Summary
本详细的协议描述经颅刺激电极在颞骨上的放置, 以研究经颅电刺激在自由运动大鼠中的短期和远期效果。
Abstract
经颅电刺激 (工商业污水附加费) 是一种强有力的和相对简单的方法来弥漫影响大脑活动, 无论是随机或以闭环事件触发方式。尽管许多研究集中在健康和病理脑中的附加费可能带来的好处和副作用, 但对于刺激的作用机制仍然存在许多基本的开放性问题。因此, 显然需要一种稳健和可重复的方法来检测啮齿动物的急性和慢性附加费的影响。工商业污水附加费可以与常规的行为, 电生理和成像技术结合, 以调查神经网络在体内。经颅内刺激电极的植入不会对实验设计施加额外的限制, 同时它提供了一种多功能的、灵活的工具来操纵大脑活动。在这里, 我们提供了一个详细的, 循序渐进的协议, 以制造和植入经颅刺激电极, 以影响大脑活动在一个世俗的约束方式, 几个月。
Introduction
经颅电刺激 (工商业污水附加费) 是一种有价值的方法, 以影响大脑活动的世俗约束方式。根据刺激电极的大小和位置, 附加费会影响大的脑容量和 entrain 神经元的数量弥漫1,2,3。经颅直接电流刺激已经医学上批准的治疗主要抑郁障碍4,5, 和许多研究的重点是显示经颅刺激的认知效果的人6,7. 此外, 据报, 有关工商业污水附加费在控制癫痫发作的潜力方面有很有希望的结果89。
尽管进行了深入的研究, 但对于详细的操作机制、潜在的副作用以及应用此方法10、11、12的长期结果, 仍然存在许多公开的问题。因此, 有一个健壮的, 可重现的协议, 以研究附加费的影响, 在动物模型是至关重要的。鉴于许多疾病 (例如、抑郁症、癫痫和精神分裂症) 只能在清醒的动物中进行广泛的调查, 这些病症的性质通常需要长期治疗, 我们为慢性大鼠经颅电极植入术。这里提出的方法可以用于行为研究, 也可以结合记录电极植入 (即, 电线, 硅胶探头, juxtacellular 电极) 或与慢性颅窗的电生理实验和影像学研究, 分别。根据实验设计, 刺激的时间可以是随机的或事件触发特定的行为线索, 或特定的大脑状态 (癫痫发作, θ振荡) 的电生理标志8,11,13。
值得一提的是, 与目前使用的人类方法相比, 这是使用电极放置在皮肤上, 在这里我们显示一种方法, 采用皮下植入在颞骨表面, 因为老鼠勉强容忍任何放置在他们的皮肤上, 这是容易接近使用他们的爪子。
根据置换、还原和细化的原则, 由于植入的慢性性质, 这种方法有助于减少动物数量, 因为每种动物可以在不同的实验条件下进行几个月的招募, 允许使用更少的动物来测试各种假说。
在本研究中, 我们提供了一个详细的, 循序渐进的协议, 经颅刺激电极制造 (图 1A-B), 并证明这些电极慢性植入六月大的颞骨雄性长埃文斯鼠。
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Protocol
此处描述的所有方法均符合欧洲共同体理事会 (86/609 ECC) 的指示, 并已获得阿尔贝圣捷尔吉-Györgyi 医学和药物中心的动物研究伦理委员会批准。塞格德 (XIV/218/2016)。
1. 刺激电极的制作
- 要制作一个刺激电极, 切下六10厘米长的微型挂钩线, 在一端卸下2厘米的包覆, 另一端为1厘米。
- 将两根电缆拧在一起, 并在较短的去皮侧焊接。
- 获取带 SOT-353 盒的任何集成电路的三磁带封装。
- 通过包裹的三孔缝上扭曲的电线。较长的剥线部分应在封装的腔内。放置电缆, 使绝缘端与孔的边缘一致。
- 把牙科用的水泥放在孔上修理电线。
注意: 牙科水泥必须足够致密, 以免泄漏进包裹的腔内。 - 一旦水泥固化 (最小10分钟), 翻转包装, 并把一层薄薄的超强力胶水进入孔, 形成一个防水密封向多孔水泥。避免胶合被剥皮的导线。
- 将电缆拧在较短的去皮边上, 然后将其焊接 (图 1A)。
- 用细镊子的尖端抓住电线的较长的去皮段, 滚动它们, 然后将它们封装到腔中 (图 1B)。如有必要, 请切断多余的电缆。
2. 记录电极的制作
- 要制作一个记录三重电极 (图 1C-d), 请使用高速旋转锯切一厘米长的不锈钢管。用锋利的针头从管子的末端取出鳍, 确保管子是干净的碎片并且完全渗透性。
注意: 不要使用钳子, 因为它们会扭曲管子。 - 弯曲镀金板间隔销, 最小长度为3厘米, 以形成 J 形支架。切长腿的 ' J ' 形状, 并焊接在一起, 以恢复原来的形状, 使一个可拆卸的关节之间的长直线部分, 将持有的立体定向装置, 和 ' U ' 形状, 将举行的电极, 并作为一个锚固点.将管子和 "J" 保持架的短腿粘在一起。如有必要, 再粘上1厘米长的钢筋以保持稳定性。
- 用不锈钢、超细剪刀切割3件2.5 厘米长的电极线。确保它是一个清晰和尖锐的切割, 和绝缘在电极线的圆形表面完好无损。还要确保切割尖端没有弯曲, 因为施加的力。弯曲1或2毫米在每个导线的一端在不同的角度 (例如, 一个左直, 一个 45°, 一个直角), 使它们可区分。
- 用导线填满管子, 为实验选择合适的电极间距 (例如, 对于皮质局部磁场电位 (LFP) 和电流源密度 (CSD) 的注册, 建议的导线尖端的凸出管的开口: 分别为4.5 毫米、4.1 毫米和3.7 毫米。注意哪根导线对应于哪个深度保持适当的通道顺序。
- 一旦电线对齐, 并与管平行, 以修复电极线, 放置一滴液体超强力胶水在两端的管与一个尖锐的针。确保胶水是流入管由于毛细管效应, 但不是对记录点在突出的两端。
- 准备一个与所使用的记录系统兼容的适当 microconnector 的电极接口板。
- 将导线的非记录、弯曲端插入与所需记录通道对应的电极接口板的孔中。当所有的导线都就位时, 用镊子将金别针推入孔中。
注: 金别针可以用牙科水泥固定到位, 但在大多数情况下, 即使没有这个安全步骤, 它也足够稳定。
3. 麻醉
- 将动物放置在密封麻醉感应腔内, 在2升/分的医疗空气中填充 4-5% 的异氟醚。
- 当老鼠仰卧时, 将动物从腔室中取出, 放在一个有适当通气鼻片的立体定向的框架内。
- 将异氟醚的水平设置为 2%, 但气流速率应保持不变。检查麻醉的水平。如果没有爪子退缩反射反应捏, 继续, 否则增加麻醉深度。
- 用恒温监测系统监测和维持37至0.5 摄氏度的大鼠体温。在眼睛上涂抹一滴石蜡膏, 防止角膜干燥。如有必要, 在手术中重复这一过程几次。
- 皮下注射0.3 毫克/千克阿托品, 以避免呼吸道粘液形成。每四小时重复一次, 以防手术时间延长。如果需要, 监控呼吸和调节蒸发器。
4. 刺激和记录电极的植入
注: 高压釜所有必要的手术器械, 在全过程中仔细遵循无菌和防腐的一般规则。避免接触手术区外的菌区域。在植入前将电极浸泡在乙醇 (70%) 中30分钟。
- 用理发剪掉头皮上的大部分头发。将脱毛膏涂抹在头皮上, 均匀地涂抹在表面上, 等待几分钟。用刮刀轻轻地除去奶油和剩下的头发。用清水冲洗皮肤, 然后用消毒剂。
- 注射 1-2% 利多卡因 (不超过总剂量7毫克/千克) 皮下麻木皮肤。对眼睛应用一滴兽医软膏 (例如, 石蜡切片)。
- 用手术刀, 从前额到颈部, 在中线上做一个彻底和长 (2 厘米) 的矢状切口。解剖组织, 包括从头骨的骨膜, 然后使用凿子或牙镊子清洁的区域之间的嵴两个颞骨。用四头斗牛犬缩回解剖过的皮肤, 保持头骨外露。
- 轻轻地将细镊子放在颞骨和肌肉的陡峭边缘之间, 并将它们分开。使跳汰运动暴露尽可能多的颞骨的大表面, 最好从枕骨的边缘到冠状缝线的平面, 而不损害肌肉。
- 放置拉钩 bitemporally 以保持颞骨外露。
- 用 1-2 毫升 3% H2O 2 冲洗头骨表面,然后用 1-2 毫升水清洗。
- 将颞骨的表面干燥得很仔细, 用眼棍擦去水分。测试如果刺激电极适合于清洁的垂直头骨表面 (刺激电极的上边缘应该与颞骨嵴的边缘一致)。如有必要, 重新调整斗牛犬和拉钩或用剪刀塑造刺激电极。
- 用导电凝胶填充刺激电极的腔体, 将一层薄薄的胶水放在电极的边缘上。
- 将刺激电极放在颞骨的干面上, 用一个精确的动作, 并将其牢牢地固定在一分钟内, 用细镊子。请确保没有湿气与胶水接触。如果有必要, 用眼棍擦干净。
注意: 如果电极有任何不稳定情况, 请将其取出。清洗后的骨骼, 重复这一步骤与新的刺激电极。 - 将牙科水泥放在刺激电极的边缘, 而组织的渗漏水分则用眼棒持续干燥。用水泥覆盖整个刺激电极。
- 水泥完全硬化后, 对侧侧重复这些步骤。
- 在头骨上钻一些孔, 用于锚固螺钉。把微型螺丝开到洞里, 把牙科水泥放在上面。与螺杆直径相比, 使用10% 直径较小的钻头。
- 根据实验的目的, 无论是焊接连接线两端的电缆, 把它放在表面上, 并盖上水泥, 或继续植入记录电极和光纤, 或准备一个颅骨窗口在头骨上。在后一种情况下, 焊接连接器并将它们锚定到结构末端。如果需要长期的同时附加费和 LFP 录音, 植入上述的电极三胞胎而不是单一的电线。
注意: 此设置允许删除公用模式刺激文物8。有关记录电极植入的详细信息, 请参阅以前的协议14,15。 - 用消毒剂大量冲洗暴露的组织。注射 1-2% 利多卡因 (不超过总剂量7毫克/千克) 皮下。
- Debride 伤口边缘和关闭他们与简单的中断缝合周围的连接器/种植体。用聚维酮碘对伤口进行消毒。
- 注射5毫克/千克 carprofene 皮下。如有必要, 重复此操作。
注: 任何其他止痛药可与当地道德许可委员会规定的要求相匹配。 - 暂停麻醉, 释放 earbars 和鼻甲, 并将动物放在术后恢复笼中恢复知觉。
- 确保动物在术后的第一个小时内受到严密的监督。继续定期监测种植区。
注意: 动物不应被留在无人看管, 直到它恢复足够的意识, 以维持胸骨卧床。单独把动物放到完全恢复过程中。
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Representative Results
慢性刺激电极 (图 1B) 的植入可与记录电极的附加植入 (图 1C-d) 结合使用。这种设置适合于形成按需记录和刺激系统来干扰特定的脑活动。在这里, 我们提出了一个闭环癫痫检测和干预系统的代表性结果, 适用于长埃文斯大鼠表达自发性癫痫 (图 2A)9。这种菌株是已知的短束和行为症状的缺席 (小发作) 癫痫 (图2B)。在癫痫发作的情况下, 由于记录的 intracortical 信号实时分析, 一个触发器发送到一个孤立的刺激发电机在适当的时刻, 以干扰的穗和波活动的大脑。反过来, 刺激发生器通过双时态刺激电极提供电荷平衡的三相刺激, 以阻断癫痫发作的活动。
图 2C-D显示了以时间为目标的刺激在1周至16周内中断持续发作的能力, 这表明植入式刺激电极的健壮性和可靠性。为了将这些结果放在上下文中,图 2E显示中止实验的记录, 在该试验中, 由于电极不正确的密封和固井, 二次组织穿透了颞骨和电极表面 (解剖动物证实了组织入侵)。除了增加刺激电极的阻抗外, 生长的组织也有可能提供电分流。这个实验突出了仔细隔离在刺激实验中获得可靠和可重现结果的绝对重要性。
图 1: 刺激和记录电极制作的步骤.(A) 缠绕在孔上并固定在包装上的绞线, 然后将去皮的导线装入腔内。(B) 刺激电极的最终形式。嵌入: 包装内的电线;(C) 记录电极的侧面视图;(D) 记录电极的顶部视图。插入: 记录站点的尖端, 400 µm 间距。(E) 经颅刺激电极放置的术中图片。刺激电极已经被植入, 以及一些锚固螺钉。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 使用本协议的刺激电极进行闭环扣押干预的代表性结果.(A) 闭环系统概述。三重记录电极植入顶叶皮层, 刺激电极被放置 bitemporally 在头骨上。该大鼠配备了一个头部放大器, 并连接到一个实时的癫痫检测系统。(B) LFP 不间断的穗和波检出 (C和D) 的跟踪示例 LFP 1st和16第周刺激的缉获干预的痕迹.(E) 在刺激电极和颞骨之间的组织生长 (尸检证实) 的情况下, 扣押中断失败的例子请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
该协议最关键的步骤是在骨骼表面上粘附电极包。在封堵不当的情况下, 电极与骨之间形成间隙, 二次瘢痕组织可发育成间隙, 降低刺激质量。在粘附在包裹的步骤中, 骨表面必须是完全干燥的, 在遇到电极不稳定的情况下, 必须将其移除并用新的包替换, 以获得最佳效果。
这种方法的局限性是, 由于手术后皮肤没有完全闭合, 感染的风险相对较高。术后护理在头 4-5 天的恢复期间用消毒剂溶液, 稍后用粉末, 有助于防止感染。在我们的经验中, 这种治疗有利于瘢痕组织的形成, 它可以完全闭合伤口向外部世界。
在这里, 我们提出了最便宜的, 最容易接近的电极制造方法之一, 但根据特殊的需要的特殊实验, 可能需要修改导电材料,例如, 涂层的电缆表面与非极化电极接口材料,例如, PEDOT: PSS。电极封装可以定制, 3 d 打印, 并修改的实验者, 如果我们的建议不符合特定的研究要求。根据我们的经验, 在本研究中制备的经颅电极的大小允许雄性和雌性大鼠在300克体重以上的植入, 但在协议步骤中切割小条可以很容易地减少刺激电极的大小。1.3. 此外, 议定书中所给的所有胶水和牙科水泥都可以替换为替代品, 考虑到外层与组织直接接触, 因此它们应与生物相容。
在本研究中, 我们提供了一个双时态刺激电极制作和植入的协议, 它在技术上简单的执行, 成本效益, 可靠的长期, 允许电刺激实验自由移动老鼠9。当刺激电极放置在颞骨上时, 整个水平颅骨表面被保留为其他植入。此方法可以与常规的电生理15、16、optogenetic17和成像18技术相结合, 提供了多种实验协议组合的可能性。
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Disclosures
Antal Berényi 是 Amplipex 有限公司的所有者和创始人, 是一家制造大规模复用搜索放大器的公司。加博尔·布罗迪 Kozák 和陶马什·巴恩 Földi 没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了 EU-FP7-ERC-2013-Starting 赠款 (337075 号) 的支持, 匈牙利科学院的 "动量" 计划 (LP2013-62) 和 GINOP-2.3. 2-15-2016-00018 赠款。我们感谢 Máté Kozák 记录的刺激和记录电极和 Mihály Vöröslakos 在协议设计期间卓有成效的讨论。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cyanoacrylate liquid | Henkel | Loctite 401 | |
| Cyanoacrylate gel | Henkel | Loctite 454 | |
| Wire for stimulation electrodes | Phoenix Wire Inc. | 36744MHW - PTFE Microminiature Hook-Up Wire | |
| Board spacer | E-tec Interconnect | SP1-020-S378/01-55 | |
| Connector | E-tec Interconnect | P2510I-02 | |
| Tape packaging for stimulation electrodes | Nexperia | 74HC1G00GW | Tape packaging of any integrated circuit with SOT-353 case can be used |
| Grip Cement Industrial Grade | Caulk Dentsply | 675571 (powder) 675572 (solvent) | |
| Electroconductive gel | Rextra | ECG Gel | |
| Recording electrode wire | California Fine Wire Co. | .002 (50 micron) Tungsten 99.95% (CFW Material #: 100-211), HMl-Natural, cut to 3.0 inch pieces, Round, Cut length piece wire | |
| Ultrafine scissors | Hammacher Instrumente | Stainless HSB 544-09 | |
| Stainless steel tube | Vita Needle Company | 29 RW, 304SS Tubing, T.I.G. Welded and Plug | |
| High speed rotary saw | Dremel | Model # 395 | |
| Rotary saw holder | Dremel | Model # 220 | |
| Rotary saw cut-off wheel | Dremel | Model # 409 | |
| Ocular sticks | Lohmann-Rauscher | Pro-ophta Ocular Sticks | |
| Wet disinfectant | Egis | Betadine | |
| Dry disinfectant | Wagner Pharma | Reseptyl-urea | |
| Drilling machine | NSK-Nakanishi United Kingdom | Vmax35RV Pack | |
| Anchoring screws | Antrin Miniature Specialties, Inc. | 000-120x1/16 SL BIND MS SS |
References
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