Summary

Aislamiento y cultivo de progenitores neuronales seguido por inmunoprecipitación de cromatina de histona 3 lisina 79 dimetilación marca

Published: January 26, 2018
doi:

Summary

Presentamos un método eficaz y reproducible para aislar las células progenitoras neurales de tejido cerebral embrionario y postnatal de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) de la histona 3 lisina 79 dimetilación (H3K79me2) – una marca de histona situada dentro de la cultura el dominio globular de la histona 3.

Abstract

Desarrollo del cerebro es un proceso complejo, que es controlado en forma temporo-espacial por gradientes de morfógenos y diferentes programas transcripcionales. Además, modificaciones epigenéticas de la cromatina, como la metilación de las histonas, tienen un papel importante para establecer y mantener destinos celulares específicas dentro de este proceso. La gran mayoría de la metilación de las histonas se produce en la cola de la histona flexible, que es accesible a los modificadores de las histonas, los borradores y proteínas de histona lector. En cambio, metilación de H3K79 se encuentra en el dominio globular de la histona 3 y está implicada en diversas funciones del desarrollo. H3K79 metilación evolutionarily se conserva y puede encontrarse en una amplia gama de especies de Homo sapiens a Saccharomyces cerevisiae. La modificación se produce en diferentes poblaciones celulares dentro de los organismos, incluyendo progenitores neuronales. La ubicación de la metilación de H3K79 en el dominio globular de la histona 3 hace difícil evaluar. Aquí se presentan métodos para aislar y progenitor cortical cultura (CPCs) con células de tejido embrionario cerebro cortical (E11.5-E14.5) o progenitores de neuronas granulares cerebelosas (CGNPs) del tejido postnatal (P5-P7) y eficientemente immunoprecipitate H3K79me2 para PCR cuantitativa (qPCR) y secuenciación del genoma.

Introduction

Las funciones sensoriales, motores y cognitivas del cerebro son altamente complejas y susceptibles a los cambios físicos y ambientales. El cerebro consta de tres partes generales el hind-, mediados de y prosencéfalo, que están profundamente conectados. En el prosencéfalo, el telencéfalo puede dividirse en un telencéfalo dorsal (DT) y un telencéfalo ventral (VT). El DT de los ratones consiste en seis capas corticales que se forman entre E11.5 y E18.5 en una manera de “inside-out”1. El VT incluye las eminencias ganglionares en desarrollo, que posteriormente forman los ganglios basales2,3. Varios tipos celulares se pueden clasificar en mamífero sistema nervioso central tales como neuronas, astrocitos y oligodendrocitos4, que se convierten en una forma temporo-espacial5. En primer lugar, las células progenitoras neurales (PNJ) dan lugar a diferentes tipos de neuronas, interneuronas en las VT y las neuronas de proyección en el despegue y más tarde en las células gliales (p. ej., astrocitos6). Durante el desarrollo cortical, la capa más superficial (capa I), que contiene las células de Cajal-Retzius, está formado en primer lugar. Luego, entre E12.5 y E14.5, NPCs generan capas más profundas neuronales (VI, V) mientras que entre 14,5 y 16,5, progenitores dan lugar a las neuronas de la capa superior (IV-II)7,8. Identidad neuronal está especificado por diferentes programas transcripcionales temporo-espacial inducida por morfógeno y además por programas epigenéticos2.

El cerebelo, que está implicado en la coordinación motora, se encuentra en el cerebelo y se desarrolla entre E10 y P20 en ratones9. Contiene la corteza cerebelosa y los núcleos cerebelosos10. La corteza cerebelosa adultos consta de tres capas, la capa molecular externa, la capa de células de Purkinje y la capa granular más interna que contiene las neuronas granulares10. Las células del gránulo cerebeloso son las neuronas más pequeñas y representan alrededor del 80% de todas las neuronas en el cerebro vertebrados11. Se desarrollan a partir de precursores en la zona germinal externa y migran a través de la capa de células de Purkinje a su destino12. Como en el telencéfalo, el desarrollo del cerebelo está regulado por varios importantes morfógenos, que tienen funciones específicas de tiempo y espacio dependiente e iniciar define programas transcripcionales10.

El desarrollo de capas corticales y cerebelosas es controlado por la expresión transcripcional de morfógenos específicos y, por tanto, el estado de la cromatina de la DNA. En una visión simplificada, Estados de la cromatina pueden dividirse en eucromatina como transcripcionalmente activo y heterocromatina regiones transcripcionalmente silencioso. Como la unidad básica de la cromatina nucleosoma contiene dos copias de cada histona núcleo H2A, H2B, H3 y H4, rodeado de 147 pares de bases de ADN13. Las histonas son modificadas altamente postraduccional por metilación, acetilación, fosforilación, ubiquitinación, la sumoilación, ADP-ribosylation, desaminación y prolina isomerización14,15. La metilación de lisina de las histonas se considera que la modificación de las histonas más estable que controla la transcripción, replicación, recombinación16, daño de la DNA respuesta17e impresión genómica18. Lisinas pueden ser mono-, di- o tri-metilados19 y aparecer en las colas de las histonas accesible, sino también en el dominio globular de las histonas20. Metilaciones específicas en H3K4 y H3K36 se asocian principalmente a eucromatina, metilaciones específicas en H3K9 H3K27 y H4K20 se encuentran principalmente en regiones heterochromatic, aunque todos los residuos se encuentran a la cola de las histonas14, 19,21. Metilación de H3K79 se encuentra en el dominio globular de las histonas y se ha asociado con la actividad transcripcional, sino también con las regiones genomic transcripcionalmente inerte22. La modificación evolutionarily se conserva ya que se ha observado en levaduras, timo de ternero, pollo y humana23. H3K79 mono, di y trimetilación (H3K79me1, me2 y me3) son catalizadas por la histona metiltransferasas DOT1L24,25 y la Nuclear conjunto dominio-que contienen la proteína 2 (Nsd2)26. DOT1L está implicado en la proliferación y reparación del ADN celular reprogramación27. Pérdida de Dot1l en ratones conduce a una muerte prenatal alrededor de la etapa de desarrollo E10.528,29. Durante el desarrollo del corazón y en la diferenciación de myocardiocyte, DOT1L es esencial para gene expresión Reglamento30. En el sistema nervioso central, función DOT1L podría estar implicada en el tubo neural desarrollo31, está implicado en la supresión de Tbr1-expresión durante el desarrollo de cerebro anterior32y puede funcionar en la regulación de la tensión ER de genes de respuesta33. Contexto-dependiente de la activación o represión acción de H3K79me, especialmente con en vivo situaciones como el desarrollo del sistema nervioso central, es hasta la fecha sólo parcialmente entendida32. Puesto que la metilación del H3K79 se encuentra en el dominio globular de la histona 3, es sterically menos accesible en comparación con modificaciones de la histona flexible cola23. Para entender la función de la metilación de H3K79, se necesitan métodos de análisis fiables y reproducibles para determinar su ubicación y entorno genómico. En este trabajo métodos, presentamos métodos de aislamiento de diferentes progenitores neuronales (CPCs de la corteza) y CGNPs para el cerebelo, eficaz tratamiento del inhibidor de DOT1L y un método de ChIP para analizar H3K79 metilación mediante qPCR o secuenciación en tiempo diferente puntos durante el desarrollo cortical y cerebeloso. Para tener una visión general del protocolo y sus posibilidades, vea la figura 1.

Protocol

Comités de bienestar animal de la Universidad de Freiburg y las autoridades locales aprobaron todos los experimentos con animales (G12/13, 11 G16) mencionados en el siguiente protocolo. 1. preparaciones Preparativos para el aislamiento de CPCs Configurar tiempo de apareamiento para obtener embriones en diferentes etapas de desarrollo de la corteza (entre E11.5 y E14.5). Utilizar ratones de la cepa NMRI (Instituto de investigación médica Naval) que son a…

Representative Results

Régimen general de progenitoras neurales aislamiento, cultivo, métodos de análisis de H3K79me2 ChIP y ChIP: La figura 1 muestra un diagrama de flujo para realizar H3K79me2 ChIP de células progenitoras cortical en diferentes momentos durante el desarrollo embrionario del cerebro o de progenitores de neuronas granulares cerebelosas en etapas postnatales. Como primer paso, el cerebro tiene que ser aislado y el telencéfalo (entre E11.5 y E14…

Discussion

Hay dos maneras principales de inmunoprecipitación de cromatina para detectar la ocupación genómica de modificaciones de las histonas, factores de transcripción, lectores de código de las histonas, escritores o gomas de borrar. Uno es el método de ChIP nativo con nucleasa digerida, la cromatina nativa para la inmunoprecipitación, y el otro es el método presentado con cromatina PFA-fijo, esquilada, en el que los nucleosomas y otras proteínas ADN Unido están covalentemente al ADN 39. ChIP …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a Henriette Bertemes para ayudar a establecer el protocolo de cultivo de CGN dentro del laboratorio. Este papel de método fue apoyada por la DFG financió CRC992 médico epigenética por financiación a TV. Los autores reconocen el apoyo del equipo galaxia Freiburg: Pavankumar Videm, Björn Grüning y Prof. Rolf Backofen, bioinformática, Universidad de Freiburg, Alemania financiado por colaboración investigación 992 centro médico epigenética (grant DFG SFB 992/1 de 2012) Ministerio Federal alemán de educación e investigación (BMBF grant 031 A538A RBC (de. NBI)).

Materials

Anti-GAPDH Abcam ab8245 Category: Antibody
Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:5000
Anti-H3 Abcam ab1791 Category: Antibody
Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:3000
Anti-H3K79me2 Diagenode pAb-051-050 Category: Antibody
Abbreviation/Comment: ChIP antibody
Anti-H3K79me2 Abcam ab-051-050 Category: Antibody
Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:1000
Anti-rabbit-IgG Diagenode C15410206 Category: Antibody
Abbreviation/Comment: ChIP Ctrl antibody
Anti-Tubulin alpha Abcam ab108629 Category: Antibody
Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:3000
Apo-Transferrin (1 mg/ml) Sigma-Aldrich T1147 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
B27 Supplement (50x) Life Technologies 17504044 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
Bioanalyzer Agilent technologies G2940CA Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For analysis of sheared chromatin
Bioruptor NextGen Diagenode B01020001 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: Ultrasonicator
Boric acid pH 8.4 Sigma Aldrich B6768 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CPC culturing
CFX Connect RT PCR Detection System Bio-Rad 1855201 Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: Detection system for qPCR
DMEM-F12 Life Technologies 11320-033 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CGM
Dynabeads Protein A Invitrogen 10001D Category: ChIP
Abbreviation/Comment: Magnetic beads, for ChIP
EPZ-5676 Selleckchem S7062 Category: DOT1L inhibition
Abbreviation/Comment: For DOT1L inhibition in cell culture
Ethylenediamine tetraacetic acid SERVA 39760.01 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: EDTA
Fetal Bovine Serum 10% (v/v) Gibco 10082147 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CPC isolation and CGM
Glucose Sigma-Aldrich G5767 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CGNP isolation
Glutathione (1.25 mg/ml) Sigma-Aldrich G4251 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
Glycine Carl Roth 3187 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For cell fixation
GoTaq mastermix Promega A6002 Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: DNA polymerase master mix for qPCR
Hank’s Balanced Salt Solution Life Technologies 14025-100 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: HBSS
L-glutamine (200 mM) Life Technologies 25030081 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
Laminin Sigma-Aldrich L2020 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CPC culturing
Lithium chloride Sigma-Aldrich L4408 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: LiCl
N2 supplement Life Technologies 17502048 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CGM
NanoDrop 3300 Thermo Fisher 3300 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: Fluorospectrometer for DNA quantification
NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina NEB E7645S Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: Kit for Library preparation
NEBNext Multiplex Oligos for Illumina NEB E7335 Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: Oligos for Library preparation
Neurobasal medium Gibco 21103049 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
NP-40 Alternative Calbiochem 492016 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP buffer
Paraformaldehyde Carl Roth 335 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: PFA, for cell fixation
Penicillin-Streptomycin-Neomycin 1% (v/v) Life Technologies 15640055 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: PSN, for CCM and CGM
Phosphate buffered saline Life Technologies 10010023 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: PBS, for CPC isolation
PicoGreen Kit Thermo Fisher P11496 Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: Visualizing dye for DNA quantification
Poly-D-lysine Sigma-Aldrich P6407 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CGNP isolation
Poly-L-ornithine hydrobromide Sigma Aldrich P3655 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CPC culturing
Potassium chloride Thermo Fisher AM9640G Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: KCl, for CGM
Protease inhibitor Roche 4693159001 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP
Proteinase K Sigma-Aldrich 3115879001 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP
Qiagen MinElute Qiagen 28004 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: Kit for DNA purification
RNAse Sigma-Aldrich R6513 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP
SGC0946 Selleckchem S7079 Category: DOT1L inhibition
Abbreviation/Comment: For DOT1L inhibition in cell culture
Sodium bicarbonate Carl Roth 8551.1 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: for Elution buffer
Sodium chloride Carl Roth 9265 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: NaCl, for ChIP buffer
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich 30970 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP
Sodium dodecylsulfate Carl Roth 183 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: SDS, for ChIP
Sonic hedgehock (SHH) Sigma-Aldrich SRP6004 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CGNP isolation
Superoxide dismutase (1mg/ml) Sigma-Aldrich S7571 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
Tris(hydroxymethyl)aminomethane Carl Roth 9090 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: TRIS, for ChIP buffer
Triton X-100 Carl Roth X100 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP buffer
Trypsin-EDTA 0,05% (w/v) Sigma Aldrich 59417C Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CPC isolation
Tween20 Carl Roth 28320 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For bead preparation
Other Lab devices: Neubauer counting chamber, Incubator, Rotator, Shaker, Disection set, Water bath
CCM: Cortical cell medium
CGM: CGNP cell culture medium

References

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Cite This Article
Bovio, P., Roidl, D., Heidrich, S., Vogel, T., Franz, H. Isolation and Cultivation of Neural Progenitors Followed by Chromatin-Immunoprecipitation of Histone 3 Lysine 79 Dimethylation Mark. J. Vis. Exp. (131), e56631, doi:10.3791/56631 (2018).

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