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Pre-condizionamento delle vie aeree dei topi con bleomicina aumenta l'efficienza di Orthotopic del polmone cancro Engraftment delle cellule

Published: June 28, 2018 doi: 10.3791/56650
Automatic Translation
*1, *1, 1,2
1Department of Pathology, Yale University School of Medicine, 2Department of Medical Oncology, Yale University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Descriviamo un metodo per migliorare in modo significativo orthotopic engraftment delle cellule di cancro del polmone nei polmoni murini di pre-condizionamento delle vie aeree con la ferita. Questo approccio può essere applicato anche per studiare le interazioni stroma all'interno del microambiente polmonare, la disseminazione metastatica, la co-morbidità, cancro del polmone, e per generare in modo più efficiente paziente derivato xenotrapianti.

Abstract

Cancro del polmone è una malattia refrattaria di trattamento mortale che è biologicamente eterogenea. Per capire e trattare efficacemente lo spettro clinico completo delle malignità toracica, sono necessari ulteriori modelli animali che possono ricapitolare fasi e sottotipi di cancro del polmone umano diversi. Modelli dell'allotrapianto o dello xenotrapianto sono versatili e permettono la quantificazione della capacità tumorigeniche in vivo, utilizzando cellule maligne di origine umana o murina. Tuttavia, metodi precedentemente descritti del engraftment di cellula del cancro del polmone sono stati effettuati in siti non-fisiologica, come il fianco dei topi, a causa della inefficienza di trapianto orthotopic delle cellule nei polmoni. In questo studio, descriviamo un metodo per migliorare engraftment orthotopic del polmone cancro delle cellule di pre-condizionamento delle vie aeree dei topi con la bleomicina agente d'induzione di fibrosi. Come un esperimento di proof-of-concept, abbiamo applicato questo approccio per attecchire le cellule del tumore del sottotipo dell'adenocarcinoma del polmone, ottenuti da mouse o fonti umane, in vari ceppi di topi. Dimostriamo che ferendo le vie respiratorie con bleomicina prima dell'iniezione di cellule di tumore aumenta l'attecchimento delle cellule del tumore da 0-17% a 71-100%. Questo metodo ha migliorato significativamente, l'incidenza del tumore del polmone e la conseguenza successiva utilizzando diversi modelli e diversi ceppi di topi. Inoltre, le cellule tumorali del polmone engrafted diffondono dai polmoni in pertinenti organi distanti. Quindi, mettiamo a disposizione un protocollo che può essere utilizzato per stabilire e mantenere nuovi modelli ortotopici del cancro polmonare con limitare le quantità di cellule o di biospecimen e di valutare quantitativamente la capacità tumorigenica delle cellule di cancro del polmone in impostazioni fisiologicamente rilevanti .

Introduction

Il cancro del polmone è la principale causa di cancro correlati morti in tutto il mondo1. Pazienti con cancro polmonare soccombono alla fine dalla metastasi agli organi distanti, in particolare per il sistema nervoso centrale, fegato, ghiandole surrenali e ossa2,3,4. Le malignità toraciche sono stati tradizionalmente classificate come carcinoma polmonare a piccole cellule (SCLC) o non a piccole cellule del polmone cancro (NSCLC)5. NSCLC è il più frequentemente diagnosticato malignità e può essere suddiviso in diversi sottotipi istologici, compreso l'adenocarcinoma del polmone (LUAD) e del polmone a cellule squamose (LUSC)6. Analisi genomica dei tumori polmonari primari umani resecato ha rivelato che i tumori all'interno di un determinato istotipo anche possono esprimere diverse perturbazioni molecolari, ulteriormente contribuire alla loro divergenti progressione clinica e prognosi paziente di confondimento. La notevole eterogeneità dei tumori polmonari rappresenta una sfida significativa per la progettazione razionale, sperimentazione pre-clinica e implementazione di strategie terapeutiche efficaci. Di conseguenza, c'è una necessità di ampliare il repertorio di trattabili sperimentale del polmone cancro modelli per lo studio della diversa origine cellulare, sottotipi molecolari e fasi di questa malattia.

Vari approcci utilizzando modelli animali sono stati impiegati per lo studio del polmone cancro in vivo, ciascuno con i propri vantaggi e svantaggi a seconda delle domande biologiche di interesse. Modelli murini geneticamente (GEMM) possono indirizzare specifiche alterazioni genetiche in un tipo di cellula progenitore determinato, con conseguente tumori che il progresso all'interno di un ospite immunocompetente7. Mentre estremamente potente e clinicamente rilevanti, la morbosità di tumore latenza, variabilità e/o polmonare connessa con GEMM può essere proibitiva per determinate misure quantitative e l'individuazione di metastasi ritardata di fase in organi distanti8. Un approccio complementare è l'utilizzo di modelli di allotrapianto, per cui le cellule tumorali del polmone, ottenuti direttamente da un tumore di topo o derivato in primo luogo come linee cellulari stabilizzate nella cultura, sono re-introdotte in syngeneic padroni di casa. Analogamente, gli xenotrapianti di cancro del polmone sono stabiliti da linee cellulari umane o campioni tumorali derivate paziente. Gli xenotrapianti di linea cellulare umana o pazienti derivati xenotrapianti (PDXs) vengono di solito mantenuti in topi immunocompromessi e pertanto precludono completa sorveglianza immunitaria9. Nonostante questo inconveniente, che forniscono un viale per propagare limitare importi umano biospecimens e studio fondamentale in vivo delle proprietà cellule tumorali umane, che codificano per più complesse aberrazioni che i tumori GEMM.

Una proprietà utile di allotrapianti e gli xenotrapianti è che essi sono suscettibili di tradizionale e limitante i saggi di diluizione di cellulare, impiegati per quantificare la frequenza del tumore che inizia le cellule (TICs) all'interno di una popolazione di cellule maligne10. In questi esperimenti, un numero definito di cellule vengono iniettato per via sottocutanea al fianco degli animali e la frequenza dei TIC possa essere stimata in base tasso di prendere del tumore. I tumori sottocutanei, tuttavia, possono essere più hypoxic11 e potrebbero non modellare i vincoli chiave fisiologici del microambiente del tumore del polmone. Consegna intratracheale di staminali epiteliali o cellule progenitrici nei polmoni dei topi è un metodo per studiare la rigenerazione polmonare e delle vie respiratorie della cellula formativa biologia12. Tuttavia, il tasso di attecchimento da questa tecnica può essere relativamente basso, a meno che i polmoni sono sottoposti prima a forme fisiologiche di ferita, quali infezione virale13,14. Supporto da cellule stromali infiammatorie e/o la rottura della membrana dello scantinato del polmone può migliorare la conservazione delle cellule trapiantate in nicchie di cellule staminali pertinenti nella vie aeree distali15. Fibrosi che inducono gli agenti può anche pre-condizione i polmoni di attecchimento di cellule pluripotenti indotte16 e cellule staminali mesenchimali17. Se altre forme simili di ferita della via aerea possono influenzare il tasso di attecchimento, capacità d'inizio del tumore e la conseguenza delle cellule di cancro del polmone ha ancora essere valutati sistematicamente.

In questo studio, descriviamo un metodo per aumentare l'efficienza di engraftment di orthotopic del polmone cancro delle cellule, di pre-condizionamento i polmoni dei topi con la ferita. LUAD si pone nelle vie aeree distali con un sottoinsieme significativo di questi cancri sviluppando un stroma fibrotico18 che spesso correla con la prognosi difficile19. Bleomicina, un peptide di ibrido naturale nonribosomal-polyketide, è stata ampiamente utilizzata per indurre fibrosi polmonare in topi20. Instillazione della via aerea di bleomicina promuove in primo luogo epiteliale logoramento in alveoli e il reclutamento di cellule infiammatorie, tra cui i macrofagi, neutrofili e monociti21. Questa è seguita da tessuto che ritocca le vie aeree distali, la membrana dello scantinato riorganizzazione22,23 e la deposizione di matrice extracellulare (ECM)24. Gli effetti di un'iniezione singola bleomicina sono transitori, con fibrosi risoluzione dopo 30 giorni nella maggior parte dei studi25. Utilizzando modelli dell'allotrapianto sia dello xenotrapianto, abbiamo testato se pre-condizionamento delle vie aeree dei topi con bleomicina potrebbe aumentare notevolmente il tasso di prendere delle cellule LUAD nei polmoni.

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Protocol

Tutti gli esperimenti sono stati effettuati secondo protocolli approvati dalla istituzionale Animal Care and uso Committee (IACUC) all'Università di Yale.

1. impostare / preparazione dei reagenti.

  1. Bleomicina
    Attenzione: Basandosi sul sistema mondiale armonizzato (GHS) di classificazione ed etichettatura delle sostanze chimiche, bleomicina è classificata come un pericolo per la salute GHS08.
    1. Preparare la bleomicina in una cappa chimica. Risospendere 15 U in 5 mL di soluzione salina sterile tamponata al fosfato (PBS).
    2. Aliquotare 100-200 µ l della soluzione in vetro fiale e congelarli a-20 ° C per un uso futuro. Etichettare correttamente i tubi con la data di risospensione. Utilizzare entro 6 mesi da questa data.
      Nota: Ogni ceppo del mouse ha una diversa sensibilità a bleomicina26. Si raccomandano test differenti dosi di bleomicina per ogni sforzo del mouse. I ceppi di topi e dosi corrispondenti di bleomicina usati negli esperimenti rappresentativi sono elencate nella tabella 1.
  2. Topi
    1. Acquistare il necessario per l'esperimento di topi e topi di attendere 7 giorni acclimatare prima iniezione. Eseguire infusioni in una cappa di biosicurezza. Trasferire gli animali ospitati in una camera di BSL2 non conforme ad una camera di BSL2 utilizzando le procedure standard istituzionali prima dell'infusione di bleomicina. Iniezione di topi in 6-8 settimane di età.
      Attenzione: Iniettare topi che seguono le linee guida istituzionali per agenti pericolosi, livello di biosicurezza 2 (BSL2) e IACUC approvazione.
      Nota: Topi acquistati per gli esperimenti rappresentativi sono elencati nella Tabella materiali. Sono stati utilizzati solo i topi maschi.
  3. Linee cellulari di cancro polmonare
    1. Linee cellulari di cultura voluta nei loro rispettivi mezzi. Prima iniezioni, eseguire breve profilo del DNA ripetizione in tandem o dei test genetici per garantire l'identificazione della linea adeguata delle cellule. Per facilitare in vivo ed ex vivo imaging, infettare linee cellulari con un lentivirus esprimendo la timidina chinasi, la proteina fluorescente verde (GFP) e la luciferasi fusione reporter27e ordinare le cellule positive reporter di fluorescenza attivato ordinano (FACS) prima dell'attecchimento delle cellule. Linee per micoplasma prova ogni 6 mesi.
      1. Cultura della linea cellulare umana del H2030 come consigliato dal produttore l'uso medio di Roswell Park Memorial Institute (RPMI) con 10% siero bovino fetale (FBS), penicillina-streptomicina e anfotericina b.
      2. Cultura 368T1 linea cellulare murina (derivato da un mouse KrasG12D; p53- / - ) utilizzo medio dell'Aquila per volta di Dulbecco (DMEM) con 10% FBS, penicillina-streptomicina e anfotericina b.
      3. Cultura PC9 linea cellulare di cancro umano utilizzando RPMI con 10% FBS, penicillina-streptomicina e anfotericina b.

2. trattamento della bleomicina

  1. Prevede di iniettare vari topi con bleomicina 14 giorni prima del engraftment delle cellule del tumore.
  2. Scongelare il magazzino di bleomicina sul ghiaccio 2 h prima dell'iniezione.
  3. Una volta scongelato, diluire bleomicina fino alla concentrazione di lavoro desiderata (0,02 µ l U/50 o 0.005 U/50 µ l) e tenerlo sul ghiaccio.
    Nota: Concentrazione di bleomicina dipende il ceppo del mouse utilizzato per gli esperimenti (tabella 1). Titolazione di bleomicina in topi deve essere eseguita per determinare la dose ottimale.
  4. Preparare l'anestesia diluendo ketamina e xilazina ad una concentrazione finale di 10 mg/mL e 1 mg/mL, rispettivamente, utilizzando un ago di siringa e 27 G di 1 mL, anestetizzare ogni mouse iniettando soluzione intraperitonealmente chetamina/xilazina a 100/10 mg/kg rispettivamente.
  5. Monitorare la respirazione dei topi e impiegano un pizzico di punta. Confermare il corretto amputate quando il mouse non risponde alla punta pizzico. Applicare unguento veterinario sugli occhi per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia.
  6. Posto 1 il mouse alla volta su una piattaforma di intubazione per impiccagione suoi denti anteriori con le spalle contro la piattaforma.
  7. Illuminare la parte superiore del torace utilizzando un illuminatore a fibre ottiche per aiutare con visualizzazione della trachea. Aprire la bocca del mouse ed estrarre delicatamente la linguetta con pinze sterili piatte.
  8. Utilizzare un catetere endovenoso senza l'ago per evitare di bloccare la respirazione. Posizione il catetere sopra la luce bianca emessa dall'apertura della trachea.
  9. Inserire il catetere nella trachea fino a cima del catetere raggiunge i denti anteriori. Verificare l'esatto posizionamento del catetere nella trachea visualizzando la luce bianca brillante attraverso l'apertura del catetere in bocca.
  10. Usando una pipetta, dispensare 50 µ l di bleomicina o veicolo (PBS) direttamente nel catetere per garantire che l'intero volume viene inalato. Eseguire questo passaggio in condizioni di sterilità.
  11. Se il catetere è stato inserito correttamente, il mouse sarà immediatamente inalare il contenuto del catetere. Attendere qualche secondo fino a quando l'intero volume viaggia giù il catetere. Quindi estrarre il catetere dalla trachea e smaltire in soluzione di candeggina al 10%.
    Nota: Il tempo medio per topo di passaggi 2.7-2.11 è circa 5 min.
  12. Se il mouse non è l'inalazione del liquido, monitorare la respirazione attentamente e regolare la posizione del catetere. Se il mouse smette di respirare, rimuovere immediatamente il catetere e lasciare il mouse per riprendere la respirazione normalmente prima di reinserire il catetere.
  13. Posizionare il mouse iniettato su un rilievo di riscaldamento approvato IACUC sulla schiena su una superficie piana per il recupero. L'intera procedura porterà 10 min per topo. Non restituiscono un animale che ha subito l'iniezione per la compagnia di altri animali fino a quando completamente recuperato.
  14. Posto una carta "Chimici pericolosi in uso" sulla gabbia per 24 h.

3. monitoraggio topi post-intubazione

  1. Monitorare i topi per distress respiratorio subito dopo intubazione e poi ogni 15 minuti fino a quando i topi si sveglia dall'anestesia. Non lasciare incustodito topi fino a quando essi hanno ripreso conoscenza sufficiente per mantenere decubito sternale.
  2. Iniettare il ketoprofene (5 mg/kg) per via intraperitoneale per alleviare il dolore.
  3. Esaminare l'intubazione di post di topi 24 h e 3 volte a settimana per eventuali segni di morbosità.
  4. Tenere traccia della data della procedura, identificazione degli animali, tipo di procedura, tipo di anestetiche e post-operatorie monitoraggio osservazioni con volte.
  5. Monitorare i topi per perdita di peso, difficoltà respiratoria, le anomalie del comportamento e un punteggio della condizione corporea < 2 (segmentazione della colonna vertebrale dorsale/evidente ossa pelviche sono palpabili) bi-settimanale a seguito di iniezione di bleomicina.
  6. Eutanasia di topi sotto l'afflizione respiratoria o topi che hanno sperimentato la perdita del 15% della massa corporea di CO2 o di chetamina/xilazina seguita da dislocazione cervicale. Confermare l'eutanasia conducendo palpazione per l'attività respiratoria.

4. engraftment delle linee cellulari di Adenocarcinoma polmonare.

Nota: Eseguire engraftment delle cellule 14 giorni dopo l'iniezione di bleomicina (punto 2.1).

  1. Consentire alle cellule di crescere in beute2 75cm indisturbati per 3 giorni prima del giorno dell'iniezione con media corrispondente come indicato al punto 1.3.
    Nota: Dovrebbero essere 80% confluenti al giorno dell'iniezione (che corrisponde a 2-3 x 106 in ciascuna beuta, a seconda della linea cellulare).
  2. Lavare le cellule che crescono su 75 cm2 boccette con 5 mL di PBS a temperatura ambiente.
  3. Aspirare la PBS e aggiungere 1,5 mL di tripsina alle celle e incubare le cellule a 37 ° C fino a staccano le cellule (in genere 2-5 min).
    Nota: Si consiglia di consultare ogni 2 min per distacco cellulare dalla plastica di semplice visualizzazione della parte inferiore del pallone o sotto un microscopio chiaro. Non superare i 5 minuti di incubazione con tripsina.
  4. Neutralizzare la tripsina aggiungendo 4 mL di supporto contenente 10% FBS (stesso supporto come passo 4.1). Raccogliere le cellule in una provetta da 15 mL e centrifugare esso a 200 x g per 3 min a temperatura ambiente.
  5. Aspirare i media e risospendere il pellet cellulare in 5 mL di PBS per lavare le cellule. Centrifugare le cellule a 200 x g per 3 min a temperatura ambiente per agglomerare le cellule. Ripetere questa 1 volta.
  6. Aspirare il PBS e risospendere il pellet in 1,5 mL di PBS per fiaschetta.
  7. Mescolare 50 µ l di miscela delle cellule con 50 µ l di blu di trypan e contare le celle utilizzando un Cell Counter/emocitometro camera28.
  8. Preparare la sospensione cellulare diluendo le cellule in PBS per iniettare 1 x 105 celle (o altro importo indicato) in 50 µ l per topo. Mantenere le cellule sul ghiaccio prima dell'iniezione.
    Nota: Preparare almeno due volte più cellule per iniezione per evitare l'esaurimento di sospensione cellulare.
  9. Preparare l'anestesia diluendo ketamina e xilazina ad una concentrazione finale di 10 mg/mL e 1 mg/mL, rispettivamente, utilizzando un ago di siringa e 27 G di 1 mL, anestetizzare ogni mouse iniettando soluzione intraperitonealmente chetamina/xilazina a 100/10 mg/kg rispettivamente.
  10. Monitorare la respirazione dei topi e impiegano un pizzico di punta. Confermare il corretto amputate quando il mouse non risponde alla punta pizzico. Applicare unguento veterinario sugli occhi per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia.
  11. Posto 1 il mouse alla volta su una piattaforma di intubazione per impiccagione suoi denti anteriori con le spalle contro la piattaforma.
  12. Illuminare la parte superiore del torace utilizzando un illuminatore a fibre ottiche per aiutare con visualizzazione della trachea.
  13. Risospendere le cellule delicatamente utilizzando una pipetta p200 per assicurarsi che non formano grumi. Aprire la bocca del mouse ed estrarre delicatamente la linguetta con pinze sterili piatte.
  14. Utilizzare un catetere endovenoso con l'ago rimosso per evitare di ostacolare la respirazione. Posizione il catetere sopra la luce bianca emessa dall'apertura della trachea.
  15. Inserire il catetere nella trachea fino a cima del catetere raggiunge i denti anteriori. Verificare l'esatto posizionamento del catetere nella trachea visualizzando la luce bianca brillante attraverso l'apertura del catetere in bocca.
  16. Usando una pipetta, dispensare 50 µ l di cellule direttamente nel catetere per garantire che l'intero volume viene inalato. Eseguire questo passaggio in condizioni di sterilità.
    Nota: Se il catetere è stato inserito correttamente, il mouse immediatamente inalare il contenuto del catetere.
  17. Attendere qualche secondo fino a quando l'intero volume viaggia giù il catetere, quindi rimuovere il catetere dalla trachea e smaltire in soluzione di candeggina al 10%.
  18. Se il mouse non è l'inalazione del liquido, monitorare la respirazione attentamente e regolare la posizione del catetere. Se il mouse smette di respirare, rimuovere immediatamente il catetere e lasciare il mouse per riprendere la respirazione normalmente prima di reinserire il catetere.
    Nota: Il tempo medio per topo di passaggi 4,11-4.18 è circa 5 min.
  19. Posizionare il mouse iniettato su un rilievo di riscaldamento approvato IACUC sulla schiena su una superficie piana per il recupero.
    Nota: L'intera procedura richiederà 10 min per topo. Non restituiscono un animale che ha subito l'iniezione per la compagnia di altri animali fino a quando completamente recuperato.
  20. Radere la zona intera nervatura entrambi ventralmente e dorsalmente utilizzando un rasoio elettrico prima di formazione immagine di B6129SF1/J e altri ceppi di topi con i capelli scuri.
  21. 2-3 minuti dopo l'iniezione delle cellule, iniettare 100 µ l di luciferina retrò-orbitally (15 mg/mL) utilizzando un ago da insulina. Si alternano l'occhio utilizzato per l'iniezione ogni sessione di imaging.
  22. Dopo almeno 2 min, inserire fino a 5 topi in un imager di bioluminescenza animale in posizione di decubito dorsale e acquisire un'immagine ventrale con luminescenza impostazioni29.
  23. Sotto il pannello di controllo è possibile regolare le impostazioni di risoluzione e sensibilità per misurare la luminescenza di una linea cellulare dato. Per la maggior parte delle applicazioni, avviare con 3 min (o "Auto" se saturi), binning = medio (4), F/Stop = 1, campo di vista = D, soggetto altezza = 1.50.
    Nota: Se l'iniezione viene eseguita correttamente, viene rilevato segnale di luminescenza nella zona superiore del torace, in un polmone o di entrambi i polmoni.
  24. Topi di vibrazione sulla posizione di decubito sternale e acquisire un'immagine dorsale come sopra.
    Nota: Se l'iniezione di cellule non viene eseguita correttamente, le cellule possono cluster all'ingresso della trachea o del collo.
  25. Iniettare ketoprofene 5 mg/kg per via intraperitoneale per alleviare il dolore.
  26. Riportare i topi alla loro gabbia e mettere una carta "BSL-2 agente in uso" sulla gabbia.
  27. Monitorare topi per distress respiratorio immediatamente dopo l'intubazione e poi ogni 15 minuti fino a quando i topi si sveglia dall'anestesia. Non lasciare incustodito topi fino a quando essi hanno ripreso conoscenza sufficiente per mantenere decubito sternale.
  28. Esaminare l'intubazione di post di topi 24 h e tre volte a settimana per eventuali segni di morbosità.
  29. Mantenere record nel giornale di bordo della data della procedura, identificazione degli animali, tipo di procedura, tipo di anestetiche e post-operatorie monitoraggio osservazioni e volte.
  30. Monitorare i topi per perdita di peso, difficoltà respiratoria, le anomalie del comportamento e un punteggio della condizione corporea < 2 (segmentazione della colonna vertebrale dorsale/evidente ossa pelviche sono palpabili) bi-settimanale a seguito di inoculazione di bleomicina.
    Nota: I topi con i tumori del polmone possono esibire irritazione delle vie respiratorie, perdita di peso, cachessia e morte.
  31. Eutanasia di topi sotto l'afflizione respiratoria o topi che hanno sperimentato la perdita del 15% della massa corporea di CO2 o di chetamina/xilazina seguita da dislocazione cervicale se raccolta tessuti. Confermare l'eutanasia conducendo palpazione per l'attività respiratoria.

5. monitoraggio della crescita del tumore di bioluminescenza Imaging

  1. Formazione immagine di ripetizione dei topi a post-attecchimento giorno 3 e settimanale da allora in poi.
  2. Anestetizzare topi iniettando chetamina/xilazina (come descritto nei passaggi 2.4-2.5) o da inalazione isoflurane (2%). Monitorare la respirazione dei topi e impiegano un pizzico di punta per confermare la corretta amputate. Applicare unguento veterinario sugli occhi per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia.
  3. Radere la zona intera nervatura entrambi ventralmente e dorsalmente utilizzando un rasoio elettrico prima di formazione immagine di B6129SF1/J e altri ceppi di topi con i capelli scuri.
  4. Una volta che i topi sono sotto anestesia, iniettare 100 µ l di luciferina retrò-orbitally (15 mg/mL) utilizzando un ago da insulina. Aspettare 2 minuti Alternate l'occhio utilizzato per l'iniezione ogni sessione di imaging.
  5. Posizionare i topi nel riproduttore d'immagini e acquisire immagini dorsale e ventrale, come descritto nei passaggi 4,22-4,24.
  6. Topi posto nuovamente dentro la gabbia dopo formazione immagine, sulla loro parte posteriore su una superficie piana per il recupero.
    Nota: L'intera procedura richiederà 5 min per ogni gruppo di 5 topi. Non lasciare incustodito topi fino a quando essi hanno ripreso conoscenza sufficiente per mantenere decubito sternale.
  7. Analizzare le immagini utilizzando il software di analisi di imager/bioluminescenza.
    1. Selezionare le immagini appropriate e caricarli come un gruppo del software di analisi di bioluminescenza.
    2. Fare clic su strumento ROI | Piazza per aggiungere un'area quadrata di interesse (ROI). Posto il ROI sulla zona superiore del torace, che ricopre l'immagine di intero polmone. Ripetere questa operazione per ogni immagine del mouse.
    3. Fare clic destro e selezionare copia tutte le ROI funzione per applicare il ROI stesso a tutte le immagini del gruppo e la loro posizione nella parte superiore del torace dei topi, viste sia ventrale e dorsale.
    4. In alto a sinistra della finestra immagine, selezionare la funzione di fotoni . Fare clic sulla funzione di pannello di controllo misura per misurare il ROIs. Copiare e incollare la tabella di output contenente il flusso totale (fotoni/s) in un software di scelta per analizzare ulteriormente i dati.
    5. Normalizzare il valore giornaliero di ROI di ogni topo al suo valore ROI misurato il giorno 0.

6. i tessuti isolamento e trattamento.

  1. Anestetizzare topi iniettando chetamina/xilazina (come descritto nei passaggi 2.4-2.5 o da inalazione isoflurane (2%). Monitorare la respirazione dei topi e impiegano un pizzico di punta. Confermare il corretto amputate quando il mouse non risponde alla punta pizzico. Applicare unguento veterinario sugli occhi per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia.
  2. Iniettare 100 µ l di luciferina retrò-orbitally (15 mg/mL) utilizzando un ago da insulina. Attendere 2 min.
  3. Topi di immagine seguendo passaggi 4,22-4,24 dal presente protocollo.
  4. Iniettare l'altro occhio dal punto 6.2 un altro 100 µ l di luciferina retrò-orbitally utilizzando un ago da insulina prima dell'eutanasia.
  5. Eutanasia i topi tramite l'iniezione intraperitoneale di chetamina/xilazina (Vedi punto 2.4 per dettagli) seguita da dislocazione cervicale se i topi sono sotto anestesia profonda conformemente agli orientamenti forniti da IACUC. Confermare l'eutanasia conducendo palpazione per l'attività respiratoria.
  6. Usando le forbici chirurgiche sterili fare un'incisione della pelle sotto lo sterno. Aprire lo strato del muscolo lungo il diaframma utilizzando pinze e forbici chirurgiche ed esporre la cavità toracica da taglio attraverso la gabbia toracica su entrambi i lati evitando le arterie toraciche interne.
  7. Irrorare il mouse facendo una piccola incisione nell'atrio destro del cuore e iniettare 5 mL di PBS attraverso il ventricolo sinistro. Il colore del tessuto polmonare andrà dal rosso al bianco-rosa pallido se l'aspersione di sangue è fatto correttamente.
  8. Asportare i polmoni dalla cavità toracica attentamente afferrando l'esofago o il cuore con il forcipe. Delicatamente tirare il tessuto e forbici per tagliare accuratamente connettivo evitando puntura del tessuto polmonare. Preservare la trachea per quanto possibile per l'inflazione delle vie aeree del polmone in un passaggio successivo.
  9. Lavare il polmone immergendo e vorticoso il tessuto 3 volte in un piatto ben 6 riempito con 3 mL di PBS per rimuovere il sangue in eccesso.
  10. Posizionare il polmone sul coperchio di una piastra ben 6 e mettere il coperchio che contiene il tessuto nell'imager bioluminescente e acquisire un'immagine luminescente30.
    Nota: Si consiglia di selezionare le seguenti impostazioni dal "pannello di controllo di acquisizione" "campo di vista = A" e "soggetto altezza = 0,75 cm" e quindi "esposizione automatica" per evitare di ottenere immagini sature.
  11. Accise e immagine altri organi, come fatto nel passaggio 6.9-6.10, dove le metastasi sono state individuate dalla luminescenza, come fegato, cervello, rene o milza31, surrenale, osso, i linfonodi.
  12. Irrorare il polmone con 1 mL di paraformaldeide al 4% inserendo l'ago nella trachea del mouse. I polmoni si gonfiano se ben perfuso.
    Attenzione: paraformaldeide al 4% è un tossico, un salute GHS07 e GHS08 di pericolo.
  13. Trasferire i polmoni in un conico da 15 mL con 5 mL di paraformaldeide al 4%.
  14. Difficoltà i polmoni o altri tessuti incubando il tessuto con paraformaldeide al 4% durante la notte a 4 ° C in un dispositivo di agitazione a 30-50 giri/min.
  15. Incorporare i polmoni (o altri tessuti) in paraffina o temperatura di taglio ottimale composto a seconda l' applicazione32.
    Nota: Paraffina è il metodo preferito di conservare la struttura del polmone e per Masson Trichrome ed ematossilina-eosina.

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Representative Results

Per aumentare l'efficienza di engraftment di cellula del cancro LUAD nei polmoni dei topi, abbiamo sviluppato un protocollo che in primo luogo pre-condizioni delle vie respiratorie con bleomicina seguita da iniezione di orthotopic del tumore delle cellule (Figura 1). Abbiamo confermato che anche quando amministrato in topi immunocompromessi athymic, bleomicina transitoria fibrosi indotta da giorno 14 come evidenziato dalla perdita dell'architettura delle vie respiratorie e deposizione di collagene aumento (Figura 2). Lorda fibrosi in questi topi risolto 50 giorni dopo l'iniezione di bleomicina (Figura 2; pannelli di destra) coerente con gli studi precedenti24.

Sulla base di queste osservazioni abbiamo engrafted cellule LUAD di diversa origine nei polmoni di diversi ceppi di topi che erano stati pre-condizionati con una singola dose di veicolo o bleomicina 14 giorni prima. Ad esempio, una sospensione di cellule LUAD dalla consolidata LUAD linea cellulare umana, H2030, è stata consegnata vari nei polmoni di topi athymic. Dopo 35 giorni, topi pretrattati con bleomicina avevano difficoltà del tumore del polmone alta come rilevato da bioluminescenza (Figura 3A). Al contrario, in animali trattati con veicolo, nessun tumore sono stato rilevato per il lasso di tempo stesso (Figura 3A). Carico del tumore del polmone è stata confermata dall'istologia dopo l'autopsia. Polmoni pretrattati con veicolo non ha avuto prova di noduli del tumore mentre polmoni pretrattati bleomicina ha avuto noduli di grandi dimensioni del tumore (Figura 3B). Usando questo protocollo, abbiamo anche aumentato l'attecchimento di un'altra linea cellulare umana di LUAD in topi athymic (PC9; Figura 3) e una linea cellulare LUAD murina che è stata iniettata in topi syngeneic di B6129SF1/J immunocompetenti (Figura 3D). Lesioni in anticipo osservate nei topi syngeneic pre-trattati di bleomicina sono stati principalmente di grado 1 e 2 e sono stati ben differenziate, simile a tumori che insorgono in situ da KrasG12D / +; p53- / - GEMM33. Tutti i LUADs engrafted è cresciuto sia nel polmone prossimale e distale (Figura 3B, 3E figura, Figura 3; star (distale), asterisco (prossimale)). L'istituzione di PDXs da biospecimens di cancro del polmone (da biopsie o resezioni chirurgiche) è relativamente inefficiente, anche quando le cellule umane per via sottocutanea sono trapiantate in severamente immunodeficienti animali quali la gamma NOD scid (NSG) del mouse ceppo34. Per valutare la potenziale applicazione del nostro metodo di PDXs, abbiamo anche iniettato una popolazione altamente metastatico delle cellule della linea cellulare H2030, chiamata H2030-BrM3 cellule35, vari in topi NSG che era stato pre-condizionato con veicolo o bleomicina. Notiamo che i topi NSG possono essere più suscettibili agli effetti tossici della bleomicina (dati non mostrati) e che una dose inferiore a 0,02 unità per mouse è consigliabile quando si lavora con questo ceppo. Tuttavia, il nostro protocollo anche significativamente aumentato l'attecchimento e la difficoltà del tumore nei polmoni dei topi NSG (Figura 3F, Figura 3).

Successivamente abbiamo usato questo protocollo per verificare le tariffe di attecchimento di limitare la quantità di celle utilizzando la linea cellulare H2030 in topi athymic. Topi pre-trattati con bleomicina sono stati iniettati con 5 x 105, 5x104o 5 x 103 H2030 celle. 85,7-100% dei topi ha sviluppato i tumori del polmone tra 7 e 10 settimane a tutte le diluizioni testate (tabella 2). Concludiamo che attecchimento di un relativamente basso numero di cellule del tumore nel polmone è possibile se i topi sono pre-condizionati con bleomicina. Nel complesso, il nostro protocollo potrebbe essere adeguato ai diversi ceppi di topi e vari modelli della linea cellulare LUAD per aumentare il tasso di attecchimento delle cellule tumorali nei polmoni da 0-16,7% al 71,4-100% (tabella 2).

Infine, per valutare la cinetica putativa di conseguenza delle cellule LUAD e disseminazione metastatica da polmoni pre-condizionato bleomicina, abbiamo caratterizzato il comportamento di cellule altamente metastatiche di H2030-BrM3 utilizzando il nostro protocollo. A seguito di orthotopic attecchimento nei topi trattati con veicolo, logoramento delle cellule del tumore è stata osservata da bioluminescenza al giorno 3 dopo l'iniezione e crescita del tumore del polmone non poteva essere rilevata da allora in poi o endpoint (giorno 35) (Figura 4A, Figura 4B). Al contrario, abbiamo rilevato la conseguenza del tumore del polmone in topi pre-trattati con bleomicina più presto post-iniezione giorno 7 (Figura 4A). Dopo 39-57 giorni di espansione del tumore, la morbosità e l'intensità bioluminescenti associato con limiti di peso del tumore del polmone ad alta l'analisi della malattia diffusa (dati non mostrati). Pertanto, abbiamo ripreso la metastasi in organi distanti ex vivo all'autopsia. In animali che avevano difficoltà del tumore del polmone per i 57 giorni, piccole lesioni potrebbero essere rilevate anche in tessuti come il cervello, fegato, reni, ghiandole surrenali e arti posteriori dell'osso alle frequenze variabili (Figura 4). Di conseguenza, concludiamo che la malattia spontanea diffusa nei siti clinicamente rilevanti possa essere generata da questo metodo di orthotopic.

Figure 1
Figura 1: metodo per la pre-condizione i polmoni per engraftment delle cellule del tumore. Schema del protocollo utilizzato. Ferita di polmone viene eseguita iniettando bleomicina vari. LUAD cellule vengono poi iniettate nella trachea di topi 14 giorni dopo. Topi sono successivamente ripreso settimanalmente per luminescenza a monitor tumore attecchimento, la crescita e la metastasi distante. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: bleomicina provoca fibrosi polmonare transitoria ed ECM rimodellamento. Immagini rappresentative di ematossilina-eosina (H & E) e la colorazione tricromica di Masson dei polmoni dal veicolo e bleomicina trattati topi 14 giorni dopo l'iniezione (picco di fibrosi) e a 51 giorni dopo l'iniezione (risoluzione di fibrosi) in assenza di cellule tumorali iniezione. Barra della scala = 500 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: engraftment polmonare delle linee cellulari LUAD in modelli murini di più è aumentato di topi pre-trattati con bleomicina. A) Athymic topi pre-trattati con veicolo o bleomicina sono stati iniettati con cellule di 5 x 105 H2030. Carico del tumore del polmone relativa all'endpoint (giorno 35 normalizzato a post-iniezione giorno 0) come misurato tramite bioluminescenza è tracciata. Per ogni gruppo, è mostrato un mouse con difficoltà mediano del tumore. n = 6-7 topi per ogni gruppo. B) rappresentante H & E immagini dei polmoni pre-trattati con veicolo o bleomicina dalla al giorno 35. Asterisco = distale; Star = prossimale. C) Athymic topi trattati come in A sono stati iniettati con cellule di 1 x 105 PC9. Immagini di onere e rappresentante del tumore sono misurate e mostrate in a. n = 7 topi per ogni gruppo. D-E) B6129SF1/J topi pre-trattati con veicolo o bleomicina sono stati iniettati con 1 x 105 368T1 KrasG12D / + p53- / - (KP T-non Met) cellule. Carico del tumore, immagini rappresentative e H & Es vengono misurati e raffigurato come in A e B. n = 7 topi per ogni gruppo. F-G) NSG topi pre-trattati con veicolo o bleomicina sono stati iniettati con cellule di 1 x 105 H2030-BrM3. Carico del tumore, immagini rappresentative e H & Es (giorno 9 e 10 ° giorno post-iniezione) sono misurati e visualizzati come in A e B. n = 3-6 topi per ogni gruppo. Barra della scala = 500 µm. Inset = alto ingrandimento delle zone di tumore delle cellule innestate. Barra della scala di inserti = 100 µm. p valori calcolati tramite il test di Mann-Whitney. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: LUAD cellule innestate nei topi trattati con bleomicina metastasi agli organi distanti più. A) Athymic topi pre-trattati con veicolo o bleomicina sono stati iniettati con cellule di 5 x 105 H2030-BrM3. Carico del tumore del polmone è stata misurata settimanalmente tramite bioluminescenza. Viene mostrato il flusso dorsale fotone totale normalizzato al giorno 0. B) tumore onere di bioluminescenza dei polmoni da un endpoint (post-iniezione giorno 35). Per ogni gruppo, è mostrato un mouse con difficoltà mediano del tumore. n = 6-7 topi per ogni gruppo. C) immagini rappresentative degli organi con metastasi rilevabile dal mouse stesso all'autopsia (a sinistra). Tabella con le frequenze indicate dei topi con metastasi negli organi distanti endpoint (post-attecchimento giorno 39-57) (a destra). Organi di ex vivo con segnale visivo bioluminescente sopra 1.5 x 104 fotoni / (steradiante di2 sec cm) sono stati contati come positiva metastasi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Razza del topo Unità/mouse
Athymic 0,02
NSG 0,02
B6129SF1/J 0,005

Tabella 1: Elenco delle dosi raccomandate di bleomicina per ceppi murini testati.

Razza del topo Linea cellulare Numero di cellule iniettate attecchimento % valore di p
Veicolo Bleomicina
Athymic H2030 5 x 105 0% (0/7) 100% (6/6) 0,0006
Athymic H2030 5 x 104 n.d. 85,7% (6/7) n.a.
Athymic H2030 5 x 103 n.d. 85,7% (6/7) n.a.
Athymic PC-9 1 x 105 0% (0/7) 85,7% (6/7) 0,0023
NSG H2030-BrM3 1 x 105 16,7% (1/6) 100% (3/3) * 0.0476
B6129SF1/J 368T1 1 x 105 0% (0/7) 71,4% (5/7) * 0,0105

Tabella 2: Tabella riassuntiva della frequenza attecchimento (%) utilizzando ceppi murini indicato, linee cellulari e numeri di cell. Attecchimento è stato determinato da in vivo imaging luminescenza e confermata da formazione immagine di ex vivo con istologia dei tessuti tra 37 e 50 giorni post-iniezione. * Attecchimento positiva è stata confermata da in vivo luminescenza al giorno 10 post-iniezione. p valori calcolati da test esatto di Fischer unilaterale. n.a. = non applicabile; n.d. = non determinato.

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Discussion

Analogie sorprendenti cliniche sono state documentate tra cancro ai polmoni e altre malattie croniche del polmone36. In particolare, i pazienti con fibrosi polmonare idiopatica (IPF) hanno una maggiore predilezione per sviluppare il cancro del polmone, e questa associazione è indipendente da fumo storia37,38. IPF è caratterizzata dalla distruzione progressiva dell'architettura del polmone e la funzione respiratoria alterata attraverso deposizione di ECM39. Inoltre, a seguito di resezione chirurgica, pazienti NSCLC stadio precoce con IPF simultanee hanno un risultato difficile40. Maggior parte dei tumori NSCLC contengono una componente fibrotica al momento della diagnosi, e la portata di questa reazione stromale correla con la prognosi difficile18. Danno tissutale acuto o sostenuta da fibrosi può aumentare l'incidenza del tumorigenesis in più modi. Per esempio, dopo la lesione, il processo di rigenerazione epiteliale può espandere il pool di cellule progenitrici suscettibili alla trasformazione. In alternativa, l'afflusso e la funzione delle varie cellule immuni può aiutare a stabilire un microambiente immunosopressivo, mentre l'attivazione dei myofibroblasts può secernere fattori di crescita o depositare dipromozione ECM. Di conseguenza, il nostro metodo di pre-condizionamento i polmoni con una fibrosi che inducono agente può rivelarsi particolarmente adatto a studiare gli effetti di comorbilità per cancro del polmone (ad es. fibrosi) e modellazione sottotipi di NSCLC, che sono ricchi di matrice extracellulare e un lo stroma infiammatoria41.

Nel complesso, il nostro metodo ha migliorato significativamente l'attecchimento delle cellule del tumore iniettato nelle vie respiratorie tramite la trachea. Questa osservazione vale per diversi ceppi di topi con diversi gradi di immunocompetenza. Altri metodi di iniezione delle cellule del tumore nei polmoni includono iniezione della vena della coda o iniezione diretta nel parenchima polmonare tramite la parete toracica. Per lo scopo specifico di studiare la carcinogenicità di cellula del cancro del polmone, questi metodi sono sub-ottimali, come le cellule del tumore di sopravvivere in circolazione e MPEG prima escrescenza (un processo più simile a metastasi nei polmoni), mentre il secondo richiede l'ex può indurre le cellule a fuoriuscire nello spazio pleurico presto dopo l'iniezione (dati non mostrati). Entrambi i metodi possono confondere la quantificazione di loco-regionale di conseguenza delle cellule del cancro del polmone. In alternativa, il nostro protocollo assicura che le cellule del tumore seminato prima vengano mantenute nelle vie aeree circondate da dello stroma del polmone. Fondamentale per il successo del presente protocollo, sono la corretta intubazione dei topi, la dose tollerabile di bleomicina e la tempistica di pre-condizionamento delle vie respiratorie rispetto a iniezione di cellule del tumore. Inoltre dimostriamo che questo protocollo permette alle cellule di successivamente diffondere ad altri tessuti, compreso il cervello. Anche se la morbosità connessa con carico del tumore del polmone può ancora limitare la completa caratterizzazione di macrometastasis distanti, questo approccio può essere utile per quantificare e studiare cellule tumorali circolanti che proviene dai polmoni.

Nonostante i vantaggi del metodo descritto nel presente documento, diverse tecniche variabili possono influenzare la massima efficienza di attecchimento e monitoraggio della progressione del tumore. In primo luogo, è ben documentato che la risposta fibrotica a bleomicina in topi è ceppo-dipendente. Per esempio, topi C57Bl/6 sono più inclini a fibrosi rispetto ai topi di Balb/c42. In secondo luogo, la sensibilità a bleomicina è sesso ed età dipendente. Nella nostra esperienza, femmine e giovani topi sono più inclini a effetti negativi sopra l'intero protocollo. Questo potrebbe limitare la tumorigenesi studi che richiedono confronti diretti tra maschio e femmina, o animali giovani e vecchi. Inoltre, l'instillazione intratracheale di topi di età inferiore a 7 settimane è tecnicamente impegnativo e regolazioni per le dimensioni del catetere possono essere richieste. In terzo luogo, bleomicina è tossico e può essere mutagenico a causa della sua capacità di indurre rotture del DNA. È importante testare la dose tollerabile di bleomicina per ogni sforzo del mouse prima di eseguire gli esperimenti. In questa prova di studio di principio, forniamo dosi suggerite per topi maschi attraverso vari ceppi. Inoltre, topi con pelliccia scura sono meno adatti per imaging a causa della penetrazione del tessuto basso bioluminescenti e mascheramento del segnale bioluminescente dalla pelliccia. Depilating i topi può migliorare misure di immagine, ma metodi alternativi possono essere impiegati anche come risonanza magnetica e formazione immagine fluorescente usando sonde di lunghezza d'onda lunga come TdTomato o Katushka43. Infine, il potenziale immunogenicità di una proteina reporter dato dovrebbe essere considerato quando si seleziona una modalità di rilevazione del tumore per un determinato modello.

Bleomicina rimodella i polmoni distali di alveolare dannosi prima digitare 2 cellule (AT2) che quindi rigenerano nel tentativo di riparare gli alveoli44. Poiché le cellule AT2 sono uno dei tipi principali delle cellule per dare origine a NSCLC, pre-condizionamento dei polmoni con bleomicina può inoltre modificare l'inizio e la progressione dei tumori che presentano in situ da gemm. Altri tipi di lesioni, compreso l'influenza infezione13 o naftalene instillazione14, sono stati indicati per aumentare l'attecchimento di cellule staminali/progenitrici del polmone umano e murino. In particolare, naftalene danni staminali/progenitrici delle cellule nelle giunzioni bronchiolo-alveolare e potenzialmente aumenta l'inizio del tumore in GEMM45. Messa a punto il tipo di lesione e delle vie respiratorie nicchia mirati per i tipi di cellule engrafted può ottimizzare ulteriormente il nostro metodo per studiare allotrapianti di cancro del polmone o xenotrapianti di origini diverse. Infine, proponiamo che questo metodo potrebbe essere effettuato per la generazione standard del cancro del polmone PDXs. Il tasso di successo di stabilire cancro polmonare PDXs da biospecimens umani da trapianto sottocutaneo in topi NSG è relativamente bassa (30-40%)46,47. Crescita di orthotopic del PDXs può non solo aumentare questa percentuale di successo con limitare le quantità di campione (da polmoni umani), ma anche generare più fisiologicamente rilevanti Condizioni per testare la farmacocinetica e la farmacodinamica di terapeutica del cancro del polmone.

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Disclosures

Gli autori non dichiarano concorrenti interessi finanziari.

Acknowledgments

Questo studio è stato finanziato da sovvenzioni dal National Cancer Institute (R01CA166376 e R01CA191489 a D.X. Nguyen) e il dipartimento della difesa (W81XWH-16-1-0227 a D.X. Nguyen).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bleomycin Sigma B5507-15UN CAUTION Health hazard GHS08
Exel Catheter 24G Fisher 1484121 Remove needle. For intratracheal injection
Ketamine (Ketaset inl 100 mg/mL C3N 10 mL) Butler Schein 56344 To anesthetize mice
Xylazine Butler Schein 33198 To anesthetize mice
Ketoprofen, 5,000 mg Cayman Chemical 10006661 Analgesic
Puralube Veterinary Ophthalmic Ointment BUTLER ANIMAL HEALTH COMPANY LLC 8897 To prevent eye dryness while under anesthesia
D-Luciferin powder Perkin Elmer Health Sciences Inc 122799 For luminescent imaging. Reconstitute powder with PBS for a working concentration of 15mg/mL. Protect from Light
Rodent Intubation stand Braintree Scientific RIS-100 Recommended stand for intratracheal injection
MI-150 ILLUMINATOR 150W MI-150 DOLAN-JENNER INDUSTRIES MI-150 / EEG2823M To illuminate and visualize trachea
Graefe Forceps, 2.75 (7 cm) long serrat Roboz RS-5111 For intratracheal injection
Syringe Luer-Lok Sterile 5ml BD / Fisher 309646
Satiny Smooth by Conair Dual Foil Wet/Dry Rechargeable Shaver Conair - To shave mice
Bonn Scissors, 3.5" straight 15 mm sharp/sharp sure cut blades Roboz RS-5840SC
15 mL conical tube BD / Fisher 352097
1.5 mL centrifuge tubes USA SCIENTIFIC INC 1615-5500
Vial Scintillation 7 mL Borosilicate Glass GPI Fisher 701350
Filter pipette tips (200 μL) USA SCIENTIFIC INC 1120-8710
Phosphate Buffered Saline Life Technologies 14190-144
0.25% Trypsin-EDTA Life Technologies 25200-056
DMEM high glucose Life Technologies 11965-092
RPMI Medium 1640 Life Technologies 11875-093
Fetal bovine serum USDA Life Technologies 10437-028
Penicillin-Streptomycin Life Technologies 15140-122
Amphotericin B Sigma A2942-20ML
Trypan Blue Stain 0.4% Life Technologies 15250-061
Countess Automated Cell Counter Life Technologies AMQAX1000
Flask T/C 75cm sq canted neck, blue cap Fisher / Corning 353135
IVIS Spectrum Xenogen Bioluminiscence Perkin Elmer Health Sciences Inc 124262 For in vivo bioluminescence imaging
Living image software Perkin Elmer Health Sciences Inc 128113 For in vivo bioluminescence analysis
XGI-8 Gas Anesthesia System Perkin Elmer Health Sciences Inc 118918 For Isoflurane anesthesia
BD Ultra-Fine II Short Needle Insulin Syringe 1 cc. 31 G x 8 mm (5/16 in) BD / Fisher BD328418 For retro-orbital luciferin injection
Syringe 1ml BD / Fisher 14-823-434 For intraperitoneal injections
26 G x 1/2 in. needle BD / Fisher 305111 For intraperitoneal injections
4% Paraformaldehyde VWR 43368-9M CAUTION Health hazard GHS07, GHS08. For fixing tissue
Pipet-Lite Pipette, Unv. SL-200XLS+ METTLER-TOLEDO INTERNATIONAL 17014411
Mayer's Hematoxylin ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES 517-28-2
Eosin Y stain 0.25% (w/v) in 57% Fisher 67-63-0
Masson Trichrome Stain Kit IMEB Inc K7228 For masson trichrome stain to visualize collagen
Superfrost plus glass slides Fisher 1255015
6 well plate Corning C3516
Universal Mycoplasma Detection Kit ATCC 30-1012K
OCT Embedding compound ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES 62550-12 For embedding tissue for frozen sections
Leica CM3050 S Research Cryostat Leica CM3050 S To section tissue for staining analysis
Keyence All-in One Fluorescence Microscope Keyence BZ-X700
ImageJ US National Institutes of Health IJ1.46 http://rsbweb.nih.gov/ij/ download.html
Prism 7.0 for Mac OS X GraphPad Software, Inc. -
Athymic (Crl:NU(NCr)-Foxn1nu) mice Charles River NIH-553
NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) mice Jackson Laboratories 5557
B6129SF1/J mice Jackson Laboratories 101043
NIH-H2030 cells ATCC CRL-5914
368T1 generously provided by Monte Winslow (Standford University) -
PC9 cells Nguyen DX et al. Cell. 2009;138:51–62 -
H2030 BrM3 cells Nguyen DX et al. Cell. 2009;138:51–62 -

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Pre-condizionamento delle vie aeree dei topi con bleomicina aumenta l'efficienza di Orthotopic del polmone cancro Engraftment delle cellule
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Stevens, L. E., Arnal-Estapé,… More

Stevens, L. E., Arnal-Estapé, A., Nguyen, D. X. Pre-Conditioning the Airways of Mice with Bleomycin Increases the Efficiency of Orthotopic Lung Cancer Cell Engraftment. J. Vis. Exp. (136), e56650, doi:10.3791/56650 (2018).

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