Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Isolering og dyrkning af neurale stamceller efterfulgt af kromatin-Immunoprecipitation af Histon 3 lysin 79 Dimethylation Mark

Published: January 26, 2018 doi: 10.3791/56631
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1
1Institute for Anatomy and Cell Biology, Department of Molecular Embryology, Faculty of Medicine, University of Freiburg, 2Faculty of Biology, University of Freiburg

Summary

Vi præsenterer en effektiv og reproducerbar metode til at isolere og kultur neurale stamceller fra embryonale og postnatal hjernevæv for kromatin immunoprecipitation (ChIP) af Histon 3 lysin 79 dimethylation (H3K79me2) - en Histon mark ligger inden for den kugleformede domæne af Histon 3.

Abstract

Hjernens udvikling er en kompleks proces, der styres i et temporo-rumlige måde af forløb af morphogens og forskellige transcriptional programmer. Derudover har epigenetiske kromatin ændringer, ligesom Histon methylering, en vigtig rolle for etablering og vedligeholdelse af specifikke celle skæbner i denne proces. Langt størstedelen af Histon methylering opstår på fleksible Histon hale, som er tilgængelige for Histon modifikatorer, viskelædere og Histon læseren proteiner. Derimod H3K79 methylering er placeret i den kugleformede domæne af Histon 3 og er involveret i forskellige udviklingsmæssige funktioner. H3K79 methylering er evolutionært bevaret og kan findes i en bred vifte af arter fra Homo sapiens at Saccharomyces cerevisiae. Ændringen indtræder i forskellige cellepopulationer i organismer, herunder neurale stamceller. Placeringen af H3K79 methylering i domænet kugleformede af Histon 3 gør det vanskeligt at vurdere. Her præsenterer vi metoder til at isolere og kultur kortikale stamfader celler (CPCs) fra embryonale kortikale hjernevæv (E11.5-E14.5) eller cerebellare kornede neuron stamfaderen (CGNPs) fra postnatal væv (P5-P7), og effektivt immunoprecipitate H3K79me2 for kvantitativ PCR (qPCR) og genome-wide sekventering.

Introduction

De sensoriske, motoriske og kognitive funktioner i hjernen er meget komplekse og modtagelige for fysiske og miljømæssige ændringer. Hjernen består af tre almindelige dele den hind-, midt-, og forhjernen, som er dybt forbundet. Inden for forhjernen, kan telencephalon opdeles i en dorsal telencephalon (DT) og en ventral telencephalon (VT). DT af mus består af seks kortikale lag, som er dannet mellem E11.5 og E18.5 i en "inside-out" måde1. VT omfatter de ganglionære eminences i udvikling, som senere danner de basale ganglier2,3. Flere celletyper kan klassificeres i pattedyr centralnervesystemet som neuroner, astrocytter, og oligodendrocytes4, der udvikler sig i en temporo-rumlige måde5. Først, de neurale stamceller (NPC) give anledning til forskellige former for neuroner, interneurons i VT og projektion neuroner i DT, og senere videre til glial celler (f.eks., astrocytter6). Under kortikale udvikling, den mest overfladiske lag (lag jeg), som indeholder Cajal-Retzius celler, dannes først. Derefter, mellem E12.5 og E14.5, NPCs generere dybere neuronal lag (VI, V) mens mellem 14,5 og 16,5, stamfaderen giver anledning til øverste lag (IV-II) neuroner7,8. Neuronal identitet er angivet ved forskellige morphogen-induceret temporo-rumlige transcriptional programmer og desuden epigenetiske programmer2.

Lillehjernen, som er impliceret i motor koordinering, ligger i baghjernen og udvikler mellem E10 og groft P20 i mus9. Det indeholder den cerebellare cortex og de cerebellare kerner10. Voksen cerebellare cortex består af tre lag, den yderste molekylære lag, Purkinje cellelag og den inderste granulerende lag indeholdende granulerede neuroner10. De cerebellare granula celler er de mindste neuroner og udgør omkring 80% af alle neuroner i hvirveldyr hjernen11. De udvikle sig fra prækursorer placeret i den ydre germinal zone og vandrer gennem Purkinje cellelag til deres destination12. Ligesom i telencephalon, udvikling af lillehjernen er reguleret af flere vigtige morphogens, defineret som har specifikke tid - og rum-afhængige funktioner og indlede transcriptional programmer10.

Udviklingen af kortikale og cerebellare lag kontrolleres af transcriptional udtryk for specifikke morphogens og således af kromatin staten af DNA. I en forenklet visning, kan kromatin stater opdeles i euchromatin som transcriptionally aktive og heterochromatin som transcriptionally tavs regioner. Nucleosome som den grundlæggende enhed af kromatin indeholder to kopier af hver kerne Histon H2A, H2B, H3 og H4, omgivet af 147 basepar af DNA13. Histoner er stærkt post-translationally ændret ved methylering, acetylation, fosforylering, ubiquitination, sumoylation, ADP-ribosylation, deamination og prolin isomerisation14,15. Histon lysin methylering er anset for at være den mest stabile Histon ændring, der styrer transskription, replikering, rekombination16, DNA-skade svar17og genomisk prægning18. Lysines kan være mono-, di- eller tri-methylerede19 og vises ikke kun på de tilgængelige Histon haler, men også inden for domænet kugleformede histoner20. Specifikke methylations på H3K4 og H3K36 er især forbundet med euchromatin, specifikke methylations på H3K9, H3K27 eller H4K20 er hovedsageligt findes i heterochromatic regioner, selv om alle rester er placeret inden for Histon hale14, 19,21. H3K79 methylering er placeret inden for domænet Histon kugleformede og har været forbundet med transcriptional aktivitet, men også med transcriptionally inert genomisk regioner22. Ændringen er evolutionært bevaret, da det er blevet observeret i gær, kalv thymus, kylling og menneskelige23. H3K79 mono-, di- og trimethylation (H3K79me1, me2, me3) er katalyseret af Histon methyltransferases DOT1L24,25 og nukleare sæt domæne indeholdende Protein 2 (Nsd2)26. DOT1L er impliceret i spredning, DNA reparation og cellulære reprograming27. Tab af Dot1l i mus fører til en prænatal død omkring udviklingsstadiet E10.528,29. Under udvikling af hjertet og myocardiocyte differentiering er DOT1L afgørende for gen expression forordning30. I det centrale nervesystem, DOT1L funktion kan være impliceret i neuralrøret udvikling31, det er involveret i undertrykke Tbr1-udtryk under forhjernen udvikling32, og kan fungere i reguleringen af ER-stress svar gener33. Kontekst-afhængige aktivering eller undertrykke handling af H3K79me, især med i vivo situationer som udvikling af det centrale nervesystem, er til dato kun delvist forstået32. Da H3K79 methylering er placeret i domænet kugleformede af Histon 3, er det sterically mindre tilgængelige i forhold til ændringer på fleksible Histon haler23. For at forstå funktionen af H3K79 methylering, er pålidelig og reproducerbar analysemetoder til at bestemme dens placering og genomisk miljø nødvendige. I denne metoder papir præsenterer vi isolation metoder til forskellige neurale stamceller (CPC'er for cortex) og CGNPs til lillehjernen, effektiv DOT1L-hæmmer behandling, og en ChIP metode til at analysere H3K79 methylering via qPCR eller sekvensering på andet tidspunkt punkter i løbet af kortikale og cerebellare udvikling. En oversigt over protokollen og dens muligheder, se figur 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dyrevelfærd udvalg af universitetet i Freiburg og lokale myndigheder godkendt alle dyreforsøg (G12/13, G16/11), nævnt i følgende protokol.

1. præparater

  1. Forberedelserne til CPCs isolation
    1. Oprette timet parring for at opnå embryoner på forskellige stadier af cortex udvikling (mellem E11.5 og E14.5). Bruge mus af stammen NMRI (Naval Medical Research Institute), som er mindst 8 uger gamle. Efter parring, overveje en positiv vaginal stik på E0.5.
    2. For at få nok materiale, skal du bruge et kuld af NMRI mus til én H3K79me2 ChIP fra cortex af E12.5 eller E14.5. For senere vorden, bruge et kuld mere ChIP analyser (gennemsnitlig kuldstørrelse NMRI: 10 embryoner).
    3. Precool Hank´s Balanced Salt løsning (HBSS) og fosfatbufferet saltopløsning (PBS) til 4 ° C (langtidsopbevaring på RT).
    4. Blandingen henstår i 4 ° C gemt Trypsin-EDTA (0,05% w/v) til 37 ° C.
    5. Forbered kortikale-celle medium (CCM): Supplere medium til neuroner (Se Tabel af materialer) med endelige koncentrationer af 2% (v/v) B-27 supplement, 5 µg/mL Apo-Transferrin, 1 µg/mL glutathion, 0,5 mM L-glutamin, 0,8 µg/mL superoxiddismutase, og 1% (v/v) Penicillin-Streptomycin-Neomycin antibiotika blanding. Opbevares ved 4 ° C. For eksperimentet, reagensglasset medium til 37 ° C.
    6. Tø føtalt kalveserum (FCS), alikvot det (50 mL hver), og Blandingen henstår en alikvot til 37 ° C (langvarig opbevaring ved-20 ° C).
    7. Forberede bestande af DNAse 1 (10 mg/mL) i H2O på cellekultur. Butik alikvoter ved-20 ° C.
    8. Hvis det er nødvendigt, opløses de specifikke DOT1L hæmmere EPZ-5676 eller SGC0946 i DMSO til en bestand koncentration på 100 mM. Anvende en ende koncentration på 1-5 µM til cellerne på dag 0 og genanvende hæmmer hver to dage.
    9. For CPC-dyrkning, pels celle kultur plader (6 nå eller 12 godt) med poly-L-ornithin hydrobromid (1 mg/mL i 150 mM borsyre pH 8.4) i mindst 1 time på RT og bagefter med laminin (1 mg/mL) i CCM medium ved 37 ° C natten over.
  2. Forberedelserne til CGNP isolation
    1. Organisere en passende parring af mus til at generere P5-P7 dyr til isolation af lillehjernen (3-5 dyr pr. ChIP og betingelse).
    2. Forbered HBSS/Glucose ved at tilføje 6 mg/mL glukose til HBSS buffer.
    3. Forbered CGNP cellekulturmedium (CGM) ved at tilføje 1% (v/v) N2 supplement, 1% (v/v) Penicillin-Streptomycin-Neomycin, 25 mM KCl og 10% FCS DMEM-F12. CGNP dyrkning forberede CGM medium uden FCS men herunder 0,6 µg/mL sonic hedgehog (SHH) (CGM-SHH) og reagensglasset det 37 ° C når det er nødvendigt.
    4. Pels 6-godt celle kultur plader med 100 µg/mL poly-D-lysin for 1-2 h i RT om glia-celle fjernelse. Bagefter vaskes to gange med steril ddH2O og lad pladerne tørre. Gemme pladerne for maksimal en uge ved 4 ° C.
    5. Til dyrkning af CGNPs pels 6-godt celle kultur plader med poly-L-ornithin (0,1 mg/mL) ved 4 ° C natten over. Bagefter vaskes to gange med H2O for cellekultur og lad pladerne tørre.
      Bemærk: Pladerne kan opbevares i maksimalt én uge ved 4 ° C.
    6. Forberede 0.025% trypsin (w/v) i HBSS/Glucose og reagensglasset det 37 ° C når det er nødvendigt.
  3. Forberedelserne til ChIP af H3K79me2
    1. Forberede PFA (1% i PBS, pH 8) frisk før crosslinking kromatin. For at forberede PFA varme 50 mL PBS i mikrobølgeovnen til maksimalt 65 ° C. Tilføje 0,5 mg PFA til PBS under konstant omrøring. Derefter tilsættes 50 µL 10 M NaOH og vente, indtil PFA er opløst. Bagefter, tilføje 42,5 µL HCl (37% v/v) til at få en pH på 8. Kontrollere pH igen og lad 1% PFA løsningen nå RT.
    2. Forberede bestande af RNase (1 mg/mL) og Proteinase K (20 µg/µL) separat i sterile ddH2O. gemme alikvoter ved-20 ° C.
    3. Forberede følgende buffere og reagenser: PBS, som indeholder 0,02% Tween, lysisbuffer, glycin, fortynding buffer, ChIP buffer 1, ChIP buffer 2, ChIP buffer 3 og TE buffer og gemme dem på 4 ° C. Forberede eluering buffer frisk hver gang.
      1. Forberede PBS, som indeholder 0,02% Tween. Venter på de fleste uges ved 4 ° C.
      2. Forberede lysisbuffer bruger 50 mM Tris på pH 8,0, 10 mM EDTA, 1% (w/v) sodium dodecyl sulfat (SDS) og 1 x Protease inhibitor.
      3. Forberede 2,5 M Glycin.
      4. Forbered fortynding buffer ved hjælp af 20 mM Tris ved pH 8.0, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% (v/v) Triton X-100, 0,25% (w/v) SDS og 1 x Protease inhibitor.
      5. Forbered ChIP buffer 1 ved hjælp af 20 mM Tris ved pH 8.0, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% (v/v) Triton X-100 og 0,2% (w/v) SDS.
      6. Forbered ChIP buffer 2 bruge 20 mM Tris pH 8,0, 500 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% (v/v) Triton X-100 og 0,2% (w/v) SDS.
      7. Forberede ChIP buffer 3 bruger 20 mM Tris pH 8,0, 250 mM LiCl, 2 mM EDTA, 1% (v/v) NP-40, og 1% (w/v) SDS.
      8. Forberede TE buffer ved hjælp af 20 mM Tris pH 8,0 og 2 mM EDTA.
      9. Forberede frisk eluering buffer indeholdende 1% (w/v) SDS, 100 mM NaHCO3.

2. neurale stamfader Isolation af hjernevæv

  1. Isolation og valgfri dyrkning af CPCs
    1. Aflive de gravide dyr af cervikal dislokation og overførsel af embryoner til iskolde HBSS.
    2. Fjerne kraniet med saks og isolere hjernen, derefter fjerne meninges, eventuelt med lille pincet og isoleres cortex (hele, DT eller VT) af begge hjernehalvdele ved at fjerne alle andre hjerne dele under kikkert anvendelsesområde ved hjælp af lille pincet og, hvis nødvendigt, lille saks. Gemme de isolerede cortex i 5 mL HBSS buffer ved 4 ° C i en 15 mL tube.
    3. Centrifugeres isolerede hjernen materiale i 5 min på 1.000 x g og 4 ° C.
    4. Vaske cortex med 5 mL iskold HBSS og homogeniseres dem med 1 mL pipette spids af pipettering op og ned. Hvis det er nødvendigt, skåret spidsen af pipetten tip.
    5. Centrifugeres den homogeniserede prøve for 5 min på 1.000 x g og 4 ° C. Fjerne HBSS.
    6. Tilføj 3 mL Trypsin og inkuberes prøve for 5 min ved 37 ° C.
    7. Tilsæt 1 mL FCS, 5 mL CCM og 30 µL af DNase 1 til prøven og homogeniseres prøve med 5 mL glas pipette af pipettering forsigtigt op og ned.
    8. Centrifugeres de isolerede celler i 5 min ved 1000 x g og 4 ° C. Kassér supernatanten, tilsættes 5 mL CCM og homogeniseres prøven igen.
    9. Fortynde en alikvot af prøven og tæller det med en Neubauer tælle-kammer. Et gennemsnitligt beløb på 4,5 x 106 celler pr. embryo forventes. Til dyrkning af isolerede CPCs fortsætte med trin 2.1.10. For ChIP, straks gå videre med trin 3.
    10. For dyrkning, plade CPC'er på poly-L-ornithin (0,1 mg/mL) og laminin (1 mg/mL) belagt retter med en tæthed mellem 8 x 104 og 2,5 x 105 celler/cm2 i CCM medium og dem der inkuberes ved 37 ° C, 5% CO2og 100% relativ luftfugtighed.
    11. Da CPCs begynder at differentiere sig til neuroner i cellekultur (efter ca 4 dage), overveje dissektion dato som dagen in vitro- 0 (dag 0). For længere betingelserne for dyrkning, ændre halvdelen af medium hver fjerde dag med frisk CCM medium.
    12. Anvend 1-5 µM SGC0946 eller EPZ5676 opløst i DMSO på dag 0 (4-5 h efter celle isolation) og opdatere det hver anden dag. Bruge DMSO som en kontrol behandling. Teste effektiviteten af inhibitor behandling via standard immunblot metoder, hvis det kræves.
  2. Isolation og valgfri dyrkning af CGNPs
    1. Aflive P5-7 dyr ved halshugning ved hjælp af saks. Fjerne hovedbund huden, åbne kraniet og fjerne hjernen ved hjælp af lille saks og pincet. Isolere lillehjernen og overføre det til iskolde HBSS/Glucose. Fjern alle meninges og blodkar og overføre cerebella i 15 mL rør fyldt med kold HBSS/Glucose.
    2. Vask cerebella tre gange med 10 mL iskold HBSS/Glucose (indsamle dem ved centrifugering ved 650 x g i 5 min. ved 4 ° C) og homogeniseres cerebella efterfølgende af pipettering forsigtigt op og ned med 1 mL pipette (maksimalt 2 - 3 gange) at få 0,5-1 mm3 fragmenter.
    3. Der tilsættes 5 mL af 0.025% trypsin i HBSS/Glucose og inkuberes vævet under konstant omrøring i et 37 ° C vandbad i 15 min. Stop fordøjelsen ved at tilføje 5 mL af CGM og indsamler væv ved centrifugering ved 650 x g i 5 min. ved 4 ° C.
    4. Fjern supernatanten og hakkede væv med 1 mL pipette spids i 1 mL CGM og overføre det til en ny 15 mL tube.
      Bemærk: Det er vigtigt at undgå luftbobler.
      1. Der tilsættes 5 mL CGM og inkuberes blanding for 2 min på is at bilægge væv rester. Overføre supernatanten ind i en ny 15 mL rør. Der tilsættes 2 mL CGM til de resterende væv og Gentag proceduren for ændring.
    5. (Uden væv rester, ca. 10 mL i alt) Supernatanterne samles og centrifugeres ved 650 x g i 5 min. ved 4 ° C til at indsamle de cerebellare celler. Resuspenderes i 10 mL CGM.
    6. Da astrocytter overholder hurtigere og stærkere poly-D-lysin end CGNPs, plade celler på 100 µg/mL poly-D-lysin belagt 6-well-plader (op til 4 mL pr. brønd), og der inkuberes i 20 min. ved 37 ° C til at fjerne astrocytter.
    7. Ryst pladen og indsamle supernatanten. Derefter centrifugeres ved 650 x g i 5 min. ved 4 ° C i en 15 mL tube. Resuspenderes i 10 mL CGM og tælle cellerne med en Neubauer tælle kammer.
      Bemærk: CGNPs er runde, lille, og vise en glorie når afbildet ved hjælp af fase kontrast mikroskopi.
    8. Hvis påkrævet, frø celler i 37 ° C pre varmede CGM på poly-L-ornithin-belagte plader (3 x 106 celler pr. 6-godt) og dem der inkuberes ved 37 ° C, 5% CO2 og 100% relativ luftfugtighed.
      Bemærk: Hvis seeding ikke er udført, fortsætte til trin 3.1.
      1. Efter 6-12 h, udveksling medium til CGM-SHH. Behandle den isolerede CGNPs 6 h (eller når du skifter til CGM-SHH) efter isoleret med DOT1L-hæmmer og DMSO kontrollere og forny det hver anden dag (Sammenlign med 2.1.12). Teste effektiviteten af inhibitor behandling via standard immunblot metoder, hvis det kræves. For ChIP, gå videre med trin 3.3.
        Bemærk: Forlader CGM på pladerne (og med at FBS) vil resultere i differentiering af CGNPs til cerebellare kornede neuroner (CGNs).

3. fiksering af celler og klipning af kromatin

Bemærk: Udfør trin 3.1 og 3.2, hvis celler ikke er kulturperler, hvis de er Fortsæt til trin 3.3.

  1. Indsamle cellerne ved centrifugering i 4 min på 1.000 x g og tilføje 1,3 mL PBS. Overføre prøven til et 1,5 mL tube. Der centrifugeres i 4 min på 1.000 x g ved 4° C. Vask prøve to gange med 1,3 mL PBS.
  2. Kritiske trin: Tilføje 350 µL 1% PFA til prøven og der inkuberes i 5 min. ved 22 ° C. For at stoppe reaktionen, tilføje 18,4 µL glycin, og 1 mL PBS. Centrifugeres prøven i 5 min på 1.000 x g ved 4 ° C.
    1. Vask prøve to gange med iskold PBS. Indsamle de faste celler ved centrifugering i 5 min på 1.000 x g og 4 ° C. Holde prøver på is fra nu af.
      Bemærk: Fiksering tid skal være netop 5 min at få optimale resultater. Forskellige celle numre kan kræve tid tilpasninger.
  3. Kritiske trin: Kulturperler CGNPs (eller CPC), tilføje op til 1 mL 1% PFA direkte til celle kultur plade brønde. Efter en 5 min inkubation ved 22 ° C, tilføje en passende mængde af glycin og PBS og høste cellerne med en celle skraber.
    1. Overføre cellerne i 1,5 mL rør og centrifugeres prøven i 5 min på 1.000 x g og 4 ° C. Vask prøve to gange med iskold PBS. Indsamle de faste celler ved centrifugering for 5 minat 1.000 x g ved 4 ° C. Holde prøver på is fra nu af.
  4. Kritiske trin: Tilføje 700 µL af lysisbuffer (+ protease hæmmer) og inkuberes prøven i 15 min. ved 4 ° C. Vortex prøve hver 5 min. Shear kromatin lysed celleområde 3 x 10 min i sonikator (30 s puls, 30 s pause) ved maksimal effekt.
    1. Sikre, at lydstyrken ikke overstiger 350 µL pr. rør. Vortex prøver hver 10 min. Tjek lysate for resterende kerner med et fasekontrast mikroskop.
      Bemærk: Det er vigtigt at få optimal klipning resultater (Sammenlign med figur 1B) til senere analyse. Ved hjælp af andre metoder for klipning af kromatin, optimere klipning til kromatin fragmenter størrelse mellem 200-500 bp.
  5. Pellet celle rester for 10 min, 13.000 x g, 4 ° C. Bruge supernatanten for trinnet preclearing 5.2. Fryse prøve ved-20 ° C til senere brug, hvis det er nødvendigt.

4. forberedelse af perler og Preclearing

  1. Vaske 45 µL protein A magnetiske perler/ChIP og 20 µL magnetiske perler/prøve med 1 mL iskold PBS indeholdende 0,02% Tween tre gange ved hjælp af en magnetisk stand. Derefter tilsættes 1 mL iskold PBS til perlerne.
  2. 1 mL iskold PBS og 45 µL perler/ChIP, tilføje 3 µg af antistof/ChIP (H3K79me2 eller kanin IgG). Inkuber prøver i 2 timer ved 4 ° C på en rotator binde antistoffer til perlerne. Afhængigt af antistof, bruge ~ 3 µg antistof/ChIP.
  3. Vask antistof-bundet-perler tre gange med 1 mL iskold PBS indeholdende 0,02% Tween. Tilføje den passende perle volumen (begyndende volumen af magnetiske perler bruges) iskold PBS til vasket antistof-kombineret-perlerne.
  4. Tilføje 600 µL af fortynding buffer og 20 µL af vasket magnetiske perler til prøven for preclearing (samlede volumen 1.320 µL) og inkuberes i 2 timer ved 4 ° C på en rotator. Fjerne perler ved hjælp af en magnetisk stand. Tage 5% (33 µL) af lysates som input prøver og fryse dem ved-20 ° C.

5. kromatin Immunoprecipitation

  1. Opdele den precleared uddrag i to rør (ca 643.5 µL), tilføje den samme mængde af fortynding buffer og antistof-bundet-perler (45 µL/prøve; H3K79me2 eller kanin IgG). Inkuber prøver ved 4 ° C natten over på et rotator.
  2. Vaske perlerne iskold ChIP buffer 1, ChIP buffer 2 og ChIP buffer 3 til 10 min ved 4 ° C på en rotator. Bagefter vaskes tre gange med TE buffer i 5 min. ved 4 ° C på en rotator.
  3. Elueres perler med eluering buffer for 1 h på 1400 rpm i en shaker ved stuetemperatur.
  4. Tilføje 10 µg RNase (1 mg/mL) pr. ChIP prøve og 5 µg til de input prøver og inkuberes prøver i 30 minutter ved 37 ° C (1400 rpm).
  5. Tilføj 100 µg Proteinase K (20 µg/µL) pr. ChIP prøve og 50 µg pr. input og inkuberes natten over ved 65 ° C ved 1.400 omdrejninger.

6. rensning af ChIP prøver

  1. Rense ChIP og input prøver med en DNA rensning kit (Se Tabel af materialer) Ifølge manualen. Bruge flere rensning kolonner, når mere end 5 µg DNA forventes. Elueres prøve med 2 x 15 µL DNA eluering buffer findes i kit.
  2. Udføre kvantificering af prøverne (brug 1 µL) ved hjælp af en visualisering fluorophore og en fluorospectrometer (Se Tabel af materialer).

7. analyse af ChIP prøver via qPCR

  1. Primer design for qPCR analyse, hente genomiske sekvenser af interesse fra Integrativ genomforskning Viewer (IGV) browser34. Design primere omkring transcriptional startsted (TSS) af et gen, da H3K79me2 er tilbøjelige til at blive placeret der. Som et kontrolelement, skal du overveje ikke-kodende genomisk regioner eller regioner omkring 10 Kb opstrøms af TSS eller 10 Kb nedstrøms transcriptional afslutning site (TES).
    1. Generere primere med https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ ved hjælp af en produktstørrelse mellem 70 og 200 bp og en optimal temperatur forudindstillet på 60 ° C. Til forsøgsformål, brug primere for genomisk regionerne Aft4, Ddit3, Scd1, Aft3, og Npm1 i tabel 1anførte.
  2. Teste nydesignede primere med følgende qPCR program, master mix og en udgloedning temperaturgradient mellem 58 og 63 ° C, og vælg den udgloedning temperatur med den højeste produktantal og kvalitet.
    1. Anvende DNA gelelektroforese for at kontrollere det forventede produktstørrelse. For qPCR analyse, bruge en Real-Time PCR Detection System (Se Tabel af materialer).
    2. Forberede master mix med 10 µL DNA polymerase master mix, 0,5 µL primer frem (10 µM), 0,5 µL primer omvendt (10 µM), 4 µL nukleasen-gratis vand og 5 µL DNA (1 ng/µL).
    3. Bruge en 2-trins qPCR program som følger: 5 min. ved 95 ° C, 50 x (30 s ved 95 ° C, 30 s på 58 ° C - 63 ° C), og denaturering gradient konstant ved 4 ° C.
  3. Oprette en fortyndingsrække af genomisk, afrevne, oprenset DNA-prøver (2 ng/µL, 1 ng/µL, 0,5 ng/µL, 0,25 ng/µL og 0,125 ng/µL) og bruge 5 µL for en effektiv test ved hjælp af qPCR. Bestemme hældningen af standardkurven og beregne primer effektivitet ved følgende formel:
    Effektivitet (%) = (10^(-1/slope)-1) * 100.
    1. Bruge primere med effektivitetsgevinster mellem 90 og 105% i sag ideel eller på mindst med effektivitetsgevinster mellem 85 og 115%.
  4. For at analysere ChIP og input prøver, anvender 0,1-1 ng af ChIP DNA blandet med respektive forward og reverse primer, nukleasen-gratis vand og DNA polymerase master mix i en endelige mængden af 20 µL for hver qPCR reaktion.
  5. Bestemme tærskelværdierne på cyklus (Ct) af ChIP og input prøver og normalisere prøve Ct Ct værdier af input til at beregne berigelse (% input) med følgende formel. Brug Ct værdier fremstillet af IgG kontrol at bestemme baggrunden.
    % input = 100-2^(norm. input − normen. ChIP)
    normen. input = Ct (input) − log2(fortyndingsfaktoren)
    normen. ChIP = Ct (ChIP) − log2(fortyndingsfaktoren)
    Bemærk: normen. = normaliseret

8. analyse af ChIP prøver via sekventering

  1. Overføre ChIP prøver (input og immunoprecipitated DNA-prøve) til en sekvensering facilitet.
  2. For at forberede et bibliotek på forhånd, brug en passende bibliotek forberedelse kit (Se Tabel af materialer) og konvertere 2 ng af input DNA og alt af immunoprecipitated DNA i indekserede biblioteker for næste generation multiplex sekventering på den angivet platform (Se Tabel af materialer).
  3. Kritiske trin: Ligate sekventering adaptere (med en arbejdsgruppe koncentration på 15 µM) for at afslutte repareret og dA-tailed DNA fragmenter efter instruktionerne kit. Sekventering adaptere og PCR bruge primere passende oligos (Se Tabel af materialer). For dette beløb af input DNA, kan bruge 6-9 PCR cykler for at berige adapter forbundet DNA fragmenter.
    Bemærk: Normalt, det er ikke nødvendigt at udføre en størrelse udvælgelse af adapter forbundet DNA. Det er bedst at bruge så få PCR cykler som muligt, da mange PCR forstærkning cyklusser resultat i PCR dubletter og en høj GC bias.
  4. En endelige bibliotek check, tager 0,5 µL af den samlede reaktion for analyse at visualisere størrelse distribution på en passende anordning (Se Tabel af materialer). For kvantificeringen, skal du bruge en visualisering farvestof i kombination med en fluorospectrometer eller andre metoder (Se Tabel af materialer).
  5. Eftersom H3K79me2 synes at være en Histon ændring, som er bredt spredes over større genomisk regioner, sekvens af prøver parret-ende med et Læs længde af 50 bp og med en sekventering dybde af 75 Mio læser.
  6. Analysere ChIP-seq data med Galaxy/Uni Freiburg Server (galaxy.uni-freiburg.de).
  7. Udføre kvalitetskontrol med fremstillet ChIPseq med FastQC, og hvis det er relevant, knytte dem direkte med Bowtie2 version 2.2.035 med eller uden trimning. Som reference genom forsamling bruge mm9 eller den nyeste version mm10; og som reference annotering Ensembl FTP frigive 79.
  8. Valgfrit: Fjern læse dubletter ved hjælp af Picard MarkDuplicates (http://broadinstitute.github.io/picard) før peak kald.
  9. Kalde toppe med MACS2 version 2.1.036 ved hjælp af indstillingen "brede" for H3K79me2.
  10. For at få en log2 forholdet mellem ChIP og input prøve, log2 antal læsninger af læst forholdet mellem begge prøver bruge BamCoverage og BamCompare.
  11. For alle andre dybdegående ChIP-seq specifikke analyse, gælde deepTools2 version 2.3.5 eller 2.4.137, dvs at generere dækning spor filer (bamCoverage for chippen kun, bamCompare for sammenligning af ChIP til input), for at anslå chippen ydeevne bruger plotFingerprint og til at generere en generel oversigt bruger computeMatrix, plotHeatmap. Vælg K-mean klyngedannelse i løbet af computeMatrix proces at klynge genomisk regioner i henhold til H3K79me2 fordelingen.
  12. Brug offentliggjort ChIP-seq data som H3K79me2 af E14.5 DT deponeret på NCBI til forsøgsformål (stammesamlingsnummer: SRP057733).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Generelle ordning af neurale stamceller isoleret, dyrkning, H3K79me2 ChIP og ChIP analysemetoder: Figur 1 viser et rutediagram til at udføre H3K79me2 ChIP af kortikale stamceller på forskellige tidspunkter i løbet af embryonale hjernens udvikling eller af cerebellare kornede neuron ophav i postnatal faser. Som et første skridt, hjernen skal isoleres og telencephalon (mellem E11.5 og E14.5) eller lillehjernen (P5-P7) har at blive genfundet. Det er muligt at analysere de forskellige regioner i telencephalon ved at opdele det i DT og VT. Bagefter vil homogeniseret væv og neurale stamfaderen adskilt. Nu, er det muligt at kultur stamceller og behandle dem med DOT1L hæmmere. En anden mulighed er at lave stamfaderen direkte og underkaste dem ChIP procedure. For ChIP, vil kromatin forskydes i fragmenter af 200-500 bp og inkuberes efterfølgende med magnetisk koblede perler antistof mod H3K79me2. Efter vask perlerne og hentning af DNA, kan udfældet DNA analyseres ved sekventering eller qPCR (figur 1A). Det er vigtigt at have en god fordeling af kromatin fragmenter efter klipning, så det er tilrådeligt at tjekke fragment størrelse med DNA gelelektroforese eller med andre metoder (eksempler i figur 1B). Når du vælger genome-wide sekventering, vil ChIP-seq-læser til H3K79me2 belægning blive leveret som en fastq-fil til videre analyse (figur 1 c). Kvaliteten af Sekventeringen læser behov skal vurderes ved anvendelse af FastQC, og hvis det er nødvendigt, fastq-filer kan trimmes ved hjælp af TrimGalore. Tilknytning til Mus musculus genom mm9 eller mm10 kan udføres med Bowtie2 og styres via PlotFingerprint. Det er tilrådeligt at fjerne dubletter med MarkDuplicates og normalisere læsninger af BamCoverage og sammenligne ChIP til input prøverne med BamCompare. ChIP-seq læser kan efterfølgende være visualiseret genom bred i heatmaps eller gene-wise i Integrativ genomforskning Viewer (IGV) browsersessioner.

CPC kultur og DOT1L hæmning: CPCs var isoleret og behandlet med 5 µM DOT1L hæmmer SGC0946 på dag 0 og 2. Opløsningsmidlet DMSO blev brugt som et kontrolelement. På dag 3, CPCs er høstet, proteiner var isoleret, kvantificeres og analyseres via immunblot (figur 2A). Figur 2A viser, at H3K79me2 niveauer effektivt faldt efter tre dage af CPC-dyrkning og DOT1L hæmning at sikre en effektiv inhibitor behandling ordning. Protein mængden af H3, GAPDH eller Tubulin-alpha tjener som lastning kontrol var dermed ikke svækket. Immunfarvning af faste CPCs med antistoffer mod aktive caspase 3 (CASP3 +) til påvisning af apoptose og HuC/D til at visualisere neuronale celler anført at behandling af CPCs med DOT1L hæmmer førte til øget celledød efter tre dage i kultur, som vist i figur 2B. Kvantificering af de celler, som er CASP3 +/ DAPI + eller HuC/D +/ DAPI + inden for CPC kultur afsløret en betydelig stigning af CASP3 + celler afslører programmeret celledød ved DOT1L hæmning. Antallet af HuC/D-positive neuroner, men forblev uændret (figur 2 c).

H3K79me2 ChIP-qPCR af Aft4, Ddit3, Scd1, Aft3, og Npm1 fra CPCs behandlet med DOT1L hæmmer: til at teste, hvis SGC0946 hæmmer behandling af DOT1L var effektiv og førte til en reduktion af H3K79me2 på specifikke gener, vi udførte en ChIP analyse efterfulgt af qPCR CPC behandlet for 3 dage. Kanin IgG blev brugt som en spånkontrol. Da det er kendt, at H3K79me2 er placeret på de endoplasmatic stress-responderende generne Aft4, Ddit3, Scd1, og Aft3 samt på det nukleare transport gen Npm133,38, brugte vi qPCR primere dækker TSS, TES og genomisk regioner inden for gen organer for at finde ud af forskellene i H3K79me2 fordeling efter DOT1L hæmning (figur 3A). Gener med et højt H3K79me2 fald i første omgang såsom Atf4, Ddit3, og Npm1 var mest lydhør over for hæmmer behandlingen, så at tre dage af hæmning af DOT1L førte til et betydeligt i H3K79me2. Gener med en lavere H3K79me2 dækning, som Atf3 og Scd1, viste ingen væsentlige ændringer i H3K79me2 niveauer.

Oversigt af H3K79me2 ChIP-seq analyse: Genom-dækkende analyse af H3K79me2 niveauer i CPCs fra E14.5, udført og analyseret ifølge præsenteres ordninger og protokoller (figur 1), viste en meget høj kvalitet ChIP. Mens binned tæller, sorteret efter deres hyppighed af de input læser i Fingerprint skamplet (figur 4A), var jævnt fordelt, H3K79me2 tællinger viste berigelse på bestemte områder (placeringer rangeret med 1), der viser vellykkede ophobning af kromatin fragmenter ændret på H3K79. Et heatmap af H3K79me2 langs gener mellem deres TSS og deres TES og +/-10Kb opstrøms eller nedstrøms viser (figur 4B) at H3K79me2 toppe omkring TSS og faldt over TES i almindelighed. Der er gener, som er helt dækket med H3K79me2, og gener, som har et højdepunkt inden for regionen TSS. Endoplasmatic-stress relaterede gener såsom Atf4, Ddit3, og nucleophosmin Npm1 havn, for eksempel, et højt H3K79me2 niveau på TSS, der er kun lidt faldt langs hele genet kroppen (figur 4 c). Scd1 har derimod en lav H3K79me2 belægning på TSS og ingen H3K79me2 inden for selve genet. Atf3 som et sidste eksempel har forskellige skarpe og lavt niveau H3K79me2 toppe langs selve genet.

Figure 1
Figur 1: ordning af H3K79me2 ChIP protokol fra isolerede CPC'er eller CGNPs og rutediagram sekventering analyse. (A) oversigt over præsenteres protokol. For CPC isolation, første E14.5 hjerner vil være isolerede og cortex kan opdeles i DT og VT, hvis nødvendigt. For CGNPs har cerebelli skal hentes fra P5-P7 mus. Vævet bliver homogeniseret, stamfaderen adskilt, og derefter cellerne kan kulturperler og behandlet med en passende hæmmer eller direkte bruges til ChIP. For ChIP, er fiksering af kromatin efterfulgt af klipning og immunoprecipitation med en anti-H3K79me2 antistoffer og kanin IgG som kontrol. Efter DNA-oprensning, ChIP prøver kan analyseres via biblioteket forberedelse og sekventering eller kan analyseres via qPCR. (B) eksempler på passende og upassende kvalitet kromatin. DNA fragment fordeling er vist i bp. (C) ChIP-seq resultater kan underkastes en analyse pipeline på Freiburg/Galaxy server. Efter en kvalitetskontrol (FastQC), kan læser pyntet med TrimGalore og derefter knyttes via Bowtie2 til musen genom (i præsenteres tilfælde mm9). PlotFingerprint evaluerer kvaliteten af chippen. Hvis du vil definere toppe for H3K79me2, kan MACSpeaks anvendes. For normalisering BamCoverage og til sammenligning med de input BamCompare er anvendelige. For at visualisere resultater IGV er browser og heatmaps passende. Forventede filformater er kursiv. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: kortikale stamfader kultur og DOT1L hæmning. (A) Immunoblots viser H3K79me2 niveauer i CPC på E14.5 efter DOT1L hæmning for 3 dage (dag 3, n = 3-11) i forhold til kontrolelementet DMSO. H3, GAPDH og Tubulin alpha blev brugt som lastning kontrol. (B) Immunocytological farvning af en CPC-kultur dage 2 og 3. Aktiveret Caspase 3 (CASP3 grøn)-positive celler og neuroner (HuC/D: rød) var plettet. DAPI (blå) blev brugt til at visualisere cellekerner. Skalalinjen: 100 µm. (C) kvantificering af immunostainings præsenteret i (B). Forholdet mellem positive celler til CASP3 +/ DAPI + eller HuC/D +/ DAPI + i procent er givet. Til statistisk analyse, blev uparrede Student's t-test udført. p < 0,01 **. Dette tal blev ændret fra Roidl et al. 33 , 38 Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: H3K79me2 ChIP-qPCR af Aft4, Ddit3, Aft3, Scd1, og Npm1 fra CPCs behandlet med DOT1L hæmmer. (A) E14.5-afledte CPCs blev behandlet med 5 µM DOT1L hæmmer 4-5 h efter isolation og for anden gang på dag 2 i kultur. CPCs var fastsat på dag 3, som blev efterfulgt af kromatin udvinding, ChIP eksperiment og qPCR. Resultaterne er repræsenteret som middelværdi (+/-SEM) % input (n = 3). IgG blev brugt som en negativ kontrol. Middelværdien af IgG-niveau er afbildet som stiplet linje. Til statistisk analyse, blev to-vejs ANOVA anvendt. p < 005 *; p < 0,01 **, p < 0,001 ***; TSS transcriptional startsted, TES transcriptional ende websted. Dette tal blev ændret fra Roidl et al. 33 , 38 Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: oversigt over H3K79me2 ChIP-seq analyse. (A) fingeraftryk af H3K79me2 ChIP-seq fra E14.5-afledte CPCs i forhold til input viser en berigelse af DNA fragmenter for H3K79me2 at sikre en høj ChIP-seq kvalitet. (B) H3K79me2 ChIP-seq resultater afbildet i en heatmap. Kraftigt beriget genomisk regioner er præsenteret i blå. Skalering 0 (mørk rød) - 45 (mørkeblå). H3K79me2 Topper nær TSS og falder i 3´ retning til TES. (C) H3K79me2 ChIP-seq læser blev tilknyttet mm9 genom og visualiseret med Integrativ genom viewer (IGV). H3K79me2 belægning af et gen er vises som log2 af antallet af læser forholdet mellem ChIP og input læser per kilobase per million (skalering: -10-10). Refseq gen struktur er repræsenteret, mens en rød boks angiver den første exon herunder TSS. Generne Aft4, Ddit3, Scd1, Aft3, og Npm1 er vist. Til sammenligning vises et H3K4me3 signal i samme genomisk region. TSS transcriptional startsted, TES transcriptional ende websted. Dette tal blev ændret fra Roidl38. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Gen Regionen Primer fremad 5' - 3' Primer reverse 5' - 3'
Aft4 TSS GGACGATCTCTAACGCCACA GCCCTAAACCCGCCCTTTAT
Aft4 TSS + 1500 CTCCCGAATATGACATGAACCG TCCATTCGAAACAGAGCATCG
Aft4 TES CCGTAATAGGGTAGTCAGGTGC AAAGAATGACACTGAAAACCCACA
Ddit3 TSS GTACTGGCTCCGTCTAACCC CAAGAGAGGGCCTGTAAGCA
Ddit3 TSS + 2500 TCAAGCAGCCGGTCTCATAG CTCAGATCCCCCAATGGCTT
Ddit3 TSS + 4500 GAGCTGGAAGCCTGGTATGA TCACCTCTTCGTTTCCTGGG
Ddit3 TES CACCAAGCATGAACAGTGGG GTACCGTCTATGTGCAAGCC
Aft3 TSS AACTGAGAGCGCAACTCCTC GCTGCCGTTCTTAGCTGGTA
Aft3 TES CTGTTGGCACAAAGTGGCTC GGGATCTGCCATGGTGGAAA
Scd1 TSS TAGTGACCACACACAAAAGCTC CCCAAGTGTAATTTGGATGATTTCC
Npm1 TSS TCCCCCTCCAGTCAGTTACC CGTCCTTTCCTTGGCGTGA
Npm1 TES AGGGACATACTTAAGACAAGCCAG AGGATTGAGGCAGACTGTCAAT
TSS: Transcriptional startsted
TES: Transcriptional ende site

Tabel 1: Liste over primere bruges til ChIP-qPCR.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Der er to vigtige måder at udføre kromatin immunoprecipitation til påvisning af genomisk belægning af Histon ændringer, transkriptionsfaktorer, Histon kode læsere, forfattere eller viskelædere. Ene er metoden indfødte ChIP bruger nukleasen fordøjet, native kromatin for immunoprecipitation, og den anden er metoden præsenteres ved hjælp af PFA-fast, afrevne kromatin, hvor nucleosomes og andre DNA-attached proteiner er kovalent bundet til DNA 39. indfødte ChIP med sin høje antistof opdagelse sats bør gælde for Histon methylering siden kromatin og Histon methylations er forholdsvis stabile i hele chippen. Men da en stor mængde af starter materiale er nødvendig, er det ikke relevant for at studere kortikale eller cerebellare udvikling, hvor antallet af celler fra mus hjerner er normalt begrænset. Selv om antistoffer er generelt rejst mod ikke-fast materiale, kunne vi bevise at antistoffet specifikt registrerer H3K79me2 siden specifik hæmning af DOT1L fører til en nedsat H3K79me2 signal i ChIP-qPCR analyse og i immunoblots (figur 2A og figur 3A). ChIP ved hjælp af krydsbundet materiale kan være ineffektive, men præsenteres protokollen sikrer nok specielt beriget materiale til qPCR og sekventering analyse.

For en effektiv ChIP, kan SDS koncentrationen af lysisbuffer være afgørende, da SDS denaturerer proteiner og gør dem tilgængelige for antistof bindende. Denne funktion er især vigtigt for H3K79me2, som er en Histon ændring ligger inden for de kugleformede domæne af Histon 3 og nucleosome kerne af kromatins mindste enhed22. Således, for H3K79me2, en højere SDS koncentration (ca 0,3% w/v) under analysen er nødvendige for at sikre optimal antigene tilgængelighed. Med denne SDS koncentration, kunne vi meget berige H3K79me2 over IgG kontrolelementer (figur 3) og over input (figur 4). Dermed kvaliteten af ChIP-materiale til sekvensering var passende og berigelse over input sammenlignes med H3K4me3 (figur 4). Vi forventer, at den samme SDS fusion ville være nødvendige for ChIP af H3K79 mono eller trimethylation mark. Generelt, jo strengere ChIP buffer er, mindre falsk-positive kromatin fragmenter er immunoprecipitated, hvis kvaliteten af antistoffet ikke påvirkes af vaskemiddel anvendes. For fremtiden, kan det være muligt at anvende præsenteres protokollen andre Histon ændringer inden for domænet kugleformede af histoner.

Hvis antistoffer er egnet til ChIP og er stabile i højere koncentrationer, vaskemiddel, indeholder protokollen hovedsagelig to kritiske trin. Først, fiksering af celler og den efterfølgende klipning af kromatin skal optimeres for hver celle og hvert ultrasonicator. Langvarig cross-linking fører til fiksering artefakter og kan reducere antistof opdagelse sats da antigener kan være maskeret. Kromatin klipning skulle føre en størrelse fordeling af DNA mellem 200 og 500 bp (figur 1B). Nucleosomes indeholder 147 bp af DNA. Kromatin fragmenter, der er alt for lang vil føre til falske positive resultater i qPCRs. Under genome-wide sekventering, vil en forkert størrelse distribution føre til falske negative resultater, da anses for ofte kun små fragmenter. Det andet vigtige skridt er biblioteket forberedelse til genome-wide sekvensering. En DNA amplifikation trin skal udføres ved hjælp af 6-9 PCR-cykler. Undgå talrige PCR cykler er afgørende, da de kan føre til en høj GC bias og mange PCR dubletter. Med præsenteres protokollen kan nok DNA hentes for at holde antallet af nødvendige PCR cyklusser lav.

Hjernevævet består af en meget forskellige celletyper som neuroner, oligodendrocytes og glia celler4. Under udvikling af disse celler afledt af neurale stamceller og opbygge særlige områder i hjernen på en afhængig af tid og sted måde3. Neurogenese af hjernebarken, for eksempel, finder sted mellem E11.5 og E18.5 i mus. I tidligere faser som E11.5 og E12.5 næsten alle celler stamfader identitet1, men senere cellulære mangfoldighed skal tages i betragtning. Derfor, en ChIP af kortikale væv på E14.5 kan afsløre H3K79me2 eller enhver anden Histon ændring for det specifikke tidspunkt men kan ikke vise celletype specifikke kromatin funktioner. Dette problem kan løses ved tilsætning af specifikke celler med fluorescens-aktiveret celle sortering (FACS) eller magnetisk-aktiveret celle sortering (MLA-sortering)40, hvilket er muligt efter hjernen homogenisering. Med MaCS-sortering neurale stamceller bærer specifikke celle overflade markører kan være mærket med magnetiske perler og derefter isoleret ved hjælp af en magnetisk stå40. Bagefter kan cellerne kulturperler eller direkte bruges til ChIP. Præsenteres protokollen kan bruges ikke kun til neurale stamceller, men også for andre homogene cellepopulationer. Med tilføjelsen af FACS eller MaCS, kan protokollen anvendes til alle isolatable celler i en organisme.

Tilsammen, gør præsenteres protokollen det muligt at undersøge Histon ændring H3K79me2 på forskellige tidspunkter af kortikale og cerebellare udvikling i en effektiv og reproducerbar måde. Det kan gælde for andre Histon ændringer ligger inden for Histon kerne og kan anvendes til andre homogene celletyper i organismen. Da H3K79me2 er en bevaret Histon ændring23, kan protokollen også være egnet til at analysere H3K79me2, ikke kun i mus, men på tværs af forskellige arter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende finansielle interesser

Acknowledgments

Vi takker Henriette Bertemes for at hjælpe med at etablere CGN dyrkning protokol inden for laboratoriet. Denne metode papiret blev støttet af DFG-finansierede CRC992 medicinsk Epigenetik af finansieringen til TV. Forfatterne anerkender støtten fra Freiburg Galaxy Team: Pavankumar Videm, Björn Grüning og Prof. Rolf Backofen, bioinformatik, universitetet i Freiburg, Tyskland finansieret af Collaborative Research Center 992 medicinsk Epigenetik (DFG grant SFB 992/1 2012) og tyske føderale ministerium for uddannelse og forskning (BMBF grant 031 A538A RBC (de. NBI)).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-GAPDH Abcam ab8245 Category: Antibody
Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:5000
Anti-H3 Abcam ab1791 Category: Antibody
Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:3000
Anti-H3K79me2 Diagenode pAb-051-050 Category: Antibody
Abbreviation/Comment: ChIP antibody
Anti-H3K79me2 Abcam ab-051-050 Category: Antibody
Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:1000
Anti-rabbit-IgG Diagenode C15410206 Category: Antibody
Abbreviation/Comment: ChIP Ctrl antibody
Anti-Tubulin alpha Abcam ab108629 Category: Antibody
Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:3000
Apo-Transferrin (1 mg/ml) Sigma-Aldrich T1147 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
B27 Supplement (50x) Life Technologies 17504044 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
Bioanalyzer Agilent technologies G2940CA Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For analysis of sheared chromatin
Bioruptor NextGen Diagenode B01020001 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: Ultrasonicator
Boric acid pH 8.4 Sigma Aldrich B6768 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CPC culturing
CFX Connect RT PCR Detection System Bio-Rad 1855201 Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: Detection system for qPCR
DMEM-F12 Life Technologies 11320-033 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CGM
Dynabeads Protein A Invitrogen 10001D Category: ChIP
Abbreviation/Comment: Magnetic beads, for ChIP
EPZ-5676 Selleckchem S7062 Category: DOT1L inhibition
Abbreviation/Comment: For DOT1L inhibition in cell culture
Ethylenediamine tetraacetic acid SERVA 39760.01 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: EDTA
Fetal Bovine Serum 10% (v/v) Gibco 10082147 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CPC isolation and CGM
Glucose Sigma-Aldrich G5767 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CGNP isolation
Glutathione (1.25 mg/ml) Sigma-Aldrich G4251 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
Glycine Carl Roth 3187 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For cell fixation
GoTaq mastermix Promega A6002 Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: DNA polymerase master mix for qPCR
Hank’s Balanced Salt Solution Life Technologies 14025-100 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: HBSS
L-glutamine (200 mM) Life Technologies 25030081 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
Laminin Sigma-Aldrich L2020 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CPC culturing
Lithium chloride Sigma-Aldrich L4408 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: LiCl
N2 supplement Life Technologies 17502048 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CGM
NanoDrop 3300 Thermo Fisher 3300 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: Fluorospectrometer for DNA quantification
NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina NEB E7645S Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: Kit for Library preparation
NEBNext Multiplex Oligos for Illumina NEB E7335 Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: Oligos for Library preparation
Neurobasal medium Gibco 21103049 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
NP-40 Alternative Calbiochem 492016 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP buffer
Paraformaldehyde Carl Roth 335 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: PFA, for cell fixation
Penicillin-Streptomycin-Neomycin 1% (v/v) Life Technologies 15640055 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: PSN, for CCM and CGM
Phosphate buffered saline Life Technologies 10010023 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: PBS, for CPC isolation
PicoGreen Kit Thermo Fisher P11496 Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: Visualizing dye for DNA quantification
Poly-D-lysine Sigma-Aldrich P6407 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CGNP isolation
Poly-L-ornithine hydrobromide Sigma Aldrich P3655 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CPC culturing
Potassium chloride Thermo Fisher AM9640G Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: KCl, for CGM
Protease inhibitor Roche 4693159001 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP
Proteinase K Sigma-Aldrich 3115879001 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP
Qiagen MinElute Qiagen 28004 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: Kit for DNA purification
RNAse Sigma-Aldrich R6513 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP
SGC0946 Selleckchem S7079 Category: DOT1L inhibition
Abbreviation/Comment: For DOT1L inhibition in cell culture
Sodium bicarbonate Carl Roth 8551.1 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: for Elution buffer
Sodium chloride Carl Roth 9265 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: NaCl, for ChIP buffer
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich 30970 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP
Sodium dodecylsulfate Carl Roth 183 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: SDS, for ChIP
Sonic hedgehock (SHH) Sigma-Aldrich SRP6004 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CGNP isolation
Superoxide dismutase (1mg/ml) Sigma-Aldrich S7571 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
Tris(hydroxymethyl)aminomethane Carl Roth 9090 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: TRIS, for ChIP buffer
Triton X-100 Carl Roth X100 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP buffer
Trypsin-EDTA 0,05% (w/v) Sigma Aldrich 59417C Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CPC isolation
Tween20 Carl Roth 28320 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For bead preparation
Other Lab devices: Neubauer counting chamber, Incubator, Rotator, Shaker, Disection set, Water bath
CCM: Cortical cell medium
CGM: CGNP cell culture medium

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Molyneaux, B. J., Arlotta, P., Menezes, J. R. L., Macklis, J. D. Neuronal subtype specification in the cerebral cortex. Nat. Rev. Neurosci. 8, 427-437 (2007).
  2. Kandel, E. R., Squire, L. R. Neuroscience: breaking down scientific barriers to the study of brain and mind. Science. 290, 1113-1120 (2000).
  3. Götz, M., Sommer, L. Cortical development: the art of generating cell diversity. Dev. Camb. Engl. 132, 3327 (2005).
  4. Hirabayashi, Y., Gotoh, Y. Epigenetic control of neural precursor cell fate during development. Nat. Rev. Neurosci. 11, 377-388 (2010).
  5. Davis, A. A., Temple, S. A self-renewing multipotential stem cell in embryonic rat cerebral cortex. Nature. 372, 263-266 (1994).
  6. Sauvageot, C. M., Stiles, C. D. Molecular mechanisms controlling cortical gliogenesis. Curr. Opin. Neurobiol. 12, 244-249 (2002).
  7. McConnell, S. K., Kaznowski, C. E. Cell cycle dependence of laminar determination in developing neocortex. Science. 254, 282-285 (1991).
  8. Desai, A. R., McConnell, S. K. Progressive restriction in fate potential by neural progenitors during cerebral cortical development. Dev. Camb. Engl. 127, 2863-2872 (2000).
  9. Glickstein, M., Strata, P., Voogd, J. Cerebellum: history. Neuroscience. 162, 549-559 (2009).
  10. Marzban, H., et al. Cellular commitment in the developing cerebellum. Front. Cell. Neurosci. 8, (2015).
  11. Azevedo, F. A. C., et al. Equal numbers of neuronal and nonneuronal cells make the human brain an isometrically scaled-up primate brain. J. Comp. Neurol. 513, 532-541 (2009).
  12. Machold, R., Fishell, G. Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors. Neuron. 48, 17-24 (2005).
  13. Luger, K., Mäder, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 389, 251-260 (1997).
  14. Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128, 693-705 (2007).
  15. Zhang, Q., et al. Histone modification mapping in human brain reveals aberrant expression of histone H3 lysine 79 dimethylation in neural tube defects. Neurobiol. Dis. 54, 404-413 (2013).
  16. Zhang, Y., Reinberg, D. Transcription regulation by histone methylation: interplay between different covalent modifications of the core histone tails. Genes Dev. 15, 2343-2360 (2001).
  17. Sanders, S. L., et al. Methylation of histone H4 lysine 20 controls recruitment of Crb2 to sites of DNA damage. Cell. 119, 603-614 (2004).
  18. Martin, C., Zhang, Y. The diverse functions of histone lysine methylation. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 838-849 (2005).
  19. Greer, E. L., Shi, Y. Histone methylation: a dynamic mark in health, disease and inheritance. Nat. Rev. Genet. 13, 343-357 (2012).
  20. Ng, H. H., et al. Lysine methylation within the globular domain of histone H3 by Dot1 is important for telomeric silencing and Sir protein association. Genes Dev. 16, 1518-1527 (2002).
  21. Kebede, A. F., Schneider, R., Daujat, S. Novel types and sites of histone modifications emerge as players in the transcriptional regulation contest. FEBS J. 282, 1658-1674 (2015).
  22. Roidl, D., Hacker, C. Histone methylation during neural development. Cell Tissue Res. 356, 539-552 (2014).
  23. Mersfelder, E. L., Parthun, M. R. The tale beyond the tail: histone core domain modifications and the regulation of chromatin structure. Nucleic Acids Res. 34, 2653-2662 (2006).
  24. van Leeuwen, F., Gafken, P. R., Gottschling, D. E. Dot1p Modulates Silencing in Yeast by Methylation of the Nucleosome Core. Cell. 109, 745-756 (2002).
  25. Jones, B., et al. The histone H3K79 methyltransferase Dot1L is essential for mammalian development and heterochromatin structure. PLoS Genet. 4, e1000190 (2008).
  26. Woo Park, J., et al. RE-IIBP Methylates H3K79 and Induces MEIS1-mediated Apoptosis via H2BK120 Ubiquitination by RNF20. Sci. Rep. 5, 12485 (2015).
  27. Vlaming, H., van Leeuwen, F. The upstreams and downstreams of H3K79 methylation by DOT1L. Chromosoma. , (2016).
  28. Jones, B., et al. The histone H3K79 methyltransferase Dot1L is essential for mammalian development and heterochromatin structure. PLoS Genet. 4, e1000190 (2008).
  29. Feng, Y., et al. Early mammalian erythropoiesis requires the Dot1L methyltransferase. Blood. 116, 4483-4491 (2010).
  30. Cattaneo, P., et al. DOT1L-mediated H3K79me2 modification critically regulates gene expression during cardiomyocyte differentiation. Cell Death Differ. 23, 555-564 (2016).
  31. Zhang, Q., et al. Histone modification mapping in human brain reveals aberrant expression of histone H3 lysine 79 dimethylation in neural tube defects. Neurobiol. Dis. 54, 404-413 (2013).
  32. Büttner, N., Johnsen, S. A., Kügler, S., Vogel, T. Af9/Mllt3 interferes with Tbr1 expression through epigenetic modification of histone H3K79 during development of the cerebral cortex. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 7042-7047 (2010).
  33. Roidl, D., et al. DOT1L Activity Promotes Proliferation and Protects Cortical Neural Stem Cells from Activation of ATF4-DDIT3-Mediated ER Stress In Vitro. Stem Cells Dayt. Ohio. 34, 233-245 (2016).
  34. Robinson, J. T., et al. Integrative genomics viewer. Nat. Biotechnol. 29, 24-26 (2011).
  35. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat. Methods. 9, 357-359 (2012).
  36. Zhang, Y., et al. Model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9, R137 (2008).
  37. Ramírez, F., et al. deepTools2: a next generation web server for deep-sequencing data analysis. Nucleic Acids Res. 44, W160-W165 (2016).
  38. Roidl, D. Histone modifications during cerebral cortex development. , (2015).
  39. Turner, B. ChIP with Native Chromatin: Advantages and Problems Relative to Methods Using Cross-Linked Material. Mapping Protein/DNA Interactions by Cross-Linking. , Institut national de la santé et de la recherche médicale. (2001).
  40. Dincman, T. A., Beare, J. E., Ohri, S. S., Whittemore, S. R. Isolation of cortical mouse oligodendrocyte precursor cells. J. Neurosci. Methods. 209, 219-226 (2012).

Tags

Neurovidenskab sag 131 cerebellare cellekultur kortikale cellekultur cortex udvikling cerebellare udvikling H3K79 methylering DOT1L ChIP DOT1L hæmning
Isolering og dyrkning af neurale stamceller efterfulgt af kromatin-Immunoprecipitation af Histon 3 lysin 79 Dimethylation Mark
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bovio, P., Roidl, D., Heidrich, S.,… More

Bovio, P., Roidl, D., Heidrich, S., Vogel, T., Franz, H. Isolation and Cultivation of Neural Progenitors Followed by Chromatin-Immunoprecipitation of Histone 3 Lysine 79 Dimethylation Mark. J. Vis. Exp. (131), e56631, doi:10.3791/56631 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter