Summary
Det här protokollet beskriver en imaging-baserad metod för att aktivera T-lymfocyter som använder photoactivatable peptid-MHC, möjliggör exakt spatiotemporal kontroll av T-cellsaktivering.
Abstract
T-lymfocyter engagera sig i snabb, polariserade signalering, som uppträder inom minuter efter TCR aktivering. Detta inducerar bildandet av immunologisk synaps, en stereotyp cell-cell korsningen som reglerar T cellaktivering och directionally mål effektor svaren. För att studera dessa processer effektivt, krävs en tänkbar strategi som är anpassad till fånga snabb, polariserade svaren. Det här protokollet beskriver ett sådant system, som bygger på en photoactivatable peptid-major histocompatibility complex (pMHC) som är icke-stimulerande tills det utsätts för ultraviolett ljus. Riktade decaging av denna reagens under videomicroscopy experiment möjliggör exakt spatiotemporal kontroll av TCR aktivering och högupplösta övervakning av efterföljande cellulära svar av Totalreflexion (Frida) imaging. Detta tillvägagångssätt är också kompatibel med genetiska och farmakologiska störning strategier. Detta möjliggör montering av väldefinierade molekylära vägar som länkar TCR signalering till bildandet av de polariserade cytoskeletal strukturer som ligger bakom immunologisk synaps.
Introduction
T-lymfocyter (T-celler) spelar en central roll i cellulär immunitet genom att erkänna antigen peptider visas i samband med cellytan MHC. Antigen erkännande, som medieras av TCR, driver differentiering av naiva T-celler och främjar leverans av cytolytisk och kommunikativa svar av effektor populationer. TCR interaktion inducerar också dramatiska förändringar i cellulära arkitektur. Inom minuter gloms T-cellerna på sidan av den antigen-presenterande cellen (APC), bildar en polariserad gränssnitt som kallas immunologisk synaps (IS)1,2. IS förstärker T cell effector Svaren genom att aktivera riktad frisläppandet av cytokiner eller, när det gäller cytotoxiska T-lymfocyter (CTL), lytisk proteiner som förstör APC.
TCR interaktion av pMHC inducerar den snabba fosforyleringen av flera nedströms adapter molekyler, inklusive Linker för aktivering av T-cellerna (LAT), som i slutändan främjar robust remodeling av synaptic cytoskelettet2. Kortikala fintrådiga aktin (F-aktin) driver T cell spridning över APC ytan, och sedan löser in en ringformig struktur som kännetecknas av F-aktin ackumulering vid IS periferi och utarmning från centrum. F-aktin ring bildandet är tätt kopplade till reorientationen av mikrotubuli organisera center (MTOC, även kallad centrosome i T-celler) till en position strax under mitten av gränssnittet. Båda händelserna inträffar inom minuter om inledande antigen erkännande och upprätta det arkitektoniska sammanhang i vilka efterföljande aktivering händelser och effektor Svaren används.
För att studera är bildning, har olika labs utvecklat metoder som APC ska ersättas med en glasyta som antingen innehåller immobiliserade TCR ligander eller stöder en lipid lipidens att själv innehåller ligander3,4. T-celler bildar IS-liknande kontakter på dessa ytor som kan avbildas av totalreflexion fluorescens Mikroskop (Frida) eller konfokalmikroskopi, aktivera högupplösta studier av tidig T cellaktivering och IS bildas.
Även om dessa metoder har tillåtit för utmärkt visualisering av färdigmonterad är, sker mycket av den signalering följande TCR:pMHC ligation inom sekunder, komplicerande ansträngningar för att fastställa händelseförloppet efter TCR aktiveringen exakt . För att kringgå problemet, har en ljusaktivering strategi utvecklats, där photoactivatable pMHC används för att uppnå spatiotemporal kontroll av TCR aktiveringen5,6,7. I detta system, är T-celler kopplade till glasytor som innehåller photoactivatable pMHC som är icke-stimulerande till TCR tills bestrålas med ultraviolett (UV) ljus. UV-bestrålning av en micron storlek region av ytan under den T-cellen tar bort den photocage att skapa en stimulerande zon som kan kännas igen av T-cellen. Efterföljande signalering händelser och cytoskeletal remodeling övervakas sedan använder genetiskt kodade fluorescerande reportrar. Två photoactivatable versioner av antigena peptider, moth cytokrom c88-103 (MCC) och äggalbumin257-264 (ägg), som presenteras i samband med klassen II MHC-Ek och klassen jag MHC H2-Kb, respektive, har varit utvecklade (figur 1). Detta gör analysen av både CD4+ T-celler specifika för MCC-jag-EKarlsson (som uttrycker den 5 C. C7, 2B4, eller och TCRs) och CD8+ T-celler specifika för ägg-H2-Kb (som uttrycker OT1 TCR).
Under det senaste decenniet, har en TCR ljusaktivering och imaging strategi utnyttjats att upprätta precisa kineticsen av tidig TCR signalering steg och också att identifiera de molekylära vägar som reglerar polariserade cytoskeletal remodeling5, 6 , 7 , 8 , 9 , 10. till exempel analysen var instrumental i att fastställa att centrosome omorientering mot APC medieras av en lokaliserad gradient av de lipid andra messenger diglyceridolja centrerad på IS. Det förväntas att denna metod kommer att vara värdefullt för program som kräver hög upplösning imaging analys av T-cellsfunktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. beredning av stimulerande glasytor
- Coat åtta-väl kamrar täckglas med biotinylerade poly-L-lysin (Bio-PLL) utspädd 1: 500 i destillerat avjoniserat vatten (ddH2O). Inkubera i 30 min i rumstemperatur (RT).
- Tvätta med H2O.
- Torka i 2 h på RT.
- Blockera Bio-PLL belagda ytor med blockerande buffert (HEPES-buffrad koksaltlösning [10 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl], med 2% BSA) under 30 minuter vid RT.
- Lös 5 mg poly-L-lysin hydrobromid i 1 mL 10 mM NaPO4, pH 8.5.
- Lägg till 125 μmol (0.55 mg) av NHS-biotin (från en 100 mg/mL lager i DMSO) och kontrollera pH-värdet i reaktionen. Om pH är lägre än 8,5, tillsätt 2 μL av 4 N NaOH att höja den till mellan pH 8,5 och 9,5.
- Virvel för 30 min.
- Släcka reaktionen med 50 μl av 100 mM glycin upplöst i 20 mM Tris pH 8,0.
- Snurra på full effekt i ca 10 min och överför supernatanten till en ny tub.
Obs: Bio-PLL kvalitet är normalt jämfört med föregående preparat av beläggning tvåfaldigt seriespädningar av materialet på en tallrik med 96 brunnar i ELISA och kvantifiera biotin innehåll efter inkubation med alkaliskt fosfatas tillsammans streptividin.
- Ta bort blockerande buffert. Låt inte brunnarna torka. Lägga till streptividin (100 µg/mL i blockerande buffert). Inkubera i 1 h vid 4 ° C.
- Tvätta i HBS. Fyll och Invertera kammare bild brunnar 4 - 5 gånger, ta bort HBS från brunnarna. Låt inte brunnarna torka.
- Tillsätt biotinylerade pMHC ligander och adhesionsmolekyler på ytan.
Obs: MCC och ägg kan vara photocaged genom att lägga till ortho-nitrobenzyl baserade skydda grupper (t.ex. nitrophenylethyl (NPE) eller nitroveratryloxycarbonyl (NVOC)) till ε-amino gruppen av viktiga lysines (K12 i MCC, K7 i ägg). Photocaged MCC och ägg kan erhållas från kommersiella leverantörer. Efter beredning i vattenlösning buffert, de är refolded till bacterially uttryckt-Ek och H2-Kb använder etablerade metoder11,12. - Validering av photoactivatable MCC eller ägg peptid
- Decage NVOC-skyddade peptider av UV bestrålning med en handhållen UV-lampa (se Tabell för material) i 20 min på RT.
- Pulse 1,0 x 105 trupptransportfordon med 1 µM av nonstimulatory peptid (negativ kontroll, e.g. Hb), obestrålat photoactivatable peptid, bestrålade photoactivatable peptid, och agonist peptid (positiv kontroll, t.ex., MCC) för 1 h till över natten vid 37 ° C.
- Att stimulera T-celler som uttrycker den 5C. C7/2B4/och TCR, använda CH12 eller CH27 B celler. För att stimulera OT1 T-celler, använda RMA-s eller EL4 thymoma celler.
- Blanda de pulsade trupptransportfordon med lika antal T-celler i 96-väl rund botten pläterar på en slutlig volym av 200 µL. Inkubera vid 37 ° C i 12-24 h.
- Återställa supernatanterna från varje brunn och analysera IL-2 av ELISA med streptividin-pepparrot peroxidas kolorimetriska upptäckt.
Obs: Bekräftelse av caging status för alla peptider av elektrospray masspektrometri före vika in MHC komplex, rekommenderas starkt.
- Utföra vikning och rening av MHC för att minimera exponering för ljus. Till exempel wrap fällbara reaktioner i aluminiumfolie och genomföra gel filtrering kromatografi med UV-lampa off.
Obs: Det har varit hittade att photoactivatable MCC-jag-Ek och OVA - H2-Kb inducera UV oberoende T-cellsaktivering på hög densitet, möjligen på grund av ofullständig funktionella kasse. Därför, den photoactivatable pMHC späds i en 10-30 x överskott av nonstimulatory pMHC (e.g. jag-EKarlsson som innehåller64-76 peptiden hemoglobin (Hb)) under immobilisering steg. Detta förbättrar signal-brus-förhållande av efterföljande imaging experiment. - Till photoactivate CD4+ T celler, kollektivt använder en blandning av biotinylerade Hb-jag-Ek (3 µg/mL), biotinylerade photoactivatable MCC-jag-EKarlsson (0.1 µg/mL) och biotinylerade antikropp mot klassen jag MHC H2-Kk (0,5 µg / mL). anti-H2-Kk antikroppen uppmuntrar 5 C. C7/2B4/och T-celler, som uttrycker H2-Kk, att sprida på glasytan utan att genomgå aktivering.
- För CD8+ T celler, använder en blandning av biotinylerade H2-Db bär peptiden KAVYDFATL (1 µg/mL), biotinylerade photoactivatable ägg-H2-Kb (0.1 µg/mL), och den extracellulära domänen av vidhäftning molekylen ICAM-1 (2 µg/mL producerad av insekt cell kultur13). Den ICAM-1 uppmuntrar nära kontakt bildandet av engagerande integrin LFA1 på T-cellens yta.
- Tillämpa alla protein blandningar i blockerande buffert, följt av inkubation för 1 h på RT eller minst 2 h vid 4 ° C.
Obs: Den molekylära tätheten på ytor av detta slag vara ~ 8000 per µm2 har funnits tidigare fastställd6. Med tanke på att photoactivatable pMHC representerar ~1/30 blirth av biotinylerade protein på ytan, dess densitet ~ 267 molekyler per µm2, före decaging. - Tvätta som i steg 1,6 och lämna i HBS förrän du är klar att använda.
- Lägg till 200.000 CD4+ eller CD8+ T celler uttrycker lämpliga TCR i varje brunn och låta celler att följa vid 37 ° C i 15 min. När cellerna har bifogats och sprids på ytan, är de redo för ljusaktivering och imaging.
Obs: Retrovirala transduktion med effektor T-celler med fluorescerande imaging sonder beskrivs i detalj elswhere6,7. Kalciumsignalering kan också studeras med hjälp av untransduced T-celler som laddad med kalcium känsliga färgämnet Fluo-46. Proportionerlig färgämnet Fura-2 rekommenderas inte eftersom det kräver magnetiseringen i intervallet UV, som också framkallar decaging av den photoactivatable pMHC.
2. bild förvärv
- Använda en inverterad Frida Mikroskop utrustad med en UV kompatibel 150 X objektiv bild förvärv. UV bestråla användardefinierade regioner med hjälp av en digital membran system bifogas en 100 W kvicksilverlampa (HBO). Direkt UV-ljus från denna lampa på provet med en 400 nm lång pass spegel.
- Använda bild analys programvara för lokaliserade ljusaktivering och time-lapse förvärv. I de flesta experiment, övervaka sonder i både gröna och röda kanalerna använder 488 nm och 561 nm excitation lasrar, respektive. Laserljus riktas in på provet med en dual-bandpass dichroic spegel som också överför i intervallet UV (för att decaging). Se Tabell för material och figur 6 för ytterligare information om Mikroskop konfiguration.
- Efter montering i kammaren bilden som innehåller T-cellerna, justera inställningar för att få Frida eller epifluorescence belysning, som behövs. I live-läge, Välj ett fält av celler som uttrycker den fluorescerande probe(s) av intresse. Upprätta micron-skala regioner för ljusaktivering under enskilda celler använder programvarukontroll.
- Börja time-lapse förvärv. Normalt 80 tidpunkter förvärvas, med ett intervall på 5 s mellan varje tidpunkt. Detta lämnar mer än tillräckligt med tid för sekventiell 488 nm och 563 nm exponeringar, när det gäller dubbel färg experiment.
- Efter 10 tidpunkter, photoactivate i utvalda regioner genom att öppna den digitala membranen slutare för 1-1,5 s.
- Efter tidsfördröjning är klar, Välj ett nytt fält av celler och upprepa processen.
3. dataanalys
Obs: Lokaliserade ljusaktivering av immobiliserade ligander skapar en väldefinierad, stillastående stimulerande region som kan användas för kvantitativ analys av signalering svaren och cytoskeletal remodeling händelser. Analys protokoll omfattar vanligtvis antingen kvantifiera fluorescensintensiteten inom regionen bestrålade eller använda bestrålade regionen som en positionella endpoint för avståndsmätningar (t.ex. för att bedöma polarisering av centrosome att den bestrålade regionen). Båda analysprotokoll beskrivs nedan. Olika interaktiva program för analys kan användas för att göra intensitet och avståndsmätningar, som sedan kan utgång för ytterligare bearbetning och analys.
-
Fluorescensintensiteten
- Fastställa fluorescensintensiteten (FI) en bakgrund region utanför cellen (FIb). Detta kommer att användas för bakgrundskorrektion.
- Rita en micron stora fyrkantiga region utanför cellen och göra en mask. För att avgöra fluorescensintensiteten, klicka på analysera | Maskera statistik. Välj Menar fluorescensintensiteten och exportera värdena.
Obs: Processuella detaljer (t.ex. 3.1.1.1) se Slidebook programvara (se Tabell för material). Genomförandet av detta protokoll som använder andra programvarupaket (t.ex., FIJI) blir något annorlunda.
- Rita en micron stora fyrkantiga region utanför cellen och göra en mask. För att avgöra fluorescensintensiteten, klicka på analysera | Maskera statistik. Välj Menar fluorescensintensiteten och exportera värdena.
- Bestämma FI inom regionen photoactivated för varje tidpunkt.
- Välj Mask att markera regionen som var photoactivated. För att avgöra fluorescensintensiteten, klicka på analysera | Maskera statistik. Välj Menar fluorescensintensiteten och exportera värdena.
- Subtrahera bakgrunden FI från FI mätvärdena inom regionen. Sedan, normalisera de korrigera FI mätningarna genom att divideras med genomsnittet, bakgrundskorrigerade FI första 9 bildrutor före ljusaktivering. ΔF/F = ((FI-FIb)/mean(FI1-9)-FIb)).
Obs: Graf ΔF/F som funktion av tiden.
- Fastställa fluorescensintensiteten (FI) en bakgrund region utanför cellen (FIb). Detta kommer att användas för bakgrundskorrektion.
-
Avstånd
- Få x och y koordinater i centrum av regionen photoactivated.
- Att bestämma x och y koordinater i centrum av regionen photoactivated, Välj Mask att markera regionen som var photoactivated. När regionen av ljusaktivering är markerad, Välj analysera | Maskera statistik | Centrum av området och exportera värdena.
- Avgör x- och y-koordinater för fluorescerande sonden av intresse för varje tidpunkt. Detta uppnås vanligen genom antingen manuell eller automatiserad partikel spårning.
- Att bestämma x och y koordinaterna för fluorescerande sonden av intresse, Välj Manuell partikel spårning och klicka på fluorescerande sonden av intresse över tid. När alla tidpunkter har spårats, Välj analysera | Maskera statistik | Centrum av området och exportera värdena.
- Beräkna avståndet mellan fluorescerande proteinet av intresse och centrera av regionen photoactivated för varje tidpunkt med hjälp av ekvation: avstånd = √ ((x2- x1)2+ (y2-y1)2), där x2 och y är2 koordinaterna för fluorescerande proteinet av intresse och x1 och y1 är koordinaterna för centrera av regionen photoactivated.
- Grafen avståndet som en funktion av tiden.
- Få x och y koordinater i centrum av regionen photoactivated.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Metoden ljusaktivering och imaging möjliggör observation och lättköpt kvantifiering av snabb, polariserade signalering svaren. Att illustrera sin kapacitet, återges här är ett experiment att undersöka spatiotemporal korrelationen mellan TCR-inducerad DAG ackumulering och centrosome omorientering. 5C. C7 T cell Blaster var retrovirally sensorik med två fluorescerande reportrar: en DAG biosensor som innehåller tandem C1 domäner från proteinkinas C-θ kopplade till GFP (C1-GFP) och RFP-tubulin för att övervaka centrosome. T-cellerna fästes sedan kamrar täckglas innehållande photoactivatable MCC-jag-EKarlsson. C1-GFP fotograferades med Frida mikroskopi och RFP-tubulin i epifluorescence läge. Som visas i figur 2, framkallar lokaliserade ljusaktivering av ytan under cellen T ansamling av DAG i zonen bestrålade. Detta följs inom sekunder av den nya inriktningen av centrosome till samma region.
C1-GFP ackumulering kan kvantifieras genom att beräkna normaliserade fluorescensintensiteten, efter bakgrundskorrektion, i mitten av regionen photoactivated över tiden (figur 3). Centrosome omorientering som svar på ljusaktivering kan kvantifieras genom att beräkna avståndet mellan centrosome och centrera av regionen photoactivated som en funktion av tiden (figur 4).
Denna metod kan användas för att undersöka ett brett utbud av snabb, polariserade signalering svaren, i princip allt som kan övervakas med hjälp av en fluorescerande sond. Till exempel TCR ljusaktivering används för att övervaka tidiga signalering microcluster formation med fluorescently märkta Grb2 (Grb2-GFP) (figur 5). Liknar den DAG ackumulering och centrosome omorientering svaren, Grb2-GFP polarisering sker strax efter ljusaktivering (figur 5) och kan kvantifieras med hjälp av metoden normaliserade fluorescens intensitet.
Figur 1: Ljusaktivering system med photocaged MCC peptid.
(A) Photocaged strategi för MCC peptid. En NPE grupp är kopplad till lysin återstoden av MCC peptiden. UV-bestrålning resulterar i borttagning av NPE, återställa MCC till dess ursprungliga form. (B) när NPE binds till MCC, 5 C. C7 TCR kan inte bindas till MCC. Borttagning av NPE resultat som ett erkännande av de 5 C. C7 TCR till infödda MCC peptiden. (C) den photocaged strategin har anpassats för att fungera med CD8 + T-celler, där photocaged OVA peptid används för att aktivera OT-1 TCR vid UV-bestrålning.
Figur 2: Time-lapse montage av DAG ackumulation och centrosome omorientering efter ljusaktivering av TCR i 5C. C7 T-cell.
5C. C7 cellen uttrycker en DAG biosensor, innehållande tandem C1-domäner av PKC-smält till GFP (C1-GFP) och tagg-RFP Tubulin (RFP-badkar), fluorescerande reporter för centrosome. Montage illustrera den polariserade Svaren 5 c. C7 T-celler med tiden. De ovala och texten ange tid och plats av ljusaktivering. Med tiden ackumuleras C1-GFP i regionen photoactivated, följt av centrosome omorientering mot regionen photoactivated. Skalstapeln: 10 µm.
Figur 3: Kvantifiering av DAG ackumulering vid regionen photoactivated
DAG, C1-GFP, ackumulering vid photoactivated regionen (vänster) kan kvantifieras genom att beräkna normaliserade fluorescensintensiteten, efter bakgrundskorrektion, på photoactivated regionen (gul cirkel med blå skuggning) över tid. Data är normaliserade i förhållande till de nio bildrutor som erhållits strax före ljusaktivering. C1-GFP berikning på regionen photoactivated kan beräknas genom uppdelningen av genomsnittlig fluorescensintensiteten i regionen bestrålade av genomsnittlig fluorescensintensiteten hos hela cellen, efter bakgrundskorrektion. Ekvationen: ΔF/F = ((FI-FIb)/mean(FI1-9)-FIb)), i vilka FI är medelvärdet fluorescensintensiteten kan användas för att beräkna normaliserade fluorescensintensiteten. Normaliserade fluorescensintensiteten på regionen photoactivated kan sedan visas i diagram som funktion av tiden (höger). Lila linjen visar tiden av ljusaktivering. Skalstapeln: 10 µm.
Figur 4: Kvantifiering av centrosome omorientering.
Bestäm koordinaterna för centrosome (RFP-Tub) över tiden genom att manuellt spåra centrosome vägen mot regionen photoactivated (vit pil) vid varje tidpunkt (vänster). Bestäm koordinaterna för centrera av regionen photoactivated (gul cirkel). Avståndet mellan centrosome och centrera av regionen photoactivated kan beräknas vid varje tidpunkt med hjälp av ekvation för avstånd = √ ((x2- x1)2+ (y2-y1)2), där x2 och y 2 x och y-koordinater för centrera av området av centrosome och x1 och y1 är x och y koordinater i centrum av regionen photoactivated. Distansera av centrosome från centrera av regionen photoactivated vid varje tidpunkt punkt kan sedan visas i diagram som funktion av tiden (höger). Lila linjen visar tiden av ljusaktivering. Skalstapeln: 10 µm.
Figur 5: Grb2-GFP microcluster bildning.
(A) representant 5C. C7 cellen uttrycker fluorescently märkt Grb2 (Grb2-GFP). Montage illustrera den polariserade Svaren Grb2-GFP övertid. De ovala och texten ange tid och plats av ljusaktivering. Över tid ackumuleras Grb2-GFP i regionen photoactivated. (B) kvantifiering av Grb2-GFP fluorescensintensiteten på regionen photoactivated över tid. N = 15 celler. (C) kvantifiering av Grb2-GFP fluorescensintensiteten i en kontrollregion utanför zonen photoactivated. N = 15 celler.
Figur 6: Mikroskop konfiguration för ljusaktivering och Frida imaging.
488 nm och 561 nm lasrar används för Frida och epifluorescence avbildning av gröna och röda sonder, respektive. UV-ljus för ljusaktivering tas från en kvicksilver (Hg) lampa kopplad till en digital membran system kan lysande små, användardefinierade regioner. Av en longpass spegel placerad under dichroic spegeln som reflekterar imaging lasrar reflekteras ljuset från Hg lampa/membranet på provet. Dichroic spegeln måste utformas så att passera UV ljus. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Under de senaste åren har ljus vuxit fram som ett utmärkt verktyg för spatiotemporally kontrollerade aktivering av cellulära processer. Olika metoder har utvecklats, med tillhörande fördelar och nackdelar. Systemet beskrivs här, som är baserad på den decaging av immobiliserade, extracellulär ligander, är idealiskt lämpad för analys av snabba, subcellulär, polariserade signalering svaren. Detta synsätt har tillämpats för att undersöka IS bildas i T-celler som beskrivs ovan. Dessutom har bur ligander för andra receptorer konstruerats, gör det möjligt för oss att tillämpa samma strategi för att bedöma hämmande signalering i naturliga döda celler och translokationen i cellkärnan av Transkriptionfaktorn NF-κB svar betalvägen som receptor signalering14,15.
I detta protokoll, är stimulerande ligander orörlig för att säkerställa att de förblir som en stationär, polariserade källa till stimulans för varaktigheten av imaging experimentet. Denna metod lämpar sig väl för studier av cell polarisering. Det bör dock noteras att TCR ljusaktivering inställning är enkelt anpassas för temporally kontrollerade T-cellsaktivering på stöds lipid lipidmonolager. En uppenbarligen inte kan uppnå varaktig, polariserade stimulering i detta sammanhang. Detta kan vara onödiga, får dock de experimentella mål.
Systemet är också ganska flexibel när det gäller UV ljuskällan för decaging. För närvarande används en 100 W Hg-lampa för fokuserad belysning, men en pulsad kväve laser (puls bredd 4 ns, puls energi 120 mJ), var tidigare använt6. Ibland en handhållna UV-lampa (365 nm, 4 W) har placerats över tänkbar provet för att decage större regioner av photostimulatable ligand. Särdragen i det decaging systemet beror i varje fall på de tekniska kraven i experimentet i fråga.
Vid genomförandet av detta system, är det viktigt att bekräfta att de observerade svaren är specifika för händelsen ljusaktivering och inte ett resultat av falska receptor aktiveringen eller UV-inducerad Fotoskador. För att utesluta dessa artefakter, kan två specificitet kontroller utföras. Först kan fluorescensintensiteten i celler som inte är direkt bestrålade under ljusaktivering experiment övervakas. Om ytan är ordentligt bur, märkbar observeras inte svaren i dessa celler (t.ex. figur 5 c). Andra kan experiment i vilka T celler är UV-bestrålas på ytor saknar photoactivatable ligander utföras. Denna kontroll är avgörande för att identifiera UV-inducerad effekter som är oberoende av photoactivatable-ligand (exempelvis se referens 6). Under systemoptimering är det också extremt bra att ha till hands en robust cellular imaging svar (t.ex. Grb2-GFP rekrytering) som är både snabb och lokaliserad. Det är mycket enklare om dessa händelser är spatiotemporally proximalt receptorn stimulering att bedöma korrelationer mellan signalering händelser och ljusaktivering.
Även om metoden ljusaktivering erbjuder utsökta spatiotemporal kontroll över receptor signalering, saknar det den anpassningsförmåga som ges genom transfectable optogenetic system16,17,18,19 ,20,21,22. Vissa optogenetic proteiner är också photoreversible, att ge villkorad kontroll som inte är tillgänglig med det ljusaktivering tillvägagångssätt som beskrivs här. I optogenetic system är begränsa spridningen av photoactivated proteiner dock tekniskt utmanande. Detta komplicerar analysen av polariserade signalering, särskilt i en subcellulär sammanhang.
Man bör också notera att den vinnande personen för detta ljusaktivering system är en glasyta, som inte kan sammanfatta alla aspekter av en bona fide cell-cell interaktioner. För att kringgå problemet bibehållen spatiotemporal kontroll över signalen initiering, har utredare använt ett system för optisk fälla för att föra en APC i kontakt med en T-cell, möjliggör uppkomsten av cytoskeletal rearrangements och IS mognad vara visualiseras i realtid23. Även om detta system möjliggör exakt initiering och visualisering av cytoskeletal dynamics använder en faktiska APC, det är relativt låg genomströmning och är inte kompatibel med Frida belysning, vilket negativt påverkar bildens kvalitet.
Sammanfattningsvis ger den metod som beskrivs i detta protokoll spatiotemporal kontroll av TCR-inducerad signalering inom cellen T, i slutändan gör det möjligt för förtydligandet av de snabbt biokemiska förändringar efter TCR aktivering. Detta system ger oss ett sätt att bättre förstå hur signalering händelserna efter TCR aktiveringen främja T cell polarisering, IS bildas, och slutligen leverans av effektor svaren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar medlemmar i Huse lab för råd och hjälp. Stöds av de amerikanska National institutionerna of Health (R01-AI087644 till M.H.) och P30-CA008748 till Memorial Sloan-Kettering Cancer Center.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass | Thermofischer Scientific | 155361 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P2636 | Will need to make Biotinylated Poly-L-Lysine |
| EZ-Link NHS-Biotin | Thermofischer Scientific | 20217 | Will need to make Biotinylated Poly-L-Lysine |
| Streptavidin | Thermofischer Scientific | 434301 | |
| BirA-500: BirA biotin-protein ligase standard reaction kit | Avidity | BirA500 | Will be used to biotinylate proteins |
| Biotinylated Hb I-EK | For protein folding, see reference 6. For biotinylation, use BirA kit | ||
| Biotinylated NPE-MCC I-EK | Anaspec | Custom NPE-MCC (H-ANERADLIAYL-K(Nvoc)-QATK-OH) can be purchased from Anaspec | |
| Biotinylated αH2-Kk antibody | BD Biosciences | 553591 | |
| Biotinylated NPE-OVA H2-Kb | Anaspec | Custom NPE-OVA (H-SIINFE-K(Nvoc)-L-OH) can be purchased from Anaspec | |
| Biotinylated KAVY H2-Db | Anaspec | Custom synthesized protein (KAVYDFATL) can be purchased from Anaspec | |
| Biotinylated ICAM1 | For protein folding, see reference in protocol. For biotinylation, use BirA kit | ||
| Hand held UV lamp | UVP | UVGL-25 | Lamp is held < 1 cm from the sample. 30 s of 365 light is sufficient for detectable decaging, 20 min for quantitative decaging. |
| Olympus IX-81 OMAC TIRF system. | Olympus | Additional information about the imaging system can be found in Figure 6 | |
| Mosaic digital diaphragm | Andor | ||
| Slidebook software | Intelligent Imaging Innovations |
References
- Dustin, M. L., Chakraborty, A. K., Shaw, A. S. Understanding the structure and function of the immunological synapse. Cold Spring Harb.Perspect.Biol. 2, a002311 (2010).
- Liu, X., Huse, M. Immunological Synapse Formation: Cell Polarity During T Cell-APC Interaction. Cell Polarity 1. , 247-275 (2015).
- Bunnell, S. C., Kapoor, V., Trible, R. P., Zhang, W., Samelson, L. E. Dynamic actin polymerization drives T cell receptor-induced spreading: A role for the signal transduction adaptor LAT. Immunity. 14, 315-329 (2001).
- Dustin, M. Insights into Function of the Immunological Synapse from Studies with Supported Planar Bilayers. Current topics in microbiology and immunology. 340, (2010).
- Chauveau, A., Le Floc'h, A., Bantilan, N. S., Koretzky, G. a, Huse, M. Diacylglycerol kinase α establishes T cell polarity by shaping diacylglycerol accumulation at the immunological synapse. Sci. Signal. 7, ra82 (2014).
- Huse, M., et al. Spatial and Temporal Dynamics of T Cell Receptor Signaling with a Photoactivatable Agonist. Immunity. 27, 76-88 (2007).
- Quann, E. J., Merino, E., Furuta, T., Huse, M. Localized diacylglycerol drives the polarization of the microtubule-organizing center in T cells. Nat Immunol. 10, 627-635 (2009).
- Basu, R., Chen, Y., Quann, E. J., Huse, M. The variable hinge region of novel PKCs determines localization to distinct regions of the immunological synapse. PLoS One. 9, 1-8 (2014).
- Liu, X., Kapoor, T. M., Chen, J. K., Huse, M. Diacylglycerol promotes centrosome polarization in T cells via reciprocal localization of dynein and myosin II. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 11976-11981 (2013).
- Quann, E. J., Liu, X., Altan-Bonnet, G., Huse, M. A cascade of protein kinase C isozymes promotes cytoskeletal polarization in T cells. Nat. Immunol. 12, 647-654 (2011).
- Boniface, J. J., Reich, Z., Lyons, D. S., Davis, M. M. Thermodynamics of T cell receptor binding to peptide-MHC: evidence for a general mechanism of molecular scanning. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 11446-11451 (1999).
- Garboczi, D. N., Hung, D. T., Wiley, D. C. HLA-A2-peptide complexes: refolding and crystallization of molecules expressed in Escherichia coli and complexed with single antigenic peptides. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 3429-3433 (1992).
- Huse, M., Lillemeier, B. F., Kuhns, M. S., Chen, D. S., Davis, M. M. T cells use two directionally distinct pathways for cytokine secretion. Nat. Immunol. 7, 247-255 (2006).
- Abeyweera, T. P., Merino, E., Huse, M. Inhibitory signaling blocks activating receptor clustering and induces cytoskeletal retraction in natural killer cells. J. Cell Biol. 192, 675-690 (2011).
- Nguyen Duc, T., Huse, M. A Generalizable Platform for the Photoactivation of Cell Surface Receptors. ACS Chem. Biol. 10, 2435-2440 (2015).
- Airan, R. D., Thompson, K. R., Fenno, L. E., Bernstein, H., Deisseroth, K. Temporally precise in vivo control of intracellular signalling. Nature. 458, 1025-1029 (2009).
- Xu, Y., et al. Optogenetic control of chemokine receptor signal and T-cell migration. Proc. Natl. Acad. Sci. 111, 6371-6376 (2014).
- Levskaya, A., Weiner, O. D., Lim, W. A., Voigt, C. A. Spatiotemporal control of cell signalling using a light-switchable protein interaction. Nature. 461, 997-1001 (2009).
- Guntas, G., et al. Engineering an improved light-induced dimer (iLID) for controlling the localization and activity of signaling proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. 112, 112-117 (2015).
- Wu, Y. I., et al. A genetically encoded photoactivatable Rac controls the motility of living cells. Nature. 461, 104-108 (2009).
- Pathak, G. P., Vrana, J. D., Tucker, C. L. Optogenetic control of cell function using engineered photoreceptors. Biol. cell/under auspices Eur. Cell Biol. Organ. 105, 59-72 (2014).
- Grusch, M., et al. Spatio-temporally precise activation of engineered receptor tyrosine kinases by light. EMBO J. 33, 1713-1726 (2014).
- Yi, J., et al. Centrosome repositioning in T cells is biphasic and driven by microtubule end-on capture-shrinkage. J. Cell Biol. 202, 779-792 (2013).
