Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Предварительного кондиционирования Airways мышей с блеомицин увеличивает эффективность приживления клеток рака легких ортотопическая

Published: June 28, 2018 doi: 10.3791/56650
Automatic Translation
*1, *1, 1,2
1Department of Pathology, Yale University School of Medicine, 2Department of Medical Oncology, Yale University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Мы описываем метод значительно повысить ортотопическая приживления клеток рака легкого в мышиных легкие путем предварительного кондиционирования airways с травмой. Этот подход может также применяться к исследованию стромальные взаимодействий внутри легких микроокружения, метастатические распространения, сопутствующие заболевания раком легких, и более эффективно создавать пациента производной ксенотрасплантатов.

Abstract

Рак легких является смертельной лечения огнеупорных болезнь, которая является биологически гетерогенной. Чтобы понять и эффективно лечить полный Клинический спектр грудной клетки злокачественных опухолей, необходимы дополнительные Животные модели, которые можно резюмировать подтипы рака различных человеческих легких и этапов. Аллотрансплантатом или гранулы ксенотрансплантата модели универсальны и дать количественную оценку онкогенной потенциала в естественных условиях, используя злокачественных клеток мышиных или человеческого происхождения. Однако ранее описанных методов приживления клеток рака легких выполнены в не физиологические сайтов, таких как фланг мышей, из-за неэффективности ортотопическая трансплантации клеток в легкие. В этом исследовании мы описываем метод для повышения ортотопическая легких рак клеток приживления путем предварительного кондиционирования airways мышей с фиброзом блеомицин заставить агент. Как доказательство концепции эксперимент мы применяли такой подход привить опухолевых клеток подтипа аденокарциномы легкого, полученные из антропогенных источников, или мыши в различных штаммов мышей. Мы демонстрируем, что ранив airways с блеомицин до инъекции клеток опухоли увеличивает приживления опухолевых клеток от 0-17% до 71-100%. Существенно этот метод расширения распространенности опухоли легких и последующие нарост, с использованием различных моделей и мыши штаммов. Кроме того раковые клетки прижившимися легких распространять из легких в соответствующих отдаленные органы. Таким образом мы предоставляем протокол, который может использоваться для создания и поддержания новых моделей ортотопическая рака легких с ограничением количества клеток или биопрепаратов и количественно оценить онкогенной способность клеток рака легкого в физиологически соответствующие параметры .

Introduction

Рак легких является ведущей причиной рака связанных смертей во всем мире1. У пациентов с раком легких в конечном итоге уступить от метастазов в отдаленные органы, в частности для центральной нервной системы, печени, надпочечники и кости2,3,4. Грудной клетки злокачественных опухолей традиционно были классифицированы как мелкоклеточный рак легких (МРЛ) или легких немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ)5. НМРЛ — наиболее часто диагноз злокачественных новообразований и можно подразделить различных гистологических подтипов, включая аденокарциноме легкого (LUAD) и легких плоскоклеточный рак (LUSC)6. Геномный анализ резецированный человека первичного рака легких показал, что опухоли в пределах данного histotype можно также выразить различных молекулярных возмущений, далее вклад их различные клинические прогрессии и смешанным пациента прогноз. Замечательные гетерогенность рака легких представляет собой значительный вызов рациональный дизайн, Доклинические испытания, и осуществления эффективных терапевтических стратегий. Следовательно существует необходимость расширить репертуар шансов справиться с возникающими экспериментальной легких Рак моделей для изучения различных клеточных происхождение, молекулярные подтипы и стадиях этого заболевания.

Различные подходы с использованием животных моделей были использованы для изучения легких Рак в естественных условиях, каждый имеет свои собственные преимущества и недостатки в зависимости от биологических вопрос(ы) интерес. Генетически модифицированные мыши модели (GEMMs) можно ориентировать конкретные генетические изменения в данной прародитель типа клеток, что приводит к опухоли, прогресс в рамках иммунокомпетентных принимающей7. Хотя чрезвычайно мощный, клинически значимых задержка, изменчивость и/или легких заболеваемости опухоли, связанные с GEMMs может быть непомерно высокой для определенных количественных измерений и обнаружения поздней стадии метастазирования в отдаленные органы8. Дополнительный подход является использование аллотрансплантата моделей, whereby клеток рака легкого, получены либо непосредственно от мыши опухоли или производные сначала как установленные клеточных линий в культуре, повторно введены в сингенных хостов. Аналогично от линий клеток человека или больного производных опухоли образцы устанавливаются ксенотрасплантатов рака легких. Ксенотрасплантатов линии клеток человека или больного производных ксенотрасплантатов (PDXs) обычно поддерживаются в мышах с ослабленным иммунитетом и поэтому препятствует полной иммунной наблюдения9. Несмотря на этот недостаток они обеспечивают возможность распространить ограничения количества человеческого biospecimens и исследование фундаментальных в vivo свойств человеческих раковых клеток, которые кодируют для более сложных геномной аберраций чем ГЭММ опухоли.

Одно полезное свойство аллотрансплантация тканей и ксенотрасплантатов является, что они поддаются традиционные ограничения анализов разрежения клеток, используемых для количественной оценки частоты опухоли, инициирование клетки (тики) в пределах злокачественных клеток населения10. В этих экспериментах определенное количество клеток подкожно вводят в бочку животных и частота тики могут быть оценены основе опухоли взять курс. Подкожной опухоли однако может быть более гипоксических11 и не может модель основных физиологических ограничения микроокружения опухоли легких. Доставка трахею эпителиальных стволовых и прогениторных клеток в легкие мышей является метод для изучения легких регенерации и биологии стволовых клеток дыхательных путей12. Однако приживления ставка от этой техники может быть относительно низким, если легкие сначала подвергается физиологических форм травмы, такие, как вирусная инфекция13,14. Поддержка от воспалительных стромальных клеток и/или нарушение базальной мембраны легких может улучшить удержание пересаженные клетки в соответствующих стволовых клеток ниши в дистальной airways15. Фиброз, вызывая агентов можно также предварительно состояние легких активизировать приживления индуцированных плюрипотентных клеток16 и17мезенхимальных стволовых клеток. Ли аналогичные формы повреждения дыхательных путей может повлиять на уровень приживления, инициирующей потенциала опухоли и нарост клеток рака легкого еще предстоит систематически оценивать.

В этом исследовании мы опишем способ повышения эффективности приживления ячейки рака легкого ортотопическая, путем предварительного кондиционирования легких мышей с травмой. LUAD возникает в дистальных дыхательных путях с значительное подмножество этих видов рака, развитие фиброзных стромы18 , которая часто коррелирует с плохим прогнозом19. Блеомицин, пептид гибрид естественный Нерибосомные-поликетидного, широко использовались побудить легочного фиброза в мышей20. Сократимость миокарда инстилляции блеомицин сначала способствует эпителиальных убыли в альвеолы и набор воспалительных клеток, в том числе21макрофагов, нейтрофилов и моноцитов. Это сопровождается тканей ремоделирования в дистальных дыхательных путей, базальной мембраны реорганизации22,23 и внеклеточного матрикса (ECM) осаждения24. Последствия введения единого блеомицин являются временными, с фиброзом урегулирования после 30 дней в большинстве исследований25. С помощью модели аллотрансплантата и гранулы ксенотрансплантата, мы проверили, если предварительного кондиционирования airways мышей с блеомицин может значительно увеличить скорость взять LUAD клетки в легких.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все эксперименты проводились в соответствии с протоколами, утвержденным на институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) в Йельском университете.

1. Установка / Подготовка реагентов.

  1. Блеомицин
    Предупреждение: Основываясь на глобально согласованной системы (СГС) классификации и маркировки химических веществ, блеомицин классифицируется как GHS08 опасность для здоровья.
    1. Подготовьте блеомицин в химические вытяжки. Ресуспензируйте 15 U в 5 мл стерильной фосфатный буфер (PBS).
    2. Аликвота 100-200 мкл раствора в стеклянных ампул и заморозить их при-20 ° C для использования в будущем. Правильно этикетке трубки с датой ресуспендирования. Использовать в течение 6 месяцев с этой даты.
      Примечание: Каждый штамм мышь имеет различную чувствительность к блеомицин26. Тестирование различных доз блеомицин для каждого штамма мыши рекомендуется. Штаммы мыши и соответствующие дозы блеомицина, используемая в экспериментах по представительной, перечислены в таблице 1.
  2. Мыши
    1. Приобрести необходимые для эксперимента мышей и позволяют мышей 7 дней, чтобы акклиматизироваться перед инъекцией. Выполняют инфузии в капюшоне биобезопасности. Передача животных, размещены в комнате совместимый не BSL2 в BSL2 комнату с использованием стандартных институциональных процедур до блеомицин инфузии. Придать мышей в возрасте 6-8 недель.
      Предупреждение: Inject мышей после институциональных руководящих принципов для опасных агентов, 2-го уровня биобезопасности (BSL2) и IACUC утверждения.
      Примечание: Мышей, приобрели для представителя экспериментов, перечислены в Таблице материалов. Были использованы только самцов мышей.
  3. Линии клетки рака легких
    1. Линии клетки в культуре желаемого в их соответствующих средствах массовой информации. До инъекции выполните короткий тандеме повторить профилирование ДНК или генетическое тестирование для обеспечения надлежащего ячейки строки идентификации. Для облегчения in vivo и ex vivo изображений, заразить клеточных линий с человека, выражая Тимидинкиназа, Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП) и Люцифераза фьюжн репортер27и сортировать флуоресценции клеток репортер активации клеток, сортируя (FACS) до приживления. Проверка линий для микоплазмы каждые 6 месяцев.
      1. Культура H2030 человеческих раковых клеток линии, рекомендованный изготовителем, с помощью Розуэлл парк Мемориальный институт среднего (RPMI) с 10% плода Bovine сыворотки (ФБС), пенициллин стрептомицином и амфотерицином B.
      2. Культура 368T1 мышиных клеточной линии (производный от красG12D; p53- / - мыши) с использованием средних Дульбекко изменение орла (DMEM) с 10% FBS, пенициллин стрептомицином и амфотерицином B.
      3. Культура PC9 человеческих раковых клеток линии с помощью RPMI с 10% FBS, пенициллин стрептомицином и амфотерицином B.

2. блеомицин лечение

  1. Планирует вливать intratracheally мышей с блеомицин 14 дней до приживления опухолевых клеток.
  2. Оттепель блеомицин фондовой на льду 2 h до инъекции.
  3. После размораживания, разбавить блеомицин к желаемой рабочей концентрации (0.02 мкл U/50 или 0,005 мкл U/50) и держать его на льду.
    Примечание: Концентрация блеомицин зависит от штамма мыши используется для экспериментов (Таблица 1). Титрование блеомицин мышей должны выполняться определить оптимальную дозу.
  4. Подготовить анестезии путем разбавления кетамина и ксилазина до конечной концентрации 10 мг/мл и 1 мг/мл, соответственно, с помощью иглы 1 мл шприц и 27 G, анестезировать каждой мыши, внедряя решения внутрибрюшинно кетамин/ксилазина на 100/10 мг/кг соответственно.
  5. Контролировать дыхание мышей и использовать щепотку мыс. Подтвердите надлежащее анестезии, когда мышь не реагирует на носок пинча. Примените мазь ветеринар на глаза, чтобы предотвратить сухость под наркозом.
  6. 1 место мыши одновременно на платформе интубации, повесив его передних зубов с его обратно на платформу.
  7. Осветить верхней части груди с помощью волоконно оптический осветитель, чтобы помочь с визуализацией трахеи. Откройте рот мыши и вытащить язык аккуратно пинцетом стерильную плоский.
  8. Используйте внутривенного катетера без иглы, чтобы избежать блокирования дыхание. Положение катетера через белый свет излучаемый открытия трахеи.
  9. Вставьте катетер в трахею, до тех пор, пока в верхней части катетер достигает передних зубов. Подтверждение правильного размещения катетера в трахею, визуализировать белый свет сияет путем открытия катетер в рот.
  10. С помощью пипетки, обойтись 50 мкл блеомицин или транспортного средства (PBS) непосредственно в катетер, чтобы обеспечить, что весь объем вдыхается. Выполните этот шаг в стерильных условиях.
  11. Если правильно вставляется катетер, мышь немедленно вдыхать содержимое катетера. Подождите несколько секунд, до тех пор, пока весь объем перемещается вниз катетер. Затем удалите катетер из трахеи и распоряжаться в раствор 10% отбеливателя.
    Примечание: Среднее время на мыши шагов 2.7-2.11-около 5 мин.
  12. Если мышь не является вдыхание жидкость, тщательно контролировать дыхание и отрегулировать положение катетера. Если мышь перестает дышать, немедленно удалите катетер и позволить мыши возобновить дыхание обычно перед повторно вводить катетер.
  13. Место вводят мыши на IACUC утверждения грелку на их обратно на плоской поверхности для восстановления. Вся процедура займет 10 мин на мышь. Не вернуть животное, которое претерпел инъекций в компании других животных до тех пор, пока полностью выздоровел.
  14. Место «Опасных химических веществ в использование» карты на клетке за 24 ч.

3. Мониторинг мышей после интубации

  1. Контролировать мышей для дыхательной сразу же после интубации и затем каждые 15 мин, до тех пор, пока мышей, Звонок от анестезии. Не оставляйте мышей без присмотра, пока они достаточно сознание для поддержания грудной recumbency.
  2. Придать кетопрофена (5 мг/кг), внутрибрюшинно, чтобы облегчить боль.
  3. Изучите интубации пост 24 h мышей и 3 раза в неделю для каких-либо признаков заболеваемости.
  4. Записывайте дату процедуры идентификации животных, типа процедуры, тип анестезии и послеоперационного мониторинга наблюдений с раз.
  5. Контролировать мышей для потери веса, респираторный дистресс, поведенческие аномалии и оценка состояния тела < 2 (сегментации позвоночник очевидным/спинной костей таза ощутима) два раза в неделю после введения блеомицин.
  6. Усыпить мышей респираторного дистресса или мышей, которые испытали потерю 15% массы тела CO2 или кетамина/Ксилазина следуют шейки матки дислокации. Подтвердите эвтаназии, проводя пальпация для дыхательную активность.

4. приживления линий клеток аденокарциномы легкого.

Примечание: Выполнение приживления клеток через 14 дней после инъекции Блеомицин (шаг 2.1).

  1. Позволяют клеткам расти в 75 см2 фляги спокойно за 3 дня до дня инъекции с соответствующими средствами массовой информации как указано в шаге 1.3.
    Примечание: Они должны быть 80% притока в день инъекции (который соответствует 2-3 x 10-6 в каждом колбу в зависимости от линии клетки).
  2. Вымойте клетки, растущих на 75 см2 флакон с 5 мл PBS при комнатной температуре.
  3. Аспирационная PBS и добавить 1,5 мл трипсина в клетки и инкубации клеток при 37 ° C, пока клетки (обычно 2-5 мин).
    Примечание: Мы рекомендуем проверять каждые 2 мин, для клеток отряд из пластика, простой визуализации нижней части колбы или под микроскопом света. Не превышать 5 минут инкубации с трипсином.
  4. Нейтрализовать трипсина, добавив 4 мл средства массовой информации, содержащие 10% FBS (же СМИ как шаг 4.1). Собирать клетки в 15 мл трубку и центрифуги на 200 g x 3 мин при комнатной температуре.
  5. Аспирационная СМИ и Ресуспензируйте Пелле клеток в 5 мл PBS для мытья клетки. Центрифуга клетки на 200 g x 3 мин при комнатной температуре в Пелле клетки. Повторите это 1 раз.
  6. Аспирационная PBS и Ресуспензируйте гранулы в 1,5 мл PBS на колбу.
  7. Смешайте 50 мкл клеток смеси с 50 мкл Трипановый синий и подсчитать количество ячеек с использованием клеток счетчик/Горяева палата28.
  8. Готовят суспензию клеток путем разбавления клетки в PBS придать 1 х 105 клеток (или другой указанной суммы) в 50 мкл на мышь. Держите клетки на льду до инъекции.
    Примечание: Подготовьте по крайней мере в два раза больше клеток для инъекций избежать исчерпания суспензию клеток.
  9. Подготовить анестезии путем разбавления кетамина и ксилазина до конечной концентрации 10 мг/мл и 1 мг/мл, соответственно, с помощью иглы 1 мл шприц и 27 G, анестезировать каждой мыши, внедряя решения внутрибрюшинно кетамин/ксилазина на 100/10 мг/кг соответственно.
  10. Контролировать дыхание мышей и использовать щепотку мыс. Подтвердите надлежащее анестезии, когда мышь не реагирует на носок пинча. Примените мазь ветеринар на глаза, чтобы предотвратить сухость под наркозом.
  11. 1 место мыши одновременно на платформе интубации, повесив его передних зубов с его обратно на платформу.
  12. Осветить верхней части груди с помощью волоконно оптический осветитель, чтобы помочь с визуализацией трахеи.
  13. Ресуспензируйте клетки, аккуратно с помощью пипетки Р200 чтобы убедиться, что они не образуют сгустки. Откройте рот мыши и вытащить язык аккуратно пинцетом стерильную плоский.
  14. Применение внутривенного катетера с иглой удалены, чтобы избежать блокирования дыхание. Положение катетера через белый свет излучаемый открытия трахеи.
  15. Вставьте катетер в трахею, до тех пор, пока в верхней части катетер достигает передних зубов. Подтверждение правильного размещения катетера в трахею, визуализировать белый свет сияет путем открытия катетер в рот.
  16. С помощью пипетки, обойтись 50 мкл клеток прямо в катетер, чтобы обеспечить, что весь объем вдыхается. Выполните этот шаг в стерильных условиях.
    Примечание: Если правильно вставляется катетер, мышь будет немедленно вдыхать содержимое катетера.
  17. Подождите несколько секунд, до тех пор, пока весь объем перемещается вниз катетер и затем удалить катетер из трахеи и распоряжаться в раствор 10% отбеливателя.
  18. Если мышь не является вдыхание жидкость, тщательно контролировать дыхание и отрегулировать положение катетера. Если мышь перестает дышать, немедленно удалите катетер и позволить мыши возобновить дыхание обычно перед повторно вводить катетер.
    Примечание: Среднее время на мыши шагов 4.11-4.18-около 5 мин.
  19. Место вводят мыши на IACUC утверждения грелку на их обратно на плоской поверхности для восстановления.
    Примечание: Вся процедура займет 10 мин на мышь. Не вернуть животное, которое претерпел инъекций в компании других животных до тех пор, пока полностью выздоровел.
  20. Бритье всей реберной области обоих вентрально и дорзально B6129SF1/J и другие штаммы мыши с темными волосами с помощью электробритвы до изображений.
  21. 2-3 мин после инъекции клеток, придать 100 мкл люциферин ретро орбитально (15 мг/мл) с использованием инсулина игл. Альтернативные глаз используется для инъекций каждого изображения сеанса.
  22. После по крайней мере 2 минуты до 5 мышей в формирователь изображений животных биолюминесценции в спинной recumbency позиции и приобрести вентральной изображение с помощью настройки свечения29.
  23. В панели управления настройки разрешение и чувствительность для измерения люминесценции линии заданной ячейки. Для большинства приложений, начните с 3 мин (или «Auto» если насыщения), биннинг = средний (4), F/Stop = 1, поле зрения = D, тема высота = 1.50.
    Примечание: Если инъекции является успешной, люминесценция сигнала в области верхней части грудной клетки в легких одного или обоих легких.
  24. Флип мышей на грудной recumbency позиции и приобрести спинной картина как указано выше.
    Примечание: Если инъекции клеток не выполняется должным образом, клетки могут кластера на входе трахеи или в шее.
  25. Придать кетопрофена 5 мг/кг внутрибрюшинно для облегчения боли.
  26. Переместить мышь обратно к их клетке и поместите карточку «BSL-2 агент в использование» на клетке.
  27. Контролировать мышей для дыхательной сразу после интубации и затем каждые 15 мин, до тех пор, пока мышей, Звонок от анестезии. Не оставляйте мышей без присмотра, пока они достаточно сознание для поддержания грудной recumbency.
  28. Изучите интубации пост 24 h мышей и три раза в неделю для каких-либо признаков заболеваемости.
  29. Сохранить запись в журнале о дате процедуры, идентификация животных, тип процедуры, тип анестезии и послеоперационного мониторинга наблюдения и раз.
  30. Контролировать мышей для потери веса, респираторный дистресс, поведенческие аномалии и оценка состояния тела < 2 (сегментации позвоночник очевидным/спинной костей таза ощутима) два раза в неделю после прививки блеомицин.
    Примечание: Мышей с опухоли легких могут проявлять раздражение дыхательных путей, потеря веса, кахексия или смерти.
  31. Усыпить мышей респираторного дистресса или мышей, которые испытали потерю 15% массы тела CO2 или кетамина/Ксилазина следуют шейки матки дислокации, если сбор тканей. Подтвердите эвтаназии, проводя пальпация для дыхательную активность.

5. мониторинг роста опухоли по биолюминесценции изображений

  1. Повторите изображений мышей на 3 день после приживления и неделю после.
  2. Анестезировать мышей путем инъекций кетамин/Ксилазина (как описано в шагах 2.4-2.5) или ингаляционные изофлюрановая (2%). Контролировать дыхание мышей и использовать щепотку ног для подтверждения надлежащего анестезии. Примените мазь ветеринар на глаза, чтобы предотвратить сухость под наркозом.
  3. Бритье всей реберной области обоих вентрально и дорзально B6129SF1/J и другие штаммы мыши с темными волосами с помощью электробритвы до изображений.
  4. После того как мыши под наркозом, придать 100 мкл люциферин ретро орбитально (15 мг/мл) с использованием инсулина игл. Подождите 2 мин заместитель глаз используется для инъекций каждый изображений сессии.
  5. Мышей в томограф и приобрести дорсальной и вентральной изображения, как описано в шагах 4.22-4.24.
  6. Место мыши обратно в клетку после съемки, на их обратно на плоской поверхности для восстановления.
    Примечание: Вся процедура займет 5 минут в группе 5 мышей. Не оставляйте мышей без присмотра, пока они достаточно сознание для поддержания грудной recumbency.
  7. Анализ изображений с помощью программного обеспечения для анализа тепловизор/биолюминесценции.
    1. Выберите соответствующие изображения и загружать их в программное обеспечение для анализа биолюминесценции в качестве группы.
    2. Нажмите кнопку инструмент ROI | площади для добавления площади региона интерес (ROI). Место ROI над верхней части груди, охватывающих весь легких изображения. Повторите это для каждого изображения мыши.
    3. Щелкните правой кнопкой мыши и выберите Копировать все ROI функцию, чтобы применить ко всем изображениям в группе же ROI и расположите их в верхней части грудной клетки мышей, брюшной и спинной просмотров.
    4. В верхнем левом углу окна изображения выберите функцию фотонов . Щелкните функцию панели управления мерой измерить ROI. Скопируйте и вставьте программного обеспечения выбора для анализа данных дальнейшего вывода таблицы, содержащей общего потока (фотоны/s).
    5. Нормализации повседневной значение ROI каждой мыши, чтобы его значение ROI, измеренная на день 0.

6. ткани изоляции и обработки.

  1. Анестезировать мышей путем инъекций кетамин/Ксилазина (как описано в шагах 2,4-2,5 или вдыхании изофлюрановая (2%). Контролировать дыхание мышей и использовать щепотку мыс. Подтвердите надлежащее анестезии, когда мышь не реагирует на носок пинча. Примените мазь ветеринар на глаза, чтобы предотвратить сухость под наркозом.
  2. Ретро орбитально придать 100 мкл Люциферин (15 мг/мл) с использованием инсулина игл. Подождите 2 мин.
  3. Изображение мыши следующие шаги 4.22-4.24 из настоящего Протокола.
  4. Внедрить в другой глаз от шага 6.2 еще 100 мкл люциферин ретро орбитально с использованием инсулина игл до эвтаназии.
  5. Усыпить мышей внутрибрюшинной инъекцией кетамина/Ксилазина (см. шаг 2.4 для подробной информации) следуют шейки матки дислокации, если мышь под глубокой анестезии в соответствии с указаниями IACUC. Подтвердите эвтаназии, проводя пальпация для дыхательную активность.
  6. Используя стерильные хирургические ножницы сделать разрез кожи ниже грудины. Откройте слой мышц вдоль диафрагмы с помощью щипцов и Ножницы хирургические и разоблачить грудной полости, проходящем через грудную клетку на одной из боковых сторон, избегая внутренние грудные артерии.
  7. Perfuse мышь, делая небольшой надрез в правое предсердие сердца и залить 5 мл PBS через левого желудочка. Цвет ткани легких будет идти от красного до бледно розовый белый если перфузии крови делается правильно.
  8. Акцизный легких из грудной полости тщательно, захватывая пищевода или сердце с щипцами. Осторожно потяните ткань и использовать Ножницы хирургические тщательно вырезать соединительные ткани, избегая прокол легочной ткани. Сохраните как можно больше для инфляции легких дыхательных путей на более позднем этапе трахеи.
  9. Вымойте легких, погрузив и закрученной ткани 3 раза в 6 пластины хорошо заполнены с 3 мл PBS удалить избыток крови.
  10. Место легких на крышке 6 хорошо плиты и место крышку содержащих ткани в биолюминесцентных томографа и приобрести светящиеся изображения30.
    Примечание: Мы рекомендуем, выбрав следующие параметры панели «приобретение управления» «поле зрения = A» и «предмет высота = 0,75 см» и затем «Auto экспозиции» чтобы избежать насыщенных образов.
  11. Акцизный и изображения других органов, как это сделано в шаге 6,9-6.10, где метастазы были определены люминесценции, таких как мозг, печень, надпочечников, кости, лимфатические узлы, почек и селезенки31.
  12. Perfuse легких с 1 мл 4% параформальдегида, вставляя иглу в трахею мыши. Легкие будут раздувать если хорошо перфузии.
    Предупреждение: параформальдегида 4% это токсичные, здоровье опасности GHS07 и GHS08.
  13. Передача легких в 15 мл конические с 5 мл 4% параформальдегида.
  14. Исправить легких или других тканей, инкубации ткани с параформальдегида 4% на ночь при 4 ° C в встряхивания устройства на 30-50 об/мин.
  15. Внедрить в парафин или оптимального резки температуры смеси в зависимости от приложения32легких (или других тканей).
    Примечание: Парафин является предпочтительным методом для сохранения структуры легких и Masson Trichrome и гематоксилином-эозином.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Для повышения эффективности LUAD раковых клеток приживления в легкие мышей, мы разработали протокол, который сначала предварительные условия авиалинии, блеомицин, следуют ортотопическая опухолевых клеток впрыска (рис. 1). Мы подтвердили, что даже при приеме в ослабленным Атинические мышей, блеомицин индуцированных переходных фиброз день 14, о чем свидетельствуют потери сократимость архитектуры и увеличение коллагена осаждения (рис. 2). Валовая фиброза в этих мышей решить что 50 дней после инъекции Блеомицин (рис. 2; правой панели) в соответствии с предварительного исследования24.

На основе этих наблюдений, мы прижившимися LUAD клетки различного происхождения в легкие различных штаммов мыши, которые предварительно условный с однократным транспортного средства или блеомицин 14 дней до даты. Например подвеска LUAD клеток из установленных человеческой LUAD клеток линии, H2030, была осуществлена intratracheally в легких Атинические мышей. После 35 дней мышей, предварительно обработанных с блеомицин имел высокий легких опухоли бремя как определяется биолюминесценции (рис. 3A). И наоборот в транспортное средство лечение животных, не опухоли были обнаружены за тот же срок (рис. 3A). Опухоли легких бремя было подтверждено гистологии после вскрытие. Легкие, предварительно обработанных с транспортного средства было никаких доказательств узелки опухоли, тогда как блеомицин предварительно очищенной легких узелки большие опухоли (рис. 3B). Используя этот протокол, мы также увеличили приживления другого человека LUAD клеточной линии в Атинические мышей (PC9; Рисунок 3 c) и мышиных линия клетки LUAD, который был впрыснут в сингенных иммунокомпетентных B6129SF1/J мышей (рис. 3D). Ранние поражения наблюдается в предварительно обработанных сингенных мышей блеомицин были главным образом класса 1 и 2 и были хорошо дифференцированы, напоминающие опухоли, возникающие в месте от красG12D / +; p53- / - GEMMs33. Все прижившимися LUADs вырос оба проксимальном и дистальном легких (рисунок 3B, 3E рисунок, Рисунок 3 g; звездочка (дистальной части), звезда (проксимальной)). Создание PDXs от biospecimens рака легких (от биопсии или хирургической резекции) относительно неэффективно, даже тогда, когда клетки человека подкожно пересаживают в сильно иммунодефицитных животных, таких как кивок scid гамма (ГЯП) штамм мыши34. Чтобы оценить потенциальное применение нашего метода к PDXs, мы также вводят высоко метастатического клеток подгрупп населения H2030 клеточной линии, называется H2030-BrM3 клетки35, intratracheally в ГЯП мышей, которые были предварительно кондиционером с транспортного средства или Блеомицин. Мы отмечаем, что ГЯП мышей может быть более восприимчивы к токсического воздействия блеомицина (данные не отображаются) и что доза меньше, чем 0.02 единиц в мыши рекомендуется при работе с этой нагрузкой. Тем не менее наш протокол также существенно увеличили приживления и бремя опухоли в легких ГЯП мышей (3F рисунок, Рисунок 3 g).

Далее мы использовали этот протокол для тестирования ставки приживления ограничения количества клеток с использованием линии клетки H2030 Атинические мышей. Мыши, предварительно обработанных с блеомицин вводили с 5 x 105, 5 x 10-4или 5 x 103 H2030 клетки. 85,7-100% мышей развитых опухолей легких от 7 до 10 недель на всех разведениях испытания (Таблица 2). Мы заключаем, что приживления относительно низкого количество опухолевых клеток в легком возможен, если мышь перед кондиционером с блеомицин. В целом, наш протокол могут быть приспособлены для нескольких штаммов мышей и различных LUAD клеток линии модели для увеличения скорости приживления раковых клеток в легкие от 0-16,7% до 71,4-100% (Таблица 2).

Наконец чтобы оценить предполагаемые кинетика LUAD клеток нарост и метастатическим распространения из предварительно кондиционером легких блеомицин, мы охарактеризовал поведение высоко метастатического клеток H2030-BrM3, с помощью нашего протокола. После приживления ортотопическая транспортное средство лечение мышей, истощение опухолевых клеток наблюдалось на биолюминесценции в день 3 впрыск и роста опухоли легких не могут быть обнаружены впоследствии или в конечной точке (день 35) (рис. 4A, 4B рисунок). Наоборот мы обнаружили нарост опухоли легких у мышей, предварительно обработанных с блеомицин впрыск день 7 (Рисунок 4A) в кратчайшие сроки. После 39-57 дней роста опухоли заболеваемости и биолюминесцентных интенсивности связанные с высокой легких опухоли бремя ограничения анализа диссеминированной (данные не показаны). Таким образом мы imaged метастазов в отдаленных органах ex vivo на вскрытие. В животных, которые были бременем опухоли легких для 57 дней небольших повреждений также может быть обнаружен в тканях например мозга, печени, почек, надпочечников и кости задних конечностей в переменной частоты (рис. 4 c). Таким образом мы заключаем, что спонтанное диссеминированной в клинически значимых сайты могут создаваться из этого метода ортотопическая.

Figure 1
Рисунок 1: метод предварительно состояние легких для опухолевых клеток приживления. Схема используемого протокола. Повреждение легких осуществляется путем инъекций блеомицин intratracheally. LUAD клетки затем вводят в трахею мышей через 14 дней после. Мышей впоследствии отражаются еженедельно для свечения монитор опухоли приживления, роста и отдаленных метастазов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: блеомицин вызывает фиброз легких переходных и ECM ремоделирования. Представитель изображения гематоксилином-эозином (H & E) и Массон Trichrome окрашивание легких автотранспортных средств и блеомицин лечение мышей 14 дней после инъекции (пик фиброз) и 51 дней впрыск (резолюция фиброз) в отсутствие опухолевых клеток инъекции. Шкалы бар = 500 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: приживления легких LUAD клеточных линий в нескольких моделях мыши увеличивается в мышей, предварительно обработанных блеомицином. Атинические A) мышах предварительно обработанных с транспортного средства или блеомицин вводили с 5 x 105 H2030 клеток. Бремя относительной легких опухоли в конечной точке (день 35 нормализованы в день 0 впрыск) печатаются как измеряется биолюминесценции. Для каждой группы показано мышь с средний опухоли бремя. n = 6-7 мышей для каждой группы. B) представитель H & E изображения легких предварительно обработанных с транспортного средства или блеомицин от A на день 35. Звездочка = дистальной; Звезда = проксимальный. C) Атинические мышей рассматриваются как A были введены с 1 х 105 PC9 клеток. Опухоль бремя и представитель изображения измеряются и показано как в A. n = 7 мышей для каждой группы. D-E) B6129SF1/J мышей предварительно обработанных с транспортного средства или блеомицин были введены с 1 х 105 368T1 красG12D / + p53- / - клетки (Т-не встретил КП). Опухоль бремя, представитель изображения и H & Es измеряются и изображается как в A и B. n = 7 мышей для каждой группы. F-G) ГЯП мышей предварительно обработанных с транспортного средства или блеомицин вводили с ячейками 1 x 105 H2030-BrM3. Опухоль бремя, представитель изображения и H & Es (день 9 и 10 день впрыск) измеряются и показано как A и B. n = 3-6 мышей для каждой группы. Шкалы бар = 500 мкм. врезные = высокое увеличение опухолевых клеток прижившимися районов. Шкалы бар вставками = 100 µm. p значения, рассчитанные на тест Манна-Уитни. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: LUAD клетки прижившимися блеомицин лечение мышей метастазировать в нескольких отдаленных органах. Атинические A) мышах предварительно обработанных с транспортного средства или блеомицин вводили с ячейками 5 x 105 H2030-BrM3. Бремя опухоли легких была измерена, еженедельно с помощью биолюминесценции. Поток спинной всего фотонов, нормированная на день 0 показано. B) опухоли бремя по биолюминесценции легких от A в конечной точке (день 35 впрыск). Для каждой группы показано мышь с средний опухоли бремя. n = 6-7 мышей для каждой группы. C) представитель изображения органов с обнаруживаемыми метастазами из же мышь на вскрытие (слева). Таблица с указанных частот мышей с метастазами в отдаленных органах в конечной точке (день 39-57 после приживления) (справа). Ex-vivo органов с визуального биолюминесцентных сигнала выше 1,5 х 104 фотоны / (СВЦ см2 стерадиан) были подсчитаны как позитивные метастазов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Штамм мыши Единицы/мышь
Атинические 0.02
ГЯП 0.02
B6129SF1/J 0.005

Таблица 1: Список рекомендуемых доз блеомицин для мыши штаммов испытания.

Штамм мыши Клеточная линия Количество клеток вводили приживления % значение p
Транспортное средство Блеомицин
Атинические H2030 5 x 105 0% (0/7) 100% (6/6) 0,0006
Атинические H2030 5 x 10-4 н.д. 85,7% (6/7) н.а.
Атинические H2030 5 x 10-3 н.д. 85,7% (6/7) н.а.
Атинические PC-9 1 х 105 0% (0/7) 85,7% (6/7) 0,0023
ГЯП H2030-BrM3 1 х 105 16,7% (1/6) 100% (3/3) * 0.0476
B6129SF1/J 368T1 1 х 105 0% (0/7) 71,4% (5/7) * 0.0105

Таблица 2: Сводная таблица приживления частоты (%), используя указанные мыши штаммов, клеточных линий и числа клеток. Приживления определяется в vivo изображений свечения и подтверждена ex vivo изображений с Гистология ткани между 37 и 50 дней после инъекции. * Позитивные приживления был подтвержден в vivo люминесценции в день 10 впрыск.p значений рассчитывается путем односторонней Фишер точный тест. н.а. = не применимо; н.о. = не определяется.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Поразительные параллели клинических документально между раком легких и других хронических заболеваний легких36. В частности увеличение пристрастие для развития рака легких у пациентов с идиопатического легочного фиброза (МГЛ), и эта ассоциация независимо от курения истории37,38. МГЛ характеризуется прогрессивное уничтожение легких архитектуры и нарушение дыхательной функции путем осаждения ECM39. Кроме того после хирургической резекции, ранней стадии НМРЛ больных одновременно МГЛ имеют плохой результат40. Большинство опухолей НМРЛ содержат компонент фиброзных на момент постановки диагноза, и масштабы этой реакции стромы коррелирует с плохим прогнозом18. Острый или устойчивого ткани ущерб от фиброз может увеличить число tumorigenesis несколькими способами. Например после травмы, процесс регенерации эпителия может расширить круг восприимчивы к трансформации клеток-предшественников. Кроме того приток и функции различных иммунных клеток могут помочь в создании иммуносупрессивные микроокружения, в то время как активация миофибробласты может выделяют факторы роста или депозит опухоль поощрение ECM. Таким образом, наш метод предварительного кондиционирования легких с фиброзом, заставить агент может оказаться особенно apt в изучении последствий рака легких сопутствующие заболевания (например, фиброз) и моделирования НМРЛ подтипы, которые богаты внеклеточного матрикса и воспалительные стромы41.

В целом наш метод значительно расширены приживления опухолевых клеток, вводят в дыхательные пути через трахею. Это наблюдение верно для мыши штаммы с различной степенью туберкулина. Другие методы инъекции клеток опухоли в легких включают хвост вен или прямой инъекции в паренхиме легких через стенку грудной клетки. Для конкретной цели изучения tumorigenicity клеток рака легких эти методы являются оптимальными, как бывший требует опухолевых клеток, чтобы выжить в обращении и extravasate перед продолжением (процесс более сродни метастазирования в легкие), в то время как последний может вызывать клетки просочиться в плевральную полость вскоре после инъекции (данные не показаны). Оба метода могут смешивать Локо региональный количественная оценка нарост клеток рака легких. Кроме того наши протокол гарантирует, что клетки тумора в сеяный сначала сохраняются в дыхательных путях, окруженный стромы легкого. Решающее значение для успеха этого протокола, правильной интубации мышей, допустимой дозы блеомицина и сроков предварительного кондиционирования сократимость относительно инъекции клеток опухоли. Мы также продемонстрировать, что этот протокол позволяет клетки впоследствии распространить среди других тканей, в том числе мозга. Хотя по-прежнему заболеваемости, связанного с бременем опухоли легких могут ограничивать всеобъемлющий характеристике далекой macrometastasis, этот подход может быть полезным для количественного определения и изучения циркулирующих клеток опухоли, происходящих из легких.

Несмотря на преимущества метода, описанного в настоящем документе несколько технических переменных могут повлиять конечной эффективности приживления и мониторинг прогрессии опухоли. Во-первых это хорошо документировано что фиброзных ответ блеомицин мышей зависит от штамма. К примеру мышей C57Bl/6, более склонны к фиброза, когда по сравнению с мышей Balb/c42. Во-вторых чувствительность к блеомицин-пол и возраст зависит от. По нашему опыту самок и молодых мышей более подвержены неблагоприятные последствия по всему протоколу. Это может ограничить tumorigenesis исследований, требующих прямого сравнения между мужчиной и женщиной, и молодых и старых животных. Кроме того трахею инстилляции мышей моложе 7 недель является технически сложным и могут потребоваться корректировки размера катетер. В-третьих блеомицин является токсичным и может быть мутагенных из-за его способность вызывать разрывы ДНК. Это важно для тестирования терпимый дозы блеомицина для каждого штамма мыши до выполнения экспериментов. В доказательство принцип исследования мы предоставляем предлагаемые дозы для самцов мышей через различных штаммов. Кроме того мышей с темный мех менее пригодны для биолюминесцентных изображений из-за низкой ткани проникновения и маскирующие биолюминесцентных сигнала на мех. Депиляция мышей может улучшить изображение измерений, но альтернативные методы могут также использоваться как магнитно-резонансная томография и флуоресцентных изображений с помощью зондов длинные волны, таких как TdTomato или Катюшка43. Наконец следует рассматривать потенциальные иммуногенности данного репортер белка при выборе механизма обнаружения опухоли для данной мыши модели.

Блеомицин переделывает дистальной легких, первый альвеолярного повреждения типа 2 (AT2) клетки, которые затем восстанавливаться в попытке ремонта альвеолы44. С AT2 клетки являются одним из типов основных клеток вызывают НМРЛ, предварительного кондиционирования легких блеомицином может также изменить посвящения и прогрессии опухоли, возникающие в месте от GEMMs. Другие виды вреда, включая гриппа инфекция13 или нафталина инстилляции14, было показано увеличение приживления легких человека и мышиных стволовых/прогениторных клеток. Примечательно Нафталин ущерб стволовых/клеток в bronchio альвеолярные развязок и потенциально увеличивает опухоли посвящения в GEMMs45. Доработки тип травмы и сократимость ниши, ориентированные на типы прижившимися клеток может еще больше оптимизировать наш метод для изучения аллотрансплантантов рака легких или ксенотрасплантатов различного происхождения. Наконец мы предлагаем, что этот метод может быть реализован для стандартных поколения рака легких PDXs. Успешность создания рака легких PDXs от человеческого biospecimens подкожной трансплантации в ГЯП мышей является относительно низким (30-40%)46,47. Ортотопическая рост PDXs может не только увеличить этот показатель успеха с предельной суммы образца (от человеческих легких), но также генерировать более физиологически соответствующие условия для тестирования фармакокинетики и фармакодинамики терапии рака легкого.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют не конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgments

Это исследование финансировалось за счет субсидий из Национального института рака (R01CA166376 и R01CA191489 для D.X. Nguyen) и Министерство обороны (W81XWH-16-1-0227 для D.X. Nguyen).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bleomycin Sigma B5507-15UN CAUTION Health hazard GHS08
Exel Catheter 24G Fisher 1484121 Remove needle. For intratracheal injection
Ketamine (Ketaset inl 100 mg/mL C3N 10 mL) Butler Schein 56344 To anesthetize mice
Xylazine Butler Schein 33198 To anesthetize mice
Ketoprofen, 5,000 mg Cayman Chemical 10006661 Analgesic
Puralube Veterinary Ophthalmic Ointment BUTLER ANIMAL HEALTH COMPANY LLC 8897 To prevent eye dryness while under anesthesia
D-Luciferin powder Perkin Elmer Health Sciences Inc 122799 For luminescent imaging. Reconstitute powder with PBS for a working concentration of 15mg/mL. Protect from Light
Rodent Intubation stand Braintree Scientific RIS-100 Recommended stand for intratracheal injection
MI-150 ILLUMINATOR 150W MI-150 DOLAN-JENNER INDUSTRIES MI-150 / EEG2823M To illuminate and visualize trachea
Graefe Forceps, 2.75 (7 cm) long serrat Roboz RS-5111 For intratracheal injection
Syringe Luer-Lok Sterile 5ml BD / Fisher 309646
Satiny Smooth by Conair Dual Foil Wet/Dry Rechargeable Shaver Conair - To shave mice
Bonn Scissors, 3.5" straight 15 mm sharp/sharp sure cut blades Roboz RS-5840SC
15 mL conical tube BD / Fisher 352097
1.5 mL centrifuge tubes USA SCIENTIFIC INC 1615-5500
Vial Scintillation 7 mL Borosilicate Glass GPI Fisher 701350
Filter pipette tips (200 μL) USA SCIENTIFIC INC 1120-8710
Phosphate Buffered Saline Life Technologies 14190-144
0.25% Trypsin-EDTA Life Technologies 25200-056
DMEM high glucose Life Technologies 11965-092
RPMI Medium 1640 Life Technologies 11875-093
Fetal bovine serum USDA Life Technologies 10437-028
Penicillin-Streptomycin Life Technologies 15140-122
Amphotericin B Sigma A2942-20ML
Trypan Blue Stain 0.4% Life Technologies 15250-061
Countess Automated Cell Counter Life Technologies AMQAX1000
Flask T/C 75cm sq canted neck, blue cap Fisher / Corning 353135
IVIS Spectrum Xenogen Bioluminiscence Perkin Elmer Health Sciences Inc 124262 For in vivo bioluminescence imaging
Living image software Perkin Elmer Health Sciences Inc 128113 For in vivo bioluminescence analysis
XGI-8 Gas Anesthesia System Perkin Elmer Health Sciences Inc 118918 For Isoflurane anesthesia
BD Ultra-Fine II Short Needle Insulin Syringe 1 cc. 31 G x 8 mm (5/16 in) BD / Fisher BD328418 For retro-orbital luciferin injection
Syringe 1ml BD / Fisher 14-823-434 For intraperitoneal injections
26 G x 1/2 in. needle BD / Fisher 305111 For intraperitoneal injections
4% Paraformaldehyde VWR 43368-9M CAUTION Health hazard GHS07, GHS08. For fixing tissue
Pipet-Lite Pipette, Unv. SL-200XLS+ METTLER-TOLEDO INTERNATIONAL 17014411
Mayer's Hematoxylin ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES 517-28-2
Eosin Y stain 0.25% (w/v) in 57% Fisher 67-63-0
Masson Trichrome Stain Kit IMEB Inc K7228 For masson trichrome stain to visualize collagen
Superfrost plus glass slides Fisher 1255015
6 well plate Corning C3516
Universal Mycoplasma Detection Kit ATCC 30-1012K
OCT Embedding compound ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES 62550-12 For embedding tissue for frozen sections
Leica CM3050 S Research Cryostat Leica CM3050 S To section tissue for staining analysis
Keyence All-in One Fluorescence Microscope Keyence BZ-X700
ImageJ US National Institutes of Health IJ1.46 http://rsbweb.nih.gov/ij/ download.html
Prism 7.0 for Mac OS X GraphPad Software, Inc. -
Athymic (Crl:NU(NCr)-Foxn1nu) mice Charles River NIH-553
NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) mice Jackson Laboratories 5557
B6129SF1/J mice Jackson Laboratories 101043
NIH-H2030 cells ATCC CRL-5914
368T1 generously provided by Monte Winslow (Standford University) -
PC9 cells Nguyen DX et al. Cell. 2009;138:51–62 -
H2030 BrM3 cells Nguyen DX et al. Cell. 2009;138:51–62 -

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2015. CA-Cancer J Clin. 65, 5-29 (2015).
  2. Gaspar, L. E. Brain metastases in lung cancer. Expert Rev Anticanc. 4, 259-270 (2004).
  3. Hess, K. R., et al. Metastatic patterns in adenocarcinoma. Cancer. 106, 1624-1633 (2006).
  4. Hoffman, P. C., Mauer, A. M., Vokes, E. E. Lung cancer. Lancet. 355, 479-485 (2000).
  5. Travis, W. D. Pathology of lung cancer. Clin Chest Med. 23 (1), 65-81 (2002).
  6. Chen, Z., Fillmore, C. M., Hammerman, P. S., Kim, C. F., Wong, K. K. Non-small-cell lung cancers: a heterogeneous set of diseases. Nat Rev Cancer. 14, 535-546 (2014).
  7. Kim, C. F., et al. Mouse models of human non-small-cell lung cancer: raising the bar. Cold Spring Harb Sym. 70, 241-250 (2005).
  8. Meuwissen, R., Berns, A. Mouse models for human lung cancer. Gene Dev. 19, 643-664 (2005).
  9. Junttila, M. R., de Sauvage, F. J. Influence of tumour micro-environment heterogeneity on therapeutic response. Nature. 501, 346-354 (2013).
  10. Nguyen, L. V., Vanner, R., Dirks, P., Eaves, C. J. Cancer stem cells: an evolving concept. Nat Rev Cancer. 12, 133-143 (2012).
  11. Minchinton, A. I., Tannock, I. F. Drug penetration in solid tumours. Nat Rev Cancer. 6, 583-592 (2006).
  12. Leblond, A. L., et al. Developing cell therapy techniques for respiratory disease: intratracheal delivery of genetically engineered stem cells in a murine model of airway injury. Hum Gene Ther. 20, 1329-1343 (2009).
  13. Vaughan, A. E., et al. Lineage-negative progenitors mobilize to regenerate lung epithelium after major injury. Nature. 517, 621-625 (2015).
  14. Zuo, W., et al. p63(+)Krt5(+) distal airway stem cells are essential for lung regeneration. Nature. 517, 616-620 (2015).
  15. Mahoney, J. E., Kim, C. F. Tracing the potential of lung progenitors. Nat Biotechnol. 33, 152-154 (2015).
  16. Wang, D., Morales, J. E., Calame, D. G., Alcorn, J. L., Wetsel, R. A. Transplantation of human embryonic stem cell-derived alveolar epithelial type II cells abrogates acute lung injury in mice. Mol Ther. 18, 625-634 (2010).
  17. Ortiz, L. A., et al. Mesenchymal stem cell engraftment in lung is enhanced in response to bleomycin exposure and ameliorates its fibrotic effects. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 8407-8411 (2003).
  18. Suzuki, K., et al. Prognostic significance of the size of central fibrosis in peripheral adenocarcinoma of the lung. Ann Thorac Surg. 69, 893-897 (2000).
  19. Cancer Genome Atlas Research, N. Comprehensive molecular profiling of lung adenocarcinoma. Nature. 511, 543-550 (2014).
  20. Scotton, C. J., Chambers, R. C. Bleomycin revisited: towards a more representative model of IPF? Am J Physiol-Lung C. 299, L439-L441 (2010).
  21. Hay, J., Shahzeidi, S., Laurent, G. Mechanisms of bleomycin-induced lung damage. Arch Toxicol. 65, 81-94 (1991).
  22. Vaccaro, C. A., Brody, J. S., Snider, G. L. Alveolar wall basement membranes in bleomycin-induced pulmonary fibrosis. Am Rev Respir Dis. 132, 905-912 (1985).
  23. Venkatesan, N., Ebihara, T., Roughley, P. J., Ludwig, M. S. Alterations in large and small proteoglycans in bleomycin-induced pulmonary fibrosis in rats. Am J Resp Crit Care. 161, 2066-2073 (2000).
  24. Moore, B. B., Hogaboam, C. M. Murine models of pulmonary fibrosis. Am J Physiol-Lung C. 294, L152-L160 (2008).
  25. Izbicki, G., Segel, M. J., Christensen, T. G., Conner, M. W., Breuer, R. Time course of bleomycin-induced lung fibrosis. Int J Exp Pathol. 83, 111-119 (2002).
  26. Schrier, D. J., Phan, S. H., McGarry, B. M. The effects of the nude (nu/nu) mutation on bleomycin-induced pulmonary fibrosis. A biochemical evaluation. Am Rev Respir Dis. 127, 614-617 (1983).
  27. Ponomarev, V., et al. A novel triple-modality reporter gene for whole-body fluorescent, bioluminescent, and nuclear noninvasive imaging. Eur J Nucl Med Mol I. 31, 740-751 (2004).
  28. Morten, B. C., Scott, R. J., Avery-Kiejda, K. A. Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell. J. Vis. Exp. , (2016).
  29. Tseng, J. C., Kung, A. L. Quantitative bioluminescence imaging of mouse tumor models. Cold Spring Harbor protocols. , pdb prot078261 (2015).
  30. Byrne, F. L., McCarroll, J. A., Kavallaris, M. Analyses of Tumor Burden In Vivo and Metastasis Ex Vivo Using Luciferase-Expressing Cancer Cells in an Orthotopic Mouse Model of Neuroblastoma. Methods Mol Biol. 1372, 61-77 (2016).
  31. Parkinson, C. M., et al. Diagnostic necropsy and selected tissue and sample collection in rats and mice. J. Vis. Exp. , (2011).
  32. Tammela, T., et al. A Wnt-producing niche drives proliferative potential and progression in lung adenocarcinoma. Nature. 545, 355-359 (2017).
  33. DuPage, M., Dooley, A. L., Jacks, T. Conditional mouse lung cancer models using adenoviral or lentiviral delivery of Cre recombinase. Nat Protoc. 4, 1064-1072 (2009).
  34. Byrne, A. T., et al. Interrogating open issues in cancer precision medicine with patient-derived xenografts. Nat Rev Cancer. 17, 254-268 (2017).
  35. Nguyen, D. X., et al. WNT/TCF signaling through LEF1 and HOXB9 mediates lung adenocarcinoma metastasis. Cell. 138, 51-62 (2009).
  36. Raghu, G., Nyberg, F., Morgan, G. The epidemiology of interstitial lung disease and its association with lung cancer. Brit J Cancer. 91, Suppl 2. S3-S10 (2004).
  37. Hubbard, R., Venn, A., Lewis, S., Britton, J. Lung cancer and cryptogenic fibrosing alveolitis. A population-based cohort study. Am J Resp Crit Care. 161, 5-8 (2000).
  38. Nagai, A., Chiyotani, A., Nakadate, T., Konno, K. Lung cancer in patients with idiopathic pulmonary fibrosis. Tohoku J Exp Med. 167, 231-237 (1992).
  39. Rock, J. R., et al. Multiple stromal populations contribute to pulmonary fibrosis without evidence for epithelial to mesenchymal transition. Proc Natl Acad Sci USA. 108, E1475-E1483 (2011).
  40. Saito, Y., et al. Survival after surgery for pathologic stage IA non-small cell lung cancer associated with idiopathic pulmonary fibrosis. Ann Thorac Surg. 92, 1812-1817 (2011).
  41. Stevens, L. E., et al. Extracellular Matrix Receptor Expression in Subtypes of Lung Adenocarcinoma Potentiates Outgrowth of Micrometastases. Cancer Res. 77, 1905-1917 (2017).
  42. Harrison, J. H., Lazo, J. S. High dose continuous infusion of bleomycin in mice: a new model for drug-induced pulmonary fibrosis. J Pharmacol Exp Ther. 243, 1185-1194 (1987).
  43. Shcherbo, D., et al. Bright far-red fluorescent protein for whole-body imaging. Nature Methods. 4, 741-746 (2007).
  44. Aso, Y., Yoneda, K., Kikkawa, Y. Morphologic and biochemical study of pulmonary changes induced by bleomycin in mice. Lab Invest. 35, 558-568 (1976).
  45. Kim, C. F., et al. Identification of bronchioalveolar stem cells in normal lung and lung. Cell. 121, 823-835 (2005).
  46. Fichtner, I., et al. Establishment of patient-derived non-small cell lung cancer xenografts as models for the identification of predictive biomarkers. Clin Cancer Res. 14, 6456-6468 (2008).
  47. Zhang, X. C., et al. Establishment of patient-derived non-small cell lung cancer xenograft models with genetic aberrations within EGFR, KRAS and FGFR1: useful tools for preclinical studies of targeted therapies. J Transl Med. 11, 168 (2013).

Tags

Медицина выпуск 136 аденокарциномы легкого ортотопическая мыши модели трахею инъекции блеомицин приживления метастазирование
Предварительного кондиционирования Airways мышей с блеомицин увеличивает эффективность приживления клеток рака легких ортотопическая
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stevens, L. E., Arnal-Estapé,… More

Stevens, L. E., Arnal-Estapé, A., Nguyen, D. X. Pre-Conditioning the Airways of Mice with Bleomycin Increases the Efficiency of Orthotopic Lung Cancer Cell Engraftment. J. Vis. Exp. (136), e56650, doi:10.3791/56650 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter