Summary
Caenorhabditis elegans (C. Elegans) ist ein gutes Modell, axonalen und intrazellulären Transport zu studieren. Hier beschreibe ich ein Protokoll zur in-Vivo -Erfassung und Analyse der axonalen und intraflagellar Transport in C. Elegans.
Abstract
Axonalen Transport und intraflagellar Transport (IFT) sind wesentlich für Axon und Zilien Morphogenese und Funktion. Kinesin-Superfamilie Proteine und Dynien sind molekulare Motoren, die Anterograde und retrograder Transport bzw. regulieren. Diese Motoren verwenden Mikrotubuli Netzwerke als Schienen. Caenorhabditis elegans (C. Elegans) ist eine leistungsstarke Modellorganismus axonalen Transport und IFT in Vivozu studieren. Ich beschreibe hier ein Protokoll zur axonalen Transport und IFT in lebenden beobachten C. Elegans. Beförderten Güter kann durch die Kennzeichnung Ladung Proteine mit fluoreszierenden Proteinen wie grün fluoreszierendes Protein (GFP) visualisiert werden. C. Elegans ist transparent und GFP-Tags Ladung Proteine in bestimmten Zellen unter zellspezifische Promotoren ausgedrückt werden können. Lebende Würmer können durch Microbeads auf 10 % Agarose-Gel fixiert werden, ohne zu töten oder betäuben die Würmer. Unter diesen Bedingungen kann Fracht Bewegung direkt in die Axone und Zilien des Lebens beobachtet werden C. Elegans ohne Dissektion. Diese Methode kann angewendet werden, um die Beobachtung Fracht-Moleküls in alle Zellen durch Ändern der Zielproteine und/oder die Zellen, die, denen Sie in ausgedrückt werden. Grundlegendsten wie molekulare Motoren und Adapter-Proteine, die axonalen Transport und IFT beteiligt sind sind in C. Eleganskonserviert. Im Vergleich zu anderen Modellorganismen, werden Mutanten erhalten und leichter in C. Elegansgepflegt. Kombination dieser Methode mit verschiedenen C. Elegans Mutanten kann die molekularen Mechanismen der axonalen Transport und IFT klären.
Introduction
Live Cell Imaging ist ein wesentliches Instrument für die Analyse von intrazellulären Transport. In neuronale Zellbiologie sind Analysen des axonalen Transports mit live Cell Imaging unerlässlich für das Verständnis der neuronalen Funktion und Morphogenese1. Mängel im axonalen Transport unterliegen verschiedenen neurodegenerativen Erkrankungen2. Kinesin-Superfamilie Proteine und Dynien durchführen bzw. axonalen Transport Anterogradely und Doppelthebel,1,2.
Zilien sind ein weiteres zellulären Fach, in dem die Mikrotubuli Netzwerk und Menschenhandel Maschinen hochentwickelte3sind. Protein Synthese Maschinen ist nicht in Zilien, lokalisiert, d.h. ciliary Proteine zu den Zilien-Tipps aus dem Zytoplasma transportiert werden müssen. Zilien-spezifische Kinesin und Dynien, namens Kinesin-2 und zytoplasmatischen Dynien-2, bzw., transport der Komponenten der Zilien4, in ein Phänomen namens intraflagellar Transport (IFT)5. Beeinträchtigung der IFT verursacht ein Spektrum von Krankheiten genannt Ciliopathies6. Somit ist Analyse der IFT-Mechanismus von live Cell Imaging erforderlich grundlegende Mechanismen der ciliary Entstehung und Pathogenese zu verstehen.
Caenorhabditis elegans (C. Elegans) ist ein gutes Modell, axonalen Transport und IFT7,8,9zu studieren. Um IFT zu beobachten, hat Chlamydomonas als Modell Organismus5,6verbreitet. Wie Chlamydomonas eines einzelligen Organismus ist, wäre das Verhältnis von IFT mit Altern, neuronale Funktion und Verhalten schwer zu analysieren. Darüber hinaus wurden wichtige genetische Techniken wie CRISPR/Cas9 nicht auf Chlamydomonasangewendet. Bei höheren Modellorganismen wie Mäuse und Drosophilaverursacht Störung des axonalen Transports und IFT oft tödliche Phänotypen, weil axonalen Transport und IFT für die Morphogenese und Homöostase der Tiere 10notwendig sind, 11. Bei Mäusen ist Zellkultur und Transfektion in der Regel zu beobachten axonalen Transport und IFT, wonach viele Fähigkeiten und umfangreiche Zeit12,13erforderlich. Darüber hinaus kann viele wichtige physiologische Zusammenhänge in kultivierten Zellen und Zell-Linien verloren gehen. C. Elegans Mutanten in denen axonalen Transport oder IFT werden gestört, weil das Nervensystem nicht essentiell für das Überleben der Würmer ist, sind oft nicht tödliche7,9,14. Axonalen Transport und IFT können direkt in Vivo ohne Dissektion beobachtet werden, weil C. Elegans transparent ist und deshalb einfach zu GFP-Tags Marker zu beobachten.
Es gibt mehrere Protokolle, C. Elegans, z. B. die Verwendung eines mikrofluidischen Gerät15, Agarose-Pads mit Anästhesie16oder Microbeads17zu immobilisieren. Die Einbeziehung der Narkose kann der Menschenhandel Ereignisse in Neuronen15hemmen. Ein klarer Nachteil der Mikrofluidik-Gerät Methode ist, dass die Vorbereitung einer mikrofluidischen Gerät nicht immer einfach ist. Immobilisierung von Agarose-Pads und Microbeads ist stattdessen eine bequeme und einfache Möglichkeit, Time Lapse Bildgebung in C. Elegansdurchzuführen. Ich beschreibe hier dieses grundlegende Protokoll zu immobilisieren C. Elegans und visualisieren axonalen Transport und IFT in Vivo in C. Elegans. Im Vergleich zu anderen Methoden, die hier beschriebene Methode erfordert keine spezielle Ausrüstung und ist viel billiger und leichter durchzuführen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Probenvorbereitung
- erzeugen eine transgene C. Elegans Belastung mit transgenen Methoden 18. Alternativ erhalten Sie geeignete Stämme von Caenorhabditis Genetik Center (CGC). Um axonalen Transport von synaptischen Vesikel Vorstufen zu visualisieren, verwenden die transgene Linie wyIs251 [Pmig-13::gfp::rab-3] 7. IFT, transgene Linie mnIs17 [Osm-6::gfp] 19 erhalten zu beobachten. Diese Stämme sind in diesem Protokoll verwendeten.
Hinweis: Entweder extrachromosomale Array, genomischen Integration oder sogar GFP Knock-in arbeitet. Um Hintergrund Signale zu reduzieren, verwenden Sie zellspezifische Promotoren, sondern als Pan-neuronale Promotoren.
Hinweis: Die Wartung von Würmern ist in anderen Protokollen 20 beschrieben. Belastungen wurden mittlere (NGM) Platten (1,7 % (w/V) Agarose, 50 mM NaCl, 0,25 % (w/V) Pepton, 1 mM CaCl 2, 5 mg/mL Cholesterin, 25 mM KH 2 PO 4, 1 mM MgSO auf Rasen Escherischia coli OP50 Feeder auf Nematoden Wachstum beibehalten. 4 auf 60 mm Durchmesser Kunststoffgeschirr) bei 20 ° c - Grow worms bei 20 ° C auf NGM Platten zu jeder Phase des Lebenszyklus der Würmer.
Hinweis: Man kann in jedem Stadium axonalen Transport und IFT beobachten. Späten L4 zu jungen Erwachsenen ist eine gute positive Kontrolle, weil mehrere Publikationen, diese Phasen und visualisierte Menschenhandel Veranstaltungen 14 , 21 , 22 verwendet haben , 23.
2. Vorbereitung von 10 % Agarose
Hinweis: viele Hersteller bieten ähnliche Produkte wie Agar Agar Pulver und Agarose. Verwenden Sie Elektrophorese Klasse Agarose (Stärke-gel > 1200 g/cm 2). Billige Agar Pulver nicht funktionieren, weil die resultierende Gel nicht stark genug ist, um Würmer zu immobilisieren.
- Mix 0,4 g Agarose in 4 mL destilliertem Wasser (DW) in einer Glasröhre (1,5 cm x 10,5 cm). Setzen Sie einen Deckel auf die Glasröhre um Verdunstung zu vermeiden.
- Setzen das Glasrohr auf einem Heizblock 95 ° C für 90 min. Darüber hinaus bereiten Sie ein weiteres Glasrohr (1,5 cm x 10,5 cm) gefüllt mit DW und halten Sie es bei 95 ° c stellen einen Pasteur Pipettieren in der 95 ° C DW ( Abb. 1 A). Viele kleine Bläschen zu sehen, in der Agarose-Röhre und die Lösung trüb werden sollte. Lassen Sie es, bis die Lösung klar wird. Dann mischen Sie durch Pipettieren rauf und runter, bis die Agarose-Lösung homogen wird.
Hinweis: Mikrowellen können nicht verwendet werden, zur Vorbereitung von 10 % Agarose-Lösung, wenn aus DW und Agarose. Kleine Bläschen, die durch Mikrowellen verursacht verhindern Agarose schmelzen. Jedoch kann wieder mit Hilfe einer Mikrowelle erstarrten 10 % Agarose-Gel leicht geschmolzen werden. Glasröhren mit 10 % Agarose-Gel werden vor der Zeit vorbereitet und bei 4 ° C für mindestens 6 Monate gelagert. Wenn dabei schmelzen die Lager mit Hilfe einer Mikrowelle bei Bedarf und ab Schritt 3 in diesem Protokoll.
Hinweis: Agarose verliert allmählich die Fähigkeit zu verfestigen, wenn für eine lange Zeit oder nach wiederholten Erstarrung und schmelzen bei 95 ° C inkubiert. In diesem Fall bereiten neue 10 % Agarose.
3. Vorbereitung der Agarose Pad
- mit der erwärmten Pasteur Pipettieren vorbereitet im Schritt 2.2, legen Sie 2 Tropfen 10 % Agarose auf einer Folie 76 x 22 mm.
- Erstarrt schnell Abdeckung mit einer zweiten 76 x 22 mm 2 Folie vor der Agarose-Tropfen, wie in Abbildung 1 B, und drücken Sie unten auf der zweiten Folie gezeigt, die Agarose-Lösung zu vereinfachen. Die Dicke sollte 0,5-1 mm.
- Spülen schnell Pasteurpipette Pipettieren 95 ° c DW rauf und runter, bis die Agarose-Lösung ausgewaschen ist. Andernfalls wird das Pipettieren von Agarosegel verstopft werden. Lassen Sie die Pipette stehen in der 95 ° C DW.
- Für 1 min warten. Die Agarose-Pad bildet und wird trüb. Schieben Sie die Folien voneinander entfernt per Hand ( Abbildung 1 C).
4. Montage von Würmern
Hinweis: bereits geringe Mengen an Wurm Bewegung verhindern gute Beobachtung. Levamisol hat traditionell verwendet, um zu verhindern, dass Wurm Bewegung auf die Agarose Pad 24 , 25. Jedoch Levamisole hemmt neuronale Rezeptoren in C. Elegans und deshalb beeinträchtigen Menschenhandel Ereignisse in Neuronen 15. Mit Polystyrol Microbeads beschriebenen Hereis eine gute alternative 17.
- Unter dem Stereo-Mikroskop mit einer verschiebbaren Spiegel durchleuchtbaren ausgestattet, übertragen ~ 30 transgenen Würmer mit dem Ausdruck der entsprechenden Markierungen, um eine neue NGM Platte ohne Bakterien mit einem Platindraht holen.
Hinweis: Eine Platindraht Pick ist aus Platindraht und Pasteur-Pipette (5 Zoll), und die Spitze der Platindraht wurde dem Erdboden gleichgemacht. Die Vorbereitung der Platindraht Picks und Handhabung von Würmern mit diesen sind beschrieben in der Wormbook (http://www.wormbook.org). - Lassen Sie die Platte für 1 min. Bakterien werden automatisch entfernt von den Oberflächen des Würmer wie die Würmer auf NGM Agarose-Gel ohne Bakterien bewegen.
- Put a 0.5-1.0 µL Tropfen 2,6 % 100 nm Durchmesser Polystyrol Microbeads im Wasser auf das Agar-Pad ( Abbildung 1 D). Übertragen Sie 10-20 Würmer aus der bakterienfrei NGM-Platte auf die Microbeads. Tropfen und Verbreitung der Würmer mit der Platindraht auswählen, um zu vermeiden, die Überlappung der Wurm stellen ( Abbildung 1 E).
- Gelten ein 22 x 40 mm 2 Deckglas ( Abbildung 1 F). Drücken Sie vorsichtig um Luftblasen zu entfernen, aber vermeiden vernichtende Würmer. Die Probe ist nun bereit für die Abbilderstellung.
Hinweis: Da keine Narkose verabreicht wird, sind Würmer nur durch die Reibungskraft, erzeugt durch die Agar-Pad, Polystyrol Microbeads und Deckglas 17 behoben. Das Vorhandensein von Feeder Bakterien und/oder zuviel Lösung wird die Reibungskraft schwächer machen.
Hinweis: Verschiedene Größen von Deckgläsern (z.B., 22 x 22 mm 2, 18 x 18 mm 2) arbeiten. Jedoch größere Deckgläsern können verhindern, dass Wasser eintauchen oder Öl aus der Austritt von Flüssigkeit ins Proben während der Beobachtung Objektivlinse.
5. Beobachtung
Hinweis: geeignete bildgebende Parameter (Laserleistung, Gewinn, binning, etc.) werden für jedes Mikroskop und Kamera unterscheiden. Hier dient ein Weitfeld-Mikroskop mit drehenden Scheibe konfokale Scanner und eine digitale CCD-Kamera ausgestattet.
- Stellen der Temperaturregler der Bühne auf 20 ° C, oder passen Sie die Raumtemperatur auf 20 ° c
- Setzen die Beispielfolie auf den Mikroskoptisch. Verwenden Sie 100 X (numerische Apertur = 1,3 oder besser) Objektivlinse.
- Achten Sie auf die jeweiligen Bereiche in Abbildung 2 A (für wyIs251 und axonalen Transport) oder Abbildung 2 B (für mnIs17 und IFT) als Positivkontrollen . Andere Bereiche können analysiert werden, wie gut 22.
- Set-Parameter (CCD Gain = 200, Binning = 1 oder 2, Laserleistung bei 488 nm = 1,0-1,3 mW). Zeitraffer Zeiterfassung mit 4 Frames pro Sekunde für bis zu 1 min. Speicherdateien als Tcl/TK-TIFF-Format durchführen.
Hinweis: Wenn GLP signalisiert verschwinden und es ist schwierig, weiterhin beobachten, GFP::RAB-3 oder OSM-6::GFP für 30 s, die Laserleistung ist zu stark. In diesem Fall reduzieren Sie die Laserleistung. Umgekehrt, wenn keine vesikuläre Bewegung erfasst wird, ist die Laserleistung zu schwach. In diesem Fall erhöhen die Laserleistung. - Beobachten einen anderen Wurm und 5.3 und 5.4 wiederholen. Die Beobachtungen können für bis zu 20 min dauern, aber jeder Wurm sollte nur einmal aufgezeichnet werden, um die Auswirkungen von p zu vermeidenHoto Schaden.
Hinweis: Würmer sind für mindestens 20 Minuten ohne wesentliche Mängel 7 , 27 , 28 beobachtet worden. Längere Beobachtung möglicherweise aber Haven ' t wurde noch nicht getestet. Ein deutliches Zeichen der neuronalen Tod ist die Änderung der neuronale Morphologie wie Neuriten Schwellung. Wie schwache Signale der GFP in Axone und Dendriten in wyIs251 und mnIs17 ersichtlich ist, kann die Neuriten Morphologie leicht überprüft werden, bei einem Blick auf Axone und Dendriten. Neuronale Morphologie ist in Abbildung 2 gezeigt. - Film-Dateien zu erzeugen.
- Offene Multi-TIFF-Datei mit Fidschi-Software. Gehen Sie zu Datei > öffnen und wählen Sie dann die Multi-TIFF-Datei in Schritt 5.4 gespeichert.
Hinweis: Fidschi kann bei jttps://fiji.sc heruntergeladen werden. Bild J und Plugins können auch verwendet werden, um Kymographs zu erzeugen. Wenn dabei die relevanten Anweisungen für das ausgewählte Plugin. - Klicken Sie auf die " rechteckige Auswahl " ( Abb. 3 A, Pfeil) und wählen Sie den gewünschten Bereich durch Zeichnen eines Rechtecks mit einer Computer-Maus (gelbes Rechteck im Bild 3 A). Gehe zu Bild > Stapel > Tools > Substacks und wählen Sie die Slice-Nummern, die im Film enthalten sind. Entsteht ein Substack.
- Das Substack-Fenster durch einen Klick aktivieren und zum Bild > Adjust > Helligkeit/Kontrast. Ein Fenster, um die Helligkeit und den Kontrast anpassen angezeigt wird. Schieben Sie in das Fenster oben bar (mindestens) auf der rechten Seite so dass das Hintergrundsignal verschwindet und die zweite nach oben bar (Maximum) auf der linken Seite so, dass der beweglichen Vesikel und Partikel können man ganz gut über dem Hintergrund.
- Zum Bild > Stapel > Zeit Stamper. Wie der Film mit 4 Frames/s in Schritt 5.4 aufgezeichnet ist, ist der zeitliche Abstand 0,25 s. So geben " 0,25 " Intervalls.
- Erzeugen eine Filmdatei speichern unter wählen > AVI aus dem Menü "Datei" (Movie 1 und 2).
Hinweis: Durch die Verwendung geeigneter Plugins, Sie können die Datei speichern als andere Formate wie " mpeg4 " oder " Mov " Dateien.
- Offene Multi-TIFF-Datei mit Fidschi-Software. Gehen Sie zu Datei > öffnen und wählen Sie dann die Multi-TIFF-Datei in Schritt 5.4 gespeichert.
- Erzeugen Kymographs.
- Öffnen Sie die ursprüngliche Filmdateien mit Fidschi-Software erneut und wiederholen Sie die Schritte 5.6.2 und 5.6.3 die Helligkeit und den Kontrast anpassen.
- Klicken Sie " segmentiert Linie " ( Abbildung 3 B, Pfeil). Mit der Maus eine segmentierte Linie entlang der Zilien oder Axon (gelbe Linie in Abbildung 3 B).
- Gehen zu analysieren > Multi Glomeruli > Multi Kymograph ( Abb. 3 C). Breite Fenster "Linie" wird angezeigt ( Abbildung 3 D). Typ " 3 " in der Linienbreite Fenster und klicken Sie auf "OK" ( Abbildung 3 D).
- Glomeruli Fenster entsteht. Speichern Sie das Bild in TIFF oder JPEG-Format.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Axonalen Transport in DA9 neuron
Mit der wyIs251 Linie, die Anterograde und retrograde axonale Transport von GFP::RAB-3 kann in den DA9 Motoneuron gleichzeitig aufgezeichnet werden. Die Durchschnittsgeschwindigkeit der Anterograde und retrograde Transport in den proximalen dorsalen Axon des Neurons DA9 ist etwa 1,8 und 2,6 µm/s, jeweils22. Die Anzahl der beweglichen Vesikel geht um 0,03 und 0,018 pro μm Axon pro s. So findet man für eine 30 s Beobachtung von 10 μm DA9 Axon mit einem 100 X Objektiv, etwa 9 und 5 bewegt sich Vesikel in das Axon (Abbildung 4 und Film 1). Wenn keine vesikuläre Bewegung beobachtet werden kann, ist es möglich, dass die Laserleistung zu schwach ist. Neben Langstrecken läuft, kann kurze Reichweite Bewegung der Vesikel-Pools werden aufgezeichnet (Film 1). Einige Vesikel Haltestelle diese Vesikel-Pools, während andere von dort7,23zu distanzieren. Diese Parameter können überwacht und zum Analysieren der mutierter Phänotypen.
IFT in Tail Neuronen
Zilien sind an der Spitze der Dendriten in C. Elegans (Abbildung 2B) lokalisiert. Die mnIs17 Belastung drückt GFP-Tags OSM-6, eines IFT Untereinheiten29. OSM-6 drückt sich in beiden Kopf und Rute Neuronen19. Während viele Kopf Zilien durch mnIs17gekennzeichnet sind, sind nur zwei Cilien eindeutig in der Rute Nervenzelle beobachtet. Deshalb beobachten diese Flimmerhärchen leichter Kopf Zilien (siehe auch Diskussion). OSM-6::GFP ist diffus im neuronalen Zytoplasma wie im Zellkörper, Axon und Dendrit. Allerdings ist OSM-6::GFP in Zilien, konzentrierte sich auf Zilien und in bewegten Partikel eingearbeitet. Die Länge der PHA und PHB Zilien sind etwa 6,5 µm. Anterograde IFT ist biphasische 8,9. Die Geschwindigkeit der Anterograde IFT geht um 0,7 und 1,3 µm/s in den mittleren und distalen Segmenten der Zilien, bzw. (Abb. 5 und Movie 2).
Abbildung 1 : Demonstration der Probenvorbereitung. (A) heißen DW, Pasteur pipettieren und 10 % Agarose auf Heizblock. (B und C) Vorbereitung der Agarose-Pads: eine Agarose-Pad wird zwischen den Folien (B) gebildet. Die obere Folie wird nach einer Agarose-Pad-Formen (C) entfernt. (D) schematische Zeichnung zeigt wie Polystyrol Bead-Lösung wird auf die Agarose-Pad gelegt. Wählen Sie (E) schematische Zeichnung zeigt, wie die Würmer in der Polystyrol Bead-Lösung mit einem Platindraht umgesetzt werden. (F) A Deckglas (22 x 44 mm2) wird auf die Agarose-Pad gelegt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Imaging Bereich. (A) schematische Zeichnung der DA9 und VA12 Neuronen und ein repräsentatives Bild der wyIs251. In DA9 Neuronen hat die ventralen Axon, Kommissur und proximale Axon keinen Reifen Synapsen. Aber synaptischen Vesikel Vorstufen werden vom Zellkörper an den Synapsen über diesen axonalen Regionen transportiert. Kästen zeigt die Region, die beachtet werden sollten. (B) schematische Zeichnung der PHA und PHB Neuronen und ihre Cilien. Kästen zeigt die Region, die beachtet werden sollten. Maßstabsleiste = 10 μm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Generation von Filmen und Kymographs mit Fidschi-Software. (A) Klicken Sie auf "Rechteckige Auswahl" (Pfeil) und wählen Sie den Bereich man möchte auf zu konzentrieren, indem Sie ein Rechteck (gelbe Box) um Substacks zu erzeugen. (B) Klicken Sie auf die segmentierte Linie (Pfeil) und ziehen Sie eine segmentierte Linie entlang der Zilien, die mit einer Maus (gelbe Linie). (C) wählen Sie "Analyze", "Multi Glomeruli" und "Multi Glomeruli" um ein Plugin zu starten um Kymographs zu erzeugen. (S) Linewidth einzugeben, klicken Sie auf "OK" und erzeugen Kymographs (Abbildung 5 und Abbildung 7). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 : Repräsentative Glomeruli des axonalen Transports von synaptischen Vesikel Vorstufen. GFP::Rab-3-Bewegung an den proximalen asynaptic Region DA9 Neurons eingehalten wird und die Glomeruli mit Multi Glomeruli von Fidschi generiert wurde. Horizontalen und vertikalen Balken repräsentieren Länge und Zeit. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5 : Repräsentative Glomeruli IFT. OSM-6::GFP wird in PHA und PHB Zilien beobachtet und dieser Glomeruli entsteht aus dem Menschenhandel Ereignis entweder in einer von ihnen. Die Glomeruli entstanden mit Multi Glomeruli der Fidschi-Inseln. Horizontalen und vertikalen Balken repräsentieren Länge und Zeit. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Movie 1: repräsentative Film des axonalen Transports von synaptischen Vesikel Vorstufen. GFP::Rab-3 Bewegung wird bei der proximalen asynaptic Region des Neurons DA9 beobachtet. GFP::Rab-3 ist in synaptischen Vesikel Vorstufen aufgenommen und transportiert. Anterograde und retrograde axonale Transport werden erfasst. Einige Vesikel aufhören, aber starten Sie erneut. Der Film wurde in den 4 Bilder/s und spielt bei 15 Frames/s. Sca aufgenommen.Le Bar = 5 μm. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)
Movie 2: repräsentative Film IFT. OSM-6::GFP wird in PHA und PHB Zilien beobachtet. OSM-6::GFP ist die komplexe IFT eingearbeitet und bewegt sich entlang der Zilien. Der Film wurde aktualisiert am: 4 Bilder/s und spielt bei 15 Frames/s. Maßstabsleiste = 5 μm. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Einschränkung in Bezug auf vorhandene Methoden
Die hier beschriebene Methode ist optimiert, um schnell Ereignisse wie axonalen Transport und IFT beobachten. Immobilisierung ist somit mehr als längere Inkubationszeit priorisiert. Während wir Menschenhandel Ereignisse für mindestens 20 Minuten ohne bedeutende Störung beobachtet wurden, kann diese Methode nicht immer zu langsam Ereignisse erfordern längere Beobachtungen, wie Axon Dehnung und Zellwanderung beobachten geeignet. Für längere Beobachtungen, die man braucht, um die Bedingungen zu optimieren durch Verringerung des Anteils der Agarose (d.h., das Wasser zur Vermeidung von Austrocknung und Reduzierung des Drucks, dass potenziell erhöhen verursacht Schäden). Alternativ möglicherweise beschriebene15 oder Immobilisierung der Würmer mit Agarose-Pads und Anästhesie mikrofluidischen Gerät besser geeignet16 , während Nebenwirkungen sorgfältig geprüft werden sollte.
Wichtige Schritte im Rahmen des Protokolls
Für ausreichende Beobachtung sind Marker entscheidend. Marker in Vesikeln oder Partikel integriert werden und ausreichend Helligkeit werden müssen. Entweder extrachromosomale Arrays oder integrierte Linien können verwendet werden. Für die Visualisierung des axonalen Transports von synaptischen Vesikel-Vorstufen in DA9 Neuronen ist die wyIs251 Sorte nützlich7,23. jsIs821 wurde zur axonalen Transport in Mechanosensory Neuronen in einigen Studien26,27zu beobachten. Wenn andere Neuronen analysiert werden, sollten synaptischen Vesikel Proteine in interessierten Neuronen mit Zelle spezifische Promotoren ausgedrückt werden. Diese Promotoren sollte stark genug sein. RAB-3 und SNB-1 sind weit verbreitet, synaptischen Vesikel Vorstufen22,23,26zu kennzeichnen. Um IFT zu beobachten, sollten die Komponenten des komplexen IFT beschriftet werden. Als Positivkontrolle ist der mnIs17 Sorte eine gute Wahl-29. Zilien, die aus 8 Zellen (ASE, ASG, ASI, ASL, Asche, ASK, ADF und ADL) werden gebündelt in den Kopf (Amphid), während Zilien aus 2 Zellen (PHA und PHB) im Heck (Zucht) gebündelt werden. Da OSM-6::GFP in allen ciliated Neuronen im mnIs17zum Ausdruck kommt, kann es schwierig, das IFT im Detail im Kopf Cilien zu analysieren sein. Jedoch im Großraum Rute nur PHA und PHB Neuronen sind beschriftet und IFT in jeder Zelle kann leicht gelöst werden. Anderen IFT Proteinen gekennzeichnet durch fluoreszierende Proteine lässt sich beobachten, IFT21,28. Will man Kopf Neuronen zu analysieren, würde zellspezifische Promotoren nützlich sein. Während Kopf Zilien unterschiedliche Morphologien haben, kann Transportereignisse aufgezeichneten29. Durch die Kreuzung von Mutanten mit dieser Marker, kann die Funktionen keine Gene in axonalen Transport und IFT analysierten in Vivo. Die Parameter, die analysiert werden können wurden in früheren Arbeiten22,23,26,27beschrieben. GFP ist die beste und wichtigste Wahl. mCherry und TdTomato können auch gebrauchte22sein, aber mCherry ist viel dunkler als GFP. TdTomato ist ein Tandem-Dimer und größer als Monomere fluoreszierende Proteine, die manchmal die Dynamik der Fusion Proteine30betrifft. Daher, die Ergebnisse sollten analysiert werden und vorsichtig interpretiert, wenn TdTomato verwendet wird. mScarlet, eine helle Monomeren rot fluoreszierende Protein die vor kurzem entwickelt worden, ist eine alternative Wahl31.
Während spinning Disk konfokalen Mikroskopie weit verbreitet ist, zu beobachten, axonalen Transport und IFT7,21, die Ausrüstung ist teuer und kann schwierig sein, in einigen Forschungsumgebungen zugreifen. Jedoch können diese Phänomene auch aufgezeichnet und analysiert in C. Elegans standard Fluoreszenz Mikroskopie, wenn mit hohen NA Linsen ausgestattet, weil C. Elegans ist eine kleine, transparente Tier- und einfach zu beobachten.
Zukünftige Anwendung
Durch ähnliche Immobilisierung hier beschriebene Methode wurde mit der Einzelmolekül-Auflösung in Vivo32IFT beobachtet. Darüber hinaus wurden mehrere Arten von Super-Auflösung Mikroskopie entwickelt. Man kann direkt die Höchstauflösung mikroskopische Analyse hier beschriebenen Methoden anwenden. Nach meiner Erfahrung funktioniert sehr gut der schnelle Modus des Airyscan33 IFT zu analysieren. Theoretisch wäre eine drehende Scheibe Höchstauflösung Mikroskop (SDSRM) eine gute Wahl als gut34. Abschließend durch die Kombination von mutierten Bibliotheken und diese neuen Techniken, die beschriebene Methode sollte hier nützlich sein für die Klärung der molekularen Mechanismen der axonalen Transport und IFT in Vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Der Autor hat nichts preisgeben.
Acknowledgments
Der Autor dankt tief Dr. Asako Sugimoto (Tohoku University) für ihre hilfreiche Diskussion. wyIs251 war ein großzügiges Geschenk von Dr. Kang Shen (Stanford University). mnIs17 lieferte die CGC, das von NIH Büro Infrastruktur Forschungsprogramme (P40 OD010440) gefördert wird. Diese Arbeit wurde von JSPS KAKENHI Grant #17 H 05010 und #16 H 06536 und Daiichi Sankyo-Stiftung, Brain Science Foundation und Naito Foundation unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Slideglass (76 x 26 mm) | Matsunami | S1111 | |
| Coverglass (22 x 40 mm) | Matsunami | C024401 | |
| Agarose | Wako | 318-01195 | |
| Polystylene microbeads 0.1 micron | Polysciences | #00876 | |
| Heat block | TAITEC | 0063288-000 | CTU-mini |
| Microscope | Olympus | IX-71 | widefield microscope |
| Spinning disk Scanner | Yokogawa | CSU-X1 | spinning disc confocal scanner |
| Digital CCD camera | Hamamatsu Photonics | C10600-10B | ORCA-R2 degital CCD camera |
| Objective lens (x100, NA1.4) | Olympus | UPLSAPO 100XO | |
| Pasteur pipette (5 inch) | IWAKI | IK-PAS-5P | |
| Glass tube (1.5 cm diameter x 10.5 cm) | IWAKI | 9820TST15-105NP | |
| TV9211: wyIs251 | Laboratory of Kang Shen | N/A | |
| OTL11: mnIs17 | Ref. 27, 29 | N/A | SP2101 was backcrossed with wild type for 6 times |
| Stereo microscope | Carl Zeiss | 435064-9000-000 | STEMI 508 |
| Mirror transillumination unit | Carl Zeiss | 435425-9010-000 | |
| platinum wire (0.2 mm) | Nilaco Corporation | m78483501 | |
| 60 mm plastic dish | Falcon | #351007 | |
| Fiji | N/A | N/A | https://fiji.sc/ |
| nematode growth medium (NGM) | 1.7% (w/v) agarose, 50mM NaCl, 0.25% (w/v) Peptone, 1 mM CaCl2, 5 mg/mL Cholesterol, 25 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4 |
References
- Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. Molecular motors in neurons: transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease. Neuron. 68 (4), 610-638 (2010).
- Holzbaur, E. L., Scherer, S. S. Microtubules, axonal transport, and neuropathy. N Engl J Med. 365 (24), 2330-2332 (2011).
- Kamiya, R. Functional diversity of axonemal dyneins as studied in Chlamydomonas mutants. Int Rev Cytol. 219, 115-155 (2002).
- Scholey, J. M. Intraflagellar transport motors in cilia: moving along the cell's antenna. J Cell Biol. 180 (1), 23-29 (2008).
- Rosenbaum, J. L., Witman, G. B.
- Ishikawa, H., Marshall, W. F.
- Niwa, S., et al. Autoinhibition of a Neuronal Kinesin UNC-104/KIF1A Regulates the Size and Density of Synapses. Cell Rep. 16 (8), 2129-2141 (2016).
- Snow, J. J., et al. Two anterograde intraflagellar transport motors cooperate to build sensory cilia on C. elegans neurons. Nat Cell Biol. 6 (11), 1109-1113 (2004).
- Ou, G., Blacque, O. E., Snow, J. J., Leroux, M. R., Scholey, J. M. Functional coordination of intraflagellar transport motors. Nature. 436 (7050), 583-587 (2005).
- Zhou, R., Niwa, S., Homma, N., Takei, Y., Hirokawa, N. KIF26A is an unconventional kinesin and regulates GDNF-Ret signaling in enteric neuronal development. Cell. 139 (4), 802-813 (2009).
- Zhao, C., et al. Charcot-Marie-Tooth disease type 2A caused by mutation in a microtubule motor KIF1Bbeta. Cell. 105 (5), 587-597 (2001).
- Niwa, S., Tanaka, Y., Hirokawa, N. KIF1Bbeta- and KIF1A-mediated axonal transport of presynaptic regulator Rab3 occurs in a GTP-dependent manner through DENN/MADD. Nat Cell Biol. 10 (11), 1269-1279 (2008).
- Zhou, R., Niwa, S., Guillaud, L., Tong, Y., Hirokawa, N. A molecular motor, KIF13A, controls anxiety by transporting the serotonin type 1A receptor. Cell Rep. 3 (2), 509-519 (2013).
- Klassen, M. P., et al. An Arf-like small G protein, ARL-8, promotes the axonal transport of presynaptic cargoes by suppressing vesicle aggregation. Neuron. 66 (5), 710-723 (2010).
- Mondal, S., Ahlawat, S., Koushika, S. P. Simple microfluidic devices for in vivo imaging of C. elegans, Drosophila and zebrafish. J Vis Exp. (67), (2012).
- Chai, Y., et al. Live imaging of cellular dynamics during Caenorhabditis elegans postembryonic development. Nat Protoc. 7 (12), 2090-2102 (2012).
- Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. Long-term imaging of Caenorhabditis elegans using nanoparticle-mediated immobilization. PLoS One. 8 (1), 53419 (2013).
- Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection. J Vis Exp. (18), (2008).
- Collet, J., Spike, C. A., Lundquist, E. A., Shaw, J. E., Herman, R. K. Analysis of osm-6, a gene that affects sensory cilium structure and sensory neuron function in Caenorhabditis elegans. Genetics. 148 (1), 187-200 (1998).
- Brenner, S.
- Niwa, S. The nephronophthisis-related gene ift-139 is required for ciliogenesis in Caenorhabditis elegans. Sci Rep. 6, 31544 (2016).
- Maeder, C. I., San-Miguel, A., Wu, E. Y., Lu, H., Shen, K. In vivo neuron-wide analysis of synaptic vesicle precursor trafficking. Traffic. 15 (3), 273-291 (2014).
- Wu, Y. E., Huo, L., Maeder, C. I., Feng, W., Shen, K. The balance between capture and dissociation of presynaptic proteins controls the spatial distribution of synapses. Neuron. 78 (6), 994-1011 (2013).
- Dwyer, N. D., Adler, C. E., Crump, J. G., L'Etoile, N. D., Bargmann, C. I. Polarized dendritic transport and the AP-1 mu1 clathrin adaptor UNC-101 localize odorant receptors to olfactory cilia. Neuron. 31 (2), 277-287 (2001).
- Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D., Bargmann, C. I., Avery, L.
- Kumar, J., et al. The Caenorhabditis elegans Kinesin-3 motor UNC-104/KIF1A is degraded upon loss of specific binding to cargo. PLoS Genet. 6 (11), 1001200 (2010).
- Zheng, Q., et al. The vesicle protein SAM-4 regulates the processivity of synaptic vesicle transport. PLoS Genet. 10 (10), 1004644 (2014).
- Blacque, O. E., et al. The WD repeat-containing protein IFTA-1 is required for retrograde intraflagellar transport. Mol Biol Cell. 17 (12), 5053-5062 (2006).
- Evans, J. E., et al. Functional modulation of IFT kinesins extends the sensory repertoire of ciliated neurons in Caenorhabditis elegans. J Cell Biol. 172 (5), 663-669 (2006).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
- Bindels, D. S., et al. mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging. Nat Methods. 14 (1), 53-56 (2017).
- Prevo, B., Mangeol, P., Oswald, F., Scholey, J. M., Peterman, E. J. Functional differentiation of cooperating kinesin-2 motors orchestrates cargo import and transport in C. elegans cilia. Nat Cell Biol. 17 (12), 1536-1545 (2015).
- Robison, P., et al. Detyrosinated microtubules buckle and bear load in contracting cardiomyocytes. Science. 352 (6284), 0659 (2016).
- Hayashi, S., Okada, Y. Ultrafast superresolution fluorescence imaging with spinning disk confocal microscope optics. Mol Biol Cell. 26 (9), 1743-1751 (2015).
