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Pré-condicionamento das vias aéreas de ratos com bleomicina aumenta a eficiência da enxertia de célula de câncer pulmão ortotópico

Published: June 28, 2018 doi: 10.3791/56650
Automatic Translation
*1, *1, 1,2
1Department of Pathology, Yale University School of Medicine, 2Department of Medical Oncology, Yale University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Nós descrevemos um método para melhorar significativamente a enxertia ortotópico de células de câncer de pulmão aos pulmões murino pelo pré-condicionamento das vias aéreas com lesão. Esta abordagem também pode ser aplicada para estudar interações do estroma dentro do microambiente pulmonar, disseminação metastática, co-morbidades do câncer pulmonar, e gerar mais eficiência paciente derivada xenografts.

Abstract

Câncer de pulmão é uma doença refratária tratamento mortal que é biologicamente heterogênea. Para compreender e tratar eficazmente o espectro completo clínico de malignidade torácica, são necessários modelos animais adicionais que podem recapitular estágios e subtipos de câncer de pulmão humano diverso. Aloenxerto ou enxerto heterólogo modelos são versáteis e permitem a quantificação da capacidade tumorigênico em vivo, usando células malignas de origem humana ou murino. No entanto, métodos anteriormente descritos de enxertia de células de câncer de pulmão foram realizados em locais não-fisiológicas, tais como o flanco dos ratos, devido a ineficiência de transplante ortotópico de células para os pulmões. Neste estudo, descrevemos um método para melhorar a ortotópico enxertia do pulmão câncer célula pré-condicionamento das vias aéreas de ratos com bleomicina de agente induzindo a fibrose. Como um experimento de prova de conceito, nós aplicamos esta abordagem para engraft células tumorais de subtipo de adenocarcinoma do pulmão, obtidos de fontes humanas, ou rato em várias cepas de ratos. Demonstramos que ferir as vias aéreas com bleomicina antes da injeção de células de tumor aumenta a enxertia de células tumorais de 0-17% a 71-100%. Significativamente, esse método aprimorado incidência de tumor de pulmão e consequência subsequente usando modelos e diferentes cepas de rato. Além disso, células de câncer de pulmão engrafted disseminam dos pulmões em órgãos distantes relevantes. Assim, nós fornecemos um protocolo que pode ser usado para estabelecer e manter novos modelos ortotópico de câncer de pulmão com limitação da quantidade de células ou biospecimen e avaliar quantitativamente a oncogenicidade capacidade das células de câncer de pulmão em configurações fisiologicamente relevantes .

Introduction

Câncer de pulmão é a principal causa de câncer relacionados a mortes em todo o mundo1. Pacientes com câncer de pulmão eventualmente sucumbiram de metástase para órgãos distantes, nomeadamente para o sistema nervoso central, fígado, glândulas supra-renais e os ossos2,3,4. Malignidade torácica foram tradicionalmente classificada como câncer de pulmão de pequenas células (CPPC) ou não-pequenas células lung cancer (NSCLC)5. CPNPC é o mais frequentemente diagnosticado malignidade e podem ser subdividido em diferentes subtipos histológicos, incluindo adenocarcinoma do pulmão (LUAD) e pulmão carcinoma de células escamosas (LUSC)6. Análise genômica dos cancros do pulmão primário humano ressecadas revelou que tumores dentro de um determinado histotype também podem expressar diversas perturbações moleculares, ainda mais, contribuindo para sua progressão clínica divergente e confundindo o prognóstico do paciente. A notável heterogeneidade dos cancros do pulmão representa um desafio significativo para o projeto racional, testes pré-clínicos e implementação de estratégias terapêuticas eficazes. Consequentemente, há uma necessidade de ampliar o repertório de modelos de câncer de pulmão experimental tractable para estudar as diversas origens celulares, subtipos moleculares e fases desta doença.

Várias abordagens usando modelos animais têm sido empregadas para estudar pulmão câncer na vivo, cada um com suas próprias vantagens e desvantagens dependendo as questà µ es biológicas de interesse. Modelos do rato geneticamente modificados (GEMMs) podem direcionar alterações genéticas específicas em um tipo de células progenitoras determinado, resultando em tumores que o progresso dentro de um hospedeiro imunocompetentes7. Embora extremamente poderoso e clinicamente relevantes, a morbidade de latência, variabilidade e/ou pulmão tumor associada com GEMMs pode ser proibitiva para certas medidas quantitativas e a detecção de metástases de fase final em órgãos distantes8. Uma abordagem complementar é o uso de modelos de aloenxerto, segundo o qual as células de câncer de pulmão, obtidos diretamente a partir de um tumor de rato ou derivado primeiro como linhagens celulares estabelecidas na cultura, são re-introduzidas em syngeneic anfitriões. De forma análoga, xenografts de câncer de pulmão são estabelecidos de amostras de paciente tumor derivado ou linhas de células humanas. Xenografts de linha celular humana ou pacientes derivadas xenografts (PDXs) são geralmente mantidos em ratos imunodeprimidos e, portanto, impedem a completa vigilância imune9. Apesar desta desvantagem, eles fornecem uma avenida para propagar a limitar as quantidades de humano biospecimens e estudo fundamental na vivo Propriedades de células cancerosas humanas, que codificam as aberrações genômicas mais complexas que os tumores GEMM.

Uma propriedade útil de aloenxertos e xenografts é que eles são receptivos a tradicional ensaios limitante de diluição de célula, empregados para quantificar a frequência de tumor iniciando células (TICs) dentro de uma população de células malignas10. Nesses experimentos, um número definido de células é injetado por via subcutânea o flanco dos animais e a frequência de tiques pode ser estimada com base na taxa de tomada de tumor. Tumores subcutâneos, entretanto, podem ser mais hipóxico11 e não podem modelo chaves restrições fisiológicas do microambiente do tumor de pulmão. Entrega de intratraqueal de tronco epitelial ou progenitoras para os pulmões de ratos é um método para estudar a regeneração pulmonar e das vias respiratórias de biologia de células-tronco12. No entanto, a taxa de enxertia desta técnica pode ser relativamente baixa, a menos que os pulmões são primeiro sujeitas a formas fisiológicas de lesão, tais como infecção viral13,14. Suporte de células estromais inflamatórias e/ou a ruptura da membrana de porão pulmão pode melhorar a retenção das células transplantadas em nichos de células-tronco relevantes na vias aéreas distais15. Fibrose, induzindo agentes também pode pre-condição os pulmões para melhorar a enxertia de células pluripotentes induzidas16 e células-tronco mesenquimais17. Se formas semelhantes de lesão das vias respiratórias podem afetar a taxa de enxertia, capacidade inicial de tumor e a consequência natural de células de câncer de pulmão deve ainda ser sistematicamente avaliada.

Neste estudo, descrevemos um método para aumentar a eficiência de ortotópico enxertia de células de câncer pulmonar, por pré-condicionamento nos pulmões de ratos com lesão. LUAD surge nas vias aéreas distais com um subconjunto significativo desses cânceres desenvolvendo um estroma fibrótico18 que muitas vezes se correlaciona com o prognóstico pobre19. Bleomicina, um peptídeo de híbrido natural nonribosomal-policetídeo, tem sido amplamente utilizada para induzir fibrose pulmonar em ratos20. Instilação de vias aéreas de bleomicina promove primeiro atrito epitelial nos alvéolos e recrutamento de células inflamatórias, incluindo macrófagos, neutrófilos e monócitos21. Isto é seguido por tecido remodelação nas vias aéreas distais, membrana basal reorganização22,23 e deposição de matriz extracelular (ECM)24. Os efeitos de uma injeção de bleomicina único são transitórios, com fibrose resolvendo após 30 dias na maioria dos estudos25. Usando modelos tanto aloenxertos e xenoenxertos, testamos se pré-condicionamento das vias aéreas de ratos com bleomicina poderia aumentar significativamente a taxa de tomada de células LUAD nos pulmões.

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Protocol

Todos os experimentos foram realizados em conformidade com os protocolos aprovados pelo cuidado institucional do Animal e Comissão de utilização (IACUC) na Universidade de Yale.

1. configurar / preparação dos reagentes.

  1. Bleomicina
    Atenção: Com base na globalmente harmonizado sistema (GHS) de classificação e rotulagem de produtos químicos, bleomicina é classificada como um perigo para a saúde GHS08.
    1. Prepare a bleomicina em uma capa de química. Resuspenda 15 U em 5 mL de soro fisiológico estéril tamponado de fosfato (PBS).
    2. Alíquota 100-200 µ l da solução em vidro frascos e congelá-los a-20 ° C para uso futuro. Rotule corretamente os tubos com a data de ressuspensão. Use no prazo de 6 meses a partir desta data.
      Nota: Cada cepa de rato tem uma sensibilidade diferente a bleomicina26. Testar diferentes doses de bleomicina para cada cepa de rato é recomendado. As estirpes de rato e as doses correspondentes de bleomicina utilizados em experiências representativas estão listadas na tabela 1.
  2. Ratos
    1. Ratos que precisava para a experiência de compra e permitir que ratos 7 dias se adaptar antes da injeção. Realize infusões em uma capa de biossegurança. Transferência de animais alojados em uma sala de compatível com não-BSL2 de um BSL2 usando padrão procedimentos institucionais antes da infusão de bleomicina. Injete camundongos em 6-8 semanas de idade.
      Cuidado: Injete ratos seguindo as orientações institucionais para agentes perigosos, nível de biossegurança 2 (BSL2) e IACUC aprovação.
      Nota: Ratos comprados para os experimentos representativos estão listados na Tabela de materiais. Só os ratos masculinos têm sido utilizados.
  3. Linhas de células de câncer de pulmão
    1. Linhas de células de cultura desejada em seus respectivos meios. Antes de injeções, realizar curta perfis de ADN de repetição em tandem ou testes genéticos para garantir a identificação da linha chamadora célula apropriada. Para facilitar in vivo e ex vivo da imagem latente, infectar linhas celulares com um lentivirus expressando a timidina quinase, a proteína verde fluorescente (GFP) e a luciferase fusão repórter27e classificar células positivas repórter por fluorescência ativada a célula de triagem (FACS) antes da enxertia. Testar linhas para o micoplasma cada 6 meses.
      1. Cultura H2030 linhagem de células cancerosas humanas como recomendado pelo fabricante usando meio de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) com 10% de soro Fetal bovino (FBS), penicilina-estreptomicina e anfotericina b.
      2. Cultura 368T1 a linha de celular murino (derivada de um rato KrasG12D; p53- / - ) usando médio modificado águia de Dulbecco (DMEM) com 10% FBS, penicilina-estreptomicina e anfotericina b.
      3. Linhagem de células cancerosas humanas PC9 usando RPMI com 10% de cultura FBS, penicilina-estreptomicina e anfotericina b.

2. bleomicina tratamento

  1. Plano para injetar camundongos intratraquealmente com bleomicina 14 dias antes da enxertia de células do tumor.
  2. Descongele o estoque de bleomicina no gelo 2 h antes da injeção.
  3. Uma vez descongelado, diluir bleomicina para a concentração desejada de trabalho (0,02 µ l de U/50 ou 0,005 µ l de U/50) e mantê-lo no gelo.
    Nota: Concentração da bleomicina varia de acordo com a cepa de rato usada para as experiências (tabela 1). Titulação da bleomicina em ratos deve ser realizada para determinar a dose ideal.
  4. Prepare-se anestesia diluindo ketamina e xilazina para uma concentração final de 10 mg/mL e 1 mg/mL, respectivamente, usando uma agulha de seringa e 27 G de 1 mL, anestesiamos a cada rato injetando solução intraperitonealmente cetamina/xilazina em 100/10 mg/kg respectivamente.
  5. Monitorar a respiração dos ratos e empregar uma pitada de dedo do pé. Confirme anesthetization adequada quando o mouse não responde aos pés pitada. Aplica o vet pomada nos olhos para evitar ressecamento enquanto sob anestesia.
  6. Coloque 1 rato por vez em uma plataforma de intubação por seus dentes da frente com as costas contra a plataforma de enforcamento.
  7. Ilumine a parte superior do peito usando um iluminador de fibra ótica para ajudar com a visualização da traqueia. Abra a boca do rato e puxar a língua para fora delicadamente com pinça estéril plana.
  8. Use um cateter intravenoso sem agulha para evitar o bloqueio de respiração. Posição do cateter sobre a luz branca emitida a partir da abertura da traqueia.
  9. Inserir o cateter na traqueia até o topo do cateter atinja os dentes da frente. Confirme o posicionamento adequado do cateter na traqueia através da visualização da luz branca brilhando através da abertura do cateter na boca.
  10. Utilizando uma pipeta, dispense 50 µ l de bleomicina ou veículo (PBS) diretamente dentro do cateter para garantir que todo o volume é inalado. Execute esta etapa sob condições estéreis.
  11. Se o cateter está inserido corretamente, o mouse irá inalar imediatamente o conteúdo do cateter. Aguarde alguns segundos até que todo o volume percorre o cateter. Em seguida retire o cateter da traqueia e descarte em solução 10%.
    Nota: O tempo médio por rato de passos 2.7-2.11 é em torno de 5 min.
  12. Se o mouse não é inalar o líquido, cuidadosamente, monitorar a respiração e ajustar a posição do cateter. Se o mouse parar de respirar, remova o cateter imediatamente e permitir que o mouse retomar a respiração normalmente antes de re-introduzir o cateter.
  13. Coloque o mouse injetado em uma almofada de aquecimento aprovados IACUC nas costas sobre uma superfície plana para a recuperação. Todo o processo vai demorar 10 min por rato. Não retornam um animal que passou por injeção para a companhia de outros animais até que se recuperou totalmente.
  14. Coloque um cartão de "Perigosos químicos em uso" da gaiola por 24 h.

3. monitoramento de ratos pós-intubação

  1. Monitore os ratos para insuficiência respiratória imediatamente após a intubação e depois a cada 15 min até ratos acordam da anestesia. Não abandone os ratos até eles recuperaram a consciência suficiente para manter a prostração esternal.
  2. Injete o cetoprofeno (5 mg/kg) intraperitonealmente para aliviar a dor.
  3. Examine a intubação de post de 24 h de ratos e 3 vezes por semana para quaisquer sinais de morbidade.
  4. Manter um registro da data do procedimento de identificação dos animais, tipo de procedimento, tipo de observações de monitoração anestésicas e pós-operatória com vezes.
  5. Monitorar os ratos para perda de peso, dificuldade respiratória, anormalidades comportamentais e um escore de condição corporal < 2 (segmentação da coluna vertebral dorsal/evidente ossos pélvicos são palpáveis) bi-semanal após injeção de bleomicina.
  6. Eutanásia em ratos com insuficiência respiratória ou ratos que experimentaram a perda de 15% da massa corporal por CO2 ou cetamina/xilazina seguido por deslocamento cervical. Confirme a eutanásia através da realização de palpação para a atividade respiratória.

4. enxertia de linhas de células de Adenocarcinoma de pulmão.

Nota: Realize a enxertia das células 14 dias após a injeção de bleomicina (passo 2.1).

  1. Permitir que as células a crescer em frascos de2 75cm imperturbado por 3 dias anteriores ao dia da injeção com mídia correspondente tal como indicado no passo 1.3.
    Nota: Devem estar 80% confluente no dia da injeção (que corresponde a 2-3 x 106 em cada balão dependendo da linhagem celular).
  2. Lave as células crescem em frascos de2 75cm com 5 mL de PBS em temperatura ambiente.
  3. Aspire PBS e adicione 1,5 mL de tripsina às células e incube as celulas a 37 ° C, até que as células desanexar (geralmente 2-5 min).
    Nota: Recomendamos que verifique a cada 2 min para o destacamento de célula do plástico pelo simples visualização da parte inferior do frasco ou sob um microscópio de luz. Não exceda 5 min. de incubação com tripsina.
  4. Neutralizar a tripsina adicionando 4 mL de mídia contendo 10% FBS (mesma mídia como passo 4.1). Coletar as células em um tubo de 15 mL e centrifugá-lo a 200 x g, durante 3 min à temperatura ambiente.
  5. Aspirar a mídia e ressuspender as células em 5 mL de PBS para lavar as células. Centrifugar as células a 200 x g, durante 3 min à temperatura ambiente para células de Pelotas. Repita esta 1 vez.
  6. Aspirar a PBS e resuspenda o pellet em 1,5 mL de PBS por balão.
  7. Misture 50 µ l de mistura de celular com 50 µ l de trypan azul e contar as células usando um contador de células/Hemocytometer câmara28.
  8. Prepare a suspensão de células diluindo as células em PBS para injetar 1 x 105 células (ou outro montante indicado) em 50 µ l por rato. Manter as células no gelo antes da injeção.
    Nota: Prepare pelo menos duas vezes mais células para injeção evitar a falta de suspensão de células.
  9. Prepare-se anestesia diluindo ketamina e xilazina para uma concentração final de 10 mg/mL e 1 mg/mL, respectivamente, usando uma agulha de seringa e 27 G de 1 mL, anestesiamos a cada rato injetando solução intraperitonealmente cetamina/xilazina em 100/10 mg/kg respectivamente.
  10. Monitorar a respiração dos ratos e empregar uma pitada de dedo do pé. Confirme anesthetization adequada quando o mouse não responde aos pés pitada. Aplica o vet pomada nos olhos para evitar ressecamento enquanto sob anestesia.
  11. Coloque 1 rato por vez em uma plataforma de intubação por seus dentes da frente com as costas contra a plataforma de enforcamento.
  12. Ilumine a parte superior do peito usando um iluminador de fibra ótica para ajudar com a visualização da traqueia.
  13. Ressuspender as células suavemente utilizando uma pipeta de p200 para certificar-se de que não formem grumos. Abra a boca do rato e puxar a língua para fora delicadamente com pinça estéril plana.
  14. Uso de um cateter intravenoso com a agulha removido para evitar o bloqueio de respiração. Posição do cateter sobre a luz branca emitida a partir da abertura da traqueia.
  15. Inserir o cateter na traqueia até o topo do cateter atinja os dentes da frente. Confirme o posicionamento adequado do cateter na traqueia através da visualização da luz branca brilhando através da abertura do cateter na boca.
  16. Utilizando uma pipeta, dispense 50 μL de células diretamente dentro do cateter para garantir que todo o volume é inalado. Execute esta etapa sob condições estéreis.
    Nota: Se o cateter está inserido corretamente, o mouse imediatamente irá inalar o conteúdo do cateter.
  17. Aguarde alguns segundos até que todo o volume percorre o cateter e em seguida remova o cateter da traqueia e dispor em solução 10%.
  18. Se o mouse não é inalar o líquido, cuidadosamente, monitorar a respiração e ajustar a posição do cateter. Se o mouse parar de respirar, remova o cateter imediatamente e permitir que o mouse retomar a respiração normalmente antes de re-introduzir o cateter.
    Nota: O tempo médio por rato de passos 4.11-4.18 é em torno de 5 min.
  19. Coloque o mouse injetado em uma almofada de aquecimento aprovados IACUC nas costas sobre uma superfície plana para a recuperação.
    Nota: Todo o processo levará 10 min por rato. Não retornam um animal que passou por injeção para a companhia de outros animais até que se recuperou totalmente.
  20. Raspar a região de costela inteira ambos ventralmente e dorsalmente, de B6129SF1/J e outras estirpes de rato com cabelo escuro usando um barbeador elétrico antes da imagem latente.
  21. 2-3 min após a injeção de célula, injetar 100 µ l de luciferina retrô-orbitally (15 mg/mL) usando uma agulha de insulina. Alternam o olho usado para injeção cada sessão de imagens.
  22. Depois de pelo menos 2 min, colocar até 5 ratos em um gerador de imagens de bioluminescência animal na posição de prostração dorsal e adquirir uma imagem ventral usando configurações de luminescência29.
  23. Sob o painel de controle, ajuste as configurações de resolução e sensibilidade para medir a luminescência de uma linha determinada célula. A maioria dos aplicativos, comece com 3 min (ou "Auto" se saturado), binning = médio (4), F/Stop = 1, o campo de visão = D, assunto altura = 1,50.
    Nota: Se a injeção for bem-sucedida, o sinal de luminescência é detectado na área superior do tórax, em um pulmão ou ambos os pulmões.
  24. Virar os ratos sobre posição de prostração esternal e adquirir uma imagem dorsal como acima.
    Nota: Se a injeção de célula não é executada corretamente, as células podem cluster na entrada da traqueia ou no pescoço.
  25. Injetar o cetoprofeno 5mg/kg intraperitonealmente para aliviar a dor.
  26. Mover os ratos de volta para sua gaiola e colocar um cartão de "agente de BSL-2 em uso" na gaiola.
  27. Monitorar os ratos para insuficiência respiratória imediatamente após a intubação e depois a cada 15 min até ratos acordam da anestesia. Não abandone os ratos até eles recuperaram a consciência suficiente para manter a prostração esternal.
  28. Examine a intubação de post de 24 h de camundongos e três vezes por semana para quaisquer sinais de morbidade.
  29. Manter o registro no diário de bordo da data do procedimento, identificação animal, tipo de procedimento, o tipo de observações de monitoração anestésicas e pós-operatória e vezes.
  30. Monitorar os ratos para perda de peso, dificuldade respiratória, anormalidades comportamentais e um escore de condição corporal < 2 (segmentação da coluna vertebral dorsal/evidente ossos pélvicos são palpáveis) bi-semanal após inoculação de bleomicina.
    Nota: Os ratos com tumores de pulmão podem apresentar irritação respiratória, perda de peso, caquexia, e/ou morte.
  31. Eutanásia em ratos com insuficiência respiratória ou ratos que experimentaram a perda de 15% da massa corporal por CO2 ou cetamina/xilazina seguido por deslocamento cervical se recolha de tecidos. Confirme a eutanásia através da realização de palpação para a atividade respiratória.

5. acompanhamento do crescimento do Tumor por imagens de bioluminescência

  1. Repita a imagem dos ratos em pós-enxertia dia 3 e semanal posteriormente.
  2. ANESTHETIZE ratos injetando xilazina/cetamina (conforme descrito nas etapas 2.4-2.5) ou por inalado isoflurano (2%). Monitorar a respiração dos ratos e empregar uma pitada de dedo do pé para confirmar anesthetization adequada. Aplica o vet pomada nos olhos para evitar ressecamento enquanto sob anestesia.
  3. Raspar a região de costela inteira ambos ventralmente e dorsalmente, de B6129SF1/J e outras estirpes de rato com cabelo escuro usando um barbeador elétrico antes da imagem latente.
  4. Uma vez que os ratos estão sob anestesia, injetar 100 µ l de luciferina retrô-orbitally (15 mg/mL) usando uma agulha de insulina. Espere 2 min. suplente o olho usado para injeção cada sessão de imagens.
  5. Coloque os ratos no tonalizador e adquirir imagens dorsais e ventrais, conforme descrito nas etapas 4.22-4,24.
  6. Coloque os ratos volta para a jaula após imagem, nas suas costas sobre uma superfície plana para a recuperação.
    Nota: Todo o processo levará 5 min por grupo de 5 ratos. Não abandone os ratos até eles recuperaram a consciência suficiente para manter a prostração esternal.
  7. Analise as imagens usando o software de análise de tonalizador/bioluminescência.
    1. Selecione as imagens adequadas e carregá-los como um grupo do software de análise de bioluminescência.
    2. Clique ferramenta ROI | Praça para adicionar uma região quadrada de interesse (ROI). Coloque o ROI sobre a área da parte superior do tórax, cobrindo a imagem do pulmão inteiro. Repita isto para cada imagem do mouse.
    3. Botão direito do mouse e selecione copiar todas ROI função para aplicar o mesmo ROI para todas as imagens no grupo e posicioná-los na parte superior do tórax dos camundongos, vista ventral e dorsal.
    4. No canto superior esquerdo da janela de imagem, selecione a função de fótons . Clique na função de painel de controle de medida para medir o ROIs. Copie e cole a tabela de saída que contém o fluxo total (fótons/s) em um software de escolha para analisar os dados ainda mais.
    5. Normalize o valor diário de ROI de cada rato para seu ROI valor medido no dia 0.

6. tecido isolamento e processamento.

  1. ANESTHETIZE ratos injetando xilazina/cetamina (conforme descrito nas etapas 2.4-2.5 ou por inalado isoflurano (2%). Monitorar a respiração dos ratos e empregar uma pitada de dedo do pé. Confirme anesthetization adequada quando o mouse não responde aos pés pitada. Aplica o vet pomada nos olhos para evitar ressecamento enquanto sob anestesia.
  2. Injetar 100 µ l de luciferina retrô-orbitally (15 mg/mL) usando uma agulha de insulina. Espere 2 min.
  3. Ratos de imagem seguindo passos 4.22-4.24 do presente protocolo.
  4. Injete o outro olho da etapa 6.2 outro 100 µ l de luciferina retrô-orbitally usando uma agulha de insulina antes da eutanásia.
  5. Eutanásia em ratos por injeção intraperitoneal de xilazina/cetamina (consulte a etapa 2.4 para mais detalhes) seguido por deslocamento cervical se ratos estão sob anestesia profunda em conformidade com as orientações fornecidas pela IACUC. Confirme a eutanásia através da realização de palpação para a atividade respiratória.
  6. Usando uma tesoura cirúrgica estéril faça uma incisão de pele abaixo do esterno. Abra a camada muscular ao longo do diafragma usando fórceps e a tesoura cirúrgica e expor a cavidade torácica cortando através da caixa torácica para nenhum dos lados laterais evitando as artérias torácicas internas.
  7. Perfundir o mouse, fazendo uma pequena incisão no átrio direito do coração e injetar 5 mL de PBS através do ventrículo esquerdo. A cor do tecido do pulmão vai de vermelho para rosa pálido-branco se a perfusão sanguínea é feito corretamente.
  8. Impostos especiais de consumo os pulmões da cavidade torácica cuidadosamente, agarrando o esôfago ou coração com fórceps. Suavemente, puxe o tecido e use tesoura cirúrgica para corte cuidadosamente o tecido conexão evitando perfuração do tecido pulmonar. A traqueia preserve o máximo possível para a inflação das vias aéreas pulmonares em uma etapa posterior.
  9. Lave o pulmão submergindo e agitando o tecido 3 vezes em um 6 prato bem cheio de 3 mL de PBS para remover o excesso de sangue.
  10. Coloque o pulmão para a tampa de uma placa bem 6 e coloque a tampa que contém o tecido no tonalizador bioluminescente e adquirir uma imagem luminescentes30.
    Nota: Recomendamos selecionar as seguintes configurações no painel de controle"aquisição" de "campo de visão = A" e "assunto altura = 0,75 cm" e então "exposição automática" para evitar imagens saturadas.
  11. Impostos especiais de consumo e outros órgãos, de imagem, como feito na etapa 6,9-6,10, onde foram identificados metástase por luminescência, tais como cérebro, fígado, supra-renais, osso, gânglios linfáticos, rim ou baço31.
  12. Perfundir o pulmão com 1 mL de paraformaldeído 4%, inserindo a agulha na traqueia do mouse. Os pulmões inflará se bem perfundidos.
    Cuidado: paraformaldeído 4% é um tóxico, uma saúde de risco GHS07 e GHS08.
  13. Transferi os pulmões em um 15ml cónico com 5 mL de paraformaldeído 4%.
  14. Corrigi os pulmões ou outros tecidos incubando o tecido com paraformaldeído 4% durante a noite a 4 ° C, em um dispositivo de agitação a 30-50 rpm.
  15. Incorpore os pulmões (ou outros tecidos) em parafina ou temperatura ideal corte composta dependendo do aplicativo de32.
    Nota: A parafina é o método preferido para preservar a estrutura pulmonar e para Masson Trichrome e coloração de hematoxilina-eosina.

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Representative Results

Para aumentar a eficiência da enxertia de célula de câncer LUAD nos pulmões de ratos, desenvolvemos um protocolo que primeiro pre-condições das vias aéreas utilizando a bleomicina seguida por injeção de células de tumor ortotópico (Figura 1). Confirmamos que, mesmo quando administrado em ratos imunodeprimidos modelo, bleomicina induzido fibrose transitória por dia 14, como evidenciado pela perda da arquitetura das vias aéreas e a deposição de colágeno aumentada (Figura 2). Fibrose bruta nestes ratos resolvido 50 dias pós injeção de bleomicina (Figura 2; painéis certo) consistentes com estudos prévios24.

Baseia-se estas observações, nós engrafted células LUAD de diferentes origens para os pulmões de diversas variedades de rato que tinham sido previamente condicionados com dose única de veículo ou bleomicina 14 dias antes da. Por exemplo, uma suspensão de células LUAD estabelecida humana LUAD célula na linha de, H2030, foi entregue a intratraquealmente para os pulmões de ratos do modelo. Após 35 dias, ratos pré-tratados com bleomicina tinham carga de tumor de pulmão alta detectadas por bioluminescência (Figura 3A). Por outro lado, em animais tratados com veículo, sem tumores foram detectados durante o mesmo período de tempo (Figura 3A). Fardo de tumor de pulmão foi confirmado pela histologia após a necropsia. Pulmões pré-tratados com veículo não tinham nenhuma evidência dos nódulos de tumor, Considerando que previamente tratada pulmões bleomicina tinham nódulos de tumor grande (Figura 3B). Usando este protocolo, aumentamos também a enxertia de outra linha de célula humana LUAD em camundongos modelo (PC9; A Figura 3) e uma linha de celular LUAD murino que foi injectada em ratos syngeneic de B6129SF1/J imunocompetentes (Figura 3D). As lesões iniciais observadas em ratos syngeneic previamente tratada de bleomicina eram principalmente de grau 1 e 2 e foram bem diferenciadas, assemelhando-se a tumores decorrentes em situ de KrasG12D / +; p53- / - GEMMs33. Todos os LUADs engrafted cresceram tanto no pulmão proximal e distal (Figura 3B, Figura 3E, Figura 3; estrela de (distal), asterisco (proximal)). O estabelecimento de PDXs de biospecimens de câncer de pulmão (a partir de biópsias ou ressecções cirúrgicas) é relativamente ineficaz, mesmo quando as células humanas por via subcutânea são transplantadas em animais severamente imunodeficientes como a gama NOD scid (NSG) cepa de rato34. Para avaliar o potencial de aplicação de nosso método para PDXs, nós também injetamos uma sub-população de células altamente metastático da linha celular H2030, denominada H2030-BrM3 células35, intratraquealmente em camundongos NSG que tinha sido previamente condicionada com veículo ou bleomicina. Notamos que os ratos NSG podem ser mais suscetíveis aos efeitos tóxicos da bleomicina (dados não mostrados) e que uma dose inferior a 0,02 unidades por rato é aconselhável quando se trabalha com esta tensão. No entanto, nosso protocolo também aumentou significativamente a enxertia e o fardo do tumor nos pulmões de ratos NSG (Figura 3F, Figura 3).

Em seguida usamos este protocolo para testar as taxas de enxertia de limitar a quantidade de células usando a linha de celular H2030 no modelo de ratos. Camundongos tratados previamente com bleomicina foram injetados com células de3 H2030 de 5 x 10, 5 x 104ou 5 x 105. 85,7 100-% dos ratos desenvolveram tumores de pulmão entre 7 e 10 semanas em todas as diluições testadas (tabela 2). Concluímos que a enxertia de um relativamente baixo número de células de tumor no pulmão é possível se os ratos são previamente acondicionados com bleomicina. No geral, nosso protocolo poderia ser adaptado para várias cepas de ratos e vários modelos de linha celular LUAD para aumentar a taxa de enxertia das células cancerosas nos pulmões de 0-16,7% e 71,4-100% (tabela 2).

Finalmente, para avaliar a cinética putativa da consequência de célula LUAD e disseminação metastática de pulmões pre-condicionado bleomicina, temos caracterizado o comportamento de células de H2030-BrM3 altamente metastáticos usando nosso protocolo. Após a enxertia ortotópico em camundongos tratados com veículo, atrito de células de tumor foi observado por bioluminescência no dia 3 pós-injeção e crescimento do tumor de pulmão não podia ser detectado posteriormente, ou no ponto de extremidade (dia 35) (Figura 4A, Figura 4B). Por outro lado, detectamos a consequência do tumor de pulmão em ratos pré-tratados com bleomicina logo em injeção de pós dia 7 (Figura 4A). Após 39-57 dias de expansão do tumor, a morbidade e a intensidade bioluminescente associada com limites de fardo de tumor pulmonar elevada a análise da doença disseminada (dados não mostrados). Portanto, temos imagens de metástases em órgãos distantes ex vivo na necropsia. Nos animais que tinham o ónus de tumor de pulmão por 57 dias, pequenas lesões também podem ser detectadas em tecidos como o cérebro, fígado, rim, glândulas supra-renais e osso membros posteriores em frequências variáveis (Figura 4). Portanto, concluímos que a espontânea doença disseminada em sites clinicamente relevantes pode ser gerada deste método ortotópico.

Figure 1
Figura 1: método para a pre-condição os pulmões para enxertia de células de tumor. Diagrama esquemático do protocolo usado. Lesão pulmonar é realizada através da injeção de bleomicina intratraquealmente. Células LUAD são injetou na traqueia de ratos de 14 dias após. Os ratos são posteriormente fotografados semanalmente para luminescência para monitor tumor enxertia, crescimento e metástase à distância. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: bleomicina causa fibrose pulmonar transitória e ECM remodelação. Imagens representativas de hematoxilina-eosina (H & E) e coloração tricromo Masson dos pulmões do veículo e bleomicina tratados ratos 14 dias depois da injeção (pico de fibrose) e na post-injeção 51 dias (resolução de fibrose) na ausência de células de tumor injeção. Barra de escala = 500 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: enxertia de pulmão das linhas de célula LUAD em vários modelos de mouse é aumentada em ratos pré-tratados com bleomicina. A) modelo ratos pré-tratados com veículo ou bleomicina foram injetados com células de 5 x 105 H2030. Fardo de tumor de pulmão relativo ao ponto de extremidade (dia 35 normalizado para pós-injeção dia 0) medida pelo bioluminescência é plotado. Para cada grupo, é mostrado um mouse com peso médio de tumor. n = 6-7 ratos por grupo. B) representante H & E imagens dos pulmões pré-tratadas com veículo ou bleomicina da no dia 35. Asterisco = distal; Estrela = proximal. C) modelo ratos tratados como A foram injetados com células de PC9 1 x 105 . Imagens de fardo e representante do tumor são medidas e mostradas como na. n = 7 ratos por grupo. D-E) ratos B6129SF1/J pré-tratadas com veículo ou bleomicina foram injetados com 1 x 105 368T1 KrasG12D / + p53- / - (KP-T não Met) células. Fardo de tumor, imagens representativas e H & Es são medidos e retratado como em A e B. n = 7 ratos por grupo. F-G) ratos NSG pré-tratadas com veículo ou bleomicina foram injetados com células de 1 x 105 H2030-BrM3. Fardo de tumor, imagens representativas e H & Es (dia 9 e dia 10 pós-injeção) são medidos e mostra como a e B. n = 3-6 ratos por grupo. Barra de escala = 500 µm. Inset = alta ampliação das áreas de célula incorporada do tumor. Barra de escala de inserções = 100 µm. p valores calculados pelo teste de Mann-Whitney. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: células LUAD incorporadas em camundongos tratados com bleomicina metastatizam para vários órgãos distantes. A) modelo ratos pré-tratados com veículo ou bleomicina foram injetados com células de 5 x 105 H2030-BrM3. Fardo de tumor de pulmão foi medido semanalmente utilizando bioluminescência. Fluxo de fóton total dorsal normalizado para o dia 0 é mostrado. B) Tumor fardo por bioluminescência dos pulmões de um ponto de extremidade (injeção de pós dia 35). Para cada grupo, é mostrado um mouse com peso médio de tumor. n = 6-7 ratos por grupo. C) imagens representativas de órgãos com metástase detectável o mesmo mouse na necropsia (à esquerda). Tabela com frequências indicadas de ratos com metástases em órgãos distantes no ponto de extremidade (enxertia de pós dia 39 a 57) (à direita). Órgãos ex-vivo com sinal visual bioluminescente, acima de 1,5 x 104 fótons / (esterradiano de2 seg cm) foram contados como positivo metástase. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Cepa de rato Unidades/rato
Modelo 0.02
NSG 0.02
B6129SF1/J 0.005

Tabela 1: Lista de doses recomendadas de bleomicina para rato cepas testadas.

Cepa de rato Linha celular Número de células injetadas % de enxertia valor de p
Veículo Bleomicina
Modelo H2030 5 x 105 0% (0/7) 100% (6/6) 0,0006
Modelo H2030 5 x 104 n.d. 85,7% (6/7) n.a.
Modelo H2030 5 x 103 n.d. 85,7% (6/7) n.a.
Modelo PC-9 1 x 105 0% (0/7) 85,7% (6/7) 0,0023
NSG H2030-BrM3 1 x 105 16,7% (1/6) 100% (3/3) * 0.0476
B6129SF1/J 368T1 1 x 105 0% (0/7) 71,4% (5/7) * 0.0105

Tabela 2: Quadro-resumo da frequência de enxertia (%) usando o cepas do mouse indicado, linhas celulares e números de celular. Enxertia foi determinada pela imagem de luminescência na vivo e confirmada pela imagem latente ex vivo com histologia dos tecidos entre 37 e 50 dias depois da injeção. * Enxertia positiva foi confirmada por luminescência na vivo no dia 10 pós-injeçãoDanuza valores calculados pelo teste exato de Fischer unilateral. n.a. = não aplicável; n.d. = não determinado.

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Discussion

Marcantes clínicos paralelos foram documentados entre câncer de pulmão e outras doenças crônicas do pulmão36. Em particular, pacientes com fibrose pulmonar idiopática (IPF) tem uma predileção maior para desenvolver câncer de pulmão, e esta associação é independente de fumar história37,38. IPF é caracterizada pela destruição progressiva da arquitetura pulmonar e insuficiência respiratória através da deposição de ECM39. Também, após a ressecção cirúrgica, início fase NSCLC doentes IPF simultânea têm um resultado ruim de40. A maioria dos tumores NSCLC contêm um componente fibrótico no momento do diagnóstico, e a extensão desta reação do estroma se correlaciona com o prognóstico pobre18. Danos nos tecidos aguda ou sustentado de fibrose podem aumentar a incidência de tumorigênese de várias maneiras. Por exemplo, após a lesão, o processo de regeneração epitelial pode expandir o pool de células progenitoras suscetíveis à transformação. Alternativamente, o influxo e a função de várias células do sistema imunológico podem ajudar a estabelecer um microambiente imunossupressora, enquanto a ativação de miofibroblastos pode secretar fatores de crescimento ou depósito tumor-promoção de ECM. Nesse sentido, nosso método de pré-condicionamento dos pulmões com uma fibrose induzindo agente pode vir a ser particularmente apto para estudar os efeitos do pulmão câncer co-morbidades (por exemplo, fibrose) e subtipos NSCLC, ricos em matriz extracelular de modelagem e um estroma inflamatória41.

No geral, nosso método significativamente reforçada a enxertia de células tumorais injetadas nas vias aéreas através da traqueia. Esta observação aplica-se por estirpes de rato com graus variados de imunocompetência. Outros métodos de injeção de células de tumor nos pulmões incluem injeção de veia de cauda ou injeção direta no parênquima pulmonar através da parede torácica. Para a finalidade específica de estudar tumorigenicidade de células de câncer de pulmão, esses métodos são abaixo do ideal, como o antigo requer pilhas do tumor para sobreviver em circulação e extravasate antes de consequência (um processo mais parecidas com metástase para os pulmões), enquanto o último podem causar células a vazar no espaço pleural, logo após a injeção (dados não mostrados). Ambos os métodos podem confundir a quantificação de loco-regional da consequência de células de câncer de pulmão. Como alternativa, o nosso protocolo garante que células tumorais semeado primeiro são retidas nas vias aéreas rodeadas por estroma pulmonar. São críticos para o sucesso do presente protocolo, a intubação apropriada dos ratos, a dose tolerável de bleomicina e sincronismo de pré-condicionamento das vias aéreas, em relação à injeção de células de tumor. Também demonstramos que este protocolo permite que as células posteriormente disseminar para outros tecidos, incluindo o cérebro. Embora a morbidade associada com fardo de tumor de pulmão ainda pode limitar a caracterização abrangente de macrometastasis distante, esta abordagem pode ser útil para quantificar e estudar as células de tumor circulantes provenientes dos pulmões.

Apesar das vantagens do método descrito neste documento, diversas variáveis técnicas podem influenciar a eficiência final de enxertia e monitoramento da progressão do tumor. Em primeiro lugar, está bem documentado que a resposta fibrótica a bleomicina em camundongos é dependente da tensão. Por exemplo, camundongos C57Bl/6 são mais propensos a fibrose quando comparado ao de camundongos Balb/c42. Em segundo lugar, a sensibilidade a bleomicina é gênero e idade-dependente. Em nossa experiência, as fêmeas e os ratos mais jovens são mais propensos a efeitos adversos sobre o protocolo inteiro. Isto pode limitar a tumorigênese estudos que requerem comparações diretas entre macho e fêmea ou animais jovens e velhos. Além disso, instilação intratraqueal de ratos mais jovens do que 7 semanas é tecnicamente desafiador e ajustes para o tamanho do cateter podem ser necessárias. Em terceiro lugar, bleomicina é tóxica e pode ser mutagênico devido à sua capacidade de induzir quebras de DNA. É importante testar a dose tolerável de bleomicina para cada cepa de rato antes de realizar os experimentos. Nesta prova de estudo de princípio, nós fornecemos sugeridas doses para ratos masculinos através de diversas variedades. Além disso, ratos com pelo escuro são menos adequados para bioluminescentes de imagem devido à penetração do tecido de baixo e mascaramento do sinal bioluminescente pela pele. Depilatórios os ratos podem melhorar as medidas da imagem, mas métodos alternativos também podem ser empregados tais como ressonância magnética e imagem fluorescente usando sondas de longo comprimento de onda, tais como TdTomato ou Katushka43. Finalmente, a potencial imunogenicidade de uma proteína de determinado repórter deve ser considerada ao selecionar uma modalidade de deteção do tumor para um modelo do rato determinado.

Bleomicina remodela os pulmões distais pela primeira alveolar prejudicial tipo 2 células (AT2) que então se regenerar na tentativa de reparar os alvéolos44. Desde AT2 células são um dos tipos de células grandes de originar NSCLC, pré-condicionamento dos pulmões com bleomicina pode também modificar o início e progressão de tumores decorrentes em situ GEMMs. Outros tipos de danos, incluindo gripe infecção13 ou naftaleno instilação14, foram mostrados para aumentar a enxertia das células tronco/progenitoras de pulmão murino e humano. Notavelmente, naftaleno danos tronco/progenitoras células em cruzamentos do bronchio-alveolar e potencialmente aumenta a iniciação do tumor em GEMMs45. Ajuste fino do tipo de lesão e nicho de vias aéreas, direcionados para os tipos de célula engrafted pode otimizar ainda mais o nosso método para estudar aloenxertos de câncer de pulmão ou xenografts de diferentes origens. Finalmente, propomos que este método pode ser implementado para a geração de padrão de PDXs de câncer de pulmão. A taxa de sucesso de estabelecimento de câncer de pulmão PDXs de biospecimens humana pelo transplante subcutâneo em ratos NSG é relativamente baixa (30-40%)46,47. Ortotópico crescimento de PDXs pode não só aumentar esta taxa de sucesso com limitação da quantidade de amostra (do pulmão humano), mas também gerar condições mais fisiologicamente relevantes para testar a farmacocinética e farmacodinâmica da terapêutica do câncer de pulmão.

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Disclosures

Os autores declaram não concorrentes interesses financeiros.

Acknowledgments

Este estudo foi financiado por concessões do Instituto Nacional de câncer (R01CA166376 e R01CA191489 para D.X. Nguyen) e o departamento de defesa (W81XWH-16-1-0227 para D.X. Nguyen).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bleomycin Sigma B5507-15UN CAUTION Health hazard GHS08
Exel Catheter 24G Fisher 1484121 Remove needle. For intratracheal injection
Ketamine (Ketaset inl 100 mg/mL C3N 10 mL) Butler Schein 56344 To anesthetize mice
Xylazine Butler Schein 33198 To anesthetize mice
Ketoprofen, 5,000 mg Cayman Chemical 10006661 Analgesic
Puralube Veterinary Ophthalmic Ointment BUTLER ANIMAL HEALTH COMPANY LLC 8897 To prevent eye dryness while under anesthesia
D-Luciferin powder Perkin Elmer Health Sciences Inc 122799 For luminescent imaging. Reconstitute powder with PBS for a working concentration of 15mg/mL. Protect from Light
Rodent Intubation stand Braintree Scientific RIS-100 Recommended stand for intratracheal injection
MI-150 ILLUMINATOR 150W MI-150 DOLAN-JENNER INDUSTRIES MI-150 / EEG2823M To illuminate and visualize trachea
Graefe Forceps, 2.75 (7 cm) long serrat Roboz RS-5111 For intratracheal injection
Syringe Luer-Lok Sterile 5ml BD / Fisher 309646
Satiny Smooth by Conair Dual Foil Wet/Dry Rechargeable Shaver Conair - To shave mice
Bonn Scissors, 3.5" straight 15 mm sharp/sharp sure cut blades Roboz RS-5840SC
15 mL conical tube BD / Fisher 352097
1.5 mL centrifuge tubes USA SCIENTIFIC INC 1615-5500
Vial Scintillation 7 mL Borosilicate Glass GPI Fisher 701350
Filter pipette tips (200 μL) USA SCIENTIFIC INC 1120-8710
Phosphate Buffered Saline Life Technologies 14190-144
0.25% Trypsin-EDTA Life Technologies 25200-056
DMEM high glucose Life Technologies 11965-092
RPMI Medium 1640 Life Technologies 11875-093
Fetal bovine serum USDA Life Technologies 10437-028
Penicillin-Streptomycin Life Technologies 15140-122
Amphotericin B Sigma A2942-20ML
Trypan Blue Stain 0.4% Life Technologies 15250-061
Countess Automated Cell Counter Life Technologies AMQAX1000
Flask T/C 75cm sq canted neck, blue cap Fisher / Corning 353135
IVIS Spectrum Xenogen Bioluminiscence Perkin Elmer Health Sciences Inc 124262 For in vivo bioluminescence imaging
Living image software Perkin Elmer Health Sciences Inc 128113 For in vivo bioluminescence analysis
XGI-8 Gas Anesthesia System Perkin Elmer Health Sciences Inc 118918 For Isoflurane anesthesia
BD Ultra-Fine II Short Needle Insulin Syringe 1 cc. 31 G x 8 mm (5/16 in) BD / Fisher BD328418 For retro-orbital luciferin injection
Syringe 1ml BD / Fisher 14-823-434 For intraperitoneal injections
26 G x 1/2 in. needle BD / Fisher 305111 For intraperitoneal injections
4% Paraformaldehyde VWR 43368-9M CAUTION Health hazard GHS07, GHS08. For fixing tissue
Pipet-Lite Pipette, Unv. SL-200XLS+ METTLER-TOLEDO INTERNATIONAL 17014411
Mayer's Hematoxylin ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES 517-28-2
Eosin Y stain 0.25% (w/v) in 57% Fisher 67-63-0
Masson Trichrome Stain Kit IMEB Inc K7228 For masson trichrome stain to visualize collagen
Superfrost plus glass slides Fisher 1255015
6 well plate Corning C3516
Universal Mycoplasma Detection Kit ATCC 30-1012K
OCT Embedding compound ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES 62550-12 For embedding tissue for frozen sections
Leica CM3050 S Research Cryostat Leica CM3050 S To section tissue for staining analysis
Keyence All-in One Fluorescence Microscope Keyence BZ-X700
ImageJ US National Institutes of Health IJ1.46 http://rsbweb.nih.gov/ij/ download.html
Prism 7.0 for Mac OS X GraphPad Software, Inc. -
Athymic (Crl:NU(NCr)-Foxn1nu) mice Charles River NIH-553
NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) mice Jackson Laboratories 5557
B6129SF1/J mice Jackson Laboratories 101043
NIH-H2030 cells ATCC CRL-5914
368T1 generously provided by Monte Winslow (Standford University) -
PC9 cells Nguyen DX et al. Cell. 2009;138:51–62 -
H2030 BrM3 cells Nguyen DX et al. Cell. 2009;138:51–62 -

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Medicina edição 136 adenocarcinoma do pulmão modelos de rato ortotópico injeção intratraqueal bleomicina enxertia metástase
Pré-condicionamento das vias aéreas de ratos com bleomicina aumenta a eficiência da enxertia de célula de câncer pulmão ortotópico
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Stevens, L. E., Arnal-Estapé,… More

Stevens, L. E., Arnal-Estapé, A., Nguyen, D. X. Pre-Conditioning the Airways of Mice with Bleomycin Increases the Efficiency of Orthotopic Lung Cancer Cell Engraftment. J. Vis. Exp. (136), e56650, doi:10.3791/56650 (2018).

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