Caenorhabditis elegans (C. Elegans) ist ein gutes Modell, axonalen und intrazellulären Transport zu studieren. Hier beschreibe ich ein Protokoll zur in-Vivo -Erfassung und Analyse der axonalen und intraflagellar Transport in C. Elegans.
Axonalen Transport und intraflagellar Transport (IFT) sind wesentlich für Axon und Zilien Morphogenese und Funktion. Kinesin-Superfamilie Proteine und Dynien sind molekulare Motoren, die Anterograde und retrograder Transport bzw. regulieren. Diese Motoren verwenden Mikrotubuli Netzwerke als Schienen. Caenorhabditis elegans (C. Elegans) ist eine leistungsstarke Modellorganismus axonalen Transport und IFT in Vivozu studieren. Ich beschreibe hier ein Protokoll zur axonalen Transport und IFT in lebenden beobachten C. Elegans. Beförderten Güter kann durch die Kennzeichnung Ladung Proteine mit fluoreszierenden Proteinen wie grün fluoreszierendes Protein (GFP) visualisiert werden. C. Elegans ist transparent und GFP-Tags Ladung Proteine in bestimmten Zellen unter zellspezifische Promotoren ausgedrückt werden können. Lebende Würmer können durch Microbeads auf 10 % Agarose-Gel fixiert werden, ohne zu töten oder betäuben die Würmer. Unter diesen Bedingungen kann Fracht Bewegung direkt in die Axone und Zilien des Lebens beobachtet werden C. Elegans ohne Dissektion. Diese Methode kann angewendet werden, um die Beobachtung Fracht-Moleküls in alle Zellen durch Ändern der Zielproteine und/oder die Zellen, die, denen Sie in ausgedrückt werden. Grundlegendsten wie molekulare Motoren und Adapter-Proteine, die axonalen Transport und IFT beteiligt sind sind in C. Eleganskonserviert. Im Vergleich zu anderen Modellorganismen, werden Mutanten erhalten und leichter in C. Elegansgepflegt. Kombination dieser Methode mit verschiedenen C. Elegans Mutanten kann die molekularen Mechanismen der axonalen Transport und IFT klären.
Live Cell Imaging ist ein wesentliches Instrument für die Analyse von intrazellulären Transport. In neuronale Zellbiologie sind Analysen des axonalen Transports mit live Cell Imaging unerlässlich für das Verständnis der neuronalen Funktion und Morphogenese1. Mängel im axonalen Transport unterliegen verschiedenen neurodegenerativen Erkrankungen2. Kinesin-Superfamilie Proteine und Dynien durchführen bzw. axonalen Transport Anterogradely und Doppelthebel,1,2.
Zilien sind ein weiteres zellulären Fach, in dem die Mikrotubuli Netzwerk und Menschenhandel Maschinen hochentwickelte3sind. Protein Synthese Maschinen ist nicht in Zilien, lokalisiert, d.h. ciliary Proteine zu den Zilien-Tipps aus dem Zytoplasma transportiert werden müssen. Zilien-spezifische Kinesin und Dynien, namens Kinesin-2 und zytoplasmatischen Dynien-2, bzw., transport der Komponenten der Zilien4, in ein Phänomen namens intraflagellar Transport (IFT)5. Beeinträchtigung der IFT verursacht ein Spektrum von Krankheiten genannt Ciliopathies6. Somit ist Analyse der IFT-Mechanismus von live Cell Imaging erforderlich grundlegende Mechanismen der ciliary Entstehung und Pathogenese zu verstehen.
Caenorhabditis elegans (C. Elegans) ist ein gutes Modell, axonalen Transport und IFT7,8,9zu studieren. Um IFT zu beobachten, hat Chlamydomonas als Modell Organismus5,6verbreitet. Wie Chlamydomonas eines einzelligen Organismus ist, wäre das Verhältnis von IFT mit Altern, neuronale Funktion und Verhalten schwer zu analysieren. Darüber hinaus wurden wichtige genetische Techniken wie CRISPR/Cas9 nicht auf Chlamydomonasangewendet. Bei höheren Modellorganismen wie Mäuse und Drosophilaverursacht Störung des axonalen Transports und IFT oft tödliche Phänotypen, weil axonalen Transport und IFT für die Morphogenese und Homöostase der Tiere 10notwendig sind, 11. Bei Mäusen ist Zellkultur und Transfektion in der Regel zu beobachten axonalen Transport und IFT, wonach viele Fähigkeiten und umfangreiche Zeit12,13erforderlich. Darüber hinaus kann viele wichtige physiologische Zusammenhänge in kultivierten Zellen und Zell-Linien verloren gehen. C. Elegans Mutanten in denen axonalen Transport oder IFT werden gestört, weil das Nervensystem nicht essentiell für das Überleben der Würmer ist, sind oft nicht tödliche7,9,14. Axonalen Transport und IFT können direkt in Vivo ohne Dissektion beobachtet werden, weil C. Elegans transparent ist und deshalb einfach zu GFP-Tags Marker zu beobachten.
Es gibt mehrere Protokolle, C. Elegans, z. B. die Verwendung eines mikrofluidischen Gerät15, Agarose-Pads mit Anästhesie16oder Microbeads17zu immobilisieren. Die Einbeziehung der Narkose kann der Menschenhandel Ereignisse in Neuronen15hemmen. Ein klarer Nachteil der Mikrofluidik-Gerät Methode ist, dass die Vorbereitung einer mikrofluidischen Gerät nicht immer einfach ist. Immobilisierung von Agarose-Pads und Microbeads ist stattdessen eine bequeme und einfache Möglichkeit, Time Lapse Bildgebung in C. Elegansdurchzuführen. Ich beschreibe hier dieses grundlegende Protokoll zu immobilisieren C. Elegans und visualisieren axonalen Transport und IFT in Vivo in C. Elegans. Im Vergleich zu anderen Methoden, die hier beschriebene Methode erfordert keine spezielle Ausrüstung und ist viel billiger und leichter durchzuführen.
Einschränkung in Bezug auf vorhandene Methoden
Die hier beschriebene Methode ist optimiert, um schnell Ereignisse wie axonalen Transport und IFT beobachten. Immobilisierung ist somit mehr als längere Inkubationszeit priorisiert. Während wir Menschenhandel Ereignisse für mindestens 20 Minuten ohne bedeutende Störung beobachtet wurden, kann diese Methode nicht immer zu langsam Ereignisse erfordern längere Beobachtungen, wie Axon Dehnung und Zellwanderung beobachten geeignet. Für längere Beobacht…
The authors have nothing to disclose.
Der Autor dankt tief Dr. Asako Sugimoto (Tohoku University) für ihre hilfreiche Diskussion. wyIs251 war ein großzügiges Geschenk von Dr. Kang Shen (Stanford University). mnIs17 lieferte die CGC, das von NIH Büro Infrastruktur Forschungsprogramme (P40 OD010440) gefördert wird. Diese Arbeit wurde von JSPS KAKENHI Grant #17 H 05010 und #16 H 06536 und Daiichi Sankyo-Stiftung, Brain Science Foundation und Naito Foundation unterstützt.
Slideglass (76 x 26 mm) | Matsunami | S1111 | |
Coverglass (22 x 40 mm) | Matsunami | C024401 | |
Agarose | Wako | 318-01195 | |
Polystylene microbeads 0.1 micron | Polysciences | #00876 | |
Heat block | TAITEC | 0063288-000 | CTU-mini |
Microscope | Olympus | IX-71 | widefield microscope |
Spinning disk Scanner | Yokogawa | CSU-X1 | spinning disc confocal scanner |
Digital CCD camera | Hamamatsu Photonics | C10600-10B | ORCA-R2 degital CCD camera |
Objective lens (x100, NA1.4) | Olympus | UPLSAPO 100XO | |
Pasteur pipette (5 inch) | IWAKI | IK-PAS-5P | |
Glass tube (1.5 cm diameter x 10.5 cm) | IWAKI | 9820TST15-105NP | |
TV9211: wyIs251 | Laboratory of Kang Shen | N/A | |
OTL11: mnIs17 | Ref. 27, 29 | N/A | SP2101 was backcrossed with wild type for 6 times |
Stereo microscope | Carl Zeiss | 435064-9000-000 | STEMI 508 |
Mirror transillumination unit | Carl Zeiss | 435425-9010-000 | |
platinum wire (0.2 mm) | Nilaco Corporation | m78483501 | |
60 mm plastic dish | Falcon | #351007 | |
Fiji | N/A | N/A | https://fiji.sc/ |
nematode growth medium (NGM) | 1.7% (w/v) agarose, 50mM NaCl, 0.25% (w/v) Peptone, 1 mM CaCl2, 5 mg/mL Cholesterol, 25 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4 |