Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

السيطرة المكانية والزمانية لتنشيط الخلية تي استخدام مؤثر فوتواكتيفاتابل

Published: April 25, 2018 doi: 10.3791/56655
Automatic Translation
1,2, 1
1Immunology Program, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, 2Weill-Cornell Graduate School of Medical Sciences

Summary

ويصف هذا البروتوكول أسلوب المستندة إلى تصوير لتنشيط الخلايا اللمفية تي MHC الببتيد فوتواكتيفاتابل، مما يتيح مراقبة دقيقة الزمانية المكانية لتنشيط الخلية T باستخدام.

Abstract

اللمفاويات T الانخراط في إشارات سريعة، والاستقطاب، التي تحدث في غضون دقائق بعد التنشيط تكر. وهذا يدفع تشكيل المشبك المناعية، مفترق الطرق نمطية خلية-خلية ينظم تنشيط خلية تي وتوجه يستهدف استجابات المستجيب. دراسة هذه العمليات فعالة، نهج تصوير مصمم خصيصا لالتقاط استجابات سريعة والاستقطاب اللازمة. ويصف هذا البروتوكول مثل هذا نظام، الذي يستند فوتواكتيفاتابل ببتيد-رئيسية histocompatibility معقدة (الرهن العقاري) التي غير محفزة حتى أنه يتعرض للأشعة فوق البنفسجية. ديكاجينج المستهدفة من هذا الكاشف أثناء تجارب فيديوميكروسكوبي يتيح مراقبة دقيقة الزمانية المكانية للتنشيط تكر ورصد الاستجابات الخلوية اللاحقة بالتأمل الداخلي الإجمالي (TIRF) التصوير عالية الدقة. وهذا النهج أيضا متوافقة مع استراتيجيات اضطراب الوراثية والدوائية. وهذا يسمح للجمعية العامة من المعالم المسارات الجزيئية التي تربط تكر يشير إلى تشكيل هياكل cytoskeletal الاستقطاب التي تكمن وراء المشبك المناعية.

Introduction

تي اللمفاويات (الخلايا T) تلعب دوراً مركزياً في مناعة خلوية بالاعتراف بمولده الببتيدات المعروضة في سياق سطح الخلية MHC. مستضد الاعتراف، الذي هو توسط تكر، محركات التفريق بين السذاجة تي الخلايا ويعزز تقديم استجابات السكان المستجيب عن والتواصل. مشاركة تكر يستحث أيضا تغييرات جذرية في البنية الخلوية. في غضون دقائق، جلومس الخلايا T إلى الجانب من الخلية عرض مستضد (APC)، تشكل واجهة استقطاب المعروفة باسم المشبك المناعية (ق. أ)1،2. هو يقوي التي تعالج ردود الخلية T المستجيب بتمكين الإفراج عن الاتجاه السيتوكينات، أو في حالة اللمفاويات T السامة للخلايا (CTLs)، البروتينات الحال التي تدمر APC.

مشاركة تكر بالرهن العقاري يدفع الفسفرة السريع متعددة الجزيئات محول المتلقين للمعلومات، بما في ذلك رابط "تنشيط تي" الخلايا (LAT)، الذي يعزز في نهاية المطاف إعادة عرض قوي cytoskeleton متشابك2. أكتين الخيطية القشرية (F-أكتين) محركات الأقراص خلية T تنتشر فوق سطح آسيا والمحيط الهادئ، وثم يحل في بنية حلقية تتميز بتراكم واكتين في محيط هو واستنفاد من المركز. أحكام يقترن تشكيل عصابة واكتين لإعادة توجيه مركز تنظيم microtubule (بعد، كما دعا سينتروسومي في خلايا تي) إلى موضع تحت مركز الواجهة فقط. كل الأحداث تحدث في غضون دقائق اعتراف مستضد الأولية وإنشاء السياق المعماري المستجيب وأحداث التنشيط اللاحقة التي تحدث استجابات.

دراسة تشكيل هو، طورت مختبرات مختلف النهج الذي يتم استبداله في آسيا والمحيط الهادئ على سطح زجاج الذي يحتوي على يغاندس تكر المعطل تداولها أو يدعم دهن بلير نفسه يحتوي على3،يغاندس4. وتشكل الخلايا T هو مثل جهات الاتصال على هذه الأسطح التي يمكن تصويرها بالتأمل الداخلي الإجمالي fluorescence المجهر (TIRF) أو [كنفوكل] مجهرية، تمكين الدراسات ذات الدقة العالية من أوائل تي خلية التنشيط وهو تشكيل.

على الرغم من أن هذه النهج قد سمحت لرؤية ممتازة من هو مجمع بشكل كامل، تحدث الكثير من ربط TCR:pMHC إرسال الإشارات التالية في غضون ثوان، إلى تعقيد الجهود الرامية إلى تحديد تسلسل الأحداث بعد التنشيط تكر بدقة . للالتفاف حول هذه المسألة، وضعت نهجاً فوتواكتيفيشن، التي يستخدم فيها فوتواكتيفاتابل الرهن العقاري لتحقيق الرقابة الزمانية المكانية تكر التنشيط5،،من67. في هذا النظام، يتم إرفاق الخلايا T بالواجهات الزجاجية التي تحتوي على الرهن العقاري فوتواكتيفاتابل التي غير محفزة تكر حتى المشع مع الأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية). يزيل إشعاع الأشعة فوق البنفسجية لمنطقة ميكرون الحجم من السطح أسفل الخلية T فوتوكاجي إنشاء منطقة تنشيطية يمكن التعرف عليه بواسطة الخلية T. ثم يتم رصد الأحداث إرسال الإشارات اللاحقة وإعادة عرض cytoskeletal الصحفيين الفلورسنت وراثيا المشفرة باستخدام. فوتواكتيفاتابل إصدارين من الببتيدات المستضديه، العثة السيتوكروم ج88-103 (MCC) و ovalbumin257-264 (OVA)، التي ترد في سياق الطبقة MHC ثانيا-هك والفئة الأول MHC H2-كب، على التوالي، وقد تم البلدان المتقدمة النمو (الشكل 1). وهذا يتيح تحليل CD4 كلا+ تي الخلايا المحددة للتنسيق الإداري هك (التعبير عن جيم 5 C7، 2B4، أو تكرس) و CD8+ تي الخلايا المحددة للبويضات-H2 كب (الإعراب عن تكر OT1).

على مدى العقد الماضي، قد استخدم نهج فوتواكتيفيشن وتصوير تكر إنشاء حركية دقيقة من أوائل تكر مما يشير إلى الخطوات وأيضا لتحديد المسارات الجزيئية تحكم الاستقطاب يعيد سيتوسكيليتال5، 6 , 7 , 8 , 9 , 10. على سبيل المثال، المقايسة كان مفيداً في تحديد تلك سينتروسومي إعادة توجيه نحو APC هو توسط تدرج مترجمة من diacylglycerol رسول الدهن الثانية تركزت في هو. ومن المتوقع أن تواصل هذه المنهجية أن تكون قيمة بالنسبة للتطبيقات التي تتطلب تحليل التصوير عالي الدقة للدالة T الخلية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-إعداد الأسطح الزجاجية تنشيطية

  1. معطف ثمانية آبار في غرف كوفيرجلاس مع بيوتينيلاتيد بولي-L-يسين (بيو-PLL) المخفف 1: 500 في الماء المقطر، منزوع (ddH2س). احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
  2. يغسل مع H2o.
  3. الجاف ح 2 في الرايت
  4. الكتلة الأحيائية-PLL مغلفة الأسطح مع حظر المخزن المؤقت (حبيس مخزنة المالحة [10 ملم حبيس الأس الهيدروجيني 7.4، 150 مم كلوريد الصوديوم]، مع جيش صرب البوسنة 2 ٪) لمدة 30 دقيقة في الرايت
    1. حل 5 ملغ هيدروبروميد بولي-L-يسين في 1 مل 10 مم نابو4pH 8.5.
    2. إضافة μmol 125 (0.55 ملليغرام) من دائرة الصحة الوطنية--البيوتين (من أصل 100 مغ/مل في [دمس]) والتحقق من الرقم الهيدروجيني لرد الفعل. إذا كان الرقم الهيدروجيني أقل من 8.5، إضافة 2 ميكروليتر من هيدروكسيد الصوديوم N 4 لرفعه إلى بين 8.5 و 9.5 درجة الحموضة.
    3. دوامة لمدة 30 دقيقة.
    4. إخماد رد فعل مع 50 ميكروليتر من 100 مم جليكاين حله في 20 مم تريس pH 8.0.
    5. وتدور في السلطة الكاملة لمدة 10 دقائق بنقل المادة طافية إلى أنبوب جديد.
      ملاحظة: نوعية بيو-PLL هو عادة بالمقارنة مع الأعمال التحضيرية السابقة بطلاء المسلسل شقين تخفيف المواد على صفيحة أليسا 96-جيدا والتحديد الكمي لمحتوى البيوتين بعد الحضانة مع الفوسفاتيز القلوية إلى جانب ستريبتافيدين.
  5. إزالة حجب المخزن المؤقت. لا تسمح الآبار الجافة. إضافة ستريبتافيدين (100 ميكروغرام/مل في المخزن المؤقت لحظر). احتضانها ح 1 في 4 درجات مئوية.
  6. تغسل في ميزانيات. ملء وعكس آبار دائرة الشريحة 4-5 مرات، إزالة HBS من الآبار. لا تسمح الآبار الجافة.
  7. إضافة يغاندس بيوتينيلاتيد الرهن العقاري وجزيئات الالتصاق إلى السطح.
    ملاحظة: لجنة التنسيق الإداري والبويضات يمكن أن فوتوكاجيد عن طريق إضافة اورثو نيتروبينزيل على أساس حماية المجموعات (مثلاً، نيتروفينيليثيل (NPE) أو نيتروفيراتريلوكسيكاربونيل (نفوك)) إلى مجموعة اليورو الأمينية الأساسية ليسينيس (K12 في لجنة التنسيق الإداري، K7 في البويضات). يمكن الحصول على فوتوكاجيد لجنة التنسيق الإداري والبويضات من الموردين التجاريين. بعد إعادة تشكيل في المخزن المؤقت مائي، هي ريفولديد إلى البكتريا أعرب-هك و H2-كب استخدام النهج المتبعة11،12.
  8. التحقق من صحة ببتيد لجنة التنسيق الإداري أو البويضات فوتواكتيفاتابل
    1. ديكاجي الببتيدات محمية نفوك من الأشعة فوق البنفسجية الإشعاعية بيده مصباح الأشعة فوق البنفسجية (انظر الجدول للمواد) لمدة 20 دقيقة في الرايت
    2. نبض 1.0 × 105 ناقلات الجنود المدرعة مع 1 ميكرومتر من الببتيد نونستيمولاتوري (السلبية التحكم، مثل خضاب الدم)، الإشعاع الببتيد فوتواكتيفاتابل، الببتيد فوتواكتيفاتابل المشع، ومؤثر الببتيد (مراقبة إيجابية، مثللجنة التنسيق الإداري) ل 1 (ح) بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
    3. لتحفيز خلايا تي معربا عن 5 جيم. C7/2B4/وتكر، استخدام الخلايا CH12 أو ب CH27. لتحفيز خلايا تي OT1، استخدم الجيش الملكي المغربي-s أو خلايا thymoma EL4.
    4. مزيج المصفحتين نابض بعدد متساو من خلايا تي في 96-جيدا جولة أسفل لوحات في وحدة تخزين نهائي 200 ميليلتر. احتضانها في 37 درجة مئوية ح 12-24.
    5. استرداد سوبيرناتانتس من كل بئر وتحليل إيل-2 قبل أليسا مع ستريبتافيدين-الفجل البيروكسيديز كشف اللونية.
      ملاحظة: تأكيدا لحالة كاجينج من الببتيدات جميع من اليكتروسبراي الكتلي قبل ريفولدينج إلى مجمعات MHC، ينصح بشدة.
  9. أداء قابلة للطي وتنقية MHC لتقليل التعرض للضوء. على سبيل المثال، التفاف للطي ردود الفعل في رقائق الألومنيوم والاضطلاع بهلام الترشيح اللوني مع مصباح الأشعة فوق البنفسجية قبالة.
    ملاحظة: لقد وجدت أن فوتواكتيفاتابل لجنة التنسيق الإداري هك والبويضات-H2 كب الحث على الأشعة فوق البنفسجية مستقلة تي خلية التنشيط في كثافة عالية، ربما بسبب حبس الوظيفية غير مكتملة. ومن ثم فهو المخفف الرهن فوتواكتيفاتابل إلى 10-30 العاشر الزائدة للرهن العقاري نونستيمولاتوري (مثلاً -هك المحتوية على الببتيد64-76 الهيموغلوبين (Hb)) أثناء الخطوة التثبيت. وهذا يعزز إشارة إلى نسبة الضوضاء من تجربة التصوير اللاحقة.
  10. أن فوتواكتيفاتي CD4+ تي الخلايا، جماعياً استخدام خليط من بيوتينيلاتيد هب هك (3 ميكروغرام/مل)، بيوتينيلاتيد فوتواكتيفاتابل لجنة التنسيق الإداري هك (0.1 ميكروغرام/مل)، وجسم بيوتينيلاتيد ضد الفئة أنا MHC H2-كك (0.5 ميكروغرام/ مل)-الأجسام المضادة-H2 كك تشجع جيم 5 الخلايا C7/2B4/وترينيداد، التي تعبر عن H2-كك، ينتشر على سطح الزجاج دون إخضاعها للتنشيط.
  11. ل CD8+ تي الخلايا، استخدام خليط بيوتينيلاتيد H2-دب تحمل الببتيد كافيدفاتل (1 ميكروغرام/مل)، بيوتينيلاتيد فوتواكتيفاتابل البويضات-H2 كب (0.1 ميكروغرام/مل)، والمجال خارج الخلية للجزيء الالتصاق المتكاملة-1 (2 ميكروغرام/مل تنتجها خلايا الحشرات الثقافة13). المتكاملة-1 تشجع تكوين الاتصال الوثيق بإشراك إنتغرين LFA1 على سطح الخلية T.
  12. تطبيق جميع المخاليط البروتين في المخزن المؤقت لحظر، تليها الحضانة ح 1 في الرايت أو على الأقل 2 ح في 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: الكثافة الجزيئية على الأسطح من هذا النوع أن تكون ~ 8000 كل ميكرومتر2 قد سبق تحديدها6. نظراً لأن يمثل الرهن فوتواكتيفاتابل ~1/30 ستكونال من البروتين بيوتينيلاتيد على السطح، وكثافته ~ 267 الجزيئات الواحدة ميكرومتر2، قبل ديكاجينج.
  13. أغسل كما في الخطوة 1، 6 وترك في ميزانيات حتى جاهزة للاستخدام.
  14. إضافة 200,000 CD4+ أو CD8+ تي الخلايا معربا عن تكر المناسبة في كل بئر وتسمح للخلايا الانضمام في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. بعد إرفاق الخلايا وتنتشر على السطح، أنهم على استعداد فوتواكتيفيشن والتصوير.
    ملاحظة: يرد توصيل الفيروسات التراجعية خلايا المستجيب تي مع الفلورسنت التصوير المسابير في التفصيل elswhere6،7. إشارات الكالسيوم يمكن أيضا دراسة استخدام الخلايا T أونترانسدوسيد محملة بالصبغة الحساسة الكالسيوم فلوو-46. صبغة راتيوميتريك Fura-2 غير مستحسن لأنه يتطلب الإثارة في نطاق الأشعة فوق البنفسجية، الذي يدفع أيضا ديكاجينج للرهن العقاري فوتواكتيفاتابل.

2. الحصول على الصور

  1. استخدام مجهر TIRF مقلوب تجهيزه بعدسة هدف العاشر الأشعة فوق البنفسجية 150 متوافق للحصول على الصور. الأشعة فوق البنفسجية تشعيع المناطق المعرفة من قبل المستخدم باستخدام نظام الحجاب حاجز رقمي يعلق على مصباح الزئبق W 100 (HBO). توجيه ضوء من هذا المصباح على العينة باستخدام مرآة طويلة تمرير 400 نانومتر الأشعة فوق البنفسجية.
  2. استخدام برمجيات تحليل الصورة فوتواكتيفيشن المترجمة واكتساب الوقت الفاصل. في معظم التجارب، رصد تحقيقات في قنوات الأخضر والأحمر استخدام 488 شمال البحر الأبيض المتوسط وشمال البحر الأبيض المتوسط 561 الإثارة الليزر، على التوالي. يتم توجيه ضوء الليزر على العينة باستخدام مرآة مزدوج اللون مزدوج-ممر الموجه الذي ينقل أيضا في نطاق الأشعة فوق البنفسجية (لتمكين ديكاجينج). يرجى الاطلاع على الجدول للمواد و الشكل 6 للحصول على معلومات إضافية حول تكوين المجهر.
  3. بعد تركيب الشريحة دائرة تحتوي على خلايا T، ضبط الإعدادات للحصول على الإضاءة TIRF أو ابيفلوريسسينسي، حسب الاقتضاء. في طريقة العيش، حدد حقل للخلايا التي تعرب عن probe(s) الفلورية ذات الاهتمام. إنشاء مناطق ميكرون-مقياس فوتواكتيفيشن تحت الخلايا الفردية باستخدام التحكم في البرنامج.
  4. يبدأ اكتساب الوقت الفاصل. عادة، يتم الحصول على تيميبوينتس 80، مع فاصل زمني 5 s بين كل نقطة من الزمن. وهذا يترك أكثر من ما يكفي من الوقت لمتسلسلة 488 نانومتر و 563 التعرض شمال البحر الأبيض المتوسط، وفي حالة تجارب اللون المزدوج.
  5. بعد 10 تيميبوينتس، فوتواكتيفاتي المناطق المحددة عن طريق فتح الحجاب الحاجز الرقمي مصراع ل s 1-1.5.
  6. بعد الانتهاء من الفاصل الزمني، حدد حقل جديد من الخلايا وتكرار هذه العملية.

3-بيانات التحليل

ملاحظة: فوتواكتيفيشن مترجمة من يغاندس المعطل تداولها إنشاء منطقة تنشيطية ثابتة واضحة المعالم، والتي يمكن استخدامها لتحليل كمي ليشير إلى الاستجابات والأحداث يعيد cytoskeletal. تحليل البروتوكولات وعادة ما تشمل قياس كثافة الأسفار داخل منطقة المشع أو استخدام منطقة المشع كنقطة نهاية موضعية لقياسات المسافة (مثلاً. لتقييم استقطاب سينتروسومي إلى المنطقة المشع). يرد أدناه وصف كلا البروتوكولين التحليل. يمكن استخدام مختلف برامج تحليل الصور التفاعلية لجعل كثافة وقياسات المسافة، ثم يمكن أن يكون الإخراج لمعالجة إضافية وتحليلها.

  1. كثافة الأسفار
    1. تحديد كثافة الفلورية (وأي فأي) من المنطقة الخلفية خارج الخلية (وأي فأيب). سيتم استخدام هذا لتصحيح معلومات أساسية.
      1. رسم منطقة مربعة ميكرون الحجم خارج الخلية وتجعل قناع. لتحديد شدة الأسفار، انقر فوق تحليل | قناع الإحصاءات. حدد يعني كثافة الأسفار وتصدير القيم.
        ملاحظة: تشير التفاصيل الإجرائية (مثل 3.1.1.1) لبرنامج سليديبوك (انظر الجدول للمواد). تنفيذ هذا البروتوكول باستخدام حزم البرامج الأخرى (على سبيل المثال-، فيجي) ستكون مختلفة قليلاً.
    2. تحديد أي داخل منطقة فوتواكتيفاتيد لكل نقطة في الوقت.
      1. حدد قناع لتسليط الضوء على المنطقة التي كان فوتواكتيفاتيد. لتحديد شدة الأسفار، انقر فوق تحليل | قناع الإحصاءات. حدد يعني كثافة الأسفار وتصدير القيم.
    3. قم بطرح الخلفية وأي فأي من القيم وأي فأي قياس داخل المنطقة. ثم تطبيع القياسات فأي تصحيح بقسمة المتوسط، خلفية تصحيح أي الإطارات 9 أولاً قبل فوتواكتيفيشن. ΔF/F = ((FI-FIb)/mean(FI1-9)--وأي فأيب)).
      ملاحظة: الرسم البياني ΔF/و كدالة للزمن.
  2. المسافة
    1. الحصول على x و y إحداثيات مركز منطقة فوتواكتيفاتيد.
      1. لتحديد x و y إحداثيات مركز منطقة فوتواكتيفاتيد، حدد قناع لتسليط الضوء على المنطقة التي كان فوتواكتيفاتيد. حالما يتم تسليط الضوء على منطقة فوتواكتيفيشن، حدد تحليل | قناع الإحصاءات | مركز منطقة وتصدير القيم.
    2. تحديد x و y الإحداثيات لمسبار الفلورسنت من الفائدة لكل نقطة في الوقت. ويتحقق ذلك عادة عن طريق الجسيمات اليدوية أو الآلية التي تتبع.
      1. لتحديد x و y الإحداثيات لمسبار الفلورسنت ذات الاهتمام، حدد دليل الجسيمات تتبع ثم انقر فوق المسبار الفلورسنت من الاهتمام على مر الزمن. مرة واحدة وقد تم تعقب جميع النقاط الزمنية، حدد تحليل | قناع الإحصاءات | مركز منطقة وتصدير القيم.
    3. حساب المسافة بين بروتين فلوري الاهتمام ومركز منطقة فوتواكتيفاتيد لكل مرة استخدام المعادلة: المسافة = √ ((س2-س1)2+ (ص2-ص1)2)، ×2 و y2 بإحداثيات البروتين الفلورسنت ل الفائدة و x1 وص1 هي إحداثيات مركز منطقة فوتواكتيفاتيد.
    4. الرسم البياني المسافة كدالة للزمن.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يسمح نهج فوتواكتيفيشن وتصوير للمراقبة وسهلة القياس الكمي للاستجابات الإشارات السريعة، والاستقطاب. لتوضيح قدراته، يرد هنا هو تجربة دراسة العلاقة الزمانية المكانية بين تراكم همرشولد المستحثة تكر وإعادة توجيه سينتروسومي. جيم 5 ريتروفيرالي كانت ترانسدوسيد الانفجارات الخلية C7 تي مع اثنين من الصحفيين الفلورسنت: biosensor همرشولد التي تحتوي على نطاقات C1 جنبا إلى جنب من البروتين كيناز ج-θ مرتبطة بالتجارة والنقل (C1-التجارة والنقل) وطلب تقديم العروض-tubulin لرصد في سينتروسومي. الخلايا تي تم إرفاقه ثم كوفيرجلاس غرف تحتوي على لجنة التنسيق الإداري ه فوتواكتيفاتابلك. وكان تصويرها C1-التجارة والنقل باستخدام الفحص المجهري TIRF وطلب تقديم العروض-tubulin في وضع ابيفلوريسسينسي. كما هو مبين في الشكل 2، فوتواكتيفيشن مترجمة من على السطح أسفل الخلية تي يستحث تراكم همرشولد في منطقة المشع. هذا يتبع في غضون ثوان قبل إعادة توجيه سينتروسومي إلى نفس المنطقة.

يمكن تحديده كمياً تراكم C1-التجارة والنقل عن طريق حساب كثافة طبيعية الأسفار، بعد تصحيح الخلفية، في مركز منطقة فوتواكتيفاتيد على مر الزمن (الشكل 3). إعادة توجيه centrosome ردا على فوتواكتيفيشن يمكن قياسها كمياً بحساب المسافة بين سينتروسومي ومركز منطقة فوتواكتيفاتيد كدالة للزمن (الشكل 4).

يمكن استخدام هذا الأسلوب لدراسة طائفة واسعة من الاستجابات الإشارات السريعة، والاستقطاب، أساسا أي شيء يمكن رصدها باستخدام مجس فلورسنت. على سبيل المثال، يستخدم فوتواكتيفيشن تكر لرصد مطلع تشكيل ميكروكلوستير مما يشير إلى استخدام Grb2 المسمى فلوريسسينتلي (Grb2-التجارة والنقل) (الشكل 5). مماثلة لتراكم همرشولد والردود إعادة توجيه سينتروسومي، Grb2-التجارة والنقل الاستقطاب يحدث بعد وقت قصير من فوتواكتيفيشن (الشكل 5)، ويمكن قياسها كمياً باستخدام نهج كثافة fluorescence تطبيع.

Figure 1
الشكل 1: نظام فوتواكتيفيشن باستخدام الببتيد فوتوكاجيد لجنة التنسيق الإداري.
(أ) استراتيجية فوتوكاجيد الببتيد لجنة التنسيق الإداري. مجموعة NPE موصولة إلى بقايا يسين من الببتيد لجنة التنسيق الإداري. إشعاع الأشعة فوق البنفسجية يؤدي إزالة NPE، استعادة التنسيق الإداري إلى شكلها الأصلي. (ب) عندما NPE منضماً إلى لجنة التنسيق الإداري، جيم 5 لا يمكن ربط تكر C7 إلى لجنة التنسيق الإداري. يؤدي إزالة NPE اعترافاً على جيم 5 تكر C7 إلى الببتيد لجنة التنسيق الإداري الأصلي. (ج) قد تم تكييف استراتيجية فوتوكاجيد للعمل مع خلايا CD8 + "تي"، التي يستخدم فيها فوتوكاجيد البويضات الببتيد لتنشيط "تكر" OT-1 عند إشعاع الأشعة فوق البنفسجية.

Figure 2
الشكل 2: الوقت الفاصل بين المونتاج همرشولد توجيه التكديس وسينتروسومي عقب فوتواكتيفيشن تكر في 5 جيم. الخلية C7 تي.
جيم 5 معربا عن بيوسينسور همرشولد، تتضمن جنبا إلى جنب C1-النطاقات PKC-تنصهر للتجارة والنقل (C1-التجارة والنقل) و Tubulin العلامة-طلب تقديم العروض (RFP-الحوض)، مراسل نيون سينتروسومي الخلية C7. المونتاج توضيح رد الاستقطاب 5 جيم. خلايا C7 T مع مرور الوقت. البيضاوي الأصفر والنص تشير إلى الوقت والمكان من فوتواكتيفيشن. مع مرور الوقت، يتراكم C1-التجارة والنقل في منطقة فوتواكتيفاتيد، تليها إعادة توجيه سينتروسومي نحو المنطقة فوتواكتيفاتيد. شريط الحجم: 10 ميكرون.

Figure 3
الشكل 3: القياس الكمي لتراكم همرشولد في منطقة فوتواكتيفاتيد
يمكن تحديده كمياً تراكم همرشولد، C1-التجارة والنقل، في منطقة فوتواكتيفاتيد (إلى اليسار) بحساب كثافة طبيعية الأسفار، بعد تصحيح الخلفية، وفي منطقة فوتواكتيفاتيد (دائرة صفراء مع تظليل أزرق) مع مرور الوقت. يتم تطبيع البيانات بالنسبة للإطارات التسعة التي تم الحصول عليها من قبل فوتواكتيفيشن. يمكن حساب إثراء C1-التجارة والنقل في منطقة فوتواكتيفاتيد بتقسيم شدة الأسفار يعني في منطقة المشع بشدة الأسفار يعني الخلية بأكملها، بعد تصحيح الخلفية. المعادلة: ΔF/F = ((FI-FIb)/mean(FI1-9)--وأي فأيب))، وفي فيه وأي فأي هو كثافة fluorescence يعني، يمكن استخدامها لحساب كثافة طبيعية الأسفار. يمكن رسوم بيانية كثافة fluorescence طبيعية في منطقة فوتواكتيفاتيد ثم كدالة للزمن (يمين). الخط الأرجواني يشير إلى وقت فوتواكتيفيشن. شريط الحجم: 10 ميكرون.

Figure 4
الشكل 4: القياس الكمي لإعادة توجيه سينتروسومي.
تحديد إحداثيات centrosome (RFP-الحوض) مع مرور الوقت عن طريق تتبع المسار centrosome تجاه منطقة فوتواكتيفاتيد (السهم الأبيض) عند كل نقطة من نقاط الوقت (يسار) يدوياً. تحديد إحداثيات مركز منطقة فوتواكتيفاتيد (دائرة صفراء). يمكن حساب المسافة بين سينتروسومي ومركز منطقة فوتواكتيفاتيد عند كل نقطة الوقت باستخدام المعادلة للمسافة = √ ((س2-س1)2+ (ص2-ص1)2)، الذي x2 و y 2 x وهي الإحداثيات y لمركز منطقة سينتروسومي، و x1 وص1 x و y إحداثيات مركز منطقة فوتواكتيفاتيد. مسافة سينتروسومي من مركز منطقة فوتواكتيفاتيد في كل وقت نقطة يمكن ثم رسوم بيانية كدالة للزمن (يمين). الخط الأرجواني يشير إلى وقت فوتواكتيفيشن. شريط الحجم: 10 ميكرون.

Figure 5
الشكل 5: تكوين ميكروكلوستير Grb2-التجارة والنقل.
(أ) ممثل 5 جيم. تسمية الخلية C7 معربا عن فلوريسسينتلي Grb2 (Grb2-التجارة والنقل). المونتاج توضيح رد الاستقطاب الإضافي Grb2-التجارة والنقل. البيضاوي الأصفر والنص تشير إلى الوقت والمكان من فوتواكتيفيشن. مع مرور الوقت، يتراكم Grb2-التجارة والنقل في منطقة فوتواكتيفاتيد. (ب) التحديد الكمي لشدة الأسفار Grb2-التجارة والنقل في منطقة فوتواكتيفاتيد على مر الزمن. N = 15 الخلايا. (ج) التحديد الكمي لشدة الأسفار Grb2-التجارة والنقل في منطقة تحكم خارج منطقة فوتواكتيفاتيد. N = 15 الخلايا.

Figure 6
الشكل 6: تكوين مجهر فوتواكتيفيشن وتصوير TIRF.
488 نانومتر و 561 نانومتر الليزر تستخدم TIRF وتصوير ابيفلوريسسينسي من المسابر الأخضر والأحمر، على التوالي. الأشعة فوق البنفسجية الخفيفة فوتواكتيفيشن مأخوذ من مصباح الزئبق (Hg) تعلق على الحجاب حاجز رقمي نظام قادر على إنارة المناطق الصغيرة، والمعرفة من قبل المستخدم. ينعكس الضوء من المصباح Hg/الحجاب الحاجز على العينة مرآة الفلترات المتمركزة تحت مزدوج اللون مرآة تعكس أشعة الليزر التصوير. يجب أن تصمم مرآة مزدوج اللون لتمرير الأشعة فوق البنفسجية الخفيفة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وفي السنوات الأخيرة، برز الضوء كأداة ممتازة للتنشيط التي تسيطر عليها سباتيوتيمبورالي من العمليات الخلوية. قد وضعت منهجيات مختلفة، مع كل المزايا المرتبطة بها وعيوب. النظام المذكور هنا، الذي يستند إلى ديكاجينج يغاندس المعطل تداولها، خارج الخلية، مثاليا لتحليل استجابات إرسال الإشارات السريعة، سوبسيلولار، والاستقطاب. قد تم تطبيق هذا النهج على دراسة تشكيل هو في خلايا T كما هو موضح أعلاه. بالإضافة إلى ذلك، يغاندس محبوس لمستقبلات أخرى قد تم إجراء هندسة عكسية، تمكننا من تطبيق نفس الاستراتيجية لتقييم الإشارات المثبطة في خلايا القتل الطبيعية والنووية إزفاء عامل النسخ نف κB استجابة عدد القتلى مثل مستقبلات مما يشير إلى14،15.

في هذا البروتوكول، وهي معطلة يغاندس تنشيطية ضمان أن تبقى كمصدر ثابت، والاستقطاب للتحفيز لمدة تجربة التصوير. وهذا النهج مناسبة تماما لإجراء دراسات لاستقطاب الخلية. ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن نهج فوتواكتيفيشن تكر تكييفها بسهولة للتنشيط التي تسيطر عليها وقتيا T الخلية على بيلاييرس الدهن المعتمدة. ومن الواضح أن لا يمكن للمرء أن يحقق التحفيز المستمر، والاستقطاب في هذا السياق. ومع ذلك، وهذا قد لا يكون ضروريا، نظراً لأهداف تجريبية.

هذا النظام أيضا مرنة جداً فيما يتعلق بمصدر ضوء الأشعة فوق البنفسجية ديكاجينج. حاليا، يستخدم مصباح زئبق W 100 لإضاءة مركزة، إلا أن ليزر نيتروجين نابض (ns العرض 4 نبض, نبض الطاقة 120 مللي جول)، المستخدمة سابقا6. في بعض الأحيان، مصباح الأشعة فوق البنفسجية يده (365 نانومتر، 4 ث) تم وضع على عينة التصوير بغية ديكاجي مناطق أكبر ليجند فوتوستيمولاتابل. السمات المحددة للنظام ديكاجينج سيتوقف في كل حالة على حدة على المتطلبات التقنية للتجربة في السؤال.

عند تنفيذ هذا النظام، من المهم التأكد من أن الاستجابات الملاحظة المحددة لهذا الحدث فوتواكتيفيشن، وليس نتيجة لتنشيط مستقبلات زائفة أو د المستحثة بالأشعة فوق البنفسجية. لاستبعاد هذه التحف، يمكن إجراء عنصري تحكم خصوصية. أولاً، يمكن رصد كثافة fluorescence في الخلايا التي هي غير المشعع مباشرة أثناء تجارب فوتواكتيفيشن. إذا كان السطح محبوس بشكل صحيح، وملموسة ينبغي مراعاة الردود في هذه الخلايا لا (على سبيل المثال، الرقم 5). وثانيا، يمكن إجراء التجارب في أي تي خلايا المشع الأشعة فوق البنفسجية على الأسطح التي تفتقر إلى فوتواكتيفاتابل يغاندس. عنصر التحكم هذا أمر حاسم لتحديد الآثار الناجمة عن الأشعة فوق البنفسجية مستقلة ليجند فوتواكتيفاتابل (على سبيل المثال، راجع مرجع 6). خلال نظام التحسين، كما أنها مفيدة للغاية يكون في متناول اليد ردا قويا من خلوية تصوير (مثلاً، Grb2-بروتينات فلورية خضراء التوظيف) التي سريعة والمترجمة على حد سواء. تقييم الارتباطات بين الأحداث إرسال الإشارات وفوتواكتيفيشن أكثر وضوحاً إذا كانت تلك الأحداث سباتيوتيمبورالي الدانية لتحفيز مستقبلات.

على الرغم من أن هذا النهج فوتواكتيفيشن عروض رائعة السيطرة مستقبلات الإشارات الزمانية المكانية، فإنه يفتقر إلى التكيف تتيحها أوبتوجينيتيك ترانسفيكتابل نظم16،،من1718،19 20، ،،من2122. وهي أيضا بعض البروتينات أوبتوجينيتيك فوتوريفيرسيبلي، توفير مراقبة الشرطي الذي لا يتوفر مع النهج فوتواكتيفيشن الموصوفة هنا. في أنظمة أوبتوجينيتيك، تقييد نشر فوتواكتيفاتيد البروتينات غير تحديا من الناحية التقنية. وهذا يزيد من تعقيد تحليل الإشارات المستقطبة، لا سيما في سياق سوبسيلولار.

واحد ينبغي أن نلاحظ أيضا أن الكيان الانخراط في هذا النظام فوتواكتيفيشن هو سطح زجاج، الذي لا يمكن أن الخص جميع جوانب التفاعل الحقيقيين خلية خلية. للالتفاف حول هذه المسألة مع الحفاظ على مراقبة الزمانية المكانية لإشارة البدء، استخدمت محققين نظام فخ بصري لجلب APC اتصال مع خلية "T"، مما يسمح لظهور ترتيبات جديدة سيتوسكيليتال والنضج هو أن تكون تصور في الوقت الحقيقي23. على الرغم من أن هذا النظام يتيح بدء دقيقة والتصور لديناميكية cytoskeletal استخدام APC الفعلية، أن الإنتاجية منخفضة نسبيا وغير متوافق مع TIRF الإضاءة، مما يؤثر سلبا على جودة الصورة.

وفي الختام، الأسلوب الموصوفة في هذا البروتوكول يوفر تحكماً الزمانية المكانية المستحثة تكر إشارات داخل الخلية T، ويسمح في نهاية المطاف لتوضيح التغييرات البيوكيميائية سريع بعد التنشيط تكر. ويوفر لنا هذا النظام وسيلة فهم أفضل لكيفية تعزيز الأحداث إرسال الإشارات التي أعقبت التنشيط تكر الاستقطاب خلية T وهو تشكيل، وفي نهاية المطاف تقديم استجابات المستجيب.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

ونشكر أعضاء المختبر هوس لتقديم المشورة والمساعدة. تدعمها الولايات المتحدة المعاهد الوطنية للصحة (R01-AI087644 إلى M.H.) و P30-CA008748 إلى مركز سلون كيترينج التذكاري للسرطان.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass Thermofischer Scientific 155361
Poly-L-lysine hydrobromide Sigma-Aldrich P2636 Will need to make Biotinylated Poly-L-Lysine
EZ-Link NHS-Biotin Thermofischer Scientific 20217 Will need to make Biotinylated Poly-L-Lysine
Streptavidin Thermofischer Scientific 434301
BirA-500: BirA biotin-protein ligase standard reaction kit Avidity BirA500 Will be used to biotinylate proteins
Biotinylated Hb I-EK  For protein folding, see reference 6. For biotinylation, use BirA kit
Biotinylated NPE-MCC I-EK  Anaspec Custom NPE-MCC (H-ANERADLIAYL-K(Nvoc)-QATK-OH) can be purchased from Anaspec
Biotinylated αH2-Kk antibody BD Biosciences 553591
Biotinylated NPE-OVA H2-Kb Anaspec Custom NPE-OVA (H-SIINFE-K(Nvoc)-L-OH) can be purchased from Anaspec
Biotinylated KAVY H2-Db  Anaspec Custom synthesized protein (KAVYDFATL) can be purchased from Anaspec
Biotinylated ICAM1  For protein folding, see reference in protocol. For biotinylation, use BirA kit
Hand held UV lamp UVP UVGL-25 Lamp is held < 1 cm from the sample.  30 s of 365 light is sufficient for detectable decaging, 20 min for quantitative decaging.
Olympus IX-81 OMAC TIRF system. Olympus Additional information about the imaging system can be found in Figure 6
Mosaic digital diaphragm Andor
Slidebook software Intelligent Imaging Innovations

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dustin, M. L., Chakraborty, A. K., Shaw, A. S. Understanding the structure and function of the immunological synapse. Cold Spring Harb.Perspect.Biol. 2, a002311 (2010).
  2. Liu, X., Huse, M. Immunological Synapse Formation: Cell Polarity During T Cell-APC Interaction. Cell Polarity 1. , 247-275 (2015).
  3. Bunnell, S. C., Kapoor, V., Trible, R. P., Zhang, W., Samelson, L. E. Dynamic actin polymerization drives T cell receptor-induced spreading: A role for the signal transduction adaptor LAT. Immunity. 14, 315-329 (2001).
  4. Dustin, M. Insights into Function of the Immunological Synapse from Studies with Supported Planar Bilayers. Current topics in microbiology and immunology. 340, (2010).
  5. Chauveau, A., Le Floc'h, A., Bantilan, N. S., Koretzky, G. a, Huse, M. Diacylglycerol kinase α establishes T cell polarity by shaping diacylglycerol accumulation at the immunological synapse. Sci. Signal. 7, ra82 (2014).
  6. Huse, M., et al. Spatial and Temporal Dynamics of T Cell Receptor Signaling with a Photoactivatable Agonist. Immunity. 27, 76-88 (2007).
  7. Quann, E. J., Merino, E., Furuta, T., Huse, M. Localized diacylglycerol drives the polarization of the microtubule-organizing center in T cells. Nat Immunol. 10, 627-635 (2009).
  8. Basu, R., Chen, Y., Quann, E. J., Huse, M. The variable hinge region of novel PKCs determines localization to distinct regions of the immunological synapse. PLoS One. 9, 1-8 (2014).
  9. Liu, X., Kapoor, T. M., Chen, J. K., Huse, M. Diacylglycerol promotes centrosome polarization in T cells via reciprocal localization of dynein and myosin II. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 11976-11981 (2013).
  10. Quann, E. J., Liu, X., Altan-Bonnet, G., Huse, M. A cascade of protein kinase C isozymes promotes cytoskeletal polarization in T cells. Nat. Immunol. 12, 647-654 (2011).
  11. Boniface, J. J., Reich, Z., Lyons, D. S., Davis, M. M. Thermodynamics of T cell receptor binding to peptide-MHC: evidence for a general mechanism of molecular scanning. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 11446-11451 (1999).
  12. Garboczi, D. N., Hung, D. T., Wiley, D. C. HLA-A2-peptide complexes: refolding and crystallization of molecules expressed in Escherichia coli and complexed with single antigenic peptides. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 3429-3433 (1992).
  13. Huse, M., Lillemeier, B. F., Kuhns, M. S., Chen, D. S., Davis, M. M. T cells use two directionally distinct pathways for cytokine secretion. Nat. Immunol. 7, 247-255 (2006).
  14. Abeyweera, T. P., Merino, E., Huse, M. Inhibitory signaling blocks activating receptor clustering and induces cytoskeletal retraction in natural killer cells. J. Cell Biol. 192, 675-690 (2011).
  15. Nguyen Duc, T., Huse, M. A Generalizable Platform for the Photoactivation of Cell Surface Receptors. ACS Chem. Biol. 10, 2435-2440 (2015).
  16. Airan, R. D., Thompson, K. R., Fenno, L. E., Bernstein, H., Deisseroth, K. Temporally precise in vivo control of intracellular signalling. Nature. 458, 1025-1029 (2009).
  17. Xu, Y., et al. Optogenetic control of chemokine receptor signal and T-cell migration. Proc. Natl. Acad. Sci. 111, 6371-6376 (2014).
  18. Levskaya, A., Weiner, O. D., Lim, W. A., Voigt, C. A. Spatiotemporal control of cell signalling using a light-switchable protein interaction. Nature. 461, 997-1001 (2009).
  19. Guntas, G., et al. Engineering an improved light-induced dimer (iLID) for controlling the localization and activity of signaling proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. 112, 112-117 (2015).
  20. Wu, Y. I., et al. A genetically encoded photoactivatable Rac controls the motility of living cells. Nature. 461, 104-108 (2009).
  21. Pathak, G. P., Vrana, J. D., Tucker, C. L. Optogenetic control of cell function using engineered photoreceptors. Biol. cell/under auspices Eur. Cell Biol. Organ. 105, 59-72 (2014).
  22. Grusch, M., et al. Spatio-temporally precise activation of engineered receptor tyrosine kinases by light. EMBO J. 33, 1713-1726 (2014).
  23. Yi, J., et al. Centrosome repositioning in T cells is biphasic and driven by microtubule end-on capture-shrinkage. J. Cell Biol. 202, 779-792 (2013).

Tags

علم المناعة والعدوى، العدد 134، لمفاوية T، مستقبلات خلية تي (تكر)، توصيل الإشارة، قطبية الخلية، Centrosome، والكيمياء الضوئية، مجمع Histocompatibility الرئيسية (الرهن العقاري)، Centrosome، الانعكاس الداخلي الكلي مجهرية (TIRF)، علم المناعة، والخلية علم الأحياء
السيطرة المكانية والزمانية لتنشيط الخلية تي استخدام مؤثر فوتواكتيفاتابل
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sanchez, E., Huse, M. Spatial and… More

Sanchez, E., Huse, M. Spatial and Temporal Control of T Cell Activation Using a Photoactivatable Agonist. J. Vis. Exp. (134), e56655, doi:10.3791/56655 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter