Summary
이 프로토콜 photoactivatable 펩 티 드-MHC T 세포 활성화의 정확한 spatiotemporal 제어 활성화를 사용 하 여 T 세포를 활성화 하는 영상 기반 방법을 설명 합니다.
Abstract
T 림프 톨 급속 하 고, 편광 신호에 종사 하는 TCR 활성화 다음 분 이내 발생. 이 면역 시 냅 스, T 세포 활성화를 조절 하 고 이펙터 응답을 대상으로 하는 진부한 셀 교차로의 형성을 유도 합니다. 이러한 프로세스를 효과적으로 공부 하기 빠르고, 편광 응답 캡처에 맞춤화 된 이미징 접근 필요 하다. 이 프로토콜 기반으로 photoactivatable 펩 티 드-주요 조직 적합성 복잡 한 (pMHC)는 자외선에 노출 될 때까지 비 물질로 이러한 시스템을 설명 합니다. Videomicroscopy 실험 동안 타겟 decaging이 시 약의 TCR 활성화의 정확한 spatiotemporal 제어 및 고해상도 이미징 총 내부 반사 (TIRF) 이후 세포 응답의 모니터링 수 있습니다. 이 방법은 또한 유전과 약리 섭 동 전략와 호환 됩니다. 면역학 시 냅 스의 기반이 되는 편광 cytoskeletal 구조의 형성에 TCR 신호를 연결 하는 잘 정의 된 분자 통로의 어셈블리에 대 한 수 있습니다.
Introduction
T 림프 톨 (T 세포) 항 원 펩 티 드의 세포 표면 MHC 컨텍스트에서 표시를 인식 하 여 세포 면역에 중심 역할을 재생 합니다. TCR에 의해 중재 되는 항 원 인식, naïve T 세포의 분화를 구동 하 고 이펙터 인구에 의해 cytolytic와 의사 소통 응답의 납품을 촉진. TCR 참여는 또한 세포질 구조에 극적인 변화를 유도 한다. 분 이내에, T 세포 면역학 시 냅 스 (IS)1,2로 알려진 편광된 인터페이스를 형성 하는 항 원 제시 세포 (APC)의 측에 gloms. IS cytokines의, 또는 세포 독성 T 세포 (Ctl), 송출 파괴 용균성 단백질의 경우 방향 릴리스를 사용 하 여 T 세포 효과 기 응답을 potentiates.
PMHC에 의해 TCR 참여 활성화의 T 세포 (위도), 궁극적으로 시 냅 스 골격2의 강력한 리 모델링 추진에 대 한 링커를 포함 한 여러 다운스트림 어댑터 분자의 급속 한 인 산화를 유도 한다. 대뇌 피 질의 filamentous 말라 (F-말라) T 세포 APC 표면 확산을 다음 IS 주변 및 중앙에서 고갈에 F-말라 축적으로 특징 고리 모양의 구조를 확인 한다. F-말라 반지 형성 인터페이스의 중심 바로 아래 위치에 microtubule 조직 센터 (MTOC, T 세포에서는 centrosome 라고도)의 재교육에 밀접 하 게 결합 이다. 두 이벤트는 초기 항 원 인식의 분 이내 발생 하 고 후속 활성화 이벤트와 이펙터 응답 발생 건축 컨텍스트 설정.
공부 하 고는 형성, 다양 한 실험실 접근 송출 고정된 TCR ligands를 포함 하거나 지원 자체 ligands3,4를 포함 하는 지질 bilayer 유리 표면에 의해 대체 됩니다 개발 했습니다. T 세포는 총 내부 반사 형광 현미경 (TIRF) 또는 confocal 현미경 검사 법, 초기 T 세포 활성화 및 IS 형성의 고해상도 연구를 활성화 하 여 몇 군데 수 있습니다이 표면에 IS 같은 연락처를 형성 합니다.
하지만이 방법을 완벽 하 게 조립된 IS의 뛰어난 시각화에 대 한 허용, 신호 다음 TCR:pMHC 결 찰의 많은 초 이내에, TCR 활성화를 정확 하 게 다음 사건의 순서를 결정 하는 노력을 복잡 하 게 발생 . 이 문제를 우회 하는 photoactivation 방식 개발 되었습니다, TCR 활성화5,,67의 spatiotemporal 제어를 달성 하기 위해 사용 되는 photoactivatable pMHC. 이 시스템에서 T 세포는 비 물질로 TCR까지 자외선 (UV)을 조사 하는 photoactivatable pMHC를 포함 하는 유리 표면에 부착 됩니다. UV 방사선의 T 세포 아래 표면 미크론 크기의 지역 T 세포에 의해 인식 될 수 있는 물질로 영역을 만드는 photocage를 제거 합니다. 이후 신호 이벤트와 cytoskeletal 개장 다음 유전자 인코딩된 형광 기자를 사용 하 여 모니터링 됩니다. 항 원 펩 티 드, 엄 시 토 크롬 c88-103 (MCC)와 ovalbumin257-264 (OVA), 선물 된다 II MHC-Ek 클래스와 클래스의 맥락에서 나 MHC H2-Kb, 각각의 2 개의 photoactivatable 버전 되었습니다 (그림 1)를 개발 했다. 그러면 두 CD4의 분석+ T 세포 (표현 5 C. 고객 센터-난-Ek 에 대 한 특정 C7, 2B4, 또는 모양과 TCRs)와 CD8+ T 세포 OVA-H2-Kb (OT1 TCR 표현)에 대 한 특정.
지난 10 년간, TCR photoactivation 및 이미징 접근은 이용 되어 신호 단계 초기 TCR의 정확한 활동을 설정 하 고 또한 편광된 cytoskeletal 개장5, 를 경 세 하는 분자 경로 식별 하 6 , 7 , 8 , 9 , 10. 예를 들어 분석 결과 그 centrosome 결정에서 쓸모 있었다 송출 쪽으로 재교육 가운데는 IS에 지질 두 번째 메신저 diacylglycerol의 지역화 된 그라데이션에 의해 중재입니다. 이 방법론의 T 세포 기능 고해상도 이미징 분석을 요구 하는 응용 프로그램에 대 한 가치가 있을 나갈 것입니다 예상 된다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1입니다. 물질로 유리 표면 준비
- Biotinylated 폴 리-L-리 신 (바이오-PLL)와 코트 8 잘 연 발 coverglass 희석 증류수, 이온을 제거 된 물 (ddH2O) 1: 500. 실 온 (RT)에서 30 분 동안 품 어.
- H2o. 세척
- 실시간에서 2 시간 건조
- 블록 바이오-PLL 실시간에서 30 분 동안 차단 버퍼 (HEPES 버퍼링 염 분 [10 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl], 2 %BSA)와 표면 코팅
- 폴 리-L-리 신 hydrobromide 10mm NaPO4, pH 8.5의 1 ml에서의 5 mg을 디졸브.
- (에서 DMSO에 100mg/mL 주식) NHS-비오 틴의 125 μmol (0.55 밀리 그램)를 추가 하 고 반응의 pH를 확인. PH 8.5이 하 있는 경우에, pH 8.5와 9.5 사이 그것을 인상 4 N NaOH의 2 μ를 추가 합니다.
- 30 분 동안 소용돌이입니다.
- 20 mM Tris pH 8.0에에서 녹아 100mm 글리신의 50 μ와 반응을 끄다.
- 10 분에 대 한 전체 전력에서 회전 시키십시오 그리고 새로운 튜브에는 상쾌한 전송.
참고: 바이오-PLL 품질은 일반적으로에 비해 이전 준비 직렬 2 배 희석 96-잘 ELISA 접시에 재료의 코팅 및 알칼리 성 인산 가수분해 효소를 가진 외피 streptavidin 결합 후 biotin 콘텐츠 측정.
- 블로킹 버퍼를 제거 합니다. 웰 스 건조를 허용 하지 않습니다. Streptavidin (블로킹 버퍼에서 100 µ g/mL)를 추가 합니다. 1 h 4 ° c.에 품 어
- HBS에 씻어. 와 반전 챔버 슬라이드 웰 스 4-5 번, 우물에서 HBS를 제거. 웰 스 건조를 허용 하지 않습니다.
- 표면에 biotinylated pMHC ligands 및 접착 분자를 추가 합니다.
참고: MCC 및 OVA 수 직교-nitrobenzyl를 추가 하 여 photocaged 기반 키 lysines의 ε 아미노 그룹을 보호 그룹 (예: nitrophenylethyl (NPE) 또는 nitroveratryloxycarbonyl (NVOC)) (고객 센터, OVA에서 k 7에에서 K12). Photocaged 고객 센터 및 OVA 상업용 공급 업체에서 얻을 수 있습니다. 수성 버퍼에서 재구성, 후 bacterially 표현된-Ek 와 h 2 Kb 설립된 접근11,12를 사용 하 여 refolded 있습니다 그들은. - Photoactivatable 고객 센터 또는 OVA 펩타이드의 유효성 검사
- 휴대용 UV 램프와 UV 해 여 NVOC 보호 펩 티 드 decage ( 재료의 표참조) 실시간에서 20 분
- 펄스 1.0 x 105 APCs nonstimulatory 펩 티 드 (부정적인 컨트롤, 예를 들면 Hb)의 1 개의 µ M를 1 시간에 대 한 조사 photoactivatable 펩 티 드, 펩 티 드 photoactivatable 그리고 주 작동 근 펩 티 드 (긍정적인 통제, 예를 들어, 고객 센터) unirradiated 37 ° c.에서 하룻밤
- 5 c.를 표현 하는 T 세포를 자극 하 C7/2B4/앤 TCR, CH12 또는 CH27 B 세포를 사용 합니다. OT1 T 세포를 자극, RMA s 또는 EL4 thymoma 셀을 사용 합니다.
- T 세포에의 동등한 수와 함께 펄스 APCs를 혼합 96-200의 최종 볼륨 하단 플레이트 라운드 잘 µ L. 12-24 h에 대 한 37 ° C에서 품 어.
- 각 우물에서는 supernatants 복구와 streptavidin 양 고추냉이 과산화 효소 색도계 검출 ELISA에 의해 일리노이-2를 분석 합니다.
참고: 모든 펩 티 드 MHC 복합물으로 refolding 전에 분무 질량 분석에 의해 배우면 자격의 확인이 좋습니다.
- 폴딩 및 빛에 노출을 최소화 하기 위하여 MHC의 정화를 수행 합니다. 예를 들어 포장 알루미늄 호 일에 반응을 접는 고 오프 UV 램프와 젤 여과 크로마토그래피를 실시.
참고: 그것은 그 photoactivatable 고객 센터-난-Ek 를 발견 되었으며 OVA-H2-Kb 불완전 한 기능 고른다면으로 인해 높은 밀도에서 UV 독립 T 세포 활성화를 유도 합니다. 따라서, photoactivatable pMHC nonstimulatory pMHC (예: -Ek 헤모글로빈64-76 펩 티 드 (Hb) 포함)의 10-30 x 초과로 동원 정지 단계 희석은. 이 신호 대 잡음 비 후속 이미징 실험의 향상. - Photoactivate CD4+ T 총칭 biotinylated Hb-난-Ek (3 µ g/mL), biotinylated photoactivatable 고객 센터-난-Ek (0.1 µ g/mL), 및 biotinylated 클래스에 대 한 항 체의 혼합물을 사용 하는 세포, MHC H2-Kk I (0.5 µ g / mL). 안티-H2-Kk 항 체 장려 5 c. C7/2B4/와 T 세포 H2-Kk, 정품 인증을 진행 하지 않고 유리 표면에 확산을 표현.
- CD8에 대 한+ T 세포, biotinylated h 2 Db 펩 티 드 KAVYDFATL 베어링의 혼합 사용 (1 µ g/mL), biotinylated photoactivatable OVA-H2-Kb (0.1 µ g/mL), 및 접착 분자 ICAM-1의 세포 외 도메인 (2 µ g/mL 곤충 세포 문화13생산). ICAM-1 T 세포 표면에서 LFA1 integrin 참여 하 여 가까운 접촉 형성을 장려 한다.
- RT에 1 시간 또는 2 시간 이상 4 ° c.에 외피 다음 블로킹 버퍼에 모든 단백질 혼합물을 적용
참고: 수 µ m2 당 8000 ~ 이런이 종류의 표면에 분자 밀도 이전 결정된6되었습니다. Photoactivatable pMHC ~1/30 대표는일 biotinylated 단백질 표면에, 그것의 밀도의 µ m2, decaging 이전 당 ~ 267 분자를 될 것입니다. - 1.6 단계에서 세척 하 고 사용 하 여 준비까지 HBS에 두고.
- 200000 CD4 추가+ 또는 CD8+ T 세포 각 우물에 적절 한 TCR을 표현 하 고 15 분 동안 37 ° C에서 준수 하는 셀. 일단 세포는에 연결 하 고 표면에 확산, 그들은 photoactivation 및 이미징에 대 한 준비가 되었습니다.
참고: 효과 기 T 세포 형광 이미징 프로브와 Retroviral 변환 세부 elswhere6,7에 설명 되어 있습니다. 칼슘 신호 수 있습니다 또한 공부 될 칼슘 민감한 염료 Fluo-46로드 untransduced T 세포를 사용 하 여. 비율 염료 Fura-2 decaging photoactivatable pMHC의 유도 또한 UV 범위에서 여기 필요 하기 때문에 권장 하지 않습니다.
2. 이미지 수집
- 거꾸로 TIRF 현미경 이미지 수집을 위한 UV 호환 150 X 객관적 렌즈와 복을 사용 합니다. UV 100 W 수은 램프 (HBO)에 연결 된 디지털 다이어 프 램 시스템을 사용 하 여 사용자 정의 영역을 비추는. UV 400 nm 긴 패스 미러를 사용 하 여 샘플에이 램프에서 빛을 직접.
- 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 지역화 된 photoactivation 및 시간 경과 수집에 대 한. 대부분 실험에서 모두는 녹색 및 빨강 채널에서 488를 사용 하 여 프로브를 모니터링 및 561 nm 여기 레이저, 각각. 레이저 빛은 또한 UV 범위 (decaging 사용)에서 전송 듀얼 대역 통과 dichroic 거울을 사용 하 여 샘플에 지시 된다. 현미경 구성에 대 한 자세한 내용은 테이블의 자료 와 그림 6 을 참조 하십시오.
- T 세포를 포함 하는 챔버 슬라이드를 장착, TIRF 또는 epifluorescence 조명, 필요에 따라 얻기 위해 설정을 조정 합니다. 라이브 모드로 형광 probe(s)을 표현 하는 셀의 필드를 선택 합니다. 소프트웨어 제어를 사용 하 여 개별 셀 아래 photoactivation 미크론 단위 영역을 설정 합니다.
- 시간 경과 수집을 시작 합니다. 일반적으로, 5의 간격 80 timepoints 인수는 각 시간 포인트 사이 s. 이것은 순차적 488에 대 한 더 충분 한 시간 및 듀얼 컬러 실험의 경우 563 nm 노출.
- 10 timepoints, photoactivate 디지털 다이어 프 램을 열어서 선택된 영역 1-1.5 s 셔터 후
- 시간 경과 후 셀의 새 필드를 선택 하 고 과정을 반복.
3. 데이터 분석
참고: 고정된 ligands의 지역화 된 photoactivation 신호 응답 cytoskeletal 개장 이벤트의 정량 분석을 위해 사용 될 수 있는 잘 정의 된, 고정 된 물질로 영역을 만듭니다. 프로토콜은 일반적으로 조사 지역 내에서 형광 강도 측정 하거나 위치 끝점으로 거리 측정을 위한 조사 영역을 사용 하 여 포함 하는 분석 (예. 분극에 centrosome의 평가 조사 지역)입니다. 두 분석 프로토콜은 아래 설명 되어 있습니다. 강도 및 거리 측정, 다음 추가 처리 및 분석에 대 한 출력 수 있는 다양 한 대화형 이미지 분석 프로그램을 사용할 수 있습니다.
-
형광 강도
- 셀 (FIb) 밖에 배경 영역의 형광 강도 (FI)를 결정 합니다. 이 배경 보정을 위해 사용 됩니다.
- 셀 외부 미크론 크기의 사각형 영역을 그릴 하 고 마스크. 형광 강도 확인 하려면 분석 클릭 | 통계를 마스크. 형광 강도 의미 를 선택 하 고 값을 내보냅니다.
참고: 절차 세부 정보 (예: 3.1.1.1) Slidebook 소프트웨어를 참조 하십시오 ( 재료의 표참조). 다른 소프트웨어 패키지를 사용 하 여이 프로토콜의 구현 (예., 피지) 약간 다를 수 것입니다.
- 셀 외부 미크론 크기의 사각형 영역을 그릴 하 고 마스크. 형광 강도 확인 하려면 분석 클릭 | 통계를 마스크. 형광 강도 의미 를 선택 하 고 값을 내보냅니다.
- 각 시간 지점에 대 한 photoactivated 지역 내에서 인터넷을 결정 합니다.
- 마스크 는 photoactivated 영역을 강조 표시를 선택 합니다. 형광 강도 확인 하려면 분석 클릭 | 통계를 마스크. 형광 강도 의미 를 선택 하 고 값을 내보냅니다.
- 배경을 FI 지역 내에서 측정된 된 FI 값에서 뺍니다. 그런 다음 평균으로 나누어 수정된 FI 측정 표준화, 배경 수정 photoactivation 전에 처음 9 프레임의 FI. Δ/F = ((FI-FIb)/mean(FI1-9)-FIb)).
참고: 그래프 δ/F 시간의 기능으로.
- 셀 (FIb) 밖에 배경 영역의 형광 강도 (FI)를 결정 합니다. 이 배경 보정을 위해 사용 됩니다.
-
거리
- X 및 y 좌표는 photoactivated 지역의 중심의.
- X 및 y를 확인 하려면 photoactivated 지역의 중심의 좌표 마스크 는 photoactivated 영역을 강조 표시를 선택. Photoactivation의 지역 강조 되 면 선택 분석 | 통계를 마스크 | 지역 센터 내보낼 값.
- X 및 y 결정 각 시간 지점에 대 한 관심의 형광 프로브에 대 한 좌표. 이것은 수동 또는 자동 입자 추적을 통해 일반적으로 달성 된다.
- X 및 y를 확인 관심, 형광 프로브의 좌표 수동 입자 추적 을 선택 하 고 시간이 지남에 따라 관심의 형광 프로브에 클릭. 일단 모든 시간 포인트 추적 된 선택 분석 | 통계를 마스크 | 지역 센터 내보낼 값.
- 관심사의 형광 단백질 및 방정식을 사용 하 여 각 시간 지점에 photoactivated 지역의 중심 사이의 거리를 계산: 거리 = √ ((2x x-1)2+ (y2y-1)2), x2 와 y는2 에 관심과 x1 과 y1 의 형광 단백질의 좌표는 photoactivated 지역의 중심의 좌표.
- 시간의 기능으로 거리 그래프입니다.
- X 및 y 좌표는 photoactivated 지역의 중심의.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Photoactivation 및 이미징 접근 관찰과 급속 하 고, 편광 신호 응답의 손쉬운 정량화 할 수 있습니다. 복제의 기능을 설명 하기 위해 여기 TCR 유도 DAG 축적과 centrosome 재교육 사이 spatiotemporal 상관 관계를 조사 하는 실험 이다. 5 C. C7 T 셀 폭발 했다 2 명의 형광 기자 불리고 retrovirally: 단백질 키 니 아 제 C θ에서에서 탠덤 C1 도메인 포함 된 DAG 바이오 센서는 centrosome 모니터링 GFP (C1-GFP) RFP tubulin에 연결. T 세포 다음 photoactivatable 고객 센터-난-Ek를 포함 하는 연 발된 coverglass에 붙어 있었다. C1-GFP는 TIRF 현미경 및 RFP tubulin epifluorescence 모드에서 사용 하 여 몇 군데. 그림 2에서 같이, T 셀 아래 표면의 지역화 된 photoactivation 조사 영역에서 DAG의 축적을 유도 합니다. 이 같은 지역에는 centrosome의 재교육에 초 이내에 선행 된다.
C1-GFP 축적 시간 (그림 3)에 photoactivated 지역의 중심에서 배경 보정 후 정규화 된 형광 강도 계산 하 여 측정할 수 있습니다. Photoactivation에 대 한 응답에서 centrosome 재교육 시간 (그림 4)의 기능으로는 centrosome 및 photoactivated 지역의 중심 사이의 거리를 계산 하 여 측정할 수 있습니다.
이 메서드는 본질적으로 아무것도 형광 프로브를 사용 하 여 모니터링할 수 있는 급속 하 고, 편광 신호 응답의 다양 한 배열을 검토 하 사용할 수 있습니다. TCR photoactivation를 활용 하 여 초기 신호 microcluster 형성 붙일 레이블된 Grb2를 사용 하 여 모니터링 하는 예를 들어 (Grb2-GFP) (그림 5). 마찬가지로 DAG 축적 및 centrosome 재교육 응답 Grb2 GFP 분극 곧 photoactivation (그림 5)에 따라 발생 하 고 정규화 된 형광 강도 접근을 사용 하 여 측정할 수 있습니다.
그림 1: Photoactivation 시스템 photocaged 고객 센터 펩 티 드를 사용 하 여.
(A) 고객 센터 펩 티 드에 대 한 Photocaged 전략. NPE 그룹 MCC 펩 티 드의 리 진 잔류물에 첨부 됩니다. UV 방사선 조사 결과 NPE, MCC 기본 형태로 복원 제거. (B) 때 NPE 바인딩되어 5 C. 고객 센터 C7 TCR MCC에 바인딩할 수 없습니다. 5 c. 인정 NPE의 제거 결과 C7 TCR 네이티브 MCC 펩 티 드에. (C) photocaged 전략 CD8 + T 세포, UV 방사선 조사 시 OT 1 TCR 활성화에 사용 되는 photocaged OVA 펩 티 드와 함께 작동 하도록 적응 되어 있다.
그림 2: 다음 5 c에서 TCR의 photoactivation DAG 축적과 centrosome 재교육의 시간 경과 몽 타 쥬 C7 T 세포입니다.
5 C. C7 셀의 PKC-GFP (C1-GFP) 및 태그 RFP Tubulin (RFP-욕조), 형광 기자는 centrosome 융합 협동 C1-도메인 포함 된 DAG 바이오 센서를 표현입니다. montages 설명 5. 편광된 응답 시간이 지남에 C7 T 세포입니다. 노란 타원형 및 텍스트 시간 및 photoactivation의 위치를 나타냅니다. 시간이 지남에, C1-GFP photoactivated 지역, photoactivated 지역으로 centrosome 재교육 뒤에 축적. 눈금 막대: 10 µ m.
그림 3: photoactivated 지역에서 DAG 축적의 정량화
Photoactivated 지역 (왼쪽)에서 DAG, C1-GFP, 축적 배경 보정 후, 시간이 지남에 따라 photoactivated 지역 (파란색 노란색 동그라미)에서 정규화 된 형광 강도 계산 하 여 측정할 수 있습니다. 데이터는 photoactivation의 바로 전에 얻은 9 프레임을 기준으로 정규화 됩니다. Photoactivated 지역에서 C1-GFP 농축 배경 수정 다음 전체 셀의 평균 형광 강도 의해 방사능된 지역에서 평균 형광 강도의 사단에 의해 계산할 수 있습니다. 방정식: Δ/F = ((FI-FIb)/mean(FI1-9)-FIb))는 인터넷에서 평균 형광 강도, 정규화 된 형광 강도 계산 하기 위해 사용할 수 있습니다. Photoactivated 지역에서 정규화 된 형광 강도 다음 시간 (오른쪽)의 함수로 그래프로 수 있습니다. 퍼플 라인 photoactivation의 시간을 나타냅니다. 눈금 막대: 10 µ m.
그림 4: centrosome 재교육의 정량화입니다.
수동으로 (왼쪽) 각 시간 지점에서 photoactivated 지역 (흰색 화살표)으로 centrosome 경로 추적 하 여 시간이 지남에 centrosome (RFP-욕조)의 좌표를 결정 합니다. Photoactivated 지역 (노란색 원)의 중심의 좌표를 결정 합니다. centrosome 및 photoactivated 지역의 중심 사이의 거리는 거리를 위한 방정식을 사용 하 여 각 시간 지점에서 산출 될 수 있다 = √ ((2x x-1)2+ (y2y-1)2), x2 와 y는 2 는 x와 x1 과 y1 는 centrosome 영역 중심의 y 좌표는 x 및 y 좌표는 photoactivated 지역의 중심의. 각 시간에서 photoactivated 영역 중심에서 centrosome 거리 포인트 (오른쪽) 시간의 기능으로 그래프로 수 다음. 퍼플 라인 photoactivation의 시간을 나타냅니다. 눈금 막대: 10 µ m.
그림 5: Grb2 GFP microcluster 형성입니다.
(A) 대표 5 c. C7 셀 붙일 표현 Grb2 표시 (Grb2-GFP). montages Grb2 GFP 연장의 편광된 응답을 보여 줍니다. 노란 타원형 및 텍스트 시간 및 photoactivation의 위치를 나타냅니다. 시간이 지남에, Grb2 GFP photoactivated 지역에서 축적 한다. (B) 시간이 지남에 photoactivated 지역에서 Grb2 GFP 형광 강도의 정량화. N = 15 셀. (C) photoactivated 영역 밖에 컨트롤 영역에서 Grb2 GFP 형광 강도의 정량화. N = 15 셀.
그림 6: photoactivation 및 TIRF 이미징에 대 한 현미경 구성.
488 nm 및 561 nm 레이저 각각 TIRF와 녹색, 빨간색 프로브 epifluorescence 이미징에 대 한 사용 됩니다. Photoactivation에 대 한 자외선 수은 (Hg) 램프는 디지털 다이어 프 램 시스템 계몽 작은, 사용자 정의 영역에 연결 된에서 가져온 것입니다. Hg 램프/다이어 프 램에서 빛 longpass 미러 이미징 레이저를 반영 하는 dichroic 거울 아래 위치 하 여 샘플에 반영 됩니다. Dichroic 거울 UV 빛을 전달 하도록 설계 되어야 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
최근 몇 년 동안, 라이트는 세포질 과정의 spatiotemporally 제어 활성화를 위한 훌륭한 도구로 떠오르고 있다. 다양 한 방법론 개발 되었습니다, 각각 관련 장점과 단점. 고정, extracellular ligands의 decaging에, 기반으로, 여기에 설명 된 시스템은 급속 한, subcellular, 편광 신호 응답의 분석에 대 한 이상적으로 적합 합니다. 이 방법은 위에서 설명한 T 세포에는 대형 검사에 적용 되었습니다. 또한, 다른 수용 체에 대 한 갇힌된 ligands가 설계 되었습니다, 우리 수용 체 전화를 자연 살해 세포와 응답에 녹음 방송 요인 NF-κB의 핵 전 좌에 억제 신호를 평가 하기 위해 동일한 전략을 적용할 수 있도록 14,15신호.
이 프로토콜에서 물질로 ligands 그들은 이미징 실험의 기간에 대 한 자극의 고정, 편광 소스로 유지 되도록 움직일 수 있다. 이 방식은 셀 분극의 연구에 적합 합니다. 그러나 그것은 TCR photoactivation 접근 쉽게 지원된 지질 bilayers에 일시적으로 제어 T 세포 활성화에 대 한 적응은 주목 해야한다. 물론, 하나 이런이 맥락에서 지속적인, 편광 자극을 얻을 수 없다. 그러나, 실험 목표 부여이 필요 있을 수 있습니다.
시스템은 또한 decaging에 대 한 UV 광원에 대해 매우 유연. 그러나 현재, 100 W Hg 램프 펄스 질소 레이저 (펄스 폭 4 ns, 펄스 에너지 120 엠 제이), 이전에 사용한6집중된 조명, 사용 됩니다. 때때로, 소형 UV 램프 (365 nm, 4 W) 이미징 샘플 위에 photostimulatable ligand의 큰 영역을 decage 위해 배치 되었습니다. Decaging 시스템의 특정 기능은 문제의 실험의 기술적 요구 사항에 따라 각 경우에 합니다.
이 시스템을 구현할 경우는 관찰은 photoactivation 이벤트 및 스 퓨 리 어스 수용 체 활성화 또는 UV 유도 photodamage 아닌 결과 대 한 구체적인 확인 중요 하다. 이러한 아티팩트를 배제 하기 위해 두 개의 특이성 컨트롤을 수행할 수 있습니다. 첫째, 형광 강도 photoactivation 실험 동안 직접 조사 하지 셀에 모니터링할 수 있습니다. 표면이 제대로 감 금, 감지할 경우이 셀에 응답 (예: 그림 5C) 관찰 하지 해야. 둘째, 어떤 T 세포는 photoactivatable ligands 부족 하는 표면에 UV 방사선 실험을 수행할 수 있습니다. 이 컨트롤은 photoactivatable ligand의 독립적인 UV 유도 효과 식별 하는 데 중요 한 (예를 들어 참조 6 참조). 시스템 최적화 하는 동안 그것은 또한 매우 도움이 손을 강력한 세포 이미징 응답 (예: Grb2 GFP 모집)을 신속 하 고 지역화 된. 신호 이벤트와 photoactivation 사이의 상관 관계를 평가 하는 것은 그 이벤트 spatiotemporally 인접 수용 체 자극 하는 경우 훨씬 더 간단 합니다.
Photoactivation 접근 제공 절묘 한 spatiotemporal 제어 신호 하는 수용 체, 하지만 그것은 transfectable optogenetic 시스템16,,1718,19에서 제공 하는 적응성 부족 ,20,,2122. 특정 optogenetic 단백질 photoreversible, 여기서 설명 하는 photoactivation 방식으로 사용할 수 있는 조건부 컨트롤을 제공 하 고 있습니다. 그러나 Optogenetic 시스템에서, photoactivated 단백질의 확산을 제한 기술적 도전 이다. 이 복잡 subcellular 맥락에서 특히 편광 신호 분석.
하나는 또한이 photoactivation 시스템의 매력적인 엔터티는 타고 난 세포 세포 상호 작용의 모든 측면을 정리 수 없다 유리 표면 주의 해야. 신호 개시의 spatiotemporal 제어를 유지 하면서이 문제를 회피, 조사자 사용 광학 트랩 시스템 T 세포 접촉 송출 될 cytoskeletal 재배열 및 IS 성숙의 개시에 대 한 수를가지고 실시간으로23에 시각. 이 시스템은 정확한 개시 및 실제 APC를 사용 하 여 cytoskeletal 역학의 시각화 수 있습니다, 하지만 그것은 상대적으로 낮은 처리량 이며 부정적인 이미지 품질에 영향을 TIRF 조명와 호환 되지 않습니다.
결론적으로,이 프로토콜에서 설명 하는 방법을 제공 합니다 spatiotemporal TCR 활성화에 따라 빨리 생 화 확 적인 변경의 설명에 대 한 궁극적으로 허용 하는 T 세포 내 신호 TCR 유도. 이 시스템 어떻게 TCR 활성화 다음 신호 이벤트 홍보 T 셀 분극, IS 형성, 그리고 궁극적으로 이펙터 응답의 더 나은 이해 하는 수단으로 우리를 제공 합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리는 조언과 지원을 위한 Huse 실험실의 구성원 감사. 미국 국립 보건원 (R01-AI087644 수소) 및 P30-CA008748 기념 슬로 안-Kettering 암 센터에 의해 지원.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass | Thermofischer Scientific | 155361 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P2636 | Will need to make Biotinylated Poly-L-Lysine |
| EZ-Link NHS-Biotin | Thermofischer Scientific | 20217 | Will need to make Biotinylated Poly-L-Lysine |
| Streptavidin | Thermofischer Scientific | 434301 | |
| BirA-500: BirA biotin-protein ligase standard reaction kit | Avidity | BirA500 | Will be used to biotinylate proteins |
| Biotinylated Hb I-EK | For protein folding, see reference 6. For biotinylation, use BirA kit | ||
| Biotinylated NPE-MCC I-EK | Anaspec | Custom NPE-MCC (H-ANERADLIAYL-K(Nvoc)-QATK-OH) can be purchased from Anaspec | |
| Biotinylated αH2-Kk antibody | BD Biosciences | 553591 | |
| Biotinylated NPE-OVA H2-Kb | Anaspec | Custom NPE-OVA (H-SIINFE-K(Nvoc)-L-OH) can be purchased from Anaspec | |
| Biotinylated KAVY H2-Db | Anaspec | Custom synthesized protein (KAVYDFATL) can be purchased from Anaspec | |
| Biotinylated ICAM1 | For protein folding, see reference in protocol. For biotinylation, use BirA kit | ||
| Hand held UV lamp | UVP | UVGL-25 | Lamp is held < 1 cm from the sample. 30 s of 365 light is sufficient for detectable decaging, 20 min for quantitative decaging. |
| Olympus IX-81 OMAC TIRF system. | Olympus | Additional information about the imaging system can be found in Figure 6 | |
| Mosaic digital diaphragm | Andor | ||
| Slidebook software | Intelligent Imaging Innovations |
References
- Dustin, M. L., Chakraborty, A. K., Shaw, A. S. Understanding the structure and function of the immunological synapse. Cold Spring Harb.Perspect.Biol. 2, a002311 (2010).
- Liu, X., Huse, M. Immunological Synapse Formation: Cell Polarity During T Cell-APC Interaction. Cell Polarity 1. , 247-275 (2015).
- Bunnell, S. C., Kapoor, V., Trible, R. P., Zhang, W., Samelson, L. E. Dynamic actin polymerization drives T cell receptor-induced spreading: A role for the signal transduction adaptor LAT. Immunity. 14, 315-329 (2001).
- Dustin, M. Insights into Function of the Immunological Synapse from Studies with Supported Planar Bilayers. Current topics in microbiology and immunology. 340, (2010).
- Chauveau, A., Le Floc'h, A., Bantilan, N. S., Koretzky, G. a, Huse, M. Diacylglycerol kinase α establishes T cell polarity by shaping diacylglycerol accumulation at the immunological synapse. Sci. Signal. 7, ra82 (2014).
- Huse, M., et al. Spatial and Temporal Dynamics of T Cell Receptor Signaling with a Photoactivatable Agonist. Immunity. 27, 76-88 (2007).
- Quann, E. J., Merino, E., Furuta, T., Huse, M. Localized diacylglycerol drives the polarization of the microtubule-organizing center in T cells. Nat Immunol. 10, 627-635 (2009).
- Basu, R., Chen, Y., Quann, E. J., Huse, M. The variable hinge region of novel PKCs determines localization to distinct regions of the immunological synapse. PLoS One. 9, 1-8 (2014).
- Liu, X., Kapoor, T. M., Chen, J. K., Huse, M. Diacylglycerol promotes centrosome polarization in T cells via reciprocal localization of dynein and myosin II. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 11976-11981 (2013).
- Quann, E. J., Liu, X., Altan-Bonnet, G., Huse, M. A cascade of protein kinase C isozymes promotes cytoskeletal polarization in T cells. Nat. Immunol. 12, 647-654 (2011).
- Boniface, J. J., Reich, Z., Lyons, D. S., Davis, M. M. Thermodynamics of T cell receptor binding to peptide-MHC: evidence for a general mechanism of molecular scanning. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 11446-11451 (1999).
- Garboczi, D. N., Hung, D. T., Wiley, D. C. HLA-A2-peptide complexes: refolding and crystallization of molecules expressed in Escherichia coli and complexed with single antigenic peptides. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 3429-3433 (1992).
- Huse, M., Lillemeier, B. F., Kuhns, M. S., Chen, D. S., Davis, M. M. T cells use two directionally distinct pathways for cytokine secretion. Nat. Immunol. 7, 247-255 (2006).
- Abeyweera, T. P., Merino, E., Huse, M. Inhibitory signaling blocks activating receptor clustering and induces cytoskeletal retraction in natural killer cells. J. Cell Biol. 192, 675-690 (2011).
- Nguyen Duc, T., Huse, M. A Generalizable Platform for the Photoactivation of Cell Surface Receptors. ACS Chem. Biol. 10, 2435-2440 (2015).
- Airan, R. D., Thompson, K. R., Fenno, L. E., Bernstein, H., Deisseroth, K. Temporally precise in vivo control of intracellular signalling. Nature. 458, 1025-1029 (2009).
- Xu, Y., et al. Optogenetic control of chemokine receptor signal and T-cell migration. Proc. Natl. Acad. Sci. 111, 6371-6376 (2014).
- Levskaya, A., Weiner, O. D., Lim, W. A., Voigt, C. A. Spatiotemporal control of cell signalling using a light-switchable protein interaction. Nature. 461, 997-1001 (2009).
- Guntas, G., et al. Engineering an improved light-induced dimer (iLID) for controlling the localization and activity of signaling proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. 112, 112-117 (2015).
- Wu, Y. I., et al. A genetically encoded photoactivatable Rac controls the motility of living cells. Nature. 461, 104-108 (2009).
- Pathak, G. P., Vrana, J. D., Tucker, C. L. Optogenetic control of cell function using engineered photoreceptors. Biol. cell/under auspices Eur. Cell Biol. Organ. 105, 59-72 (2014).
- Grusch, M., et al. Spatio-temporally precise activation of engineered receptor tyrosine kinases by light. EMBO J. 33, 1713-1726 (2014).
- Yi, J., et al. Centrosome repositioning in T cells is biphasic and driven by microtubule end-on capture-shrinkage. J. Cell Biol. 202, 779-792 (2013).
