Summary
Mitokondrier er kun en lille procentdel af anlægget celle, skal de være renset for en række undersøgelser. Mitokondrier kan isoleres fra en bred vifte af anlæg organer ved homogenisering, efterfulgt af differentiale og tæthed gradient centrifugering at opnå et højt oprenset mitokondrie brøkdel.
Abstract
Mitokondrier er væsentlige organeller involveret i mange metaboliske omsætningsveje i planter, især produktionen af adenosin trifosfat (ATP) fra oxidation af reduceret forbindelser såsom nicotinamid-adenin-dinucleotid (NADH) og flavin adenin dinucleotid (FADH2). Den komplette anmærkning af Arabidopsis thaliana genom har etableret det som mest udbredte plante modelsystem, og dermed behovet for at rense mitokondrier fra en lang række organer (blade, rod eller blomst) er nødvendige for fuldt ud at udnytte værktøjerne, er nu tilgængelige for Arabidopsis at studere mitokondrie biologi. Mitokondrier er isoleret ved homogenisering af væv ved hjælp af en bred vifte af tilgange, efterfulgt af en række differential centrifugering trin producere en rå mitokondrie pellet, der er yderligere renset ved hjælp af kontinuerlig kolloid tæthed farveforløb centrifugering. Kolloid tæthed materiale fjernes efterfølgende ved flere centrifugering trin. Startende fra 100 g friske blade væv, kan 2-3 mg af mitokondrier rutinemæssigt opnås. Respiratorisk eksperimenter på disse mitokondrier vise typiske satser for 100-250 nmol O2 min-1 mg samlede mitokondrie protein-1 (NADH-afhængige sats) med mulighed for at bruge forskellige substrater og hæmmere for at afgøre, hvilken substrater oxideres og kapaciteten af de alternative og cytokrom terminal oxidases. Denne protokol beskriver en isolation metode af mitokondrier fra Arabidopsis thaliana blade ved hjælp af kontinuerlig kolloid tæthed gradienter og en effektiv respiratorisk målinger af renset plante mitokondrier.
Introduction
Mitokondrie planteforskning historie går tilbage over 100 år1. Intakt mitokondrier blev først isoleret i begyndelsen af 1950 ' erne ved hjælp af differentieret centrifugering. Fremkomsten af en kolloid tæthed farveforløb i 1980 ' erne tillod mitokondrier skal renses uden lider osmotisk justering. Mens gradient renset mitokondrier er velegnet til de fleste formål, på grund af følsomheden af massespektrometri, selv forholdsvis mindre forurenende stoffer kan registreres og kan være uhensigtsmæssigt tildelt en mitokondrie placering2. Brug af frie flow elektroforese kan fjerne både plastidic og Peroxisom forurening3, men frie flow elektroforese er en højt specialiseret teknik og er ikke påkrævet for det store flertal af undersøgelser. Desuden, hvornår placering af et protein, det skal være husket at dobbelt statsborgerskab eller flere målretning af proteiner opstår i celler. Over 100 dobbelt målrettede proteiner er beskrevet for grønkorn/plastids og mitokondrier4og en række proteiner målrettet til mitokondrierne og peroxisomerne er også kendt for5. Udflytning af proteiner under bestemte stimuli, f.eks. oxidativ stress, er desuden et spirende tema i celle biologi6. Således, placeringen af proteiner skal overvejes i forbindelse med biologi studerede, og en bred vifte af tilgange bruges til at bestemme og kontrollere placering2.
Mitokondrier er typisk isoleret fra plantevæv ved homogenisering, en balance er nødvendig mellem bryde åbne cellevæg at frigive mitokondrier, og ikke skadelige mitokondrier. Traditionelt, med kartofler og blomkål indebærer homogenisering at bruge husstand blender/juicer apparater til at gøre en flydende ekstrakt i en buffer med forskellige komponenter til at opretholde aktiviteterne. Isolering af mitokondrier fra ært blade, (et populært materiale til mitokondrie isolation ved hjælp af unge planter (~ 10 dage gammel), udnytter en blender til lyse celler som blade materiale er blødt. Med tilgængeligheden af Arabidopsis thaliana T-DNA pattedyrsceller knock-out linjer, har behovet for at være i stand til at rense mitokondrier at foretage funktionelle studier nødvendiggjort udvikling af metoder til at isolere mitokondrier fra blade, rod og blomst væv. Overordnede arbejdede metoder udviklet for andre planter godt7, med den perquisite, slibning af materialet skulle være optimeret. For Arabidopsis dette kan opnås i en række forskellige måder (se nedenfor), og adskiller sig mellem vævstyper (rod versus skyde). Brugen af den kontinuerlige forløb kan også optimeres som tætheden af mitokondrier fra forskellige organer eller udviklingsstadier betyder, at de kan overføre forskelligt. Således kan tætheden af gradienten for maksimal adskillelse raffineres sikre for at opnå bedste adskillelse.
Når renset, mitokondrier kan bruges til en lang række undersøgelser, herunder protein og tRNA optagelse eksperimenter, enzym aktivitet assays, respiratorisk kæde målinger og vestlige skamplet analyser. Isolerede mitochondrier kan også bruges til massespektrometri analyser af protein overflod. Målrettet flere reaktion overvågning (MRM) analyser giver mulighed for kvantificering af defineret proteiner, men kræver betydelig assay udvikling. Derimod giver kvantificering af dimethyl eller andre isotop etiketter8, discovery tilgang i at identificere forskelle på tværs af hele proteomet, der kan bruges til at afdække nye biologiske indsigter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokol bruges til isolering af intakt mitokondrier fra Arabidopsis thaliana organer dyrkes på jord ved hjælp af kontinuerlig kolloid tæthed gradienter. Alle procedurer efter indsamlingen af materialet er foretaget ved 4 ° C.
1. forberedelse af slibning Medium, Wash Buffer og Gradient løsninger
- Forberede 300 mL slibning medium (minus Ascorbat og cystein) og 200 mL af 2 x vaskebuffer pr. tabel 1 en dag i isolation, holde dem kolde ved 4 ° C.
Bemærk: Tilføje natrium Ascorbat og L-Cystein (gratis base) til en endelig koncentration på 17.84 og 20.36 mM, henholdsvis til slibning medium om morgenen af isolation. Hvis mitokondrier er skal anvendes for vestlige skamplet eller blå native-polyacrylamid gel elektroforese (BN-side) analyser, udgør 2 x vaskebuffer uden BSA. - Forberede forløb om morgenen af mitokondrie isolation (figur 1 og tabel 1).
- Gøre de tunge og lette gradient løsninger i to bægre; 35 mL af hver er tilstrækkelig til to gradient rør.
- Vaske kamre af gradient vinprop og PVC peristaltiske slange med deioniseret vand og sikre selv flow gennem slangen fra alle slanger.
- Sted 2 centrifugeglas (50 mL) i en lille vinkel på isen med PVC peristaltiske slanger afsætningsmuligheder tapede til indersiden af rør til at sikre den gradient løsning kører ned langs siden af rørene.
- Tæt forbindelse mellem den indre og ydre kamre (sort håndtag ned). Sted gradient skænkeprop på en magnetomrører med en lille rør i den indre kammer.
- Hæld 35 mL tunge gradient løsning i den indre kammer (afdeling med slanger outlet). Undvære den tunge gradient løsning til de to centrifugeglas anbringes på is, indtil halvdelen er tilbage med den peristaltiske pumpe sats fastsat til hurtig (300 mL/h).
- Hæld 35 mL lys gradient løsning i det ydre kammer (afdeling uden slanger outlet). Åbne forbindelsen mellem kamre (push sort håndtag op halvvejs) og tillade løsninger til blandes forsigtigt. Bland løsninger med en magnetomrører.
- Give løsninger til at køre langsomt (60 mL/h) indtil alle gradient mix har været udleveret fra kamre resulterer i to 0 - 4,4% (w/v) polyvinylpyrrolidon (PVP) gradient-fyldt rør. Holde forløb på is indtil klar til brug i trin 2.12.
Bemærk: Når gradueringen, der er blevet udarbejdet, fortyndes 2 x vask medium til 1 x med prechilled-deioniseret vand og holde kulde ved 4 ° C.
2. homogenisering og mitokondriel Isolation
- Skære hele roset væv fra 4 - uger gamle Arabidopsis planter dyrkes på jord med en saks, vil mindst 80 planter være nødvendig for 1 prep.
Bemærk: 10-14 dag gamle vand kulturer, minimum 5 Potter/prep, eller 2 - uger gamle planter dyrkes på Murashige & Skoog Basal Salt blanding (MS) agar plader, minimum 4 plader, kan også bruges. - Læg halvdelen af det plantemateriale, der er blevet skåret i små stykker i en pre Vandkølet 4 ° C stor morter og støder med 75 mL af slibning medium (tabel 1), og male udførligt i flere minutter indtil ingen store stykker af væv er tilbage.
- Pre våd 4 lag af filtrering materiale (22-25 µm porestørrelse) med slibning medium og filtrerer homogenatet igennem 4 lag af filtrering materiale gennem en plastik tragt i en 500 mL konisk kolbe.
- Slibe den resterende halvdel af væv med en anden 75 mL slibning medium.
- Kombinere homogeniseret i materialet, filtrering og filtrere så meget som muligt homogenatet gennem.
- Slibe den resterende væv forbliver på filtrering materiale igen med de resterende 150 mL slibning medium, filter igen i 500 mL konisk kolbe.
- Der centrifugeres den filtrerede homogenatet i 8 pre kølet 50 mL plastik centrifugeglas på 2.500 x g ved 4 ° C i en fast vinkel rotor i 5 min.
- Hæld supernatanten til ren centrifugeglas (50 mL; undgå at forstyrre den grønne pellet) og centrifugeres ved 17.500 x g ved 4 ° C i 20 min. i en fast vinkel rotor.
- Kassér alle, men < 3 mL af supernatanten ved aspiration (eller hæld forsigtigt ned uden at forstyrre pelleten). Forsigtigt resuspenderes i resterende supernatanten ved hjælp af en lille fin pensel.
- Der tilsættes 10 mL af 1 x vaskebuffer til hver tube og kombinere 4 rør i 1 ren centrifugeglasset (dvs., resulterer i 2 rør).
- Fylde disse rør med 1 x vaskebuffer til 50 mL og gentage trin 2,7-2.9.
- Pool rå mitokondrie pellets ind 1 rør ved hjælp af en dråbetæller og spredes jævnt med fine pensel (en lille mængde af wash buffer kan anvendes men det endelige rumfang skal være mindre end 3 mL til at passe på toppen af gradient). Forsigtigt lag mitokondrie suspension med en dråbetæller på 2 sammenhængende 0 - 4,4% (w/v) PVP gradienter.
- Balance rør af vægt (med 1 x vaskebuffer) og centrifugeres ved 40.000 x g ved 4 ° C i 40 min. sikre pausen er slået fra. Mitokondrier vil migrere til et band i bunden af røret, eller kan være til stede i den tunge løsning i bunden af røret (identificeret af en overskyet, gullig band; Figur 2).
- Fjern forsigtigt den øverste 5 cm af løsning ovenfor mitokondrie bandet ved aspiration.
- Distribuere den resterende løsning indeholdende mitokondrier i 2 ren rør og fylde med 1 x vaskebuffer. Jævnt distribuere kolloid tæthed farveforløb og mitokondrier ved dækker mundingen af røret med en plastik paraffin film og vende flere gange. Der centrifugeres i 15 min. ved 31.000 x g ved 4 ° C med langsom bremsning.
Bemærk: Inden centrifugering, Sørg for mitokondrier og de resterende kolloid tæthed farveforløb er jævnt fordelt. Ellers, kolloid tæthed farveforløb kan koncentrere sig i bunden af røret og forhindre pelleringsmidler af mitokondrier. - Fjern supernatanten ved aspiration, fylde røret med 1 x wash buffer op til 50 mL, og inverter igen for at sikre blanding. Der centrifugeres i 15 min. ved 31.000 x g ved 4 ° C med langsom bremsning.
- Opsug supernatanten og indsamle de mitokondrielle pellets i så lille en mængde (~ 500 µL) som muligt ved hjælp af en pipette med modificerede 200 µL tips (skåret spidsen lidt over sin ende at øge dens åbning). Placer mitokondrier i en 1,5 mL tube og holde på is til umiddelbar anvendelse eller opbevares ved-80 ° C.
Bemærk: Hvis mitokondrier vil blive brugt til sodium dodecyl sulfat-polyacrylamid gelelektroforese (SDS-PAGE), BN-side eller immunblot analyser, bruge 1 x vaskebuffer uden BSA til de endelige skylninger (dvs., trin 2.15 og 2.16). - Bestemme proteinkoncentration af mitochondrier ved hjælp af metoden Bradford.
Bemærk: For BN-side centrifuge alikvoter ved 4 ° C, og butikken pellet ved-80 ° C indtil brug. Til ilt forbrug målinger, kan der anvendes kun frisk isolerede mitochondrier.
3. ilt forbrug målinger
Bemærk: Iltforbrug af frisk isoleret anlæg mitokondrier kan analyseres med en Clark-type ilt elektrode, gør det muligt for bestemmelse af mitokondrie handelsformer, cytokrom c pathway aktivitet og alternative pathway aktivitet.
- Installation af software
- Installere licenseret ilt overvågning software på computeren, der bruges til ilt forbrug målinger.
- Forberedelse af respiration medium, substrater, kemiske stamopløsninger og Clark-type ilt elektrode
- Forberede respiration medium (300 mM saccharose, 10 mM NaCl, 5 mM KH2PO4, 2 mM MgSO4, 0,1% (w/v) bovint serumalbumin (BSA), 10 mM TES (pH 7,2)) bruges til ilt forbrug assays.
- Forbered substrater, hæmmere og effektorer bruges til at måle mitokondrie respiration (tabel 2). Disse kan være fremstillet tidligere og opbevares ved-20 ° C.
Bemærk: Neutralisere pH i sure opløsninger som organiske syrer til pH 7,0 ved hjælp af NaOH før brug. - Varm respiration medium til den samme temperatur som assay kammer (25 ° C).
- Samle Clark-type ilt elektrode som beskrevet i protokollen af fabrikanten.
- Placer 1 mL luft-mættet vand (luft-mættet vand opnås ved kraftigt at ryste en lille mængde af deioniseret vand i en stor konisk kolbe) i målekammeret. For at tænde omrøreren, skal du klikke på knappen "Omrører hastighed". Klik på knappen "På" og indstille hastigheden, omrører til 65 rpm. Klik på "OK" for at fortsætte. Rør vand kontinuerligt ved 25 ° C.
- Kalibrering af ilt elektrode
- Varmt vand, der vil blive anvendt til kalibrering til den samme temperatur som assay kammer (25 ° C).
- Afvente den nuværende til at stabilisere og kalibrere ilt elektrode.
- For at starte kalibreringen af ilt elektrode, klik på knappen "Kalibrer", Vælg "Flydende fase kalibrering", og derefter "Luften mættet vand."
- Et nyt vindue vil åbne (ilt kalibrering (flydende fase) - trin 1 af 5). Vælg kanalen til at kalibrere (den kanal boksen elektrode kontrol er knyttet til) og angive variabler (sæt "Kammertemperaturen" til 25 ° C og "Atmosfærisk pres" til 101.32 kPa). Klik på "OK" for at fortsætte.
- I næste trin (trin 2 af 5), setup omrører hastighed (65 rpm) og klik på "OK" for at fortsætte.
- I trin 3 af 5, vente på signal til at nå et plateau. Udtrykket "Plateau nås, tryk på OK for at fortsætte" vises i boksen. Klik på "OK" for at fortsætte.
- I trin 4 af 5, indføre nul ilt i salen ved at tilføje 5 mg natrium dithionite. Klik på "OK" for at fortsætte.
Bemærk: Et fald i iltkoncentrationen skal være synlige i sporet og bør nå 0. - I det sidste trin i kalibreringen (trin 5 af 5), vente på signal til at nå et plateau. Udtrykket "Plateau nås, tryk på OK for at fortsætte" vises i boksen. Klik på "OK" for at fortsætte.
- Klik på "Gem kalibrering" for at gemme kalibreringen. Et nyt vindue åbnes. Klik på "OK" for at bekræfte, hvis du vil gemme den nye kalibrering for ilt kontrolboks.
Bemærk: Efter vellykket kalibrering, mærkning "ilt (nmol/mL)" vises på y-aksen. - Efter kalibrering, skal du rense målekammeret ved skylning kammer med vand (mindst 5 - 10 gange) for at sikre ordentlig rengøring. Sted 1 mL af respiration medium til at måle kammer og tillade membran til blandingen henstår i et par minutter indtil ilt forbrug spor er lineær.
- Tilpasse omfanget af ilt forbrug spor til at få en god hældning visning. Klik på "Zoom XY" og Angiv variabler (Indstil "Ilt" til 0 - 300 og "Tidsaksen" til 0 - 45 min).
- Bestemmelse af mitokondrie integritet
- Med stemplet åben, skal du tilføje 970 µL luft-mættet respiration medium til reaktionskammeret.
- Tilføj 30 µL isoleret mitokondrier eller 150 µg samlede mitokondrie protein som fastsat efter mitokondrier isolation (total protein skal indgå i beregningerne bagefter) til reaktionskammeret ved hjælp af en pipette med et cut tip.
- Rør den mitokondrielle suspension kontinuerligt med en magnetomrører bar (65 rpm) på 25 ° C til luft-mætte løsningen.
- Forsegle kammer med stemplet, klik på "Start optagelse" for at registrere forbrug af ilt og tillader ilt forbrug spor at stabilisere (1-2 min).
- Bestemme de iltforbrug manuelt efter tilsætning af 10 mM Ascorbat og 25 µM cytokrom c i 5 min at få "før detergent" satsen.
Bemærk: For at mærke tilsætning af substrater, hæmmere og effektorer direkte i sporingen, skal du klikke på knappen "Tilføj begivenhed Mark" og indtaste de tilsvarende etiket betegnelse. Klik på "OK" for at fortsætte. - Bestemme de iltforbrug manuelt for 3 min efter at tilføje 0,05% (v/v) vaskemiddel for at give "efter detergent" sats. Klik på "Stop optagelse".
- Klik på knappen "Satser for ændring tabel". 2 markører vises som lodrette linjer på skærmbilledet graf. Klik og træk par sats markører på de nødvendige stillinger i spor at definere sats interval. Flytte sats interval langs spor ved hjælp af venstre sats markøren. Indstil hastigheden intervallet for sig selv ved hjælp af den rigtige kurs markøren. Ilt overvågning software automatisk trækker en linje af bedste fit mellem de to markører mens du flytter sats interval markører langs sporingen.
- Når den ønskede interval og stilling er blevet defineret, træder satsen i bordet med et Højreklik på 1 af de 2 markører, og vælge "Tilføj sats til bordet." Klik på "Tilføj" knappen for at bekræfte for at vise satsen på den primære tabel.
- Beregne mitokondrie integritet ved at dividere "før detergent" satsen af "efter detergent"-pris, udtrykt i procent, og fratrække det fra 100.
- Bestemmelse af mitokondrie respiration
- Med stemplet åben, skal du tilføje 970 µL af luft-mættet respiration medium til reaktionskammeret. Tilføje 500 µM ATP og 30 µL isoleret mitokondrier eller 150 µg samlede mitokondrie protein ved hjælp af en pipette med et cut tip til respiration medium i reaktionskammeret.
- Rør den mitokondrielle suspension løbende ved hjælp af en magnetisk omrører bar (65 rpm) på 25 ° C.
- Luk stemplet, klik på "Start optagelse" for at registrere forbrug af ilt, og vente 1-2 min for ilt forbrugssats at stabilisere (når ilt forbrug spor er lineære). Tilføj 5 mM succinat. Optage udnyttelsesgrad af ilt til ca 2 min.
Bemærk: For at mærke tilsætning af substrater, hæmmere og effektorer direkte i sporingen, skal du klikke på knappen "Tilføj begivenhed Mark" og indtaste de tilsvarende etiket betegnelse. Klik på "OK" for at fortsætte. - Tilføj 1 mM adenosin ud (ADP). Fortsæt optagelse sats på iltforbrug i 2 min.
- Tilføj 1 mM NADH. Optage udnyttelsesgrad af ilt i 4-8 min. Denne sats er kapaciteten af respiration via cytokrom oxidase.
- Tilføj 1 mM kalium cyanid (KCN) (eller 2,5 µM myxothiazol eller 5 µM antimycin A) for at hæmme cytokrom c pathway, og fortsætte med at indspille for ca 2 min til at observere iltforbrug via den alternative oxidase.
- Tilføj 5 mM dithiothreitol (DTT) og 10 mM pyruvat fuldt aktivere den alternative oxidase. Fortsætte med at registrere for de 5-7 min: Dette er kapaciteten af den alternative oxidase.
- Tilføje 500 µM n-propyl gallate (nPG), og registrere for 2 min. Dette vurderer resterende ilt forbrugssats, der ikke kan være kemisk hæmmet. Trække denne sats fra de andre satser, der registreres, da det ikke er sandsynligt at være mitokondrie oprindelse. Iltforbrug stadig forekommer efter hæmning af det cytokrom c og AOX pathway (af KCN og nPG) er meget tænkes at komme fra peroxidases stede som kontaminanter i isolerede mitochondrier9.
- Klik på "Stop optagelse".
- Klik på knappen "Satser for ændring tabel" og angive satsen i bordet med et Højreklik på en af de to markører, og vælg "Tilføj sats til bord". Klik på "Tilføj" knappen for at bekræfte for at vise satsen på den primære tabel.
Bemærk: Når tilføje effektorer opløst i organiske opløsningsmidler (fx., antimycin A, nPG, myxothiazol), kammer og stemplet skal skylles med ethanol og derefter vand for at sikre ordentlig rengøring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjælp af denne protokol, var vi i stand til at opdage forskellige mitokondrielle proteiner af SDS-PAGE og immunoblotting. Som vist i figur 3A, er protein isoleret fra vand kultur væv tilstrækkeligt til at påvise en svag band (2 µg). Signal intensiteten stiger proportionalt med de beløb, der er indlæst. For mitokondrier isoleres fra væv dyrket på plader (figur 3B), reaktion på høje lys stress kan behandling i forskellige genotyper analyseres ved immunodetection med alternative oxidase antistoffer.
Handelsformer mitokondrier, cytokrom c pathway aktivitet og alternative vej kan måles ved hjælp af frisk isolerede mitokondrie prøver. Mitokondrie integritet er velbevaret under proceduren beskrevet isolation (figur 4A). Tilføjer forskellige substrater, hæmmere og effektorer til isolerede mitochondrier, iltforbrug gennem cytokrom c pathway og alternative oxidase pathway er påvirket (figur 4B).
Figur 1: opsætning til forberedelse af gradienter. Venstre: Centrifugeglas (50 mL) med en lille vinkel lagt på is med PVC peristaltiske slanger afsætningsmuligheder tapede til indersiden af rørene; Midten: Peristaltisk pumpe; Højre: Gradient skænkeprop oven på en magnetomrører, som indeholder tunge gradient (indre kammer) og lys gradient (ydre kammer) løsninger. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: rensning af mitokondrier fra Arabidopsis skyder ved hjælp af en kontinuerlig 0 - 4,4% (w/v) PVP/28% kolloid tæthed farveforløb. Den mørke grønne band er tylakoiderne og andre forureninger som angivet i toppen af de gradient løsninger. Mitokondrie brøkdel optrådte som en hvid-grønlig band tættere til bunden af røret. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: adskillelse af mitokondrielle proteiner af SDS-PAGE og immunodetection ved hjælp af specifikke antistoffer. (A) mitokondrier isoleret fra to-uge-forhenværende vand-kulturperler Arabidopsis thaliana vilde skrive (Columbia-0, Col-0) planter var underkastet SDS-PAGE og aftestede med antistoffer rejst mod NADH: ubikinon oxidoreductase subunit () S4 Ndufs4, At5g67590). Molekylvægt unstained markører blev indlæst på den yderste vognbane af gel og størrelsen af ti repræsentative bands er angivet i kilo Dalton (kDa). Tilsyneladende molekylære massen af det Ndufs4 protein fundet er 18 kDa. Protein overflod er vist i forhold til værdien af 2 µg total protein. (B) to-uge-forhenværende planter dyrkes på Gamborg's B5 medier med 3% (w/v) saccharose og 0,8% agar (w/v) blev udsat for 750 µE m-2 s-1 fremhæve (HL) og høstet efter 6 h. mitokondrier blev renset og de mitokondrielle proteiner var adskilt af SDS-PAGE og aftestede med antistoffer rejst mod alternative oxidase (AOX). Tilstedeværelsen af en immunodetectable AOX protein med en tilsyneladende molekylvægt 34 kDa er indiceret. Protein overflod er vist i forhold til værdien af kontrolelementet (2 µg). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Repræsentative spor af O2 forbrug af isolerede plante mitokondrier. (A) mitokondrier isoleret fra Arabidopsis thaliana wild-type planter (Col-0) som skitseret ovenfor blev analyseret for ydre membran integritet før ilt forbrug målinger. 30 µL af isolerede mitochondrier (150 µg samlede mitokondrie protein) blev brugt. Mitokondrie integritet blev fastsat som 90%, som beskrevet ovenfor. (B) ilt forbrug målinger blev udført ved hjælp af 30 µL af isolerede mitochondrier (150 µg samlede mitokondrielle proteiner) fra Arabidopsis thaliana wild-type planter. Samlede mitokondrie respiration og AOX pathway blev fastsat. Fra disse data, kan iltforbrug gennem cytokrom c pathway og AOX pathway bestemmes. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Slibning medium | |
| Kemiske | Koncentration |
| Saccharose | 0,3 M |
| Tetranatrium pyrofosfat (Na4P2O7 · 10 H2O) | 25 mM |
| EDTA dinatriumsalt | 2 mM |
| Kalium fosfat monobasic (KH2PO4) | 10 mM |
| Polyvinylpyrrolidon (PVP40) | 1% (w/v) |
| Bovint serumalbumin (BSA) | 1% (w/v) |
| Ionbyttet vand | |
| Justere pH 7,5 (ved hjælp af HCl) | |
| Bemærk: For 300 mL slibning medium, 1,06 g natrium Ascorbat (endelig koncentration: 17.84 mM) og 0,74 g cystein (endelig koncentration: 20.36 mM) tilsættes lige før brug. Tjek pH efter tilsætning og justere til 7.5 med 1 M NaOH, hvis det kræves. | |
| 2 X vaske buffer | |
| Kemiske | Koncentration |
| Saccharose | 0,6 M |
| TES | 20 mM |
| Bovint serumalbumin (BSA) | 0,2% (w/v) |
| Ionbyttet vand | |
| Justere pH 7,5 (ved hjælp af NaOH) | |
| Forløb | |
| Tunge Gradient løsning (4,4% (w/v) PVP) | 2 gradient rør |
| 2 X vaske buffer | 17,5 mL |
| Colloidial tæthed farveforløb | 9.8 mL |
| PVP-40 (20% (w/v)) | 7.7 mL |
| Lys Gradient løsning (0% (w/v) PVP) | 2 gradient rør |
| 2 X vaske buffer | 17,5 mL |
| Colloidial tæthed farveforløb | 9.8 mL |
| Ionbyttet vand | 7.7 mL |
Tabel 1: Sammensætningen af buffere og gradienter bruges til mitokondrier isolation.
| Forkortelse | Koncentrationen af stamopløsninger | Opbevaring | Endelig koncentration | Volumen tilføjet til 1 ml reaktion | |
| Substrater | |||||
| Cytokrom c | Cyt c | 2,5 mM (i H2O) | -20 ° C | 25 ΜM | 10 μl |
| NADH | NADH | 0,1 M (i H2O) | -20 ° C | 1 mM | 10 μl |
| Succinat | Succ | 500 mM (i H2O) | -20 ° C | 5 mM | 10 μl |
| Hæmmere | |||||
| Antimycin Andersen | AA | 1 mM (i EtOH) | -20 ° C | 5 ΜM | 5 μl |
| Cyanid | KCN | 100 mM (i H2O) | 4 ° C | 1 mM | 10 μl |
| Myxothiazol | Myxo | 500 μM (i EtOH) | -20 ° C | 2,5 ΜM | 5 μl |
| n-Propyl gallate | nPG | 100 mM (i EtOH) | -20 ° C | 500 ΜM | 5 μl |
| Effektorer | |||||
| ADP | ADP | 100 mM (i H2O) | -20 ° C | 1 mM | 10 μl |
| Ascorbat | ASC | 500 mM (i H2O) | Gøre friske dag i brug | 10 mM | 20 μl |
| ATP | ATP | 100 mM (i H2O) | -20 ° C | 500 ΜM | 5 μl |
| Dithiotreitol | DTT | 1 M (i H2O) | Gøre friske dag i brug | 10 mM | 10 μl |
| Pyruvat | Pyr | 1 M (i H2O) | -20 ° C | 10 mM | 10 μl |
| Rengøringsmiddel | 10% (v/v) (i H2O) | 4 ° C | 0,05% (v/v) | 5 μl | |
Tabel 2: Liste over substrater, hæmmere og effektorer bruges til ilt forbrug målinger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Isolering af mitokondrier fra Arabidopsis efterlader typisk, udbytter op 3 mg af mitokondrier fra ca 80-100 3 - 4 - uger gamle planter, selv om udbyttet af større end 5 mg kan ofte opnås med grundig slibning. Udbyttet afhænger af vækstbetingelser og falder drastisk som efterlader senesce, selv om mitokondrier struktur synes at være godt vedligeholdt under gulne9. En af de mest kritiske funktioner til at få et godt udbytte er metoden til slibning for at lyse celler for at frigive mitokondrier. Mens en række mekaniske slibning apparater er tilgængelige for køb, for Arabidopsis opnår slibning i en morter og støder konsekvent gode resultater med hensyn til udbytte, som det lyses celler med kun lidt skade organeller. Mens mekaniske vinkelslibere er hurtig, de kræver optimering og mængden af slibning kræves kan variere afhængigt af væv. Med en morter og pistil, det ofte praktisk og mere effektive, hvis væv er skåret eller snittet med en kniv eller saks inden slibning. Som skitseret, alle trin skal udføres ved 4 ° C og hele proceduren fra slutningen af slibning til at opnå en vasket pellet af renset mitokondrier bør tage ca 4 h. Da spor af vaske-og rengøringsmidler eller andre reagenser på rør eller gradient Dråbefangere kan dramatisk reducere udbytte, er alle komponenter, der bruges i disse procedurer vaskes uden vaskemiddel og ikke anvendes i andre procedurer. Endelig er det vigtigt, at mitokondrier er tilstrækkeligt adskilt fra de andre fraktioner på farveforløb at tillade dem at blive fjernet og vasket. Hvis de er også i nærheden af bunden af røret, betyder det, at en blanding af de lette og tunge løsninger skal justeres, for at tillade mere af de tunge løsning at hælde inden blanding. Omvendt, hvis bandet vises diffuse og er høj i røret, blanding skal forekomme lidt tidligere.
Metoden beskrevet her kan let anvendes til isolering af mitokondrier fra Arabidopsis blomst og root væv11,12. Rødder er det praktisk at vokse i hydroponiske kultur og har brug for 100 g friske vægt at opnå 2 mg beløb af mitokondrier. Til slibning rødder skal skæres i små stykker inden slibning i en morter og støder, og øge udbyttet kan rekvireres ved fornyet slibning root væv, enten i en morter og støder eller i en blender. For blomstermotiver væv hvor mitokondrie funktion er ofte forøget13, slibning med en morter og pistil fungerer godt, men den begrænsede mængde materiale betyder, at skal en stor mængde af planter være vokset til at høste væv. Mitokondrier har været isoleret fra Arabidopsis organer ved hjælp af lignende metoder eller mindre ændringer14,15 forskellige og fra ris (Oryza sativa)16.
Begrænsningerne af den ovenfor beskrevne metode er i) de store mængder af frø kræves til mitokondrie isolering, ii) kun specifikke væv fra Arabidopsis og ris anvendes i denne isolation metode, iii) små mængder af forskellige forurenende stoffer (som peroxisomal proteiner) stadig eksisterede i renset mitokondrier. Mitokondrier fremstillet ved hjælp af de metoder, der er beskrevet ovenfor er egnet til en lang række undersøgelser, lige fra ilt optagelse undersøgelser til kvantitativ massespektrometri analyser af protein overflod. Gradient renset mitokondrier vil stadig indeholde små mængder af forskellige forurenende stoffer, såsom peroxisomal proteiner3. En sammenligning med definerede organelle lister kan bruges til at bestemme forandringer i mitokondrielle proteiner, så længe mængden af forurening med ikke-mitokondrielle proteiner er små (< 10%) og lignende prøver sammenlignes, så den type og grad af ikke-mitokondrielle proteiner er lignende. Analyser af protein overflod af SDS-PAGE eller andre gel-baserede tilgange kan udføres med forholdsvis små beløb af mitokondrier (2-20 µg), ved hjælp af varierende beløb af mitokondrier for at kontrollere lineariteten af påvisning af antistoffer (figur 3). Mens porin (spænding afhængige anion kanal (VDAC)) bruges ofte som en loading kontrol for kvantificering, kan den relativt store overflod af dette protein i vores erfaring betyde, at svaret er ofte ikke lineær, hvis store mængder af protein er indlæst på gel , så linearitet antistofrespons bør altid kontrolleres, når du bruger kontrollen lastning. Betydningen af denne tilgang isolering af mitokondrier er, at i modsætning til forløb, der bruger saccharose som materiale til at danne tæthed farveforløb, kolloid tæthed gradienter ikke kræver osmotisk justering af renset mitokondrier er krævet med saccharose. Dette betyder, at der er mindre chance for brud renset mitokondrier og efter vask at fjerne kolloid tæthed materiale, de kan bruges direkte i en bred vifte af assays eller programmer.
Væv blots, hvor registreres mitokondrielle proteiner fra hele blade eller væv ekstrakter, er en attraktiv tilgang til at måle mængden af mitokondrielle proteiner i dette væv. I betragtning af den generelt lave volumen af mitokondrier i forhold til andre organeller, ekstrakter påvisning af mitokondrielle proteiner på hele væv skal fortolkes med nogen forsigtighed, som mitokondrielle proteiner kan være uden registrering i sådanne tilgange. Omhyggelig kontrol, hvor renset mitokondrier er electrophoresed sammen med væv ekstrakter til at sikre identiske migration og lineariteten af påvisning, skal udføres til at have tillid til sådanne tilgange.
Med hjælp fra en Clark-type ilt elektrode, kan ændringer i oxygen partialtrykket af en løsning måles. Den faktiske elektrode består af en platin katode og en sølv anode, der er forbundet med en KCl bro og dækket af en elektrolyt-fugtet papir (cigaretpapir) og en ilt-permeabel membran (polytetrafluorethylen membran). En spænding på 600-700 mV fører til reduktion af ilt, hvilket giver et lineært forhold mellem koncentration af ilt og spænding. Ilt elektroder findes kommercielt fra forskellige firmaer. Hvert selskab vil have sin egen instruktioner vedrørende montage og opsætning af ilt elektrode. Men generelt sølv anode og platin katode af elektrode disk skal renses ved hjælp af en elektrode rengøring kit eller et viskelæder pen før montering. Det er vigtigt at sikre, at luftboblerne ikke udgør under montagen (f.eks. mellem polytetrafluorethylen mellemgulvet og cigaretpapir). Efter samling skal elektrode disk være knyttet til mødesalen med platin katoden opad i bunden af reaktionskammeret. Salen, selv er omgivet af en vand jakke temperatur kontrol. Det er yderst vigtigt, at Parlamentet altid er tilbage fuld af vand, da membranen vil tørre ud og revne ellers. Membranen skal ligeledes ikke blive rørt af pipetter eller sprøjter, når du føjer forbindelser til kammeret, at undgå rivning.
Forud for analysen, respiration medium bør opvarmes til den samme temperatur som assay kammer (i de fleste tilfælde 25 ° C) og membranen må Blandingen henstår i respiration buffer for et par min. Efter lukning af stemplet til iltforbrug undersøgelser, bør tilsætning af effektor molekyler udføres ved hjælp af enten ikke-engangs microliter sprøjter (fx mikro sprøjter) eller engangs gel ladning pipette tips. Hvis du bruger micro sprøjter, har det sikres, at sprøjten er skylles grundigt med 100% ethanol og vand mellem tilføjelser, at undgå at forurene stamopløsninger. Dette gælder også for vask af kammeret mellem målinger. De fleste reagenser, der anvendes i ilt forbrug assays er opløseligt i vand og kan nemt fjernes ved flere skylning med vand (ca. fem gange) mellem målinger. Nogle kemikalier til assays er dog kun opløselige i organiske opløsningsmidler, såsom antimycin A, myxothiazol og nPG. Parlamentet skal derfor skylles med et organisk opløsningsmiddel (50% (v/v) ethanol) mellem assays til at fjerne resterende spor af disse molekyler, og derefter med vand (ca. fem gange) til at nedbryder restkoncentrationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer nogen interessekonflikt.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af en australsk forskning Rådet Centre of Excellence i anlægget energi biologi CE140100008, en australsk forskning Rådet fremtid Fellowship (FT130100112) til MWM og en Feodor Lynen Research Fellowship (Alexander von Humboldt Foundation, Tyskland) til JS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ADP | Sigma-Aldrich | A2754 | Chemical |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | Chemical, dissolve in ethanol |
| AOX antibody | from Tom Elthon | Elthon et al., 1989 | |
| Ascorbate | Sigma-Aldrich | A0157 | Ascorbate Oxidase from Cucurbita sp. |
| ATP | Sigma-Aldrich | A26209 | Chemical |
| Bovine serum albumin (BSA) | Bovogen | BSAS 1.0 | Chemical |
| Clarity western ECL substrate | Bio-Rad Laboratories | 1705061 | Chemical |
| Criterion Stain-Free Precast Gels 8-16% 18 Wells | Bio-Rad Laboratories | 5678104 | Chemical |
| Cyanide | Sigma-Aldrich | 60178 | Chemical |
| Cytochrome c | Sigma-Aldrich | C3131 | Chemical |
| Difco Agar, granulated | BD Biosciences | 214530 | Chemical |
| Dithiotreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | Chemical |
| EDTA disodium salt | Sigma-Aldrich | E5134 | Chemical |
| Gamborg B-5 Basal Medium | Austratec | G398-100L | Chemical |
| Gamborg Vitamin Solution (1000x) | Austratec | G219-100ML | Chemical |
| Goat Anti-Mouse IgG (H + L)-HRP Conjugate | Bio-Rad Laboratories | 1706516-2ml | Chemical |
| Goat Anti-Rabbit IgG (H + L)-HRP Conjugate | Bio-Rad Laboratories | 1706515-2ml | Chemical |
| L-Cysteine | Sigma | C7352-100G | Chemical |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 230391 | Chemical |
| Murashige & Skoog Basal Salt Mixture (MS) | Austratec | M524-100L | Chemical |
| Myxothiazol | Sigma-Aldrich | T5580 | Chemical, dissolve in ethanol |
| NADH | Sigma-Aldrich | N8129 | Chemical |
| Ndufs4 antibody | from Etienne Meyer | Meyer et al., 2009 | |
| n-Propyl gallate | Sigma-Aldrich | P3130 | Chemical, dissolve in ethanol |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | Chemical, colloidal density gradient |
| Polyvinylpyrrolidone (PVP40) | Sigma-Aldrich | PVP40 | Chemical |
| Potassium cyanide | Sigma-Aldrich | 60178 | Chemical |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | Chemical |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | Chemical |
| Sodium chloride | Chem-Supply | SA046 | Chemical |
| Sodium dithionite | Sigma-Aldrich | 157953 | Chemical |
| Sodium L-ascorbate | Sigma | A4034-100G | Chemical |
| Succinate | Sigma-Aldrich | S2378 | Chemical |
| Sucrose | Chem-Supply | SA030 | Chemical |
| TES | Sigma-Aldrich | T1375 | Chemical |
| Tetrasodium pyrophosphate (Na4P2O7 · 10H2O) | Sigma-Aldrich | 221368 | Chemical |
| Trans-Blot Turbo RTA Midi Nitrocellulose Transfer Kit | Bio-Rad Laboratories | 1704271 | Chemical |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | X100 | Chemical, detergent |
| Western Blocking Reagent | Sigma | 11921681001 | Chemical |
| Balance | Mettler Toledo | XS204 | Equipment |
| Beakers | Isolab | 50 mL | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-26XP | Equipment |
| Centrifuge tubes | Nalgene | 3117-9500 | Equipment |
| Circulator | Julabo | 1124971 | Attached to oxygen electrode chamber |
| Conical flask | Isolab | 500 mL | |
| Dropper | 3 mL | ||
| Fixed angle rotor | Beckman Coulter | JA25.5 | Equipment |
| Funnel | Per Alimenti | 14 cm | For filtering |
| Gradient pourer | Bio-Rad | 165-4120 | For preparation of gradients |
| Magnetic Stirrer ATE | VELP Scientifica | F20300165 | Equipment |
| Miracloth | VWR | EM475855-1R | Filtration material |
| Mortar and pestle | Jamie Oliver | Granite, 6 Inch | Equipment |
| O2view | Hansatech Instruments | Oxygen monitoring software | |
| Oxygraph Plus System | Hansatech Instruments | 1187253 | Clark-type oxygen electrode |
| Paintbrush | Artist first choice | 1008R-12 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | plastic paraffin film |
| Peristaltic pump | Gilson | F155001 | For preparation of gradients |
| PVC peristaltic tubing | Gilson | F117930 | For preparation of gradients |
| Water bath | VELP Scientifica | OCB | Equipment |
References
- Day, D. A. Highlights in plant mitochondrial research. Methods in molecular biology. Plant mitochondria. 1305, v-xvi (2015).
- Millar, A. H., Carrie, C., Pogson, B., Whelan, J. Exploring the function-location nexus: Using multiple lines of evidence in defining the subcellular location of plant proteins. Plant Cell. 21 (6), 1625-1631 (2009).
- Eubel, H., et al. Free-flow electrophoresis for purification of plant mitochondria by surface charge. Plant J. 52 (3), 583-594 (2007).
- Murcha, M. W., et al. Protein import into plant mitochondria: Signals, machinery, processing, and regulation. J. Exp. Bot. 65 (22), 6301-6335 (2014).
- Carrie, C., et al. Approaches to defining dual-targeted proteins in Arabidopsis. Plant J. 57 (6), 1128-1139 (2009).
- Pinto, G., Radulovic, M., Godovac-Zimmermann, J. Spatial perspectives in the redox code - Mass spectrometric proteomics studies of moonlighting proteins. Mass Spectrom. Rev. , (2016).
- Day, D. A., Neuburger, M., Douce, R. Biochemical characterisation of chlorophyll-free mitochondria from pea leaves. Aust. J. Plant Physiol. 12 (3), 219-228 (1985).
- Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Nat. Protoc. 4 (4), 484-494 (2009).
- Cheah, M. H., et al. Online oxygen kinetic isotope effects using membrane inlet mass spectrometry can differentiate between oxidases for mechanistic studies and calculation of their contributions to oxygen consumption in whole tissues. Anal Chem. 86 (10), 5171-5178 (2014).
- Chrobok, D., et al. Dissecting the metabolic role of mitochondria during developmental leaf senescence. Plant Physiol. 172 (4), 2132-2153 (2016).
- Lee, C. P., Eubel, H., O'Toole, N., Millar, A. H. Combining proteomics of root and shoot mitochondria and transcript analysis to define constitutive and variable components in plant mitochondria. Phytochemistry. 72 (10), 1092-1098 (2011).
- Lee, C. P., Eubel, H., Solheim, C., Millar, A. H. Mitochondrial proteome heterogeneity between tissues from the vegetative and reproductive stages of Arabidopsis thaliana development. J. Proteome Res. 11 (6), 3326-3343 (2012).
- Millar, A. H., Whelan, J., Soole, K. L., Day, D. A. Organization and regulation of mitochondrial respiration in plants. Annu. Rev. Plant Biol. 62, 79-104 (2011).
- Peters, K., et al. Complex I - complex II ratio strongly differs in various organs of Arabidopsis thaliana. Plant Mol. Biol. 79 (3), 273-284 (2012).
- Werhahn, W. H., et al. Purification and characterization of the preprotein translocase of the outer mitochondrial membrane from Arabidopsis thaliana: Identification of multiple forms of TOM20. Plant Physiol. 125 (2), 943-954 (2001).
- Heazlewood, J. L., Howell, K. A., Whelan, J., Millar, A. H. Towards an analysis of the rice mitochondrial proteome. Plant Physiol. 132 (1), 230-242 (2003).
