Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Preconditionering de luchtwegen van muizen met bleomycine verhoogt de efficiëntie van Orthotopic long kanker cel Engraftment

Published: June 28, 2018 doi: 10.3791/56650
Automatic Translation
*1, *1, 1,2
1Department of Pathology, Yale University School of Medicine, 2Department of Medical Oncology, Yale University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Beschrijven we een methode om engraftment van de orthotopic van longkanker kankercellen in de longen lymfkliertest aanzienlijk te verbeteren door preconditionering van de luchtwegen met blessure. Deze benadering kan ook worden toegepast om te studeren stromale interacties binnen de longen communicatie, gemetastaseerde verspreiding, long kanker co morbiditeit en efficiënter genereren patiënt afgeleid xenografts.

Abstract

Longkanker is een dodelijke behandeling vuurvaste ziekte die biologisch heterogeen is. Om te begrijpen en effectief behandelen het volledige klinische spectrum van thoracale maligniteiten, zijn extra dierlijke modellen die diverse menselijke long kanker subtypen en stadia kunnen recapituleren nodig. Allograft of xenograft modellen zijn veelzijdig en inschakelen van de kwantificering van tumorigene capaciteit in vivo, met behulp van kwaadaardige cellen van lymfkliertest of menselijke oorsprong. Echter zijn eerder beschreven methoden voor long kanker cel engraftment uitgevoerd in niet-fysiologische sites, zoals de flank van muizen, te wijten aan de inefficiëntie van orthotopic transplantatie van cellen in de longen. In deze studie beschrijven we een methode ter verbetering van orthotopic long kanker cel engraftment door preconditionering de luchtwegen van muizen met de fibrose inducerend agent bleomycine. Als een experiment van proof-of-concept, wij deze aanpak om het engraft van tumorcellen van het Long adenocarcinoom subtype, verkregen uit de muis of menselijke bronnen, in verschillende muizenstammen toegepast. We laten zien dat het verwonden van de luchtwegen met bleomycine vóór tumor cel injectie de engraftment van tumorcellen van 0-17 verhoogt % tot 71-100%. Deze methode verbeterde aanzienlijk, Long tumor incidentie en verdere uitgroei met behulp van verschillende modellen en muis stammen. Daarnaast verspreiden werk Long kankercellen uit de longen in relevante verre organen. Dus, wij bieden een protocol dat kan worden gebruikt om te stellen en onderhouden van nieuwe modellen van de orthotopic van longkanker met beperking van de hoeveelheid cellen of biospecimen en kwantitatief beoordelen de tumorigene capaciteit van Long kankercellen in fysiologisch relevante instellingen .

Introduction

Longkanker is de belangrijkste oorzaak van kanker gerelateerde sterfgevallen wereldwijd1. Patiënten met longkanker bezwijken uiteindelijk van metastase tot verre organen, met name aan het centraal zenuwstelsel, lever, bijnieren en botten2,3,4. Thoracale maligniteiten zijn traditioneel ingedeeld als kleincellige longkanker (SCLC) of niet-kleincellige longkanker kanker (NKCLK)5. NKCLK is de meest vaak gediagnosticeerd maligniteit en kan worden onderverdeeld in verschillende histologische subtypes, met inbegrip van adenocarcinoom van de Long (LUAD) en Long plaveiselcelcarcinoom (LUSC)6. Genomic analyse van gereseceerd menselijke primaire longkankerziekten is gebleken dat de tumoren binnen een bepaalde histotype ook divers moleculaire verstoringen, verder bij te dragen aan hun uiteenlopende klinische progressie en verstorende patiënt prognose kunnen uitdrukken. De opmerkelijke heterogeniteit van de longkankerziekten vormt een aanzienlijke uitdaging voor het rationele ontwerp preklinisch onderzoek en uitvoering van effectieve therapeutische strategieën. Daarom is er een noodzaak om uit te breiden van het repertoire van hanteerbare experimentele long kanker modellen te bestuderen van de verschillende cellulaire oorsprong, moleculaire subtypen en stadia van deze ziekte.

Verschillende benaderingen met behulp van dierlijke modellen zijn tewerkgesteld long kanker om te studeren in vivo, elk met hun eigen voor- en nadelen, afhankelijk van de biologische vragen van belang. Genetisch gemodificeerde Muismodellen (GEMMs) kunnen richten op specifieke genetische wijzigingen in een bepaalde voorlopercellen celtype, resulterend in tumoren die vooruitgang binnen een immunocompetent host7. Terwijl zeer krachtig en klinisch relevante, kunnen de latency, variabiliteit, en/of Long tumor morbiditeit geassocieerd met GEMMs verbiedend met bepaalde kwantitatieve metingen en de detectie van late stadium metastase in verre organen8. Een complementaire benadering is het gebruik van allograft modellen, waarbij Long kankercellen, hetzij rechtstreeks uit een muis tumor verkregen of afgeleid eerst als het gevestigde cellijnen in cultuur, opnieuw binnengebracht in syngeneic hosts worden. Naar analogie, zijn long kanker xenografts gevestigd van menselijke cellijnen of patiënt afgeleide tumor monsters. Menselijke cel lijn xenografts of patiënt afgeleide xenografts (PDXs) zijn over het algemeen gehandhaafd bij immuungecompromitteerde muizen en daarom beletten volledig immuun-surveillance9. Ondanks dit nadeel bieden zij een laan voor het doorgeven van de beperking van de hoeveelheid menselijke biospecimens en studie fundamentele in vivo eigenschappen van menselijke kankercellen, die voor meer complexe genomic afwijkingen dan GEMM tumoren coderen.

Een nuttige eigenschap van allografts en xenografts is dat ze vatbaar voor traditionele beperkende cel verdunning testen, werkzaam te kwantificeren van de frequentie van de tumor cellen (TICs) binnen een kwaadaardige cel bevolking10initiëren. In deze experimenten, een bepaald aantal cellen worden subcutaan ingespoten in de flank van de dieren en de frequentie van de TICs kan worden geschat op basis van de tumor te nemen koers. Subcutane tumoren kunnen echter meer hypoxische11 en kunnen niet zeer belangrijke fysiologische beperkingen van de Long tumor communicatie model. Intratracheale levering van epitheliale stam of voorlopercellen in de longen van muizen is een methode om te studeren pulmonaire regeneratie en airway stamcel biologie12. Het tarief van de engraftment van deze techniek kan echter relatief laag, tenzij de longen eerst aan fysiologische vormen van schade, zoals virale infectie13,14 onderworpen zijn. Ondersteuning van inflammatoire stromale cellen en/of de verstoring van het membraan van de kelder Long kan in de cel van de stam van de relevante niches in de distale airways15eigendomsvoorbehoud getransplanteerde cellen verbeteren. Fibrose inducerende agenten kan ook vooraf een voorwaarde van de longen te verbeteren engraftment van geïnduceerde pluripotente cellen16 en17van de mesenchymale stamcellen. Of soortgelijke beschermingsvormen airway letsel kunnen invloed hebben op het engraftment tarief, hebben tumor-initiërende capaciteit, en uitgroei van Long kankercellen nog systematisch worden beoordeeld.

In deze studie beschrijven we een methode te vergroten van de doelmatigheid van orthotopic long kanker cel engraftment, door preconditionering de longen van muizen met blessure. LUAD ontstaat in de distale airways met een grote subset van deze kankers ontwikkelen een fibrotische stroma18 die vaak met slechte prognose19 correleert. Bleomycine, een natuurlijke nonribosomal hybride peptide-polyketide, is uitgebreid om te induceren van longfibrose in muizen20gebruikt. Airway instillation van bleomycine bevordert eerst epitheliale uitputtingsslag in de longblaasjes en rekrutering van ontstekingscellen, met inbegrip van macrofagen, neutrofiele granulocyten en monocyten21. Dit wordt gevolgd door de weefsel remodeling in de distale airways, kelder membraan reorganisatie22,23 en24afzetting extracellulaire matrix (ECM). De effecten van een enkele Bleomycine injectie zijn voorbijgaande, met fibrosis oplossen na 30 dagen in de meeste studies25. Met behulp van zowel allograft en xenograft modellen, we getest als preconditionering de luchtwegen van muizen met bleomycine aanzienlijk van de te nemen koers van LUAD cellen in de longen verhogen kan.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle experimenten werden uitgevoerd volgens protocollen die zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) aan de Yale University.

1. instellen / voorbereiding van de reagentia.

  1. Bleomycine
    Let op: Gebaseerd op het wereldwijd geharmoniseerde systeem (GHS) van de indeling en etikettering van chemische stoffen, is Bleomycine geclassificeerd als een gevaar voor de gezondheid van GHS08.
    1. Bleomycine in een chemische kap voor te bereiden. Resuspendeer 15 U in 5 mL steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
    2. Aliquot 100-200 µL van de oplossing in glazen flesjes en bevriezen ze bij-20 ° C voor toekomstig gebruik. Goed het label van de buizen met de datum van resuspensie. Gebruik binnen 6 maanden vanaf deze datum.
      Opmerking: Elke muis stam heeft een andere gevoeligheid voor bleomycine26. Testen van verschillende doses van bleomycine voor elke muis stam wordt aanbevolen. De stammen van de muis en de bijbehorende doses van bleomycine gebruikt in representatieve experimenten zijn vermeld in tabel 1.
  2. Muizen
    1. Koop muizen die nodig zijn voor het experiment en laat muizen 7 dagen acclimatiseren vóór injectie. Infusies in een bioveiligheid kap uitvoeren. Breng dieren gehuisvest in een compatibele kamer van niet-BSL2 naar een BSL2 kamer met behulp van standaardprocedures institutionele vóór bleomycine infusie. Injecteren muizen op de leeftijd van 6-8 weken.
      Let op: Injecteren muizen na institutionele richtsnoeren voor gevaarlijke agentia, bioveiligheidsniveau 2 (BSL2) en IACUC goedkeuring.
      Opmerking: Muizen gekocht voor de representatieve experimenten staan in de Tabel van materialen. Alleen mannelijke muizen zijn gebruikt.
  3. Long kanker cellijnen
    1. Cultuur gewenst cellijnen in hun respectieve media. Uitvoeren voordat injecties, short tandem repeat DNA profielen of genetische testen om ervoor te zorgen de juiste cel identificatie. Om te vergemakkelijken in vivo en ex vivo imaging, cellijnen besmetten met een lentivirus uiten de thymidinekinase, de groen fluorescente proteïne (GFP) en de luciferase fusion verslaggever27en verslaggever positieve cellen sorteren fluorescentie cell sorting (FACS) voorafgaand aan de engraftment geactiveerd. Test lijnen voor mycoplasma elke 6 maanden.
      1. Cultuur H2030 menselijke kanker cellijn zoals aanbevolen door de fabrikant Roswell Park Memorial Instituut medium (RPMI) met 10% foetale runderserum (FBS), penicilline-streptomycine en amfotericine-B.
      2. Cultuur 368T1 lymfkliertest cellijn (afgeleid van een KrasG12D; p53- / - muis) Dulbecco van bewerkt Eagle's medium (DMEM) met 10% FBS, penicilline-streptomycine en amfotericine-B.
      3. Cultuur PC9 menselijke kanker cellijn met behulp van RPMI met 10% FBS, penicilline-streptomycine en amfotericine-B.

2. bleomycine behandeling

  1. Wilt u muizen intratracheally injecteren met bleomycine 14 dagen vóór de tumor cel engraftment.
  2. Ontdooi bleomycine voorraad op ijs 2 h vóór injectie.
  3. Eenmaal ontdooid, Verdun bleomycine bij de gewenste werken concentratie (0,02 U/50 µL of 0,005 U/50 µL) en houd het op ijs.
    Opmerking: Concentratie van bleomycine hangt af van de stam van de muis gebruikt voor de experimenten (tabel 1). Titratie van bleomycine in muizen moet worden uitgevoerd om te bepalen van de optimale dosis.
  4. Bereiden van verdoving door verder verdunnen van ketamine en xylazine om een eindconcentratie van 10 mg/mL en 1 mg/mL, respectievelijk, elke muis met behulp van een 1 mL spuit en 27 G naald, anesthetize door het injecteren van intraperitoneally ketamine/xylazine oplossing bij 100/10 mg/kg respectievelijk.
  5. Volgen van de ademhaling van muizen en een snuifje teen in dienst. Juiste afstomping bevestigen wanneer de muis reageert niet tot teen snuifje. Dierenarts zalf toepassen op ogen om te voorkomen dat droogte terwijl onder verdoving.
  6. Plaats 1 muis tegelijk op een intubatie platform door opknoping haar voortanden met zijn rug tegen het platform.
  7. Verlichten van de bovenste borst met behulp van een glasvezel illuminator met visualisatie van de luchtpijp. Open de mond van de muis en trek de tong zachtjes met een steriele platte Tang.
  8. Het gebruik van een intraveneuze katheter zonder de naald te voorkomen blokkeren van de ademhaling. Standpunt de katheter over het witte licht uitgezonden van de opening van de luchtpijp.
  9. Plaats de katheter in de luchtpijp tot de bovenkant van de katheter de voortanden bereikt. Bevestig goede plaatsing van de katheter in de luchtpijp door het visualiseren van het witte licht schijnt door de opening van de katheter in de mond.
  10. Met behulp van een precisiepipet, afzien 50 µL van bleomycine of voertuig (PBS) rechtstreeks in de katheter om ervoor te zorgen dat het gehele volume wordt geïnhaleerd. Voer deze stap onder steriele omstandigheden.
  11. Als de katheter is correct ingevoegd, zal de muis onmiddellijk de inhoud van de katheter inhaleren. Wacht een paar seconden totdat het gehele volume naar beneden van de katheter reist. Dan verwijderen van de katheter uit de luchtpijp en gooi in 10% bleekwater oplossing.
    Opmerking: De gemiddelde tijd per muis stappen 2.7-2.11 is ongeveer 5 min.
  12. Als de muis de vloeistof niet inademen is, zorgvuldig controleren van ademhaling en pas de positie van de katheter. Als de muis ademhaling stopt, onmiddellijk verwijderen van de katheter en laat de muis om te hervatten ademhaling normaal vóór het opnieuw invoegen van de katheter.
  13. Plaats de ingespoten muis op een IACUC goedgekeurd verwarming pad op hun rug op een vlakke ondergrond voor herstel. De hele procedure duurt 10 min per muis. Een dier dat injectie aan het gezelschap van andere dieren tot volledig hersteld heeft ondergaan niet terugkeren.
  14. Plaats een "Gevaarlijke chemische in gebruik" kaart op de kooi voor 24 h.

3. toezicht op muizen na intubatie

  1. Controleren de muizen voor respiratoire nood onmiddellijk na intubatie en vervolgens elke 15 min tot muizen wakker uit de narcose. Laat geen muizen zonder toezicht totdat ze hebben herwonnen voldoende bewustzijn te handhaven sternale ligcomfort.
  2. Injecteren ketoprofen (5 mg/kg) intraperitoneally ter verzachting van de pijn.
  3. Controleer de muizen 24u post intubatie en 3 keer per week voor symptomen van de ziekte.
  4. Een register bijhouden van de datum van de procedure, identificatie van de dieren, type procedure, soort verdoving, en post-operatieve toezicht waarnemingen met tijden.
  5. Controleren van de muizen voor gewichtsverlies, respiratoire nood, gedrags afwijkingen en een body condition score < 2 (segmentatie van wervelkolom duidelijk/dorsale bekken beenderen zijn voelbaar) bi-wekelijkse na injectie van bleomycine.
  6. Euthanaseren muizen onder Ademhalings nood of muizen die 15% verlies van lichaamsgewicht door CO2 of ketamine/xylazine gevolgd door cervicale dislocatie hebben ervaren. Bevestig euthanasie door palpatie voor respiratoire activiteit uitvoeren.

4. engraftment van longkanker adenocarcinoom cellijnen.

Opmerking: Voer engraftment van cellen 14 dagen na de injectie van bleomycine (stap 2.1).

  1. Cellen om te groeien in 75 cm2 flacons ongestoord voor 3 dagen vóór de dag van injectie met bijbehorende media zoals in stap 1.3 toestaan.
    Opmerking: Moet ze 80% heuvels op de dag van injectie (die correspondeert met 2-3 x 106 in elke kolf afhankelijk van de cellijn).
  2. Wassen van de cellen groeien op 75 cm2 flacons met 5 mL PBS bij kamertemperatuur.
  3. PBS gecombineerd en voeg 1,5 mL trypsine aan de cellen en Incubeer de cellen bij 37 ° C, totdat de cellen los (meestal 2-5 min).
    Opmerking: We raden controleren elke 2 min voor mobiele-detachement van de plastic door eenvoudige visualisatie van de bodem van de kolf of onder een lichte Microscoop. 5 min van incubatie met trypsine niet overschrijden.
  4. Trypsine te neutraliseren door toevoeging van 4 mL medium met 10% FBS (dezelfde media als stap 4.1). Verzamelen van de cellen in een tube van 15 mL en Centrifugeer het bij 200 x g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur.
  5. De media gecombineerd en resuspendeer de pellet cel in 5 mL PBS te wassen van de cellen. Centrifugeer de cellen bij 200 x g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur te pellet cellen. Herhaal dit 1 keer.
  6. De PBS gecombineerd en resuspendeer de pellet in PBS 1,5 mL per fles.
  7. Meng 50 µL van het mengsel van de cel met 50 µL van trypan blauw en cellen met behulp van een cel teller/Hemocytometer kamer28tellen.
  8. Celsuspensie bereid door verdunning van de cellen in PBS te injecteren 1 x 105 cellen (of andere vermelde bedrag) in 50 µL per muis. Houden van de cellen op ijs vóór injectie.
    Opmerking: Bereiden minstens twee keer meer cellen voor injectie te vermijden van celsuspensie opraakt.
  9. Bereiden van verdoving door verder verdunnen van ketamine en xylazine om een eindconcentratie van 10 mg/mL en 1 mg/mL, respectievelijk, elke muis met behulp van een 1 mL spuit en 27 G naald, anesthetize door het injecteren van intraperitoneally ketamine/xylazine oplossing bij 100/10 mg/kg respectievelijk.
  10. Volgen van de ademhaling van muizen en een snuifje teen in dienst. Juiste afstomping bevestigen wanneer de muis reageert niet tot teen snuifje. Dierenarts zalf toepassen op ogen om te voorkomen dat droogte terwijl onder verdoving.
  11. Plaats 1 muis tegelijk op een intubatie platform door opknoping haar voortanden met zijn rug tegen het platform.
  12. Verlichten van de bovenste borst met behulp van een glasvezel illuminator met visualisatie van de luchtpijp.
  13. Resuspendeer de cellen voorzichtig met behulp van een precisiepipet van p200 om ervoor te zorgen dat ze geen klontjes uitmaken. Open de mond van de muis en trek de tong zachtjes met een steriele platte Tang.
  14. Gebruik een intraveneuze katheter met de naald verwijderd om te voorkomen dat het blokkeren van de ademhaling. Standpunt de katheter over het witte licht uitgezonden van de opening van de luchtpijp.
  15. Plaats de katheter in de luchtpijp tot de bovenkant van de katheter de voortanden bereikt. Bevestig goede plaatsing van de katheter in de luchtpijp door het visualiseren van het witte licht schijnt door de opening van de katheter in de mond.
  16. Met behulp van een precisiepipet, afzien 50 µL van cellen rechtstreeks in de katheter om ervoor te zorgen dat het gehele volume wordt geïnhaleerd. Voer deze stap onder steriele omstandigheden.
    Opmerking: Als de katheter is correct ingevoegd, de muis zal onmiddellijk inhaleren de inhoud van de katheter.
  17. Wacht een paar seconden totdat het gehele volume naar beneden van de katheter reist, en vervolgens de katheter uit de luchtpijp verwijderen en gooi in 10% bleekwater oplossing.
  18. Als de muis de vloeistof niet inademen is, zorgvuldig controleren van ademhaling en pas de positie van de katheter. Als de muis ademhaling stopt, onmiddellijk verwijderen van de katheter en laat de muis om te hervatten ademhaling normaal vóór het opnieuw invoegen van de katheter.
    Opmerking: De gemiddelde tijd per muis stappen 4.11-4.18 is ongeveer 5 min.
  19. Plaats de ingespoten muis op een IACUC goedgekeurd verwarming pad op hun rug op een vlakke ondergrond voor herstel.
    Opmerking: De hele procedure duurt 10 min per muis. Een dier dat injectie aan het gezelschap van andere dieren tot volledig hersteld heeft ondergaan niet terugkeren.
  20. De hele rib gebied beide ventrally scheren en dorsally van B6129SF1/J en andere stammen van de muis met donker haar met behulp van een elektrisch scheerapparaat voorafgaand aan de beeldvorming.
  21. 2-3 min na injectie van de cel, injecteren 100 µL van luciferine retro-orbitally (15 mg/mL) met behulp van een naald van insuline. Het oog gebruikt voor injectie elke imaging-sessie worden afgewisseld.
  22. Na ten minste 2 minuten, maximaal 5 muizen in een dierlijke bioluminescentie imager in de dorsale lighouding positie plaatsen en het verwerven van een ventrale foto met behulp van luminescentie instellingen29.
  23. Pas de instellingen voor resolutie en gevoeligheid voor het meten van de luminescentie van een bepaalde cellijn onder het control panel. Voor de meeste toepassingen starten met 3 min (of "Auto" als verzadigd), weggooien = Medium (4), F/Stop = 1, gezichtsveld = D, onderwerp hoogte = 1,50.
    Opmerking: Als de injectie geslaagd is, luminescentie signaal wordt gevonden in het gebied van de bovenste borst, in één Long of beide longen.
  24. Muizen op sternale lighouding positie spiegelen en het verwerven van een dorsale foto als hierboven.
    Opmerking: Als cel injectie is niet goed uitgevoerd, kunnen cellen cluster bij de ingang van de luchtpijp of in de nek.
  25. Injecteren van ketoprofen 5 mg/kg intraperitoneally om pijn te verlichten.
  26. Muizen teruggaan naar hun kooi en plaats een kaart "BSL-2 Agent in gebruik" op de kooi.
  27. Monitor muizen voor respiratoire nood onmiddellijk na intubatie, en vervolgens elke 15 min tot muizen wakker uit de narcose. Laat geen muizen zonder toezicht totdat ze hebben herwonnen voldoende bewustzijn te handhaven sternale ligcomfort.
  28. Onderzoeken de muizen 24u post intubatie en drie keer per week voor symptomen van de ziekte.
  29. Bijhouden in het logboek van de datum van de procedure, de identificatie van dieren, de soort procedure, soort verdoving en postoperatieve bewaking observaties en tijden.
  30. Controleren van muizen voor gewichtsverlies, respiratoire nood, gedrags afwijkingen en een body condition score < 2 (segmentatie van wervelkolom duidelijk/dorsale bekken beenderen zijn voelbaar) bi-wekelijkse na inoculatie van bleomycine.
    Opmerking: Muizen met longkanker tumoren kunnen vertonen irritatie van de luchtwegen, gewichtsverlies, cachexia en/of dood.
  31. Euthanaseren muizen onder Ademhalings nood of muizen die 15% verlies van lichaamsgewicht door CO2 of ketamine/xylazine gevolgd door cervicale dislocatie als het verzamelen van weefsels hebben ervaren. Bevestig euthanasie door palpatie voor respiratoire activiteit uitvoeren.

5. de bewaking van de tumorgroei door bioluminescentie Imaging

  1. Beeldvorming van de muizen op dag 3 na engraftment en wekelijkse daarna herhalen
  2. Anesthetize muizen door het injecteren van ketamine/xylazine (zoals beschreven in stappen 2.4-2.5) of geïnhaleerde Isofluraan (2%). Volgen van de ademhaling van muizen en een snuifje teen te bevestigen goede afstomping tewerkstellen. Dierenarts zalf toepassen op ogen om te voorkomen dat droogte terwijl onder verdoving.
  3. De hele rib gebied beide ventrally scheren en dorsally van B6129SF1/J en andere stammen van de muis met donker haar met behulp van een elektrisch scheerapparaat voorafgaand aan de beeldvorming.
  4. Zodra de muizen onder verdoving zijn, injecteren 100 µL van luciferine retro-orbitally (15 mg/mL) met behulp van een naald van insuline. Wacht 2 min. plaatsvervanger het oog gebruikt voor injectie elke imaging-sessie.
  5. Plaats van muizen in de imager en verwerven dorsale en ventrale beelden zoals beschreven in stappen 4,22-4.24.
  6. Plaats de muizen terug in de kooi achter imaging, op hun rug op een vlakke ondergrond voor herstel.
    Opmerking: De hele procedure duurt 5 min per groep van 5 muizen. Laat geen muizen zonder toezicht totdat ze hebben herwonnen voldoende bewustzijn te handhaven sternale ligcomfort.
  7. Het analyseren van de beelden met behulp van de imager/bioluminescentie analysesoftware.
    1. Selecteer de juiste beelden en laden van hen als een groep in de Bioluminescentie analysesoftware.
    2. Klik op ROI tool | plein toe te voegen een vierkante regio van belang (ROI). Plaats de ROI over de borst gebied, die betrekking hebben op het imago van de gehele Long. Herhaal dit voor elke afbeelding van de muis.
    3. Klik met de rechtermuisknop en selecteer kopiëren alle ROI functie de dezelfde ROI toepassen op alle afbeeldingen in de groep te positioneren in de borst van de muizen, zowel ventrale en dorsale weergaven.
    4. Selecteer in de linker bovenhoek van het afbeeldingsvenster, de fotonen -functie. Klik op de maatregel controle paneel functie voor het meten van de ROI. Kopieer en plak de uitvoertabel met totale flux (fotonen/s) in een software van de keuze om de gegevens verder te analyseren.
    5. Normaliseren de dagwaarde van de ROI van elke muis op de ROI waarde gemeten op dag 0.

6. de weefsels isolatie en verwerking.

  1. Anesthetize muizen door het injecteren van ketamine/xylazine (zoals beschreven in stappen 2.4-2.5 of door geïnhaleerde Isofluraan (2%). Volgen van de ademhaling van muizen en een snuifje teen in dienst. Juiste afstomping bevestigen wanneer de muis reageert niet tot teen snuifje. Dierenarts zalf toepassen op ogen om te voorkomen dat droogte terwijl onder verdoving.
  2. Retro-orbitally 100 µL van luciferine injecteren (15 mg/mL) met behulp van een naald van insuline. 2 min wachten.
  3. Afbeelding muizen na stappen 4,22-4.24 van dit protocol.
  4. Injecteren in het andere oog uit stap 6.2 luciferine retro-orbitally met behulp van een naald van de insuline voorafgaand aan de euthanasie een andere 100 µL.
  5. De muizen euthanaseren door intraperitoneale injectie van ketamine/xylazine (zie stap 2.4 voor details) gevolgd door cervicale dislocatie als muizen onder diepe verdoving overeenkomstig richtsnoeren van IACUC zijn. Bevestig euthanasie door palpatie voor respiratoire activiteit uitvoeren.
  6. Met behulp van steriele chirurgische schaar maken een huid incisie onder het borstbeen. De spier laag langs het diafragma met behulp van Tang en chirurgische scharen open en bloot de borstholte door doorsnijden de ribbenkast op een van de laterale zijden het vermijden van het interne thoracale slagaders.
  7. Perfuse van de muis door een kleine snede in de juiste atrium van het hart en 5 mL PBS via het linkerventrikel te injecteren. De kleur van longweefsel gaat van rood naar bleke roze-wit als de bloedverspreiding naar behoren wordt gedaan.
  8. De longen van de borstholte zorgvuldig accijnzen door grijpen de slokdarm of het hart met een tang. Zachtjes trekken van het weefsel en het gebruik van chirurgische schaar te zorgvuldig snijden aansluitende weefsel vermijden aanprikken van het longweefsel. Behoud de luchtpijp zoveel mogelijk voor de inflatie van de luchtwegen van de longen in een later stadium.
  9. Wassen van de longen door dompelen en wervelende het weefsel 3 keer in een 6 goed bord gevuld met 3 mL PBS te verwijderen overtollige bloed.
  10. Plaats van de longen op het deksel van een 6 goed plaat, en plaats de deksel met het weefsel in de bioluminescente imager en verwerven een verlichte afbeelding30.
    Opmerking: We raden de volgende instellingen uit de "overname control panel" selecteren "gezichtsveld = A" en "onderwerp hoogte = 0,75 cm" en vervolgens "Auto blootstelling" vermijden wordend verzadigde afbeeldingen.
  11. Accijnzen en beeld van andere organen, zoals in stap 6,9-6.10, waar de uitzaaiing zijn geïdentificeerd door luminescentie, zoals hersenen, lever, bijnier, bot, lymfklieren, nieren of milt31gedaan.
  12. Perfuse de Long met 1 mL 4% paraformaldehyde door het invoegen van de naald in de luchtpijp van de muis. De longen zal opblazen als goed perfused.
    Let op: 4% paraformaldehyde is een giftige, een gezondheid gevaren van GHS07 en GHS08.
  13. Breng de longen in een met 5 mL 4% paraformaldehyde conische 15 mL.
  14. Het oplossen van de longen of andere weefsels door het weefsel met 4% paraformaldehyde's nachts bij 4 ° C in een schudden apparaat bij 30-50 rpm aan het broeden.
  15. Longen (of andere weefsels) insluiten in paraffine of snijden van de optimale temperatuur samengestelde afhankelijk van de toepassing-32.
    Opmerking: Paraffine is de voorkeursmethode voor het behoud van de structuur van de longen en voor Masson Trichrome en Haematoxyline-eosine-kleuring.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Het vergroten van de efficiëntie van LUAD kanker cel engraftment in de longen van muizen, ontwikkelden we een protocol dat eerst vooraf de voorwaarden van de luchtwegen met behulp van bleomycine gevolgd door orthotopic tumor cel injectie (Figuur 1). We hebben bevestigd dat zelfs indien toegediend in immuungecompromitteerde athymic muizen, bleomycine voorbijgaande fibrose geïnduceerd door dag 14 blijkens door verlies van airway architectuur en verhoogde collageen afzetting (Figuur 2). Bruto fibrose in deze muizen opgelost 50 dagen post Bleomycine injectie (Figuur 2; juiste panelen) overeenstemming met voorafgaande studies24.

Op basis van deze opmerkingen, we LUAD cellen van verschillende oorsprong geaccepteerd in de longen van verschillende muis stammen die had vooraf geconditioneerd met een enkelvoudige dosis van voertuig of bleomycine 14 dagen vooraf. Bijvoorbeeld, werd een suspensie van LUAD cellen van de gevestigde menselijke LUAD cellijn, H2030, intratracheally in de longen van athymic muizen afgeleverd. Na 35 dagen had muizen voorbehandeld met bleomycine hoge Long tumor lasten zoals gedetecteerd door bioluminescentie (figuur 3A). Omgekeerd, in de voertuig-behandelde dieren, geen tumoren ontdekt over hetzelfde tijdsbestek (figuur 3A). Long tumor last werd bevestigd door histologie na necropsie. Longen voorbehandeld met voertuig had geen bewijs van tumor knobbeltjes overwegende dat bleomycine vooraf behandelde longen had grote tumor knobbeltjes (figuur 3B). Met behulp van dit protocol, verhoogd we ook de engraftment van een andere menselijke cellijn van LUAD in athymic muizen (PC9; Figuur 3 c) en een lymfkliertest cellijn van LUAD dat werd geïnjecteerd in syngeneic immunocompetent B6129SF1/J muizen (figuur 3D). De vroege letsels waargenomen in bleomycine vooraf behandelde syngeneic muizen waren voornamelijk rang 1 en 2 en werden goed gedifferentieerd, lijkend op tumoren ontstaan in situ van KrasG12D / +; p53- / - GEMMs33. Alle werk LUADs groeide zowel in de proximale en distale Long (figuur 3B, figuur 3E, Figuur 3 g; sterretje (distale), star (proximale)). De oprichting van PDXs uit long kanker biospecimens (vanaf biopsieën of chirurgische resections) is relatief inefficiënt, zelfs wanneer menselijke cellen subcutaan in ernstig immunodeficiëntie dieren zoals de knik scid gamma (NSG) worden getransplanteerd muis stam34. Om te beoordelen van de mogelijke toepassing van onze methode te PDXs, geïnjecteerd wij ook een zeer metastatische cel subpopulatie van de cellijn van H2030, aangeduid als H2030-BrM3 cellen35, intratracheally bij NSG muizen dat vooraf geconditioneerde met voertuig is geweest of Bleomycine. Wij stellen vast dat NSG muizen gevoeliger voor de giftige effecten van bleomycine (gegevens niet worden weergegeven wellicht) en dat een dosis minder dan 0,02 eenheden per muis aan te raden is bij het werken met deze spanning. Echter verhoogd ons protocol ook aanzienlijk de engraftment en de lasten van de tumor in de longen van NSG muizen (figuur 3F, Figuur 3 g).

Wij vervolgens dit protocol gebruikt om te testen de engraftment tarieven van beperking van de hoeveelheden cellen met behulp van de cellijn van H2030 bij athymic muizen. Muizen vooraf behandeld met bleomycine werden ingespoten met 5 x 10,5, 5 x 10,4of 5 x 103 H2030 cellen. 85,7-100% van de muizen ontwikkeld tumoren van de Long tussen 7 en 10 weken in alle verdunningen getest (tabel 2). We concluderen dat engraftment voor een relatief laag aantal tumorcellen in de longen is mogelijk als het muizen zijn vooraf geconditioneerde met bleomycine. Over het geheel genomen ons protocol kan worden aangepast aan verschillende stammen van muizen en diverse modellen van de lijn van LUAD cel te verhogen van het tempo van de engraftment van de kankercellen in de longen van 0-16,7% tot 71,4-100% (tabel 2).

Tot slot, om te beoordelen van de vermeende kinetiek van LUAD cel uitgroei en metastatische verspreiding van bleomycine vooraf geconditioneerde longen, gekenmerkt we het gedrag van zeer uitgezaaide cellen van de H2030-BrM3 met behulp van ons protocol. Na orthotopic engraftment in muizen voertuig-behandeld, tumor cel uitputtingsslag werd waargenomen door bioluminescentie op dag 3 na injectie en longkanker tumorgroei niet kon worden opgespoord, daarna of op eindpunt (dag 35) (figuur 4A, figuur 4B). Omgekeerd, ontdekt we Long tumor uitgroei in muizen vooraf behandeld met bleomycine zo spoedig dag 7 na injectie (figuur 4A). Na 39-57 dagen van uitbreiding van de tumor, de morbiditeit en de bioluminescente intensiteit geassocieerd met hoge Long tumor Last grenzen de analyse van gedissemineerde ziekte (gegevens niet worden weergegeven). Dus beeld we metastase in verre organen ex vivo bij de necropsie. In dieren die longkanker tumor last 57 dagen gehad, kunnen kleine letsels ook worden gedetecteerd in de weefsels zoals de hersenen, lever, nieren, bijnieren en bot hind ledematen bij variabele frequenties (figuur 4C). Wij concluderen daarom, dat spontane gedissemineerde ziekte in klinisch relevante sites kan worden gegenereerd vanuit deze orthotopic-methode.

Figure 1
Figuur 1: methode om de vooraf de conditie van de longen voor tumor cel engraftment. Schematische voorstelling van het gebruikte protocol. Long letsel wordt uitgevoerd door het injecteren van bleomycine intratracheally. LUAD cellen zijn vervolgens geïnjecteerd in de luchtpijp van muizen 14 dagen na. Muizen zijn daarna wekelijks beeld voor luminescentie monitor tumor engraftment, groei en verre metastase. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: bleomycine veroorzaakt voorbijgaande Long-fibrose en ECM remodeling. Representatieve beelden van Haematoxyline-eosine (H & E) en Masson Trichrome verkleuring van de longen van voertuig en bleomycine behandeld muizen 14 dagen na injectie (piek van fibrose) en 51 dagen na injectie (fibrose resolutie) bij ontstentenis van tumor cel injectie. Schaal bar = 500 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: Long engraftment van LUAD cellijnen in meerdere Muismodellen wordt verhoogd in muizen vooraf behandeld met bleomycine. A) Athymic muizen vooraf behandeld met voertuig of bleomycine werden ingespoten met 5 x 105 H2030 cellen. Relatieve Long tumor lasten op eindpunt (dag 35 op dag 0 na injectie genormaliseerd) wordt zoals gemeten door bioluminescentie uitgezet. Voor iedere groep is een muis met mediaan tumor last komt te staan. n = 6-7 muizen per groep. B) vertegenwoordiger H & E beelden van longen vooraf behandeld met voertuig of bleomycine van A op dag 35. Sterretje = distale; Ster = proximale. C) Athymic muizen behandeld zoals in A waren geïnjecteerd met 1 x 105 PC9 cellen. Tumor lasten en vertegenwoordiger beelden worden gemeten en weergegeven als in A. n = 7 muizen per groep. D-E) B6129SF1/J muizen vooraf behandeld met voertuig of bleomycine waren geïnjecteerd met 1 x 105 368T1 KrasG12D / + p53- / - (T-niet Met KP) cellen. Last van de tumor, representatieve beelden en H & Es worden gemeten en afgebeeld als in A en B. n = 7 muizen per groep. F-G) NSG muizen vooraf behandeld met voertuig of bleomycine waren geïnjecteerd met 1 x 105 H2030-BrM3 cellen. Last van de tumor, representatieve beelden en H & Es (dag 9 en 10 dag na injectie) worden gemeten en weergegeven als in A en B. n = 3-6 muizen per groep. Schaal bar = 500 µm. inzet = hoge vergroting van tumor cel geaccepteerd gebieden. Schaal bar van inzetstukken = 100 µm. p waarden die zijn berekend door de Mann-Whitney-test. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: LUAD cellen in muizen bleomycine behandeld geaccepteerd metastaseren aan meerdere verre organen. A) Athymic muizen vooraf behandeld met voertuig of bleomycine werden ingespoten met 5 x 105 H2030-BrM3 cellen. Long tumor last werd gemeten wekelijks met behulp bioluminescentie. Dorsal totale foton-flux genormaliseerd naar dag 0 wordt weergegeven. B) Tumor belasten door bioluminescentie van de longen van A op het eindpunt (dag 35 na injectie). Voor iedere groep is een muis met mediaan tumor last komt te staan. n = 6-7 muizen per groep. C) representatieve beelden van organen met detecteerbare metastase van de dezelfde muis necropsie (links). Tabel met aangegeven frequenties van muizen met metastase in verre organen bij eindpunt (dag 39 tot en met 57 na engraftment) (rechts). Ex-vivo organen met de bioluminescente lichtsignaal boven 1.5 x 104 fotonen / (sec cm2 steradiaal) werden geteld als positieve metastase. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Muis stam Eenheden/muis
Athymic 0.02
NSG 0.02
B6129SF1/J 0.005

Tabel 1: Lijst van de aanbevolen doses van bleomycine voor muis stammen getest.

Muis stam Cellijn Aantal cellen geïnjecteerd % engraftment p -waarde
Voertuig Bleomycine
Athymic H2030 5 x 105 0% (0/7) 100% (6/6) 0.0006
Athymic H2030 5 x 104 n.d. 85,7% (6/7) n.a.
Athymic H2030 5 x 103 n.d. 85,7% (6/7) n.a.
Athymic PC-9 1 x 105 0% (0/7) 85,7% (6/7) 0.0023
NSG H2030-BrM3 1 x 105 16,7% (1/6) 100% (3/3) * 0.0476
B6129SF1/J 368T1 1 x 105 0% (0/7) 71,4% (5/7) * 0.0105

Tabel 2: Overzicht van de frequentie van de engraftment (%) met behulp van de aangegeven muis spanningen, cellijnen en cel nummers. Engraftment werd bepaald door in vivo luminescentie imaging en bevestigd door ex vivo imaging met histologie van de weefsels tussen 37 tot 50 dagen na injectie. * Positieve engraftment werd bevestigd door in vivo luminescentie op dag 10 na injectie.p waarden berekend door eenzijdige Fischers exacte test. n.v.t. = niet van toepassing; n.d. = niet bepaald.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Opvallende klinische parallellen zijn gedocumenteerd tussen longkanker en andere chronische ziekten van de Long-36. Met name patiënten met idiopathische longfibrose (IPF) hebben een verhoogde voorliefde voor ontwikkelende longkanker, en deze vereniging is onafhankelijk van roken geschiedenis37,38. IPF wordt gekenmerkt door progressieve vernietiging van Long architectuur en verminderde ademhalingsfunctie door afzetting van ECM39. Ook na chirurgische resectie hebben vroege fase NKCLK patiënten met gelijktijdige IPF een slechte uitkomst40. De meeste NKCLK tumoren bevatten een fibrotische component op het moment van diagnose, en de omvang van deze stromale reactie correleert met slechte prognose18. De incidentie van tumorvorming op meerdere manieren kan worden verhoogd door acute of langdurige weefselschade van fibrose. Bijvoorbeeld na schade, kan het proces van epitheliale regeneratie uitbreiden het zwembad van voorlopercellen vatbaar voor transformatie. U kunt ook kunnen de instroom en de functie van diverse immuuncellen helpen stellen een immunosuppressieve communicatie, terwijl de activering van myofibroblasts kan afscheiden van groeifactoren of tumor storten-bevordering van ECM. Dienovereenkomstig, onze werkwijze preconditionering de longen met een fibrosis inducerende agent kan blijken te zijn met name apt bestudeert de effecten van long kanker co-morbiditeit (bijvoorbeeld fibrose) en modellering NKCLK subtypes, die rijk aan de extracellulaire matrix zijn en een inflammatoire stroma41.

Over het geheel genomen verbeterd onze methode aanzienlijk de engraftment van tumorcellen geïnjecteerd in de luchtwegen via de luchtpijp. Deze constatering geldt voor muis stammen met wisselend immunocompetence. Andere methoden van tumor cel injectie in de longen zijn staart veneuze injectie of directe inspuiting in de Long parenchym via de borstwand. Deze methoden zijn voor het specifieke doel van het bestuderen van de long kanker cel tumorigeniciteit, suboptimale, zoals de voormalige tumorcellen te overleven in omloop en extravasate voordat uitgroei (een proces meer verwant aan uitzaaiingen in de longen), terwijl de laatste vereist kan veroorzaken cellen uit te lekken in de pleurale ruimte spoedig na injectie (gegevens niet worden weergegeven). Beide methoden kunnen verwarren loco-regionale kwantificering van long kanker cel uitgroei. Anderzijds is ons protocol zorgt ervoor dat geplaatste tumorcellen worden eerst bewaard in de luchtwegen omringd door de longen stroma. Cruciaal voor het succes van dit protocol, zijn de juiste intubatie van de muizen, de maximaal toelaatbare dosis bleomycine, en timing van de pre conditionering airway ten opzichte van de tumor cel injectie. We laten ook zien dat dit protocol de cellen vervolgens verspreiden naar andere weefsels kunnen, met inbegrip van de hersenen. Hoewel de morbiditeit geassocieerd met longkanker tumor last nog steeds uitgebreide karakterisering van verre macrometastasis beperken kan, kan deze aanpak zinvol zijn te kwantificeren en te bestuderen van circulerende tumorcellen die afkomstig zijn uit de longen.

Ondanks de voordelen van de methode die hierin worden beschreven, kunnen verschillende technische variabelen invloed hebben de ultieme efficiëntie van engraftment en monitoring van de progressie van de tumor. Ten eerste is het goed gedocumenteerd dat de fibrotische reacties op bleomycine bij muizen afhankelijk van de stam is. Bijvoorbeeld, zijn C57Bl/6 muizen meer vatbaar voor fibrose in vergelijking met de Balb/c muizen42. Ten tweede, gevoeligheid voor bleomycine is geslacht en leeftijd afhankelijk. In onze ervaring zijn vrouwtjes en jongere muizen gevoeliger voor bijwerkingen over het gehele protocol. Dit kan beperken tumorvorming studies vereisen van directe vergelijkingen tussen man en vrouw, of jonge en oude dieren. Bovendien intratracheale instillatietest van muizen jonger dan 7 weken is technisch uitdagend en aanpassingen van de grootte van de katheter kunnen worden vereist. Ten derde, bleomycine is giftig en mogelijk mutageen vanwege zijn vermogen voor het opwekken van DNA-einden. Het is belangrijk om te testen van de maximaal toelaatbare dosis bleomycine voor elke muis stam vóór het uitvoeren van de experimenten. In dit bewijs van beginsel studie bieden wij de voorgestelde doseringen voor mannelijke muizen over verschillende spanningen. Bovendien zijn de muizen met donkere vacht minder geschikt voor bioluminescente imaging als gevolg van lage weefsel penetratie en maskeren van de bioluminescente signaal door de vacht. De muizen verplegende afbeelding metingen kan verbeteren, maar alternatieve methoden kunnen ook worden ingezet zoals magnetische resonantie beeldvorming en fluorescerende geschikt zijn met behulp van sondes voor lange golflengte zoals TdTomato of Katushka43. Tot slot kan de potentiële immunogeniciteit van een bepaalde verslaggever eiwit moet worden overwogen bij het selecteren van een tumor detectie modaliteit voor een bepaalde muismodel.

Bleomycine vernieuwt de distale longen door eerste schadelijke alveolaire Typ 2 (AT2) cellen die vervolgens in een poging om te herstellen van de longblaasjes44regenereren. Aangezien AT2 cellen een van de belangrijkste celtypen zijn leiden tot NKCLK, kan preconditionering de longen met bleomycine ook wijzigen de inleiding en de progressie van de tumoren die voortvloeien GEMMs in situ . Andere soorten letsel met inbegrip van influenza-infectie13 of naftaleen instillation14, is aangetoond dat het verhogen van de engraftment van menselijke en lymfkliertest Long stam/voorlopercellen. Met name, naftaleen schade stam/voorlopercellen cellen in de bronchio-alveolaire kruispunten en potentieel verhoogt tumor initiatie in GEMMs45. "Fine-tuning"-het soort schade en airway niche gericht op het werk celtypes kan onze methode om te studeren long kanker allografts of xenografts van verschillende oorsprong verder te optimaliseren. Tot slot stellen wij voor dat deze methode voor de standaard generatie van longkanker, PDXs kan worden geïmplementeerd. Het slagingspercentage longkanker PDXs van menselijke biospecimens tot stand te brengen door subcutane transplantatie bij NSG muizen is relatief laag (30-40%)46,47. Orthotopic groei van de PDXs kan niet alleen verhogen deze succestarief met beperking van de hoeveelheid monster (van menselijke longen), maar ook het genereren van meer fysiologisch relevante voorwaarden de farmacokinetiek en de farmacodynamica van lung cancer therapeutics testen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

Acknowledgments

Deze studie werd gefinancierd door subsidies van het National Cancer Institute (R01CA166376 en R01CA191489 te D.X. Nguyen) en het ministerie van defensie (W81XWH-16-1-0227 te D.X. Nguyen).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bleomycin Sigma B5507-15UN CAUTION Health hazard GHS08
Exel Catheter 24G Fisher 1484121 Remove needle. For intratracheal injection
Ketamine (Ketaset inl 100 mg/mL C3N 10 mL) Butler Schein 56344 To anesthetize mice
Xylazine Butler Schein 33198 To anesthetize mice
Ketoprofen, 5,000 mg Cayman Chemical 10006661 Analgesic
Puralube Veterinary Ophthalmic Ointment BUTLER ANIMAL HEALTH COMPANY LLC 8897 To prevent eye dryness while under anesthesia
D-Luciferin powder Perkin Elmer Health Sciences Inc 122799 For luminescent imaging. Reconstitute powder with PBS for a working concentration of 15mg/mL. Protect from Light
Rodent Intubation stand Braintree Scientific RIS-100 Recommended stand for intratracheal injection
MI-150 ILLUMINATOR 150W MI-150 DOLAN-JENNER INDUSTRIES MI-150 / EEG2823M To illuminate and visualize trachea
Graefe Forceps, 2.75 (7 cm) long serrat Roboz RS-5111 For intratracheal injection
Syringe Luer-Lok Sterile 5ml BD / Fisher 309646
Satiny Smooth by Conair Dual Foil Wet/Dry Rechargeable Shaver Conair - To shave mice
Bonn Scissors, 3.5" straight 15 mm sharp/sharp sure cut blades Roboz RS-5840SC
15 mL conical tube BD / Fisher 352097
1.5 mL centrifuge tubes USA SCIENTIFIC INC 1615-5500
Vial Scintillation 7 mL Borosilicate Glass GPI Fisher 701350
Filter pipette tips (200 μL) USA SCIENTIFIC INC 1120-8710
Phosphate Buffered Saline Life Technologies 14190-144
0.25% Trypsin-EDTA Life Technologies 25200-056
DMEM high glucose Life Technologies 11965-092
RPMI Medium 1640 Life Technologies 11875-093
Fetal bovine serum USDA Life Technologies 10437-028
Penicillin-Streptomycin Life Technologies 15140-122
Amphotericin B Sigma A2942-20ML
Trypan Blue Stain 0.4% Life Technologies 15250-061
Countess Automated Cell Counter Life Technologies AMQAX1000
Flask T/C 75cm sq canted neck, blue cap Fisher / Corning 353135
IVIS Spectrum Xenogen Bioluminiscence Perkin Elmer Health Sciences Inc 124262 For in vivo bioluminescence imaging
Living image software Perkin Elmer Health Sciences Inc 128113 For in vivo bioluminescence analysis
XGI-8 Gas Anesthesia System Perkin Elmer Health Sciences Inc 118918 For Isoflurane anesthesia
BD Ultra-Fine II Short Needle Insulin Syringe 1 cc. 31 G x 8 mm (5/16 in) BD / Fisher BD328418 For retro-orbital luciferin injection
Syringe 1ml BD / Fisher 14-823-434 For intraperitoneal injections
26 G x 1/2 in. needle BD / Fisher 305111 For intraperitoneal injections
4% Paraformaldehyde VWR 43368-9M CAUTION Health hazard GHS07, GHS08. For fixing tissue
Pipet-Lite Pipette, Unv. SL-200XLS+ METTLER-TOLEDO INTERNATIONAL 17014411
Mayer's Hematoxylin ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES 517-28-2
Eosin Y stain 0.25% (w/v) in 57% Fisher 67-63-0
Masson Trichrome Stain Kit IMEB Inc K7228 For masson trichrome stain to visualize collagen
Superfrost plus glass slides Fisher 1255015
6 well plate Corning C3516
Universal Mycoplasma Detection Kit ATCC 30-1012K
OCT Embedding compound ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES 62550-12 For embedding tissue for frozen sections
Leica CM3050 S Research Cryostat Leica CM3050 S To section tissue for staining analysis
Keyence All-in One Fluorescence Microscope Keyence BZ-X700
ImageJ US National Institutes of Health IJ1.46 http://rsbweb.nih.gov/ij/ download.html
Prism 7.0 for Mac OS X GraphPad Software, Inc. -
Athymic (Crl:NU(NCr)-Foxn1nu) mice Charles River NIH-553
NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) mice Jackson Laboratories 5557
B6129SF1/J mice Jackson Laboratories 101043
NIH-H2030 cells ATCC CRL-5914
368T1 generously provided by Monte Winslow (Standford University) -
PC9 cells Nguyen DX et al. Cell. 2009;138:51–62 -
H2030 BrM3 cells Nguyen DX et al. Cell. 2009;138:51–62 -

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2015. CA-Cancer J Clin. 65, 5-29 (2015).
  2. Gaspar, L. E. Brain metastases in lung cancer. Expert Rev Anticanc. 4, 259-270 (2004).
  3. Hess, K. R., et al. Metastatic patterns in adenocarcinoma. Cancer. 106, 1624-1633 (2006).
  4. Hoffman, P. C., Mauer, A. M., Vokes, E. E. Lung cancer. Lancet. 355, 479-485 (2000).
  5. Travis, W. D. Pathology of lung cancer. Clin Chest Med. 23 (1), 65-81 (2002).
  6. Chen, Z., Fillmore, C. M., Hammerman, P. S., Kim, C. F., Wong, K. K. Non-small-cell lung cancers: a heterogeneous set of diseases. Nat Rev Cancer. 14, 535-546 (2014).
  7. Kim, C. F., et al. Mouse models of human non-small-cell lung cancer: raising the bar. Cold Spring Harb Sym. 70, 241-250 (2005).
  8. Meuwissen, R., Berns, A. Mouse models for human lung cancer. Gene Dev. 19, 643-664 (2005).
  9. Junttila, M. R., de Sauvage, F. J. Influence of tumour micro-environment heterogeneity on therapeutic response. Nature. 501, 346-354 (2013).
  10. Nguyen, L. V., Vanner, R., Dirks, P., Eaves, C. J. Cancer stem cells: an evolving concept. Nat Rev Cancer. 12, 133-143 (2012).
  11. Minchinton, A. I., Tannock, I. F. Drug penetration in solid tumours. Nat Rev Cancer. 6, 583-592 (2006).
  12. Leblond, A. L., et al. Developing cell therapy techniques for respiratory disease: intratracheal delivery of genetically engineered stem cells in a murine model of airway injury. Hum Gene Ther. 20, 1329-1343 (2009).
  13. Vaughan, A. E., et al. Lineage-negative progenitors mobilize to regenerate lung epithelium after major injury. Nature. 517, 621-625 (2015).
  14. Zuo, W., et al. p63(+)Krt5(+) distal airway stem cells are essential for lung regeneration. Nature. 517, 616-620 (2015).
  15. Mahoney, J. E., Kim, C. F. Tracing the potential of lung progenitors. Nat Biotechnol. 33, 152-154 (2015).
  16. Wang, D., Morales, J. E., Calame, D. G., Alcorn, J. L., Wetsel, R. A. Transplantation of human embryonic stem cell-derived alveolar epithelial type II cells abrogates acute lung injury in mice. Mol Ther. 18, 625-634 (2010).
  17. Ortiz, L. A., et al. Mesenchymal stem cell engraftment in lung is enhanced in response to bleomycin exposure and ameliorates its fibrotic effects. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 8407-8411 (2003).
  18. Suzuki, K., et al. Prognostic significance of the size of central fibrosis in peripheral adenocarcinoma of the lung. Ann Thorac Surg. 69, 893-897 (2000).
  19. Cancer Genome Atlas Research, N. Comprehensive molecular profiling of lung adenocarcinoma. Nature. 511, 543-550 (2014).
  20. Scotton, C. J., Chambers, R. C. Bleomycin revisited: towards a more representative model of IPF? Am J Physiol-Lung C. 299, L439-L441 (2010).
  21. Hay, J., Shahzeidi, S., Laurent, G. Mechanisms of bleomycin-induced lung damage. Arch Toxicol. 65, 81-94 (1991).
  22. Vaccaro, C. A., Brody, J. S., Snider, G. L. Alveolar wall basement membranes in bleomycin-induced pulmonary fibrosis. Am Rev Respir Dis. 132, 905-912 (1985).
  23. Venkatesan, N., Ebihara, T., Roughley, P. J., Ludwig, M. S. Alterations in large and small proteoglycans in bleomycin-induced pulmonary fibrosis in rats. Am J Resp Crit Care. 161, 2066-2073 (2000).
  24. Moore, B. B., Hogaboam, C. M. Murine models of pulmonary fibrosis. Am J Physiol-Lung C. 294, L152-L160 (2008).
  25. Izbicki, G., Segel, M. J., Christensen, T. G., Conner, M. W., Breuer, R. Time course of bleomycin-induced lung fibrosis. Int J Exp Pathol. 83, 111-119 (2002).
  26. Schrier, D. J., Phan, S. H., McGarry, B. M. The effects of the nude (nu/nu) mutation on bleomycin-induced pulmonary fibrosis. A biochemical evaluation. Am Rev Respir Dis. 127, 614-617 (1983).
  27. Ponomarev, V., et al. A novel triple-modality reporter gene for whole-body fluorescent, bioluminescent, and nuclear noninvasive imaging. Eur J Nucl Med Mol I. 31, 740-751 (2004).
  28. Morten, B. C., Scott, R. J., Avery-Kiejda, K. A. Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell. J. Vis. Exp. , (2016).
  29. Tseng, J. C., Kung, A. L. Quantitative bioluminescence imaging of mouse tumor models. Cold Spring Harbor protocols. , pdb prot078261 (2015).
  30. Byrne, F. L., McCarroll, J. A., Kavallaris, M. Analyses of Tumor Burden In Vivo and Metastasis Ex Vivo Using Luciferase-Expressing Cancer Cells in an Orthotopic Mouse Model of Neuroblastoma. Methods Mol Biol. 1372, 61-77 (2016).
  31. Parkinson, C. M., et al. Diagnostic necropsy and selected tissue and sample collection in rats and mice. J. Vis. Exp. , (2011).
  32. Tammela, T., et al. A Wnt-producing niche drives proliferative potential and progression in lung adenocarcinoma. Nature. 545, 355-359 (2017).
  33. DuPage, M., Dooley, A. L., Jacks, T. Conditional mouse lung cancer models using adenoviral or lentiviral delivery of Cre recombinase. Nat Protoc. 4, 1064-1072 (2009).
  34. Byrne, A. T., et al. Interrogating open issues in cancer precision medicine with patient-derived xenografts. Nat Rev Cancer. 17, 254-268 (2017).
  35. Nguyen, D. X., et al. WNT/TCF signaling through LEF1 and HOXB9 mediates lung adenocarcinoma metastasis. Cell. 138, 51-62 (2009).
  36. Raghu, G., Nyberg, F., Morgan, G. The epidemiology of interstitial lung disease and its association with lung cancer. Brit J Cancer. 91, Suppl 2. S3-S10 (2004).
  37. Hubbard, R., Venn, A., Lewis, S., Britton, J. Lung cancer and cryptogenic fibrosing alveolitis. A population-based cohort study. Am J Resp Crit Care. 161, 5-8 (2000).
  38. Nagai, A., Chiyotani, A., Nakadate, T., Konno, K. Lung cancer in patients with idiopathic pulmonary fibrosis. Tohoku J Exp Med. 167, 231-237 (1992).
  39. Rock, J. R., et al. Multiple stromal populations contribute to pulmonary fibrosis without evidence for epithelial to mesenchymal transition. Proc Natl Acad Sci USA. 108, E1475-E1483 (2011).
  40. Saito, Y., et al. Survival after surgery for pathologic stage IA non-small cell lung cancer associated with idiopathic pulmonary fibrosis. Ann Thorac Surg. 92, 1812-1817 (2011).
  41. Stevens, L. E., et al. Extracellular Matrix Receptor Expression in Subtypes of Lung Adenocarcinoma Potentiates Outgrowth of Micrometastases. Cancer Res. 77, 1905-1917 (2017).
  42. Harrison, J. H., Lazo, J. S. High dose continuous infusion of bleomycin in mice: a new model for drug-induced pulmonary fibrosis. J Pharmacol Exp Ther. 243, 1185-1194 (1987).
  43. Shcherbo, D., et al. Bright far-red fluorescent protein for whole-body imaging. Nature Methods. 4, 741-746 (2007).
  44. Aso, Y., Yoneda, K., Kikkawa, Y. Morphologic and biochemical study of pulmonary changes induced by bleomycin in mice. Lab Invest. 35, 558-568 (1976).
  45. Kim, C. F., et al. Identification of bronchioalveolar stem cells in normal lung and lung. Cell. 121, 823-835 (2005).
  46. Fichtner, I., et al. Establishment of patient-derived non-small cell lung cancer xenografts as models for the identification of predictive biomarkers. Clin Cancer Res. 14, 6456-6468 (2008).
  47. Zhang, X. C., et al. Establishment of patient-derived non-small cell lung cancer xenograft models with genetic aberrations within EGFR, KRAS and FGFR1: useful tools for preclinical studies of targeted therapies. J Transl Med. 11, 168 (2013).

Tags

Geneeskunde kwestie 136 adenocarcinoom van de Long orthotopic muismodellen intratracheale injectie bleomycine engraftment metastase
Preconditionering de luchtwegen van muizen met bleomycine verhoogt de efficiëntie van Orthotopic long kanker cel Engraftment
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stevens, L. E., Arnal-Estapé,… More

Stevens, L. E., Arnal-Estapé, A., Nguyen, D. X. Pre-Conditioning the Airways of Mice with Bleomycin Increases the Efficiency of Orthotopic Lung Cancer Cell Engraftment. J. Vis. Exp. (136), e56650, doi:10.3791/56650 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter