 2009 | |
| n-Propyl gallate | Sigma-Aldrich | P3130 | Chemical, dissolve in ethanol |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | Chemical, colloidal density gradient |
| Polyvinylpyrrolidone (PVP40) | Sigma-Aldrich | PVP40 | Chemical |
| Potassium cyanide | Sigma-Aldrich | 60178 | Chemical |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | Chemical |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | Chemical |
| Sodium chloride | Chem-Supply | SA046 | Chemical |
| Sodium dithionite | Sigma-Aldrich | 157953 | Chemical |
| Sodium L-ascorbate | Sigma | A4034-100G | Chemical |
| Succinate | Sigma-Aldrich | S2378 | Chemical |
| Sucrose | Chem-Supply | SA030 | Chemical |
| TES | Sigma-Aldrich | T1375 | Chemical |
| Tetrasodium pyrophosphate (Na4P2O7 · 10H2O) | Sigma-Aldrich | 221368 | Chemical |
| Trans-Blot Turbo RTA Midi Nitrocellulose Transfer Kit | Bio-Rad Laboratories | 1704271 | Chemical |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | X100 | Chemical, detergent |
| Western Blocking Reagent | Sigma | 11921681001 | Chemical |
| Balance | Mettler Toledo | XS204 | Equipment |
| Beakers | Isolab | 50 mL | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-26XP | Equipment |
| Centrifuge tubes | Nalgene | 3117-9500 | Equipment |
| Circulator | Julabo | 1124971 | Attached to oxygen electrode chamber |
| Conical flask | Isolab | 500 mL | |
| Dropper | 3 mL | ||
| Fixed angle rotor | Beckman Coulter | JA25.5 | Equipment |
| Funnel | Per Alimenti | 14 cm | For filtering |
| Gradient pourer | Bio-Rad | 165-4120 | For preparation of gradients |
| Magnetic Stirrer ATE | VELP Scientifica | F20300165 | Equipment |
| Miracloth | VWR | EM475855-1R | Filtration material |
| Mortar and pestle | Jamie Oliver | Granite, 6 Inch | Equipment |
| O2view | Hansatech Instruments | Oxygen monitoring software | |
| Oxygraph Plus System | Hansatech Instruments | 1187253 | Clark-type oxygen electrode |
| Paintbrush | Artist first choice | 1008R-12 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | plastic paraffin film |
| Peristaltic pump | Gilson | F155001 | For preparation of gradients |
| PVC peristaltic tubing | Gilson | F117930 | For preparation of gradients |
| Water bath | VELP Scientifica | OCB | Equipment |
References
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