Summary
Comme les mitochondries sont seulement un petit pourcentage de la cellule végétale, ils doivent être purifiés pour une série d’études. Les mitochondries peuvent être isolés dans divers organes de la plante par homogénéisation, suivie par centrifugation en gradient de différentiel et densité afin d’obtenir une fraction mitochondriale hautement purifiée.
Abstract
Les mitochondries sont des organites essentiels impliqués dans nombreuses voies métaboliques chez les plantes, notamment la production de l’adénosine triphosphate (ATP) de l’oxydation des composés réduits tels que la nicotinamide adénine dinucléotide (NADH) et la flavine adénine dinucléotide (FADH2). L’annotation complète du génome d’Arabidopsis thaliana a mis en place il comme plante modèle système le plus utilisé, et donc la nécessité de purifier les mitochondries des divers organes (feuilles, racines ou fleurs) est nécessaire pour utiliser pleinement les outils qui sont maintenant disponibles pour Arabidopsis étudier la biologie mitochondriale. Les mitochondries sont isolées par homogénéisation du tissu en utilisant une variété d’approches, suivie d’une série d’étapes de centrifugation différentielle produisant un granulé mitochondrial brut qui est ensuite purifiée à l’aide de gradient de densité colloïdal continue centrifugation. La matière colloïdale de densité est ensuite supprimée par plusieurs étapes de centrifugation. A partir de 100 g de tissus de la feuille fraîche, 2 à 3 mg de mitochondries peuvent être régulièrement obtenu. Respiratoires expériences sur ces mitochondries affichent les taux typiques de 100-250 nmol O2 min-1 mg de protéines mitochondriales total-1 (taux de NADH-dépendante) avec la possibilité d’utiliser divers substrats et inhibiteurs de déterminer quels substrats sont être oxydés et la capacité de l’alternative et cytochrome oxydases terminales. Ce protocole décrit une méthode d’isolement des mitochondries des feuilles d’Arabidopsis thaliana en utilisant des gradients de densité colloïdal continue et une mesure efficace respiratoire des mitochondries végétales purifiée.
Introduction
L’histoire de recherche mitochondriale plante remonte à plus de 100 ans1. Les mitochondries intactes ont été isolées pour la première dans les années 1950 en utilisant la centrifugation différentielle. Mitochondries à être purifié sans souffrir l’ajustement osmotique a permis l’avènement d’un gradient de densité colloïdales dans les années 1980. Tandis que les mitochondries purifiées dégradés ne conviennent pas pour la plupart des cas, en raison de la sensibilité de la spectrométrie de masse, contaminants même relativement mineures peuvent être détectés et peuvent être affectées indûment un emplacement mitochondrial2. L’utilisation de libre circulation électrophorèse peut enlever les deux plastidique et peroxysomes contamination3, mais libre écoulement électrophorèse est une technique hautement spécialisée et n’est pas requis pour la grande majorité des études. En outre, quand déterminer l’emplacement d’une protéine, qu'il faut rappeler que double ou multiple ciblant des protéines se produit dans les cellules. Plus de 100 doubles protéines ciblées sont décrits pour les chloroplastes/plastes et mitochondries4et un certain nombre de protéines ciblées aux mitochondries et peroxysomes sont également connus5. En outre, la re-localisation de protéines sous des stimuli spécifiques, par exemple le stress oxydatif, est un thème émergent dans la biologie cellulaire6. Ainsi, l’emplacement des protéines doit être examinée dans le contexte de la biologie a étudié, et une variété d’approches sont utilisées pour déterminer et vérifier l’emplacement2.
Les mitochondries sont généralement isolés des tissus végétaux par homogénéisation, il faut un équilibre entre rupture ouverte la paroi pour libérer les mitochondries et ne pas endommager les mitochondries. Traditionnellement, avec pommes de terre et chou-fleur, homogénéisation implique l’utilisation d’appareils ménagers blender/centrifugeuse pour faire un extrait liquide dans un tampon avec différents composants pour maintenir l’activité. Isolation des mitochondries de feuilles de pois, (un matériel populaire pour isolement mitochondriale à l’aide de jeunes plants (~ 10 jours), utilise un mélangeur pour lyser les cellules car le matériel de feuille est doux. Avec la disponibilité d’insertional knock out de Arabidopsis thaliana ADN-T, la nécessité d’être en mesure de purifier les mitochondries à réaliser des études fonctionnelles a nécessité l’élaboration de méthodes pour isoler les mitochondries des feuilles, racines ou fleurs tissus. Dans l’ensemble les méthodes mises au point pour les autres plantes a travaillé bien contre7, avec l’accessoire qui broyer du matériel nécessaire pour être optimisé. Pour Arabidopsis, cela peut être réalisé de diverses façons (voir ci-dessous) et diffère entre les types de tissus (racine contre shoot). L’utilisation du gradient continu peut également être optimisée comme la densité des mitochondries des différents organes ou stades moyens ils peuvent migrer différemment. Ainsi, pour séparation maximale, la densité du gradient peut être raffinée pour faire en sorte de réaliser la meilleure séparation.
Une fois purifié la mitochondrie peut être utilisée pour une variété d’études, y compris les expériences d’absorption de protéines et ARNt, tests d’activité enzymatique, chaîne respiratoire et buvardage de western. Mitochondries isolées peuvent également servir pour les analyses de la spectrométrie de masse de l’abondance de la protéine. Ciblé plusieurs réaction suivi des analyses (MRM) permet pour la quantification des définie des protéines, mais nécessitent le développement significatif de dosage. En revanche, quantification de diméthyle ou autres isotopes étiquettes8, fournit une approche de découverte dans l’identification des différences à travers le protéome entier qui peut être utilisé pour découvrir de nouveaux points de vue biologiques.
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Protocol
Ce protocole est utilisé pour l’isolation des mitochondries intactes des organes d’Arabidopsis thaliana cultivées sur un sol à l’aide de gradients de densité colloïdal continue. Toutes les procédures après la collecte du matériel sont réalisés à 4 ° C.
1. préparation du tampon de Medium, lavage et Gradient Solutions de meulage
- Préparer 300 mL de broyage moyen (moins ascorbate et cystéine) et 200 mL de tampon de lavage x 2 après le tableau 1 , un jour avant l’isolement, les garder au froid à 4 ° C.
NOTE : Ajouter ascorbate de sodium et de la L-cystéine (base libre) à une concentration finale de 17,84 et 20,36 mM, respectivement, au milieu de broyage dans la matinée de l’isolement. Si les mitochondries sont utilisés pour la tache occidentale ou bleu natif-polyacrylamide gel analyses d’électrophorèse (BN-PAGE), composent 2 x tampon de lavage sans BSA. - Préparer des gradients dans la matinée d’isolement mitochondriale (Figure 1 et tableau 1).
- Faire les solutions lourdes et légères de gradients dans deux béchers ; 35 mL de chacune est suffisant pour deux tubes de gradients.
- Laver les chambres du bec verseur dégradé et tuyau péristaltique en PVC avec de l’eau désionisée et assurer un flux même par l’intermédiaire de la tubulure de tous les tuyaux.
- Mettre 2 tubes à centrifuger (50 mL) avec un léger angle sur la glace avec les sorties du tube péristaltique PVC collée à l’intérieur des tubes pour que la solution dégradée s’exécute sur le côté des tubes.
- Fermer la connexion entre les chambres intérieures et extérieures (levier noir vers le bas). Placez verseur dégradé sur un agitateur magnétique avec une barre de petits remous dans la chambre intérieure.
- Versez la solution dégradé lourd de 35 mL dans la chambre intérieure (chambre avec sortie tube). Diluer la solution dégradée lourde dans les tubes à deux centrifuger mis dans la glace jusqu'à ce que la moitié est restant avec le taux de pompe péristaltique rapide (300 mL/h) la valeur.
- Verser la solution de dégradé léger 35 mL dans le vase externe (chambre sans prise de tubes). Ouvrir la connexion entre les chambres (levier-poussoir noir à mi-chemin vers le haut) et permettent des solutions à mélanger doucement. Mélanger les solutions à l’aide de l’agitateur magnétique.
- Permettre les solutions couler lentement (60 mL/h) jusqu'à ce que tous le mix dégradé a été prélevée des chambres entraînant deux 0 - 4,4 % (p/v) tubes remplis de gradient de la polyvinylpyrrolidone (PVP). Garder les gradients sur la glace jusqu’au moment de l’utiliser en étape 2.12.
Remarque : Une fois que le dégradé a été établi, diluer 2 x lavage moyen à 1 x avec prérefroidies-désionisée et garder froid à 4 ° C.
2. l’homogénéisation et l’isolement mitochondriale
- Couper le tissu de rosette entière de 4 - semaine vieux Arabidopsis plantes cultivées sur le sol avec des ciseaux, au moins 80 usines sera nécessaires pour 1 prép.
NOTE : 10-14 jours vieille eau cultures, minimum de 5 pots/prep, ou 2 - semaine vieux plantules cultivées sur milieu gélosé milieu de Murashige et Skoog basale sel mélange (MS), minimum de 4 assiettes, peuvent également être utilisés. - Placer la moitié de la matière végétale qui a été coupée en petits morceaux dans un grand mortier préalablement refroidi à 4 ° C et le pilon avec 75 mL de broyage moyen (tableau 1) et moudre intensivement pendant plusieurs minutes jusqu'à ce qu’aucun des gros morceaux de tissu ne sont laissés.
- Pré mouillage 4 couches de matériau de filtration (22-25 µm taille de pore) avec support de meulage et filtrer l’homogénat à travers les 4 couches de matériau de filtration à travers un entonnoir en plastique dans une fiole conique de 500 mL.
- Broyer l’autre moitié du tissu avec un autre 75 mL de milieu de meulage.
- Combiner des homogénats dans les matériaux de filtration et filtre autant que possible homogénat à travers.
- Moudre le tissu restant restant sur le matériel de filtration à nouveau avec le restant 150 mL de mouture moyenne, filtre à nouveau dans la fiole conique de 500 mL.
- Centrifuger l’homogénat filtrée dans 8 tubes de centrifugeuse en plastique préalablement refroidie 50 mL à 2 500 g à 4 ° C dans un rotor à angle fixe pendant 5 min.
- Versez le liquide surnageant dans tubes à centrifuger propre (50 mL ; ne pas perturber la pastille verte) et centrifuger à 17 500 x g à 4 ° C pendant 20 min dans un rotor à angle fixe.
- Jeter tout sauf < 3 mL du surnageant par aspiration (ou décanter doucement sans déranger le culot). Doucement Resuspendre le culot dans le surnageant résiduel à l’aide d’un petit pinceau fin.
- Ajouter 10 mL de 1 x tampon de lavage à chaque tube et combiner 4 tubes en tube 1 centrifugeuse propre (c'est-à-dire, donnant 2 tubes).
- Remplir ces tubes de 50 ml de tampon de lavage 1 x et répétez les étapes 2,7 à 2,9.
- Piscine bruts granulés mitochondriales dans 1 tube à l’aide d’un compte-gouttes et dispersent uniformément avec le pinceau fin (une petite quantité du tampon de lavage peut-être être utilisée mais le volume final doit être inférieur à 3 mL pour s’adapter sur le dessus de la pente). La couche doucement la suspension mitochondriale avec un compte-gouttes sur les gradients PVP 0 - continus 2 4,4 % (p/v).
- Équilibrer les tubes en poids (à l’aide de 1 x tampon de lavage) et centrifuger à 40 000 x g à 4 ° C pendant 40 min. Vérifiez que la pause est éteint. Mitochondries vont migrer vers une bande au bas du tube, ou peuvent être présents dans la solution lourde au fond du tube (identifié par une bande nuageuse, jaunâtre ; La figure 2).
- Retirez soigneusement les 5 cm supérieur de solution au-dessus de la bande mitochondriale par aspiration.
- Distribuer le reste de la solution contenant les mitochondries dans 2 tubes propres et remplir avec 1 x tampon de lavage. Répartir uniformément le gradient de densité colloïdales et des mitochondries en couvrant l’embouchure du tube avec un film de paraffine en plastique et en retournant plusieurs fois. Centrifuger 15 min à 31 000 x g à 4 ° C avec freinage lent.
Remarque : Avant la centrifugation, assurez-vous que les mitochondries et le gradient de densité colloïdal restantes sont réparties uniformément. Dans le cas contraire, le gradient de densité colloïdal peut se concentrer au fond du tube et empêcher la granulation des mitochondries. - Retirez le surnageant par aspiration, remplir le tube avec lavage 1 x jusqu'à 50 mL de tampon, puis retournez à nouveau pour assurer un mélange. Centrifuger 15 min à 31 000 x g à 4 ° C avec freinage lent.
- Aspirer le surnageant et recueillir les pellets mitochondriales en aussi petit un volume (~ 500 µL) possible à l’aide d’une pipette avec mis à jour le 200 µL conseils (coupés la pointe un peu au-dessus de son extrémité pour augmenter son ouverture). Placer les mitochondries dans un tube de 1,5 mL et le maintenir sur la glace pour une utilisation immédiate ou conserver à-80 ° C.
Remarque : Si vous servira des mitochondries pour sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel électrophorèse (SDS-PAGE), BN-PAGE ou analyses immunoblot, 1 x tampon de lavage sans BSA utilisent pour les liquides de lavage finales (c.-à-d., étape 2.15 et 2.16). - Déterminer la concentration de protéines des mitochondries à l’aide de la méthode de Bradford.
Remarque : Pour les aliquotes de BN-PAGE centrifuger à 4 ° C et pellet magasin à-80 ° C jusqu'à l’utilisation. Pour la mesure de la consommation d’oxygène, seuls les mitochondries fraîchement isolées peuvent être utilisés.
3. les mesures de consommation d’oxygène
NOTE : La consommation d’oxygène par fraîchement isolées plante mitochondries peuvent être analysées avec une électrode à oxygène de type Clark, permettant la détermination de mitochondrial intact, l’activité cytochrome c voie et l’activité de la voie alternative.
- Installation du logiciel
- Installer sous licence oxygène surveillance logiciel sur l’ordinateur utilisé pour la mesure de la consommation d’oxygène.
- Préparation du milieu de respiration, substrats, solutions chimiques de stock et la sonde à oxygène de type Clark
- Préparer le support de la respiration (300 mM de sucrose, 10 mM NaCl, 5 mM KH2PO4, 2 mM MgSO4, 0,1 % (p/v) d’albumine sérique bovine (BSA), 10 mM TES (pH 7,2)) utilisé pour des essais de consommation d’oxygène.
- Préparer des substrats, inhibiteurs et effecteurs utilisés pour mesurer la respiration mitochondriale (tableau 2). Ceux-ci peuvent être préparés plus tôt et conservés à-20 ° C.
NOTE : Neutraliser le pH des solutions acides tels que les acides organiques à pH 7,0 avec NaOH avant utilisation. - Chauffer le milieu de la respiration à la même température que la chambre de test (25 ° C).
- Assembler la sonde à oxygène de type Clark comme décrit dans le protocole du fabricant.
- Placer 1 mL d’eau saturée d’air (l’eau saturée d’air est obtenue en agitant vigoureusement une petite quantité d’eau déionisée dans une fiole conique de grande) dans la chambre de mesure. Pour basculer sur l’agitateur, cliquez sur le bouton de « Vitesse d’agitation ». Cliquez sur le bouton « On » et régler la vitesse de l’agitateur à 65 tr/min. Cliquez sur « OK » pour continuer. Remuer l’eau continuellement à 25 ° C.
- Étalonnage de la sonde à oxygène
- Chauffer l’eau qui est utilisée pour l’étalonnage à la même température que la chambre de test (25 ° C).
- Attendez que le courant à stabiliser et à calibrer la sonde à oxygène.
- Pour démarrer l’étalonnage de la sonde à oxygène, cliquez sur le bouton de « Calibrer », sélectionnez « Calibrage de Phase liquide », puis « Air saturées eau. »
- Une nouvelle fenêtre s’ouvrira (oxygène Calibration (Phase liquide) - étape 1 de 5). Sélectionnez le canal à étalonner (le canal de) que la boîte de commande d’électrode est attachée) et entrez les variables (définies « Température de la chambre » à 25 ° C et la « Pression atmosphérique » à 101,32 kPa). Cliquez sur « OK « pour continuer.
- Dans la prochaine étape (étape 2 de 5), le programme d’installation de la vitesse d’agitation (65 tr/min) et cliquez sur « OK » pour continuer.
- À l’étape 3 de 5, attendez le signal atteindre un plateau. Le terme « Plateau atteint, appuyez sur OK pour continuer » s’affiche dans la boîte. Cliquez sur « OK » pour continuer.
- À l’étape 4 de 5, établir zéro d’oxygène dans la chambre en ajoutant le dithionite de sodium 5 mg. Cliquez sur « OK » pour continuer.
Remarque : Une baisse de la concentration d’oxygène doit être visible dans la trace et devrait atteindre 0. - Dans la dernière étape de calibrage (étape 5 de 5), attendez le signal atteindre un plateau. Le terme « Plateau atteint, appuyez sur OK pour continuer » s’affiche dans la boîte. Cliquez sur « OK » pour continuer.
- Cliquez sur « Calibrage de sauver » pour enregistrer l’étalonnage. Une nouvelle fenêtre s’ouvrira. Cliquez sur « OK » pour confirmer pour enregistrer le nouveau calibrage de la boîte de contrôle de l’oxygène.
Remarque : Après l’étalonnage réussi, l’étiquetage « oxygène (nmol/mL) » s’affiche sur l’axe y. - Après calibration, nettoyer la chambre de mesure en rinçant la chambre avec de l’eau (au moins 5 - 10 fois) afin d’assurer un nettoyage correct. Placez 1 mL de milieu de respiration dans la mesure de chambre et laisser la membrane s’équilibrer pendant quelques minutes jusqu'à ce que la trace de la consommation d’oxygène est linéaire.
- Adapter la balance de la trace de la consommation d’oxygène pour obtenir une vue de la bonne pente. Cliquez sur « Zoom XY » et entrez les variables (valeur « Oxygen » 0 - 300 et le « axe du temps » de 0 à 45 min).
- Détermination de l’intégrité mitochondriale
- Avec piston ouvert, ajouter 970 µL de milieu de respiration d’air saturé à la chambre de réaction.
- Ajouter 30 µL isolé mitochondries ou 150 µg de protéines mitochondriales déterminée après l’isolement des mitochondries (protéine totale doit être inclus dans les calculs par la suite) à la chambre de réaction à l’aide d’une pipette avec une pointe coupée.
- Agiter la suspension mitochondriale en continu avec un agitateur magnétique bar (65 tr/min) à 25 ° C à air-saturer la solution.
- Sceller la chambre avec le piston, cliquez sur « Start Recording » pour enregistrer la consommation d’oxygène et permettre la consommation d’oxygène stabiliser (1-2 min).
- Déterminer le taux de consommation d’oxygène manuellement après l’ajout d’ascorbate de 10 mM et 25 µM cytochrome c pendant 5 min obtenir le taux « avant détergent ».
Remarque : Pour spécifier que l’addition de substrats, inhibiteurs et effecteurs directement dans la trace, cliquez sur le bouton « Ajouter événement marque » et saisissez la désignation étiquette correspondante. Cliquez sur « OK » pour continuer. - Déterminer le taux de consommation d’oxygène manuellement pendant 3 min après l’ajout de détergent de 0,05 % (v/v) pour donner le rythme « après détergent ». Cliquez sur « Arrêter l’enregistrement ».
- Cliquez sur le bouton « Tarifs de la Table de modifications ». 2 curseurs apparaissent comme des lignes verticales sur l’écran graphique. Cliquer et glisser les deux curseurs de taux aux postes requis dans la trace pour définir l’intervalle de taux. Déplacer l’intervalle de vitesse le long de la trace à l’aide du curseur gauche taux. Définissez l’intervalle de taux lui-même en utilisant le curseur de droite taux. L’oxygène automatiquement le logiciel de surveillance dessine une ligne de régression entre les deux curseurs tout en déplaçant les curseurs d’intervalle de vitesse le long de la trace.
- Une fois que l’intervalle de taux souhaité et la position a été définie, entrer le taux dans la table avec un clic droit sur 1 des 2 curseurs et sélectionnez « Ajouter le taux à Table. » Cliquez sur le bouton « Ajouter » pour confirmer pour afficher la vitesse sur le tableau principal taux.
- Calculer l’intégrité mitochondriale en divisant le taux « avant détergent » par le taux « après détergent », exprimé en pourcentage et il en soustraire 100.
- Détermination de la respiration mitochondriale
- Avec piston ouvert, ajouter 970 µL de milieu de respiration d’air saturé à la chambre de réaction. Ajouter 500 µM ATP et 30 mitochondries µL isolé ou 150 µg de protéines mitochondriales en utilisant une pipette avec une pointe coupée au milieu de la respiration dans la chambre de réaction.
- Agiter la suspension mitochondriale en continu à l’aide d’un agitateur magnétique bar (65 tr/min) à 25 ° C.
- Piston à proximité, cliquez sur « Start Recording » pour enregistrer la consommation d’oxygène et attendre 1-2 min pour le taux de consommation d’oxygène stabiliser (lorsque la trace de la consommation d’oxygène est linéaire). Ajouter succinate de 5 mM. Enregistrer le taux de consommation d’oxygène pendant environ 2 min.
Remarque : Pour spécifier que l’addition de substrats, inhibiteurs et effecteurs directement dans la trace, cliquez sur le bouton « Ajouter événement marque » et saisissez la désignation étiquette correspondante. Cliquez sur « OK » pour continuer. - Ajouter 1 mM l’adénosine diphosphate (ADP). Continuer à enregistrer le taux de consommation d’oxygène pendant 2 min.
- Ajouter 1 mM NADH. Enregistrer le taux de consommation d’oxygène pendant 4 à 8 min. Ce taux est la capacité de respiration par l’intermédiaire de la cytochrome oxydase.
- Ajouter 1 mM le cyanure de potassium (KCN) (ou 2,5 µM myxothiazol ou 5 µM antimycine A) pour inhiber la voie du cytochrome c et continuer d’enregistrer pendant environ 2 min observer la consommation d’oxygène par l’intermédiaire de l’oxydase alternative.
- Ajouter 5 mM le dithiothréitol (DTT) et pyruvate de 10 mM pour activer complètement l’oxydase alternative. Continuer à enregistrer pour les 5-7 min : il s’agit de la capacité de l’oxydase alternative.
- Ajouter 500 µM n-propyl gallate (nPG) et d’enregistrer pendant 2 min. Cela évalue le taux de consommation d’oxygène résiduel qui ne peut être inhibée chimiquement. Soustrayez ce taux depuis les autres taux enregistrés, car il n’est pas susceptible d’être mitochondriale à l’origine. La consommation d’oxygène produisent encore après l’inhibition du cytochrome c et voie AOX (par KCN et nPG) est très probablement provenir des peroxydases présents comme contaminants dans les mitochondries isolées9.
- Cliquez sur « Arrêter l’enregistrement ».
- Cliquez sur le bouton « Tarifs de la Table de modifications » et entrer le taux dans la table avec un clic droit sur l’un des deux curseurs, puis sélectionnez « Ajouter des taux à Table ». Cliquez sur le bouton « Ajouter » pour confirmer pour afficher la vitesse sur le tableau principal taux.
Remarque : Lorsque ajoutant effecteurs dissous dans des solvants organiques (p. ex.., l’antimycine A, nPG, myxothiazol), la chambre et le piston doivent être rincés avec de l’éthanol et puis de l’eau pour assurer un nettoyage correct.
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Representative Results
Utilisant ce protocole, nous avons été en mesure de détecter différentes protéines mitochondriales par SDS-PAGE et immunoblotting. Comme le montre la Figure 3 a, la protéine isolée du tissu de la culture de l’eau est suffisante pour détecter une faible bande (2 µg). Intensité du signal augmente proportionnellement aux montants chargés. Pour les mitochondries isolées des tissus cultivés sur des plaques (Figure 3 b), la réponse au stress léger élevé traitement dans différents génotypes peut être analysé par immunodétection avec des anticorps de l’oxydase alternative.
Le caractère intact des mitochondries, l’activité cytochrome c voie et voie alternative peut être mesuré à l’aide d’échantillons mitochondriales fraîchement isolées. Intégrité mitochondriale est bien préservée pendant la procédure d’isolement décrites (Figure 4 a). Ajout de différents substrats, inhibiteurs et effecteurs aux mitochondries isolées, la consommation d’oxygène par le biais de la voie du cytochrome c et de la voie de l’oxydase alternative est influencée (Figure 4 b).
Figure 1 : le programme d’installation pour la préparation des gradients. A gauche : Tubes à centrifuger (50 mL) avec un léger angle mis dans la glace avec PVC tube péristaltique sorties scotchées à l’intérieur des tubes ; Au milieu : Pompe péristaltique ; Droit : Verseur de dégradé au sommet d’un agitateur magnétique contenant le gradient lourd (chambre intérieure) et des solutions de gradient de lumière (chambre extérieure). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Purification des mitochondries de l’Arabidopsis tire à l’aide d’un continu 0 - gradient de densité colloïdal 4,4 % (p/v) PVP/28%. La bande verte sombre est les thylakoïdes et autres contaminations comme indiqué dans la partie supérieure des solutions dégradées. Fraction mitochondriale est apparu comme une bande de blanc-verdâtre plus près vers le bas du tube. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : séparation des protéines mitochondriales par SDS-PAGE et immunodétection utilisant des anticorps spécifiques. (A) les mitochondries isolées de deux semaines cultivées en eau Arabidopsis thaliana sauvages de type (Columbia-0, Col-0) les plantes sont soumises à SDS-PAGE et hybridés avec des anticorps dirigés contre une sous-unité de NADH : ubiquinone oxydoréductase (S4 Ndufs4, At5g67590). Poids moléculaire marqueurs non colorées ont été chargés sur le couloir extérieur du gel et la dimension des bandes représentant dix sont indiqués en kilo Daltons (kDa). La masse moléculaire apparente de la protéine Ndufs4 détectée est 18 kDa. Abondance de protéine est montré par rapport à la valeur de 2 µg de protéines totales. (B) deux semaines plants cultivés sur B5 de Gamborg médias Gélose 3 % (p/v) de sucrose et 0,8 % (p/v) ont été exposés à 750 µE m-2 s-1 mettre en surbrillance (HL) et récolté après 6 h. mitochondries ont été purifiées et les protéines mitochondriales sont séparés par SDS-PAGE et hybridés avec des anticorps contre l’oxydase alternative (AOX). La présence d’une protéine d’AOX immunodétectable avec une masse moléculaire apparente de 34 kDa est indiquée. Abondance de protéine est montré par rapport à la valeur du contrôle (2 µg). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Traces représentatives de la consommation de2 O en isolé plant mitochondries. (A) les mitochondries isolées de plantes de type sauvage d’Arabidopsis thaliana (Col-0), comme indiqué ci-dessus ont été analysés pour l’intégrité de la membrane externe avant la mesure de la consommation d’oxygène. 30 µL de mitochondries isolées (150 µg total protéines mitochondriales) ont été utilisés. Intégrité mitochondriale a été déterminée comme 90 % comme décrit ci-dessus. Oxygène (B) mesures de consommation ont été effectuées en utilisant 30 µL d’isolé des mitochondries (150 µg total protéines mitochondriales) des plantes de type sauvage d’Arabidopsis thaliana . La respiration mitochondriale totale et la voie AOX ont été déterminés. Partir de ces données, la consommation d’oxygène par le biais de la voie du cytochrome c et de la voie AOX peut être déterminée. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Support de meulage | |
| Produit chimique | Concentration de |
| Saccharose | 0,3 M |
| pyrophosphate de tétrasodium (Na4P2O7 · 10 H2O) | 25 mM |
| Sel de disodium EDTA | 2 mM |
| Phosphate monopotassique (KH2PO4) | 10 mM |
| Polyvinylpyrrolidone (PVP40) | 1 % (p/v) |
| Albumine sérique bovine (BSA) | 1 % (p/v) |
| Eau désionisée | |
| Ajuster le pH à 7,5 (avec HCl) | |
| Remarque : pour 300 mL mouture moyenne, 1,06 g ascorbate de sodium (concentration finale : 17,84 mM) et la cystéine 0,74 g (concentration finale : 20,36 mM) sont ajouté just avant son utilisation. Vérifier le pH après addition et ajustez 7,5 avec 1 NaOH M si nécessaire. | |
| Tampon de lavage 2 X | |
| Produit chimique | Concentration de |
| Saccharose | 0. 6 M |
| TES | 20 mM |
| Albumine sérique bovine (BSA) | 0,2 % (p/v) |
| Eau désionisée | |
| Ajuster le pH à 7,5 (à l’aide de NaOH) | |
| Gradients | |
| Solution de Gradient lourde (4,4 % (p/v) PVP) | 2 tubes de gradients |
| Tampon de lavage 2 X | 17,5 mL |
| Gradient de densité colloidial | 9,8 mL |
| PVP-40 (20 % (p/v)) | 7,7 mL |
| Solution dégradé clair (0 % (p/v) PVP) | 2 tubes de gradients |
| Tampon de lavage 2 X | 17,5 mL |
| Gradient de densité colloidial | 9,8 mL |
| Eau désionisée | 7,7 mL |
Tableau 1 : Composition des tampons et des dégradés utilisés pour isoler les mitochondries.
| Abréviation | Concentration des solutions mères | Stockage | Concentration finale | Volume ajouté pour la réaction de 1 ml | |
| Substrats | |||||
| Le cytochrome c | Cyt c | 2,5 mM (H2O) | -20 ° C | 25 ΜM | 10 μl |
| NADH | NADH | 0,1 M (H2O) | -20 ° C | 1 mM | 10 μl |
| Succinate | Succ | 500 mM (H2O) | -20 ° C | 5 mM | 10 μl |
| Inhibiteurs de la | |||||
| Antimycine A | AA | 1 mM (en EtOH) | -20 ° C | 5 ΜM | 5 μl |
| Cyanure | KCN | de 100 mM (H2O) | 4 ° C | 1 mM | 10 μl |
| Myxothiazol | Myxovirus | 500 μM (EtOH) | -20 ° C | 2,5 ΜM | 5 μl |
| n-Propyl gallate | nPG | de 100 mM (EtOH) | -20 ° C | 500 ΜM | 5 μl |
| Effecteurs | |||||
| ADP | ADP | de 100 mM (H2O) | -20 ° C | 1 mM | 10 μl |
| Ascorbate de | ASC | 500 mM (H2O) | Faire des frais sur le jour d’utilisation | 10 mM | 20 μl |
| ATP | ATP | de 100 mM (H2O) | -20 ° C | 500 ΜM | 5 μl |
| Dithiotreitol | TNT | 1 M (en H2O) | Faire des frais sur le jour d’utilisation | 10 mM | 10 μl |
| Pyruvate | Pyr | 1 M (en H2O) | -20 ° C | 10 mM | 10 μl |
| Détergent | 10 % (v/v) (en H2O) | 4 ° C | 0,05 % (v/v) | 5 μl | |
Tableau 2 : Liste des substrats, des inhibiteurs et des effecteurs utilisés pour la mesure de la consommation d’oxygène.
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Discussion
En règle générale, isolation des mitochondries de l’Arabidopsis laisse rendements jusqu'à 3 mg de mitochondries d’environ 80-100 3 - 4 - semaine vieilles centrales, bien que les rendements de plus de 5 mg est possible souvent avec ponçage minutieux. Le rendement varie en fonction des conditions de croissance et diminue considérablement comme feuilles sénescentes, bien que la structure de la mitochondrie semble être bien entretenu au cours de la sénescence,9. Une des caractéristiques plus importantes pour obtenir un bon rendement est la méthode de broyage pour lyser les cellules pour libérer des mitochondries. Même si un certain nombre d’appareils de broyage mécaniques est disponible à l’achat, pour Arabidopsis broyage dans un mortier et un pilon réalise régulièrement de bons résultats en termes de rendement, car il lyse les cellules avec peu de dommages aux organites. Alors que les moulins mécaniques sont rapides, dont ils ont besoin d’optimisation et la quantité de mouture requise peut varier selon les tissus. Avec un mortier et un pilon, il souvent commode et plus efficace si le tissu est découpé ou couper avec un couteau ou des ciseaux avant broyage. Comme indiqué, toutes les mesures devront être effectuées à 4 ° C et tout le processus depuis la fin du broyage à l’obtention d’une pastille lavée de mitochondries purifiées devrait prendre environ 4 h. Comme les traces de détergents ou d’autres réactifs sur tubes ou dégradés verseurs peuvent réduire considérablement le rendement, tous les composants utilisés dans les présentes procédures sont lavés sans détergent et non utilisés dans d’autres procédures. Enfin, il est important que les mitochondries sont suffisamment séparés les autres fractions du gradient pour leur permettre d’être retiré et lavé. S’ils sont trop près du bas du tube, cela signifie que le mélange des solutions légères et lourdes doit être ajustée, afin de permettre plus de la solution lourde à verser avant de mélanger. À l’inverse, si la bande apparaît diffuse et est élevée dans le tube, le mélange doit se faire un peu plus tôt.
La méthode décrite ici peut servir facilement pour l’isolation des mitochondries de Arabidopsis fleurs et racine tissu11,12. Pour les racines, il est commode de croître en culture hydroponique et besoin 100 g de poids frais d’obtenir des quantités de 2 mg de mitochondries. Pour broyer les racines doivent être coupées en petits morceaux avant broyage dans un mortier et un pilon, et augmentation des rendements peuvent être obtenues en re-broyage des tissus racinaires, dans un mortier et un pilon ou dans un mixeur. Pour tissus floraux où la fonction mitochondriale est souvent renforcée13, broyage avec un mortier et un pilon fonctionne bien, mais la quantité limitée de matériel signifie qu’une grande quantité de plantes doit être cultivé pour récolter des tissus. Les mitochondries ont été isolées de divers organes de Arabidopsis à l’aide de méthodes similaires ou légères modifications14,15 et du riz (Oryza sativa)16.
Les limites de la méthode décrite ci-dessus sont i) les grandes quantités de semences nécessaires pour isoler mitochondriale, ii) seulement des tissus spécifiques de Arabidopsis et le riz appliquée dans cette méthode d’isolement, iii) petites quantités de divers contaminants (tels que les protéines peroxysomales) existaient encore dans les mitochondries purifiées. Mitochondries obtenues selon les méthodes décrites ci-dessus ne conviennent pas pour une variété d’études, allant des études d’absorption de l’oxygène aux analyses quantitatives spectrométrie de masse de l’abondance de la protéine. Gradient de mitochondries purifiées contiendra toujours des petites quantités de divers contaminants, tels que les protéines peroxysomales3. Une comparaison avec les listes d’organelle définie peut servir à déterminer les changements dans les protéines mitochondriales, tant que le degré de saleté de protéines non-mitochondriale est faible (< 10 %) et on a comparé des échantillons similaires, donc le type et le degré de protéines non-mitochondriale est similaire. Analyses de l’abondance de la protéine par SDS-PAGE ou d’autres approches à base de gel peuvent être effectuées avec des quantités relativement faibles de mitochondries (2-20 µg), utilisant des quantités variables de mitochondries pour vérifier la linéarité de la détection de l’anticorps (Figure 3). Alors que les porines (voltage dependent anion channel (CAVD)) est souvent utilisé comme un contrôle de chargement pour la quantification, dans notre expérience, l’abondance relativement importante de cette protéine peut signifier que la réponse n’est pas toujours linéaire si de grandes quantités de protéines sont chargées sur le gel , donc la linéarité de la réponse immunitaire doit toujours être vérifiée lors de l’utilisation de ces contrôles de chargement. L’importance de cette approche consistant à isoler les mitochondries, c’est que contrairement aux gradients qui utilisent le saccharose comme le matériau pour former le gradient de densité, gradients de densité colloïdal ne nécessitent pas osmotique réajustement des mitochondries purifiés comme il faut avec saccharose. Cela signifie qu’il y a moins de chances de se rompre les mitochondries purifiées et après le lavage pour enlever la matière colloïdale de densité, ils peuvent être directement utilisés dans une variété de tests ou d’applications.
Taches de tissu, où protéines mitochondriales sont détectés dans des extraits de feuille ou d’un tissu entiers, sont une approche intéressante pour mesurer la quantité de protéines mitochondriales dans ce tissu. Étant donné le volume généralement faible des mitochondries par rapport aux autres organites, la détection des protéines mitochondriales sur tissus entiers extraits doit être interprétée avec une certaine prudence, comme protéine mitochondriale peut être au-delà de la détection dans ces approches. Attention contrôles, où les mitochondries purifiées sont PST1 ainsi que des extraits de tissus afin d’assurer la migration identique et la linéarité de la détection, doivent effectuer d’avoir confiance dans ces approches.
Avec l’aide d’une électrode à oxygène de type Clark, changements dans la pression partielle d’oxygène d’une solution peuvent être mesurées. L’électrode réel se compose d’une platine cathode et une anode en argent, qui sont reliés par un pont de KCl et couverts par un papier imbibé d’électrolyte (papier à cigarettes) et une membrane perméable à l’oxygène (membrane de polytétrafluoroéthylène). Une tension de 600-700 mV conduit à la réduction de l’oxygène, ce qui donne une relation linéaire entre la concentration d’oxygène et de tension. Électrodes à oxygène sont disponibles dans le commerce de différentes compagnies. Chaque société a ses propres instructions concernant l’assemblage et l’installation de la sonde à oxygène. Cependant, en général l’argent anode et la cathode platine du disque électrode besoin d’être nettoyés à l’aide d’une électrode de nettoyage kit ou un stylo effaceur devant l’Assemblée. Il est important de veiller à ce que les bulles d’air ne forment pas pendant le montage (par exemple entre la membrane de polytétrafluoroéthylène et le papier à cigarettes). Après le montage, le disque de l’électrode doit être affecté à la chambre avec la platine cathode vers le haut à la base de la chambre de réaction. La chambre elle-même est entourée d’une chemise d’eau assurant le contrôle de la température. Il est extrêmement important que la chambre reste toujours pleine d’eau, étant donné que la membrane se dessécher et le crack sinon. De même, la membrane ne doit pas être touchée par des pipettes ou des seringues lors de l’ajout de composés à la chambre, pour éviter les déchirures.
Avant l’essai, le milieu de la respiration doit être réchauffé à la même température que la chambre de dosage (dans la plupart des cas 25 ° C) et la membrane puissent s’équilibrer dans le tampon de la respiration pendant quelques minutes. Après essais de fermeture le piston à la consommation d’oxygène, l’ajout de molécules effectrices procéder à l’aide de seringues microlitres non jetables (p. ex. micro seringues) ou gel de chargement des pointes de pipette jetable. Si vous utilisez des seringues micro, il faut s’assurer que la seringue est complètement rincée avec 100 % d’éthanol et d’eau entre les ajouts, pour éviter de contaminer les solutions mères. Cela vaut aussi pour le lavage de la chambre entre les différentes mesures. La plupart des réactifs utilisés pour des tests de consommation d’oxygène sont solubles dans l’eau et peuvent facilement être enlevés par plusieurs rinçage avec de l’eau (environ cinq fois) entre les différentes mesures. Toutefois, certains produits chimiques utilisés pour les essais ne sont solubles dans des solvants organiques comme l’antimycine A nPG et myxothiazol. Par conséquent, la chambre doit être rincée avec un solvant organique (éthanol à 50 % (v/v)) entre dosages pour enlever les traces résiduelles de ces molécules, puis avec de l’eau (environ cinq fois) pour épuiser les résidus.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Cette étude a été financée par un australien recherche Conseil Centre d’Excellence en usine énergie biologie CE140100008, une australienne Conseil avenir bourse de recherche (FT130100112) pour MWM et une bourse de recherche Feodor Lynen (Alexander von Humboldt Fondation, Allemagne) au JS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ADP | Sigma-Aldrich | A2754 | Chemical |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | Chemical, dissolve in ethanol |
| AOX antibody | from Tom Elthon | Elthon et al., 1989 | |
| Ascorbate | Sigma-Aldrich | A0157 | Ascorbate Oxidase from Cucurbita sp. |
| ATP | Sigma-Aldrich | A26209 | Chemical |
| Bovine serum albumin (BSA) | Bovogen | BSAS 1.0 | Chemical |
| Clarity western ECL substrate | Bio-Rad Laboratories | 1705061 | Chemical |
| Criterion Stain-Free Precast Gels 8-16% 18 Wells | Bio-Rad Laboratories | 5678104 | Chemical |
| Cyanide | Sigma-Aldrich | 60178 | Chemical |
| Cytochrome c | Sigma-Aldrich | C3131 | Chemical |
| Difco Agar, granulated | BD Biosciences | 214530 | Chemical |
| Dithiotreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | Chemical |
| EDTA disodium salt | Sigma-Aldrich | E5134 | Chemical |
| Gamborg B-5 Basal Medium | Austratec | G398-100L | Chemical |
| Gamborg Vitamin Solution (1000x) | Austratec | G219-100ML | Chemical |
| Goat Anti-Mouse IgG (H + L)-HRP Conjugate | Bio-Rad Laboratories | 1706516-2ml | Chemical |
| Goat Anti-Rabbit IgG (H + L)-HRP Conjugate | Bio-Rad Laboratories | 1706515-2ml | Chemical |
| L-Cysteine | Sigma | C7352-100G | Chemical |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 230391 | Chemical |
| Murashige & Skoog Basal Salt Mixture (MS) | Austratec | M524-100L | Chemical |
| Myxothiazol | Sigma-Aldrich | T5580 | Chemical, dissolve in ethanol |
| NADH | Sigma-Aldrich | N8129 | Chemical |
| Ndufs4 antibody | from Etienne Meyer | Meyer et al., 2009 | |
| n-Propyl gallate | Sigma-Aldrich | P3130 | Chemical, dissolve in ethanol |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | Chemical, colloidal density gradient |
| Polyvinylpyrrolidone (PVP40) | Sigma-Aldrich | PVP40 | Chemical |
| Potassium cyanide | Sigma-Aldrich | 60178 | Chemical |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | Chemical |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | Chemical |
| Sodium chloride | Chem-Supply | SA046 | Chemical |
| Sodium dithionite | Sigma-Aldrich | 157953 | Chemical |
| Sodium L-ascorbate | Sigma | A4034-100G | Chemical |
| Succinate | Sigma-Aldrich | S2378 | Chemical |
| Sucrose | Chem-Supply | SA030 | Chemical |
| TES | Sigma-Aldrich | T1375 | Chemical |
| Tetrasodium pyrophosphate (Na4P2O7 · 10H2O) | Sigma-Aldrich | 221368 | Chemical |
| Trans-Blot Turbo RTA Midi Nitrocellulose Transfer Kit | Bio-Rad Laboratories | 1704271 | Chemical |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | X100 | Chemical, detergent |
| Western Blocking Reagent | Sigma | 11921681001 | Chemical |
| Balance | Mettler Toledo | XS204 | Equipment |
| Beakers | Isolab | 50 mL | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-26XP | Equipment |
| Centrifuge tubes | Nalgene | 3117-9500 | Equipment |
| Circulator | Julabo | 1124971 | Attached to oxygen electrode chamber |
| Conical flask | Isolab | 500 mL | |
| Dropper | 3 mL | ||
| Fixed angle rotor | Beckman Coulter | JA25.5 | Equipment |
| Funnel | Per Alimenti | 14 cm | For filtering |
| Gradient pourer | Bio-Rad | 165-4120 | For preparation of gradients |
| Magnetic Stirrer ATE | VELP Scientifica | F20300165 | Equipment |
| Miracloth | VWR | EM475855-1R | Filtration material |
| Mortar and pestle | Jamie Oliver | Granite, 6 Inch | Equipment |
| O2view | Hansatech Instruments | Oxygen monitoring software | |
| Oxygraph Plus System | Hansatech Instruments | 1187253 | Clark-type oxygen electrode |
| Paintbrush | Artist first choice | 1008R-12 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | plastic paraffin film |
| Peristaltic pump | Gilson | F155001 | For preparation of gradients |
| PVC peristaltic tubing | Gilson | F117930 | For preparation of gradients |
| Water bath | VELP Scientifica | OCB | Equipment |
References
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