Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine Imaging-basierte Methode zur Aktivierung der T-Lymphozyten mit Photoactivatable Peptid-MHC, ermöglicht präzise räumlich-zeitliche Steuerung der T-Zell-Aktivierung.
Abstract
T-Lymphozyten engagieren sich in schnellen, polarisierte Signale, tritt innerhalb von Minuten nach der Aktivierung des TCR. Dies induziert Bildung der immunologischen Synapse, eine stereotype Zell-Zell-Kreuzung, die T-Zell-Aktivierung reguliert und direktional richtet sich an Effektor Antworten. Um diese Prozesse effektiv zu studieren, ist ein bildgebender Ansatz, der zugeschnitten ist zur Erfassung schneller, polarisierter Antworten notwendig. Dieses Protokoll beschreibt ein solches System, basiert auf einer Photoactivatable Peptid-Major Histocompatibility complex (pMHC), das nicht-stimulierende bis UV-Licht ausgesetzt ist. Gezielte decaging von diesem Reagens während Videomicroscopy Experimente ermöglicht präzise räumlich-zeitliche Steuerung der TCR-Aktivierung und hochauflösende Überwachung der anschließende zelluläre Reaktionen der Totalreflexion (TIRF) imaging. Dieser Ansatz ist auch kompatibel mit genetischen und pharmakologischen Störung Strategien. Dies ermöglicht die Montage von klar definierten Molekulare Signalwege, die TCR-Signalisierung link zur Bildung der polarisierten Zellskelett Strukturen, die die immunologische Synapse zugrunde liegen.
Introduction
T-Lymphozyten (T-Zellen) spielen eine zentrale Rolle in der zellulären Immunität durch das erkennen Antigene Peptide, die im Rahmen der Zelloberfläche MHC angezeigt. Antigen-Anerkennung, die durch die TCR vermittelt wird, treibt die Differenzierung der naiven T-Zellen und fördert die Lieferung der Zytolyse und kommunikative Reaktionen der Effektor Populationen. TCR Engagement induziert auch dramatische Veränderungen in der zellulären Architektur. Innerhalb von Minuten die T-Zellen gloms auf der Seite der Antigen-präsentierenden Zelle (APC), bilden eine polarisierte Schnittstelle bekannt als der immunologischen Synapse (IS)1,2. Der IS potenziert T-Zell-Effektor-Reaktionen durch die Aktivierung der direktionalen Freisetzung von Zytokinen oder, im Falle von zytotoxischen T-Lymphozyten (CTLs), lytische Proteine, die die APC zerstören.
TCR Engagement von pMHC induziert die schnelle Phosphorylierung mehrere nachgeschaltete Adapter Moleküle, einschließlich Linker für die Aktivierung von T-Zellen (LAT), die letztlich fördert robuste Umgestaltung der synaptischen cytoskelett2. Kortikale filamentösen Aktin (F-Aktin) treibt T Zelle auf der APC-Oberfläche verteilt und löst sich dann in eine ringförmige Struktur zeichnet sich durch F-Aktin-Ansammlung an der Peripherie IS und Erschöpfung von der Mitte. F-Aktin Ringbildung ist eng an die Neuausrichtung der Mikrotubuli organisierenden Zentrum (MTOC, auch genannt die Centrosome in T-Zellen) an eine Position unterhalb der Mitte der Schnittstelle gekoppelt. Beide Veranstaltungen auftreten innerhalb von Minuten der erste Antigen-Anerkennung und den architektonischen Kontext, in dem nachfolgenden Aktivierung Veranstaltungen, den und Effektor Reaktionen auftreten, zu etablieren.
Um IS Bildung zu untersuchen, haben verschiedene Labors Ansätze entwickelt, in denen die APC durch eine Glasoberfläche, die ersetzt wird entweder immobilisierte Liganden TCR enthält oder ein Lipid Bilayer unterstützt, dass selbst die Liganden3,4enthält. T-Zellen bilden IS-ähnliche Kontakte auf diesen Flächen, die durch Totalreflexion Fluoreszenzmikroskop (TIRF) oder konfokalen Mikroskopie, hochauflösende Studien der frühen T-Zellaktivierung und IS Bildung abgebildet werden können.
Obwohl diese Ansätze für ausgezeichnete Visualisierung des fertig montierten IS erlaubt haben, tritt ein Großteil der Signalisierung folgende TCR:pMHC Ligatur innerhalb von Sekunden, erschweren die Bemühungen um die Abfolge der Ereignisse nach TCR Aktivierung genau bestimmen . Um dieses Problem zu umgehen, wurde ein photoaktivierungen Konzept entwickelt, in denen verwendet wird Photoactivatable pMHC, räumlich-zeitliche Kontrolle der TCR Aktivierung5,6,7zu erreichen. In diesem System sind T-Zellen Glasflächen mit Photoactivatable pMHC, die nicht-stimulierende, TCR bis Bestrahlung mit ultraviolettem (UV) Licht ist beigefügt. UV-Bestrahlung ein Mikrometer großen Bereich der Oberfläche unter der T-Zelle entfernt die Photocage schaffen eine anregende Zone, die von der T-Zellen erkannt werden kann. Ereignisse nach dem Bilanzstichtag Signalisierung und Zytoskeletts Umbau werden dann durch genetisch codierte fluoreszierende Reporter überwacht. Zwei Photoactivatable Versionen von Antigenen Peptide, Motte Cytochrom C88-103 (MCC) und Ovalbumin257-264 (OVA), die im Zusammenhang mit der Klasse II MHC-Ek und die Klasse ich MHC H2-Kb, bzw. vorgestellt werden, wurden entwickelt (Abbildung 1). Dies ermöglicht die Analyse der beiden CD4+ T-Zellen spezifisch für MCC-I-E-k (mit dem Ausdruck der 5 C. C7, 2B4, oder AND TCR) und CD8+ T-Zellen spezifisch für OVA-H2-Kb (mit dem Ausdruck der OT1 TCR).
Im letzten Jahrzehnt ist der TCR photoaktivierungen und Imaging-Ansatz, die präzise Kinetik der frühen TCR Signalisierung Schritte zu etablieren und zu identifizieren, die molekulare Wege polarisiert Zellskelett Umbau5, EZB verwendet worden 6 , 7 , 8 , 9 , 10. beispielsweise der Test war maßgeblich bei der Bestimmung, dass Centrosome Neuorientierung in Richtung der APC wird durch eine lokalisierte Steigung von Lipid zweite Bote Diacylglycerol zentriert auf den IS vermittelt. Es wird erwartet, dass diese Methodik wird weiterhin wertvoll für Anwendungen, die hochauflösenden bildgebenden Analyse des T-Zellfunktion zu fordern.
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Protocol
1. Vorbereitung der stimulierende Glasflächen
- Mantel acht Brunnen gekammert Deckglas mit biotinylierte Poly-L-Lysin (Bio-PLL) verdünnt 1: 500 in destilliertem, entionisiertem Wasser (DdH2O). Inkubieren Sie für 30 min bei Raumtemperatur (RT).
- Waschen Sie mit H2O.
- Dry für 2 h bei RT.
- Block Bio-PLL beschichtete Oberflächen mit blockierenden Puffer (HEPES gepufferten Kochsalzlösung [10 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl], mit 2 % BSA) für 30 min bei RT
- Lösen Sie 5 mg Poly-L-Lysin Hydrobromide in 1 mL 10 mM NaPO4, pH 8,5.
- Fügen Sie 125 μmol (0,55 mg) von NHS-Biotin hinzu (aus einer 100 mg/mL Brühe in DMSO) und überprüfen Sie den pH-Wert der Reaktion. Liegt der pH-Wert unter 8,5, fügen Sie 2 μL 4 N NaOH, um zwischen pH 8,5 und 9,5 zu erhöhen.
- Vortex für 30 Minuten.
- Die Reaktion mit 50 μL der 100 mM Glycin in 20 mM Tris pH 8.0 aufgelöst zu stillen.
- Bei voller Leistung für 10 min drehen und den überstand auf einen neuen Schlauch übertragen.
Hinweis: Bio-PLL-Qualität ist in der Regel im Vergleich zu bisherigen Vorbereitungen durch Beschichtung zweifache Verdünnungsreihen des Materials auf einer 96-Well-ELISA-Platte und Quantifizierung von Biotin Inhalt nach Inkubation mit alkalischer Phosphatase Streptavidin gekoppelt.
- Blockierende Puffer zu entfernen. Lassen Sie sich nicht Brunnen trocken. Fügen Sie Streptavidin (100 µg/mL in blocking-Puffer). 1 h bei 4 ° c inkubieren
- Waschen Sie in HBS. Füllen Sie und invertieren Sie Kammer Folie Brunnen 4-5mal, HBS aus dem Brunnen zu entfernen. Lassen Sie sich nicht Brunnen trocken.
- Fügen Sie die biotinylierte pMHC Liganden und Adhäsionsmoleküle an die Oberfläche.
Bemerkung: MCC und Eizellen kann Photocaged durch Zugabe von ortho-Nitrobenzyl Basis Schutzgruppen (z. B. Nitrophenylethyl (NPE) oder Nitroveratryloxycarbonyl (SVOC)) an die ε-Aminogruppe des wichtigsten Lysines (K12 im MCC, K7 in OVA). Photocaged MCC und OVA erhalten Sie von kommerziellen Anbietern. Nach der Rekonstitution in wässrigen Puffer sind sie in bakteriell ausgedrückt-Ek und H2-Kb mit etablierten Ansätzen11,12refolded. - Validierung von Photoactivatable MCC oder Eizellen Peptid
- Decage Peptide SVOC-geschützt durch UV Bestrahlung mit einer UV-Lampe handheld (siehe Tabelle der Materialien) für 20 min bei RT
- Pulse 1.0 x 105 APCs mit 1 µM nonstimulatory Peptid (negative Kontrolle, z.B. Hb), unbestrahlten Photoactivatable Peptid, bestrahlten Photoactivatable Peptid und Agonist Peptid (Positivkontrolle, z.B., MCC) für 1 h bis über Nacht bei 37 ° C.
- Förderung der T-Zellen, die mit dem Ausdruck der 5 C. C7/2B4/und TCR, Verwendung CH12 oder CH27 B-Zellen. Um OT1 T-Zellen zu stimulieren, verwenden Sie RMA-s oder EL4 Thymom Zellen.
- Mischen Sie die gepulste APCs mit einer gleichen Anzahl von T-Zellen in 96-Well Runde Bodenplatten zu einem Endvolumen von 200 µL. Inkubation bei 37 ° C für 12-24 h.
- Die Überstände von jedes gut erholen und IL-2 von ELISA mit Streptavidin-Meerrettich Peroxidase farbmetrischen Erkennung zu analysieren.
Hinweis: Bestätigung des festsetzende Status alle Peptide durch Electrospray Massenspektrometrie vor umfaltung in MHC-komplexe, wird dringend empfohlen.
- Führen Sie die Faltung und Reinigung der MHC Lichteinwirkung zu minimieren. Zum Beispiel Falten Reaktionen in Alufolie wickeln und Gel Filtration Chromatographie mit der UV-Lampe aus durchführen.
Hinweis: Es hat sich herausgestellt, dass Photoactivatable MCC-I-Ek und OVA - H2-Kb induzieren UV-unabhängige T-Zell-Aktivierung in hoher Dichte, möglicherweise aufgrund von unvollständigen funktionellen Käfighaltung. Daher wird die Photoactivatable pMHC in einer 10-30 X Überschreitung des nonstimulatory pMHC (z. B. -Ek , enthalten das Hämoglobin64-76 Peptid (Hb)) während der Ruhigstellung Schritt verdünnt. Dies verbessert das Signal Rauschabstand des nachfolgenden bildgebenden Experiments. - Zu Photoactivate CD4+ T Zellen, gemeinsam verwenden eine Mischung aus biotinylierte Hb-I-Ek (3 µg/mL), biotinylierte Photoactivatable MCC-I-E-k (0,1 µg/mL) und biotinylierte Antikörper gegen die Klasse ich MHC H2-Kk (0,5 µg / mL). der Antikörper Anti-H2-Kk fördert 5 C. C7/2B4/und T-Zellen, die H2-Kk, um auf die Glasoberfläche zu verbreiten, ohne Aktivierung zum Ausdruck bringen.
- Für CD8+ T Zellen, verwenden Sie eine Mischung aus biotinylierte H2-Db trägt das Peptid KAVYDFATL (1 µg/mL), biotinylierte Photoactivatable OVA-H2-Kb (0,1 µg/mL), und der extrazellulären Domäne des das Adhäsionsmolekül ICAM-1 (2 µg/mL produziert von Insekten Zelle Kultur13). Die ICAM-1 fördert enge Kontakt Bildung durch die Gewinnung der Integrin LFA1 auf der T-Zell-Oberfläche.
- Gelten Sie alle Protein-Mischungen in blockierende Puffer, gefolgt von Inkubation für 1 h bei RT oder mindestens 2 h bei 4 ° C.
Hinweis: Die molekulare Dichte auf Oberflächen dieser Art zu ~ 8000 pro µm2 wurde zuvor ermittelte6. Da die Photoactivatable pMHC ~1/30 darstellt werdenth biotinylierte Protein auf der Oberfläche, seine Dichte ~ 267 Moleküle pro µm2, vor decaging. - Waschen Sie wie in Schritt 1.6 und in HBS erst unmittelbar vor Gebrauch.
- Fügen Sie 200.000 CD4+ oder CD8+ T Zellen, mit dem Ausdruck der entsprechenden TCR in jede Vertiefung und lassen Zellen bei 37 ° C für 15 min einhalten. Sobald Zellen befestigt und auf der Fläche verteilt haben, sind sie bereit für photoaktivierungen und Imaging.
Hinweis: Retrovirale Transduktion von T-Effektorzellen mit fluoreszierenden bildgebende Sonden wird im Detail Elswhere6,7beschrieben. Kalzium-Signalisierung kann auch mit untransduced T-Zellen geladen mit dem Kalzium sensibler Farbstoff Fluo-46untersucht werden. Der ratiometrischen Farbstoff Fura-2 ist nicht empfehlenswert, weil es Erregung im UV-Bereich erfordert, die auch induziert decaging von Photoactivatable pMHC.
2. die Bildaufnahme
- Verwenden Sie einem inversen TIRF-Mikroskop mit einem UV kompatibel 150 X Objektiv für die Bildaufnahme ausgestattet. UV bestrahlen benutzerdefinierte Regionen mit einer digitalen Membran-System angeschlossen, um ein 100 W-Quecksilber-Lampe (HBO). Direkte UV-Licht von dieser Lampe auf die Probe mit einem 400 nm langen Pass Spiegel.
- Verwenden Sie Bildanalyse-Software für lokalisierte photoaktivierungen und Zeitraffer Erwerb. In den meisten Experimenten überwachen Sonden in den grünen und roten Kanälen mit 488 nm und 561 nm Anregung Laser, beziehungsweise. Laserlicht ist gerichtet auf die Probe mit einem Dual-Bandpass dichroitischen Spiegel, der auch im UV-Bereich (um decaging ermöglichen) überträgt. Weitere Informationen auf mikroskopkonfiguration finden Sie in der Tabelle der Werkstoffe und Abbildung 6 .
- Passen Sie nach der Montage der Kammer-Folie mit der T-Zellen Einstellungen an, um TIRF oder Epifluoreszenz-Beleuchtung, wie nötig zu erhalten. Wählen Sie im live-Modus einen Bereich von Zellen, die die fluoreszierenden Wortanzahl von Interesse zum Ausdruck bringen. Mikron-Skala Regionen für photoaktivierungen unter Einzelzellen mit Softwaresteuerung zu etablieren.
- Beginnen Sie Time-Lapse Erwerb. In der Regel 80 Zeitpunkten erworben werden, mit einem Intervall von 5 s zwischen jeden Zeitpunkt. Somit bleibt mehr als genug Zeit für sequentielle 488 nm und 563 nm Expositionen bei dual Farbe Experimente.
- Nach 10 Zeitpunkte, Photoactivate die ausgewählten Regionen durch Öffnen der digitalen Membran für 1-1.5 s Verschlusszeit.
- Nachdem die Zeitspanne abgeschlossen ist, wählen Sie ein neues Feld der Zellen, und wiederholen Sie den Vorgang.
(3) Datenanalyse
Hinweis: Lokalisierte photoaktivierungen immobilisierten Liganden erstellt eine wohldefinierte, stationäre stimulierende Region, die für Quantitative Analyse der Signalisierung Antworten und Zytoskeletts umgestaltet Veranstaltungen verwendet werden kann. Analyse Protokolle in der Regel beinhalten, Quantifizierung der Fluoreszenzintensität innerhalb der bestrahlten Region oder über der bestrahlten Region als positionelle Endpunkt für Distanzmessungen (zB. für die Beurteilung der Polarisation des Centrosome, die bestrahlten Region). Beide Analyseprotokolle sind nachfolgend beschrieben. Verschiedene interaktive Analyse Bildprogramme können verwendet werden, um Intensität und Abstandsmessungen, dann Ausgang zur weiteren Verarbeitung und Analyse werden kann.
-
Fluoreszenzintensität
- Bestimmen der Fluoreszenzintensität (FI) einer Hintergrund-Region außerhalb der Zelle (FIb). Dies wird für die Hintergrundkorrektur verwendet werden.
- Zeichnen Sie einen Mikrometer großen quadratischen Bereich außerhalb der Zelle und machen Sie eine Maske zu. Um die Fluoreszenzintensität zu bestimmen, klicken Sie auf analysieren | Maske Statistik. Wählen Sie Meine Fluoreszenzintensität und exportieren Sie die Werte.
Hinweis: Modalitäten (z.B. 3.1.1.1) beziehen sich auf Slidebook Software (siehe Tabelle der Materialien). Durchführung dieses Protokolls mit anderen Software-Paketen (zB., Fidschi) etwas anders.
- Zeichnen Sie einen Mikrometer großen quadratischen Bereich außerhalb der Zelle und machen Sie eine Maske zu. Um die Fluoreszenzintensität zu bestimmen, klicken Sie auf analysieren | Maske Statistik. Wählen Sie Meine Fluoreszenzintensität und exportieren Sie die Werte.
- Die FI in der photoaktiviert Region für jeden Zeitpunkt zu bestimmen.
- Wählen Sie die Maske um den Bereich zu markieren, der photoaktiviert war. Um die Fluoreszenzintensität zu bestimmen, klicken Sie auf analysieren | Maske Statistik. Wählen Sie Meine Fluoreszenzintensität und exportieren Sie die Werte.
- Subtrahieren Sie den Hintergrund FI aus den Messwerten der FI in der Region. Dann die korrigierte FI Messungen geteilt durch die durchschnittliche normalisieren, Hintergrund korrigiert FI die ersten 9 Frames vor photoaktivierungen. ΔF/F = ((FI-FIb)/mean(FI1-9)-FIb)).
Hinweis: Graph ΔF/F als Funktion der Zeit.
- Bestimmen der Fluoreszenzintensität (FI) einer Hintergrund-Region außerhalb der Zelle (FIb). Dies wird für die Hintergrundkorrektur verwendet werden.
-
Entfernung
- Rufen Sie die x und y Koordinaten des Zentrums der photoaktiviert Region.
- Zu bestimmen, die x und y Koordinaten des Zentrums der photoaktiviert Region, wählen Sie Maske um den Bereich zu markieren, die photoaktiviert war. Sobald die Region des photoaktivierungen markiert ist, wählen Sie analysieren | Statistiken zu maskieren | Der Mittelbereich und exportieren Sie die Werte.
- Bestimmen die x- und y-Koordinaten für die fluoreszierenden Sonde von Interesse für jeden Zeitpunkt. Dies geschieht in der Regel durch manuelle oder automatisierte Teilchen verfolgen.
- Zu bestimmen, die x und y Koordinaten der fluoreszierenden Sonde von Interesse, wählen Sie Manuell Particle Tracking und klicken Sie auf die fluoreszierende Sonde von Interesse im Laufe der Zeit. Sobald alle Zeitpunkte verfolgt haben, wählen Sie analysieren | Statistiken zu maskieren | Der Mittelbereich und exportieren Sie die Werte.
- Berechnen Sie den Abstand zwischen den fluoreszierenden Proteins des Interesses und der Mitte der photoaktiviert Region für jeden Zeitpunkt unter Verwendung der Gleichung: Abstand = √ ((x2- X1)2+ (y2-y1)2), die x2 und y sind2 die Koordinaten des fluoreszierenden Proteins von Interesse und X1 und y1 die Koordinaten des Zentrums der photoaktiviert Region.
- Diagramm der Abstand als Funktion der Zeit.
- Rufen Sie die x und y Koordinaten des Zentrums der photoaktiviert Region.
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Representative Results
Der photoaktivierungen und Imaging Ansatz ermöglicht für Beobachtung und einfache Quantifizierung von rapid, polarisierte Signalisierung Antworten. Um seine Fähigkeiten, reproduziert zu illustrieren hier ist ein Experiment, die räumlich-zeitliche Korrelation zwischen TCR-induzierte DAG Akkumulation und Centrosome Neuorientierung zu prüfen. 5 C. C7 T Zelle Blasten waren retrovirally mit zwei Leuchtstoffröhren Reporter ausgestrahlt: ein DAG-Biosensor mit Tandem-C1-Domänen von Proteinkinase C-θ in Verbindung mit GFP (C1-GFP) und RFP-Tubulin, das Centrosome zu überwachen. Die T-Zellen wurden dann gekammerten Deckglas mit Photoactivatable MCC-I-Ekangebracht. C1-GFP wurde abgebildet mit TIRF-Mikroskopie und RFP-Tubulin in Epifluoreszenz-Modus. Wie in Abbildung 2gezeigt, induziert lokalisierte photoaktivierungen der Fläche unter dem T-Zell die Ansammlung von DAG in der verstrahlten Zone. Dies folgt innerhalb von Sekunden die Neuausrichtung der Centrosome in der gleichen Region.
C1-GFP Ansammlung kann quantifiziert werden, durch die Berechnung der normierten Fluoreszenzintensität nach Hintergrundkorrektur, in der Mitte der photoaktiviert Region im Laufe der Zeit (Abbildung 3). Centrosome Neuausrichtung als Reaktion auf photoaktivierungen kann durch die Berechnung der Entfernung zwischen dem Centrosome und dem Zentrum der photoaktiviert Region als Funktion der Zeit (Abbildung 4) quantifiziert werden.
Diese Methode kann verwendet werden, um eine breite Palette von schnellen, polarisierte Signalisierung Antworten im Wesentlichen alles untersuchen, die mit einer fluoreszierenden Sonde überwacht werden können. Z. B. TCR photoaktivierungen wird genutzt, um frühe Signalisierung Microcluster-Anordnung mit Gewebekulturen beschrifteten Grb2 überwachen (Grb2-GLP) (Abbildung 5). Ähnlich wie bei der DAG-Ansammlung und Centrosome Neuausrichtung Antworten, Grb2-GFP Polarisation tritt kurz nach photoaktivierungen (Abbildung 5) und mit dem normalisierten Fluoreszenz-Intensität-Ansatz quantifiziert werden kann.
Abbildung 1: Photoaktivierungen System mit Photocaged MCC Peptid.
(A) Photocaged Strategie für MCC-Peptid. Eine Gruppe der NPE ist Lysin Rückstände des MCC Peptids beigefügt. UV-Bestrahlung führt das Entfernen der NPE, Wiederherstellung von MCC in gediegener Form. (B) bei der NPE ist verpflichtet, MCC, die 5 C. C7 TCR kann nicht an MCC gebunden. Entfernung von NPE führt in Anerkennung der 5 C. C7 TCR native MCC-Peptid. (C) die Photocaged-Strategie wurde angepasst, um die Arbeit mit CD8 + T-Zellen, in denen Photocaged OVA Peptid verwendet wird, um die OT-1 TCR auf UV-Bestrahlung zu aktivieren.
Abbildung 2: Time-Lapse Montage von DAG Anhäufung und Centrosome Neuausrichtung nach photoaktivierungen des TCR in 5 C. C7 T Zelle.
5 C. C7-Zelle mit dem Ausdruck einer DAG Biosensor, mit Tandem C1-Domänen von PKC-GLP (C1-GFP) und Tag-RFP Tubulin (RFP-Wanne), fluoreszierenden Reporter für die Centrosome verschmolzen. Die Montagen illustrieren die polarisierte Reaktion der 5 C. C7-T-Zellen im Laufe der Zeit. Die gelben Oval und Text angeben, Zeit und Ort des photoaktivierungen. Im Laufe der Zeit sammelt sich C1-GLP in der photoaktiviert-Region, gefolgt von Centrosome Umorientierung auf der photoaktiviert-Region. Maßstab: 10 µm.
Abbildung 3: Quantifizierung der DAG Akkumulation in der photoaktiviert-region
DAG, C1-GFP, Akkumulation in der photoaktiviert Region (links) kann durch die Berechnung der normierten Fluoreszenzintensität nach Untergrundkorrektur in der photoaktiviert Region (gelber Kreis mit blau schattiert) im Laufe der Zeit quantifiziert werden. Daten sind im Verhältnis zu den neun Frames erhalten kurz vor photoaktivierungen normalisiert. C1-GFP-Anreicherung in der photoaktiviert-Region kann durch die Arbeitsteilung der mittlere Fluoreszenzintensität der bestrahlten Region durch die mittlere Fluoreszenzintensität der gesamten Zelle, nach Untergrundkorrektur berechnet werden. Die Gleichung: ΔF/F = ((FI-FIb)/mean(FI1-9)-FIb)), in denen FI ist die mittlere Fluoreszenzintensität, kann verwendet werden, um die normierte Fluoreszenzintensität zu berechnen. Der normalisierte Fluoreszenzintensität an der photoaktiviert-Region kann dann als Funktion der Zeit (rechts) dargestellt werden. Violette Linie zeigt die Zeit des photoaktivierungen. Maßstab: 10 µm.
Abbildung 4: Quantifizierung der Centrosome Neuorientierung.
Bestimmen Sie die Koordinaten des Centrosome (RFP-Wanne) im Laufe der Zeit, indem Sie manuell verfolgen den Centrosome Weg in der photoaktiviert Region (weißer Pfeil) zu jedem Zeitpunkt (links). Bestimmen Sie die Koordinaten des Zentrums der photoaktiviert Region (gelber Kreis). Der Abstand zwischen den Centrosome und das Zentrum der photoaktiviert Region kann zu jedem Zeitpunkt unter Verwendung der Gleichung für die Ferne berechnet = √ ((x2- X1)2+ (y2-y1)2), in dem x2 und y 2 sind die x und y-Koordinaten für den Mittelpunkt des Bereichs von der Centrosome und x1 und y1 X und y Koordinaten des Zentrums der photoaktiviert Region. Der Abstand von der Centrosome aus der Mitte der photoaktiviert Region zu jeder Zeit Punkt kann dann als Funktion der Zeit (rechts) dargestellt werden. Violette Linie zeigt die Zeit des photoaktivierungen. Maßstab: 10 µm.
Abbildung 5: Grb2-GFP Microcluster Bildung.
(A) Vertreter 5 C. C7-Zelle mit dem Ausdruck eindringmittel mit der Bezeichnung Grb2 (Grb2-GLP). Die Montagen illustrieren die polarisierte Reaktion des Grb2-GFP Überstunden. Die gelben Oval und Text angeben, Zeit und Ort des photoaktivierungen. Im Laufe der Zeit sammelt sich Grb2-GLP auf der photoaktiviert-Region. (B) Quantifizierung des Grb2-GFP Fluoreszenzintensität an der photoaktiviert-Region im Laufe der Zeit. N = 15 Zellen. (C) Quantifizierung des Grb2-GFP Fluoreszenzintensität in einer Kontrollregion außerhalb der photoaktiviert Zone. N = 15 Zellen.
Abbildung 6: Mikroskopkonfiguration für photoaktivierungen und TIRF Imaging.
488 nm und 561 nm Laser dienen für TIRF und Epifluoreszenz Imaging von grünen und roten Sonden, beziehungsweise. UV-Licht zur photoaktivierungen stammt von Quecksilber (Hg) Lampe an eine digitale Membran-System, das leuchtende kleine, frei definierbaren Regionen angeschlossen. Licht von der Hg-Lampe/Membran auf die Probe, indem ein langpass-Spiegel unterhalb der dichroitischen Spiegel, der die bildgebenden Laser reflektiert, wider. Die dichroitische Spiegel muss entworfen werden, UV Licht weiterzugeben. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
In den letzten Jahren hat Licht als ein ausgezeichnetes Werkzeug für raumzeitlich kontrollierte Aktivierung von zellulären Prozessen entstanden. Verschiedene Methoden wurden entwickelt, jede mit damit verbundenen vor- und Nachteile. Das System hier beschrieben wird, die auf die decaging von immobilisierten, extrazellulären Liganden, eignet sich besonders für die Analyse von rapid, subzelluläre, polarisierte Signalisierung Antworten. Dieser Ansatz wurde angewandt, um IS Bildung in T-Zellen wie oben beschrieben zu untersuchen. Darüber hinaus wurden eingesperrte Liganden für andere Rezeptoren entwickelt, so dass wir die gleiche Strategie zur Beurteilung hemmenden Signalisierung in natürlichen töten Zellen und nukleare Translokation des Transkriptionsfaktors NF-κB Reaktion wie Rezeptor Maut gelten, 14,15-Signalisierung.
In diesem Protokoll sind stimulierende Liganden immobilisiert, um sicherzustellen, dass sie als stationäre, polarisierte Quelle der Anregung für die Dauer des imaging-Experiments bleiben. Dieser Ansatz eignet sich gut für Studien der Zelle Polarisation. Anzumerken ist jedoch, dass der TCR photoaktivierungen Ansatz für zeitlich gesteuerten T-Zell-Aktivierung auf unterstützten Lipid Bilayer leicht angepasst. Natürlich kann eine nachhaltige, polarisierte Stimulation in diesem Zusammenhang nicht erreichen. Dies ist unnötig, möglicherweise jedoch in Anbetracht der experimentellen Ziele.
Das System ist auch sehr flexibel in Bezug auf die UV-Lichtquelle für decaging. Derzeit ist eine 100 W Hg-Lampe für gezielte Beleuchtung verwendet, jedoch ein gepulste Stickstoff-Laser (Puls Breite 4 ns, Puls Energie 120 mJ), war zuvor verwendeten6. Manchmal handheld UV-Licht (365 nm, 4 W) wurde über die bildgebenden Probe um größere Regionen Photostimulatable Liganden decage positioniert. Die Besonderheiten des decaging Systems hängt jeweils von den technischen Anforderungen des Experiments in Frage.
Wenn Sie dieses System zu implementieren, ist es wichtig zu bestätigen, dass die beobachteten Reaktionen spezifisch für das photoaktivierungen-Ereignis und nicht das Ergebnis der falschen Rezeptor-Aktivierung oder UV-induzierten lichtbedingten sind. Um diese Artefakte auszuschließen, können zwei Spezifität Kontrollen durchgeführt werden. Erstens kann Fluoreszenzintensität im Zellen, die nicht direkt bei photoaktivierungen Experimenten bestrahlt werden überwacht werden. Wenn die Oberfläche richtig eingesperrt, nennenswerter Antworten in diesen Zellen nicht (z. B. Abbildung 5) hinzuweisen. Zweitens können Experimente, in denen, die t Zellen sind UV-Bestrahlung auf Oberflächen fehlt Photoactivatable Liganden, durchgeführt werden. Dieses Steuerelement ist entscheidend für die Ermittlung der UV-induzierten Effekte, die unabhängig von Photoactivatable Liganden (z. B. siehe Referenz 6). Während der Systemoptimierung ist es auch äußerst hilfreich, um eine robuste zelluläre Bildgebung Reaktion (z. B. Grb2-GFP Rekrutierung) zur hand zu haben, die schnell und lokalisiert ist. Beurteilung der Zusammenhänge zwischen Signal- und photoaktivierungen ist viel einfacher, wenn diese Ereignisse raumzeitlich proximal zu Stimulation der Rezeptoren sind.
Obwohl der photoaktivierungen-Ansatz exquisite räumlich-zeitliche Kontrolle über Rezeptor bietet-Signalisierung, fehlt es die Anpassungsfähigkeit, die gebotene transfectable optogenetische Systeme16,17,18,19 ,20,21,22. Bestimmte optogenetische-Proteine sind auch Photoreversible, die bedingte Kontrolle, die nicht mit der photoaktivierungen der hier beschriebene Ansatz zur Verfügung steht. In optogenetische Systemen ist jedoch einschränkend die Diffusion von photoaktiviert Proteinen technisch anspruchsvoll. Dies erschwert die Analyse der polarisierten Signaltechnik, besonders in einem subzelluläre Kontext.
Man sollte auch beachten, dass die ansprechende Einheit dieses photoaktivierungen Systems einer Glasoberfläche, die alle Aspekte einer gutgläubigen Zell-Zell-Interaktion rekapitulieren kann nicht. Um dieses Problem zu umgehen und gleichzeitig die räumlich-zeitliche Kontrolle der Signal-Initiation, haben Ermittler ein optischen Falle verwendet um eine APC in Kontakt mit einer T-Zelle, so dass für den Beginn des Zytoskeletts Umgestaltungen und IS Reifung zu bringen in Echtzeit23visualisiert. Obwohl dieses System ermöglicht die präzise Einleitung und Visualisierung des Zytoskeletts Dynamics mit einer tatsächlichen APC, es ist relativ geringen Durchsatz und ist nicht kompatibel mit TIRF-Beleuchtung, die Bildqualität beeinträchtigt.
Abschließend bietet die in diesem Protokoll beschriebene Methode räumlich-zeitliche Steuerung der TCR-induzierte Signal innerhalb der T-Zelle, so dass letztlich für die Aufklärung der schnell biochemischen Veränderungen nach TCR Aktivierung. Dieses System bietet uns ein Mittel, um besser zu verstehen, wie die Signalisierung Ereignisse nach Aktivierung der TCR T-Zell-Polarisation, ist Bildung und letztlich die Lieferung der Effektor Antworten zu fördern.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Wir danken Mitglieder des Huse Lab um Rat und Hilfe. Unterstützt durch die US National Institutes of Health (R01-AI087644, m.h.) und P30-CA008748, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass | Thermofischer Scientific | 155361 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P2636 | Will need to make Biotinylated Poly-L-Lysine |
| EZ-Link NHS-Biotin | Thermofischer Scientific | 20217 | Will need to make Biotinylated Poly-L-Lysine |
| Streptavidin | Thermofischer Scientific | 434301 | |
| BirA-500: BirA biotin-protein ligase standard reaction kit | Avidity | BirA500 | Will be used to biotinylate proteins |
| Biotinylated Hb I-EK | For protein folding, see reference 6. For biotinylation, use BirA kit | ||
| Biotinylated NPE-MCC I-EK | Anaspec | Custom NPE-MCC (H-ANERADLIAYL-K(Nvoc)-QATK-OH) can be purchased from Anaspec | |
| Biotinylated αH2-Kk antibody | BD Biosciences | 553591 | |
| Biotinylated NPE-OVA H2-Kb | Anaspec | Custom NPE-OVA (H-SIINFE-K(Nvoc)-L-OH) can be purchased from Anaspec | |
| Biotinylated KAVY H2-Db | Anaspec | Custom synthesized protein (KAVYDFATL) can be purchased from Anaspec | |
| Biotinylated ICAM1 | For protein folding, see reference in protocol. For biotinylation, use BirA kit | ||
| Hand held UV lamp | UVP | UVGL-25 | Lamp is held < 1 cm from the sample. 30 s of 365 light is sufficient for detectable decaging, 20 min for quantitative decaging. |
| Olympus IX-81 OMAC TIRF system. | Olympus | Additional information about the imaging system can be found in Figure 6 | |
| Mosaic digital diaphragm | Andor | ||
| Slidebook software | Intelligent Imaging Innovations |
References
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