Summary
Caenorhabditis elegans (C. elegans) является хорошей моделью для изучения аксональное и внутриклеточного транспорта. Здесь я описать протокол в vivo записи и анализа аксональное и intraflagellar транспорта в C. elegans.
Abstract
Аксональное и intraflagellar транспорта (IFT) имеют важное значение для axon и реснички морфогенеза и функции. Белки суперсемейства Кинезин и Динеин являются Молекулярные двигатели, которые регулируют антероградная и ретроградным транспорта, соответственно. Эти двигатели используют микротрубочек сети как рельсы. Caenorhabditis elegans (C. elegans) представляет собой мощную модель организм для изучения аксональное транспорта и IFT в естественных условиях. Здесь, я описать протокол соблюдать аксональное транспорта и IFT в жизни C. elegans. Транспортировка грузов могут быть визуализированы путем маркировать белки грузов с использованием флуоресцентных белков, таких как Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП). C. elegans является прозрачным и белки GFP-тегами груза может быть выражен в конкретных ячеек под клеток конкретных промоутеров. Живые черви может быть исправлено микрошарики на 10% агарозном геле без убийства или обезболивающим червей. В этих условиях движение грузов напрямую можно наблюдать в аксонов и реснички жизни C. elegans без вскрытия. Этот метод может применяться для наблюдения за любой молекулы грузов в любые клетки путем изменения целевых белков и/или ячейки, на которые они выражаются в. Самые основные белки как молекулярные моторы и адаптер белки, которые участвуют в аксональное транспорта и IFT сохраняются в C. elegans. По сравнению с другими модельных организмов, мутанты можно получить и более легко поддерживать в C. elegans. Сочетая этот метод с различными C. elegans мутанты могут уточнить молекулярных механизмов аксональное транспорта и IFT.
Introduction
Живых клеток является важным инструментом для анализа внутриклеточного транспорта. В нейрональных клеточной биологии анализ аксональное транспорта с живых клеток имеют важное значение для понимания нейронов функции и морфогенез1. Дефекты в аксональное транспорта лежат в основе нескольких нейродегенеративных расстройств2. Белки суперсемейства Кинезин и Динеин выполняют аксональное транспорта anterogradely и retrogradely, соответственно1,2.
Реснички являются еще один сотовый отсек, в котором сети микротрубочек и людьми машины являются высоко развитой3. Машины синтеза белка не локализуется в ресничек, что означает, что цилиарной белки должны перевозиться из цитоплазмы в советы ресничек. Специфичные для ресничек Кинезин и Динеин, называемый кинезин-2 и цитоплазматических Динеин-2, соответственно, транспортные компоненты реснички4, в явление под названием intraflagellar транспорта (IFT)5. Обесценение IFT вызывает спектр заболеваний, под названием ciliopathies6. Таким образом анализ механизма IFT живых клеток требуется понять основные механизмы цилиарной формирования и патогенеза.
Caenorhabditis elegans (C. elegans) является хорошей моделью для изучения аксональное транспорта и IFT7,8,9. Соблюдать IFT, Хламидомонада широко используется как модель организма5,6. Хламидомонада это одноклеточные организм, отношения IFT функцией старения, нейронов, и будет трудно анализировать поведение. Кроме того основные генетические методы например ТРИФОСФАТЫ/Cas9 не были применены к Хламидомонада. В высших организмов модели, такие как мышей и дрозофилысрыв аксональное транспорта и IFT часто вызывает смертоносных фенотипов, потому что аксональное транспорта и IFT необходимы для морфогенеза и гомеостаз животных 10, 11. В случае мышей культуры клеток и transfection обычно необходимо соблюдать аксональное транспорта и IFT, которая требует много навыков и обширные время12,13. Кроме того много важных физиологических контекста может быть потеряно в культивируемых клеток и клеточных линий. Потому, что нервная система не является жизненно важным для выживания червей, C. elegans мутантов в котором аксональное транспорта или IFT нарушается зачастую не смертельное7,9,14. Аксональное транспорта и IFT можно непосредственно наблюдать в естественных условиях без вскрытия потому что C. elegans является прозрачным и поэтому легко наблюдать GFP-тегами маркеров.
Существует несколько протоколов для иммобилизации C. elegans, например используя microfluidic устройства15, агарозы колодки с анестезией16, или микрошарики17. Включение анестезии могут препятствовать торговле людьми события в нейроны15. Четкий недостаток метода microfluidic устройство является подготовка microfluidic устройства не всегда легко. Вместо этого иммобилизация агарозы колодки и микрошарики является удобный и простой способ для выполнения визуализации промежуток времени в C. elegans. Здесь, я описать этот основной протокол иммобилизации C. elegans и визуализировать аксональное транспорта и IFT в естественных условиях в C. elegans. Метод, описанный здесь, по сравнению с другими методами, не требует специального оборудования и намного дешевле и проще выполнить.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. пробоподготовки
- создания трансгенных C. elegans штамм интереса, с использованием методологии трансгенных 18. Кроме того получите соответствующие штаммов от Caenorhabditis центр генетики (CGC). Чтобы визуализировать аксональное транспорта синаптических пузырьков прекурсоров, используйте трансгенные линии wyIs251 [Pmig-13::gfp::rab-3] 7. Соблюдать IFT, получать трансгенные линии mnIs17 [osm-6::gfp] 19. Эти штаммы используются в настоящем Протоколе.
Примечание: Либо нехромосомной массив, геномных интеграции или даже GFP стук в работах. Чтобы уменьшить сигналов фона, используйте клеток конкретных промоутеров, вместо того чтобы Пан нейронов промоутеров.
Примечание: Поддержание червей описан в других протоколов 20. Штаммы были сохранены на газоне Escherischia coli ОР50 фидера на нематод рост среднего пластин (НГМ) (1,7% (w/v) агарозы, 50 мм NaCl, 0,25% (w/v) Пептон, 1 мм CaCl 2, 5 мг/мл холестерин, 25 мм х 2 PO 4, 1 мм MgSO 4 на пластиковые блюда диаметром 60 мм) при 20 ° с. - Растут черви при 20 ° C на NGM пластины на любой стадии жизненного цикла червей.
Примечание: Можно наблюдать аксональное транспорта и IFT на любой стадии. Конце L4 для молодых взрослых является хороший положительный контроль, потому что несколько публикаций использовали эти этапы и визуализировать людьми события 14 , 21 , 22 , 23.
2. Подготовка 10% агарозном
Примечание: многие поставщики предоставляют аналогичные продукты, такие как агар порошок агар и агарозы. Используйте класс электрофореза агарозы (гель прочность > 1200 г/см 2). Дешевые агар порошок не работать, потому что результирующая гель не достаточно сильны, чтобы обездвижить червей.
- Mix агарозы 0,4 г в 4 мл дистиллированной воды (DW) в стеклянную трубку (1,5 x 10.5 см). Положите крышку на стеклянную трубку, чтобы избежать испарения.
- Поместить стеклянную трубку на 95 ° C тепла блок на 90 мин. Кроме того, подготовить еще один стеклянной трубки (1,5 x 10.5 см), заполнены с DW и держать его на 95 ° C. Поставьте Pasteur накапайте в 95 ° C DW ( рис. 1 А). Много мелких пузырьков будет рассматриваться в трубке агарозы и решение должно быть мутной. Оставьте его до тех пор, пока решение становится ясно. Затем смешайте закупорить вверх и вниз до тех пор, пока решение агарозы становится однородной.
Примечание: Микроволновые печи не может использоваться для подготовки 10% агарозном решение, когда из DW и агарозы. Маленькие пузырьки, вызванные микроволны предотвратить агарозы плавления. Однако затвердевших 10% агарозном геле легко может быть твореное снова с помощью микроволновой. Стеклянные пробирки, содержащие 10% геля агарозы могут быть подготовлены заранее и хранить при 4 ° C для по крайней мере 6 месяцев. Если сделать это, расплавить акций с использованием микроволновой при необходимости и начните с шага 3 в настоящем Протоколе.
Примечание: Агарозы постепенно теряет способность укрепить если инкубировали при 95 ° C, долгое время или после повторного кристаллизации и плавления. Если это произойдет, подготовить новые 10% агарозном.
3. Подготовка агарозы Pad
- с помощью утепленные Pasteur накапайте подготовлен на шаге 2.2, место 2 капли 10% агарозном на слайде 76 x 22 мм.
- Быстро крышка с второй слайд 2 76 x 22 мм до падения агарозы застывает, как показано в рисунке 1 B и нажмите вниз на втором слайде расплющивать агарозы решения. Толщина должна быть 0,5-1 мм.
- Быстро промыть пипетку Pasteur дозирования 95 ° c DW вверх и вниз до тех пор, пока решение агарозы вымывается. В противном случае накапайте будет засоряются в агарозном геле. Оставьте пипеткой стоя в 95 ° C DW.
- Ждать 1 мин. Pad агарозы формы и становится мутным. Затем сдвиньте слайды друг от друга рукой ( рис. 1 C).
4. Монтаж червей
Примечание: даже небольших количеств движения червь предотвратить хорошее замечание. Левамизол традиционно используется для предотвращения перемещения червь агарозы колодки 24 , 25. Однако левамизол препятствует нейронов рецепторов в C. elegans и поэтому может повлиять на людьми события в нейроны 15. С помощью пенополистирола микрошарики описал hereis хороший альтернативных 17.
- Под микроскопом стерео с выдвижная зеркало просвечивания, передачи ~ 30 трансгенных червей, выражая соответствующие маркеры для новой NGM пластина без бактерий с помощью провода платины выбрать.
Примечание: Выбор провода платины изготовлен из платиновой проволоки и пипетка Пастера (5 дюймов), и плоский кончик провода платины. Подготовка провода платины выборка и обработка червей с этими описаны в Wormbook (http://www.wormbook.org). - Оставить пластину за 1 мин бактерии автоматически удаляются из поверхностей червей, как черви двигаться на геле агарозы NGM без бактерий.
- Положите в 0,5-1,0 мкл падение 2,6% 100 Нм диаметр полистирола микрошарики в воде на площадку агар ( рис. 1 D). Передать 10-20 червей от бактерии, свободной NGM пластины микрошарики. Падение и распространение червей, используя провод платины выбрать, чтобы избежать дублирования червь органов ( рис. 1 E).
- Применяются coverslip 2 22 x 40 мм ( рис. 1 F). Аккуратно нажмите удалить пузырьки воздуха, но избегать дробления червей. Образец теперь готова к визуализации.
Примечание: Поскольку администрируется без анестезии, черви фиксируются только силы трения, порожденных агар колодки, полистирола микрошарики и coverslip 17. Присутствие бактерий фидер или слишком много решение сделает силы трения слабее.
Примечание: Различные размеры coverslips (например, 22 x 22 мм 2, 18 x 18 мм 2) работы. Однако, более coverslips может предотвратить погружения воды или масла от объектива, просачивается в образцов во время наблюдения.
5. Наблюдения
Примечание: соответствующие параметры обработки изображений (мощность лазера, прибыль, биннинг и т.д.) будут отличаться для каждой системы микроскопа и камеры. Здесь используется widefield микроскоп оснащен спиннинг диск конфокальный сканер и цифровая камера CCD.
- Установите регулятор температуры этапа до 20 ° C, или настроить комнатной температуры до 20 ° C.
- Поместить образец слайда на микроскопа. Использовать 100 x (числовая апертура = 1.3 или лучше) объектив.
- Посмотрите на областях, указанных в рисунке 2 A (для wyIs251 и аксональной транспорта) или B (для mnIs17 и IFT) Рисунок 2 как позитивные элементы управления . Другие области могут быть проанализированы как хорошо 22.
- Набор параметров (CCD прибыль = 200, Binning = 1 или 2, мощность лазера на 488 нм = 1,0-1,3 МВт). Выполнять запись промежуток времени в 4 кадров в секунду до 1 мин сохранять файлы как mutli-TIFF формат.
Примечание: Если GFP сигналов исчезают, и это трудно продолжать наблюдать за GFP::RAB-3 или OSM-6::GFP за 30 сек, мощность лазера является слишком сильным. В этом случае уменьшите мощность лазера. И наоборот если не везикулярного движение записывается, мощность лазера является слишком слабым. В этом случае, увеличить мощность лазера. - Наблюдать различные червя и повторите 5.3 и 5.4. Замечания могут длиться до 20 мин, но каждый червь должны быть записаны только один раз, чтобы избежать последствий pповреждения Хото.
Примечание: Червей было отмечено по крайней мере 20 минут без значительных дефектов 7 , 27 , 28. Более наблюдения может быть возможным, но убежище ' t были протестированы еще. Явный признак нейронов смерти является изменение нейрональных морфология как neurite опухоль. Как можно увидеть слабые сигналы GFP в аксонов и дендритов в wyIs251 и mnIs17, морфология neurite можно легко проверить, просто глядя на аксонов и дендритов. Нейрональных морфология показано на рисунке 2. - Генерировать файлы фильмов.
- Открыть мульти TIFF файла с помощью программного обеспечения Фиджи. Перейдите к файлу > Открыть выберите мульти TIFF файл, сохраненный на шаге 5.4.
Примечание: Фиджи можно скачать на jttps://fiji.sc. Изображения J и плагины могут также использоваться для создания kymographs. Если сделать это, выполните соответствующие инструкции для выбранной плагин. - нажмите " прямоугольное выделение " ( рис. 3, стрелки) и выберите область интереса, рисование прямоугольника с помощью компьютерной мыши (желтый прямоугольник на рисунке 3 A). Перейти к изображению > стеки > средства > Substacks и выберите номера фрагментов, которые включены в фильме. Генерируется substack.
- Активировать substack окно, нажав кнопку и перейдите на изображение > Настройка > Яркость/контраст. Окно настройки яркости и контрастности показывает вверх. В окне слайд верхней бар (минимум) вправо так, что фон сигнал исчезает и второй Топ бар (максимум) слева так что перемещение пузырьков и частиц можно увидеть довольно хорошо на фоне.
- Перейти к изображению > стеки > штампа времени. Как фильм записывается на 4 кадров/сек на шаге 5.4, временной интервал составляет 0.25 s. Таким образом, тип " 0,25 " в интервале.
- Генерировать файл фильма, выбрав Сохранить как > AVI из меню файл (фильм 1 и 2).
Примечание: С помощью соответствующих плагинов, можно сохранить файл в другие форматы, такие как " mpeg4 " или " mov " файлы.
- Открыть мульти TIFF файла с помощью программного обеспечения Фиджи. Перейдите к файлу > Открыть выберите мульти TIFF файл, сохраненный на шаге 5.4.
- Генерировать kymographs.
- Открыть исходные файлы фильма с помощью программного обеспечения Фиджи снова и повторите шаги 5.6.2 и 5.6.3 для регулировки яркости и контрастности.
- Нажмите " сегменты линии " ( рис. 3 B, стрелка). С помощью мыши нарисуйте сегментирована линию вдоль реснички или аксона (желтая линия, в рисунке 3 B).
- Перейти к анализу > Multi кимограф > Multi кимограф ( рис. 3 C). Ширина линии окно ( Рисунок 3 D). Тип " 3 " в Linewidth окне и нажмите OK ( Рисунок 3 D).
- Кимограф окно создано. Сохранить изображение в формате TIFF или JPEG.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Аксональное транспорт в DA9 нейроне
С помощью линии wyIs251 , антероградная и ретроградным аксональное транспорта GFP::RAB-3 может быть одновременно записан в DA9 двигательного нейрона. Средняя скорость антероградная и ретроградным транспорта в проксимальном спинной аксон DA9 нейрона составляет около 1,8 и 2.6 мкм/s, соответственно22. Количество движущихся пузырьков идет о 0,03 и 0,018 в мкм axon в s. Таким образом для наблюдения за 30 s 10 мкм DA9 аксона, используя объектив 100 x, можно найти около 9 и 5 Перемещение пузырьков в аксона (рис. 4 и 1 кино). Если не везикулярного движение может наблюдаться, вполне возможно, что мощность лазера является слишком слабым. В дополнение к большой дальности работает, может быть короткий диапазон движения везикул бассейнов Записанная (фильм 1). Некоторые везикулы останавливаться на этих пулов везикул, в то время как другие отмежеваться от там7,23. Эти параметры могут контролироваться и использованы для анализа мутант фенотипов.
IFT в хвост нейронов
Реснички локализованы на кончике дендритов в C. elegans (рис. 2B). Штамм mnIs17 выражает GFP-тегами OSM-6, одно из подразделений IFT29. OSM-6 выражается в обоих голова и хвост нейронов19. Хотя многие головы реснички помечены на mnIs17, только два реснички явно наблюдаются в хвост нейрона. Таким образом наблюдая эти реснички легче, чем головы реснички (см. также обсуждение). OSM-6::GFP диффузной в нейрональных цитоплазме например, аксон, клетки тела и дендритов. Однако в ресничек, OSM-6::GFP сосредоточена на реснички и включены в движущихся частиц. Длина ФГА и PHB ресничек, около 6,5 мкм. Антероградная IFT-двухфазные 8,9. Скорость антероградная IFT составляет около 0,7 и 1,3 мкм/s в средние и дистальные сегменты реснички, соответственно (рис. 5 и 2 фильма).
Рисунок 1 : Демонстрация пробоподготовки. (A) Горячие DW, Pasteur накапайте и 10% агарозном теплового блока. (B и C) Подготовка агарозы колодки: площадку агарозы образуется между слайдами (B). После формы колодки агарозы (C) удаляется верхний слайд. (D) схема, рисование, показаны как полистирола шарик решения ставится на площадку агарозы. (E) схема, чертеж, показаны, как черви, помещаются в полистирола шарик решения с помощью провода платины выбрать. (F) A coverslip (22 x 44 мм2) помещается на панель агарозы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Imaging области. (A) схема, чертеж представитель образ wyIs251и DA9 и VA12 нейронов. В DA9 нейронов вентральной аксона, спайки и проксимальной аксона не Зрелые синапсы. Но синаптических пузырьков прекурсоров транспортируются из тела клетки синапсов через эти аксональное регионов. Регионе, который должен соблюдаться показано коробки. (B) схема, чертеж ФГА и PHB нейронов и их ресничек. Регионе, который должен соблюдаться показано коробки. Шкалы бар = 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Поколение кино и kymographs, с помощью программного обеспечения Фиджи. (A), нажмите на кнопку «Прямоугольное выделение» (стрелка) и выберите область, хотелось бы сосредоточиться на, рисование прямоугольника (желтом) для создания substacks. (B) нажмите кнопку сегментирована линии (стрелка) и нарисуйте сегментирована линию вдоль ресничек, с помощью мыши (желтая линия). (C) выберите «Анализировать», «Multi кимограф» и «Multi кимограф» чтобы начать плагин для создания kymographs. (S) ввода linewidth, нажмите кнопку «OK» и генерировать kymographs (Рисунок 5 и Рисунок 7). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : Представитель кимограф аксональное транспорта прекурсоров синаптических пузырьков. GFP::Rab-3 движение наблюдается в регионе проксимальный asynaptic DA9 нейрона и кимограф был сгенерирован с Multi кимограф Фиджи. Горизонтальные и вертикальные представляют Длина и время, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5 : Представитель кимограф IFT. OSM-6::GFP наблюдается в ФГА и PHB ресничек и этот кимограф генерируется из оборота событий в один из них. Кимограф был сгенерирован с Multi кимограф Фиджи. Горизонтальные и вертикальные представляют Длина и время, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Фильм 1: представитель кино аксональное транспорта прекурсоров синаптических пузырьков. GFP::Rab-3 движение наблюдается в регионе проксимальный asynaptic DA9 нейрона. GFP::Rab-3 включена в синаптических пузырьков прекурсоров и транспортируется. Антероградная и ретроградным аксональное транспорта записываются. Некоторые везикулы остановить, но перезапустить снова. Фильм был записан на 4 кадров в секунду и пьесы на 15 кадров в секунду ScaБар Le = 5 мкм. Пожалуйста нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)
Фильм 2: представитель кино IFT. OSM-6::GFP наблюдается в ФГА и PHB ресничек. OSM-6::GFP включены в комплекс IFT и движется вдоль ресничек. Фильм был записан на 4 кадров в секунду и играет в баре 15 кадров/s. шкалы = 5 мкм. Пожалуйста нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ограничение в отношении существующих методов
Метод, описанный здесь оптимизирован для наблюдать быстрый события, такие как аксональное транспорта и IFT. Таким образом иммобилизация более приоритетными чем дольше инкубации. Хотя мы были в состоянии наблюдать за людьми события для по крайней мере 20 минут без значительных возмущений, этот метод не может быть всегда подходит наблюдать медленное события, требующие больше времени наблюдения, например удлинение аксона и миграции клеток. Для длительного наблюдения, необходимо оптимизировать условия, уменьшая процент агарозы (т.е., увеличивая воды, чтобы избежать высыхания и снижение давления, что потенциально наносит ущерб). Кроме того устройство microfluidic описанных выше15 или иммобилизации червей с помощью агарозы колодки и анестезии может быть более подходящим16 хотя побочные эффекты должны тщательно анализироваться.
Важнейшие шаги в рамках протокола
Для адекватного наблюдения маркеры имеют решающее значение. Маркеры должны быть включены в везикулы или частиц и достаточной яркости. Нехромосомной массивы или комплексных линий может использоваться. Для визуализации аксональное перевозки прекурсоров синаптических пузырьков в DA9 нейронов wyIs251 штамм является полезным7,23. jsIs821 был использован для наблюдения аксональное транспорта в mechanosensory нейронов в некоторых исследованиях26,27. При анализе других нейронов, синаптических пузырьков белки должна выражаться в заинтересованных нейронов, с использованием клеток конкретных промоутеров. Эти промоутеров должны быть достаточно прочными. РАБ-3 и СНБ-1 широко используются для обозначения синаптических пузырьков прекурсоров22,23,26. Соблюдать IFT, компоненты комплекса IFT должны обозначаться. Как позитивный элемент штамм mnIs17 является хорошим выбором29. Реснички, вытекающих из 8 клеток (ВРУ, ПГС, ASI, ASL, зола, ASK, ADF и ADL) объединяются вместе в голову (amphid) в то время как реснички от 2 клетки (ФГА и PHB) поставляются в хвост (phasmid). Потому что OSM-6::GFP выражается в всех мерцательного нейронов в mnIs17, это может быть трудно анализировать IFT подробно в голову ресничек. Однако в регионе хвост, помечены только ФГА и PHB нейронов и IFT в каждой ячейке может быть легко решена. Другие белки IFT, обозначены флуоресцентные белки могут использоваться для наблюдения за IFT21,28. Если один хочет, чтобы анализировать головы нейроны, клетки конкретных промоутеров бы полезно. Хотя глава реснички различной морфологии, транспорта события могут быть записанные29. Путем скрещивания мутантов с этих маркеров, функции любого генов в аксональное транспорта и IFT могут быть проанализированы в естественных условиях. Параметры, которые могут быть проанализированы были описаны в предыдущих работы22,23,,2627. GFP-лучшие и первичный выбор. mCherry и tdTomato также может быть использоваться22, однако, mCherry является гораздо более призрачной, чем GFP. tdTomato это тандем димер и больше, чем мономерных флуоресцентных белков, которые иногда влияет на динамику синтез белков30. Таким образом результаты должны быть проанализированы и толковать осторожно, когда используется tdTomato. mScarlet, яркий мономерные красным флуоресцентный белок, который был недавно разработан, является альтернативным выбором31.
В то время как спиннинг confocal микроскопии диска широко используется для наблюдать аксональное транспорта и IFT7,21, оборудование дорого и может быть трудным для доступа в некоторых средах исследований. Однако эти явления также может быть записала и проанализированы в C. elegans с использованием стандартных люминесцентных микроскопов, если оснащен высокой NA линзы, потому что C. elegans является небольшой и прозрачной животных и легко наблюдать.
Будущего применения
Аналогичного метода иммобилизации, описанный здесь IFT было отмечено в резолюции одной молекулы в vivo32. Кроме того были разработаны несколько видов суперразрешением микроскопии. Один можно непосредственно применять методы, описанные здесь с суперразрешением микроскопического анализа. По моему опыту быстрый режим Airyscan33 работает очень хорошо для анализа IFT. Теоретически микроскопом суперразрешением вращающийся диск (SDSRM) будет хорошим выбором как хорошо34. В заключение комбинируя мутант библиотек и эти новые методы, метод, описанный здесь должно быть полезным для уточнения молекулярных механизмов аксональное транспорта и IFT в естественных условиях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Автор не имеет ничего, чтобы раскрыть.
Acknowledgments
Автор глубоко спасибо доктор Асако Сугимото (Университет Тохоку) за ее полезные обсуждения. wyIs251 был щедрый подарок от д-ра Кан Шэн (Стэнфордский университет). mnIs17 была предоставлена CGC, которая финансируется Управлением NIH инфраструктуры научно-исследовательских программ (P40 OD010440). Эта работа была поддержана Daiichi Санкё фонд, Наито фонд и фонд науки мозга и JSP-страницы KAKENHI Грант #17 H 05010 и #16 H 06536.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Slideglass (76 x 26 mm) | Matsunami | S1111 | |
| Coverglass (22 x 40 mm) | Matsunami | C024401 | |
| Agarose | Wako | 318-01195 | |
| Polystylene microbeads 0.1 micron | Polysciences | #00876 | |
| Heat block | TAITEC | 0063288-000 | CTU-mini |
| Microscope | Olympus | IX-71 | widefield microscope |
| Spinning disk Scanner | Yokogawa | CSU-X1 | spinning disc confocal scanner |
| Digital CCD camera | Hamamatsu Photonics | C10600-10B | ORCA-R2 degital CCD camera |
| Objective lens (x100, NA1.4) | Olympus | UPLSAPO 100XO | |
| Pasteur pipette (5 inch) | IWAKI | IK-PAS-5P | |
| Glass tube (1.5 cm diameter x 10.5 cm) | IWAKI | 9820TST15-105NP | |
| TV9211: wyIs251 | Laboratory of Kang Shen | N/A | |
| OTL11: mnIs17 | Ref. 27, 29 | N/A | SP2101 was backcrossed with wild type for 6 times |
| Stereo microscope | Carl Zeiss | 435064-9000-000 | STEMI 508 |
| Mirror transillumination unit | Carl Zeiss | 435425-9010-000 | |
| platinum wire (0.2 mm) | Nilaco Corporation | m78483501 | |
| 60 mm plastic dish | Falcon | #351007 | |
| Fiji | N/A | N/A | https://fiji.sc/ |
| nematode growth medium (NGM) | 1.7% (w/v) agarose, 50mM NaCl, 0.25% (w/v) Peptone, 1 mM CaCl2, 5 mg/mL Cholesterol, 25 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4 |
References
- Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. Molecular motors in neurons: transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease. Neuron. 68 (4), 610-638 (2010).
- Holzbaur, E. L., Scherer, S. S. Microtubules, axonal transport, and neuropathy. N Engl J Med. 365 (24), 2330-2332 (2011).
- Kamiya, R. Functional diversity of axonemal dyneins as studied in Chlamydomonas mutants. Int Rev Cytol. 219, 115-155 (2002).
- Scholey, J. M. Intraflagellar transport motors in cilia: moving along the cell's antenna. J Cell Biol. 180 (1), 23-29 (2008).
- Rosenbaum, J. L., Witman, G. B. Intraflagellar transport. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (11), 813-825 (2002).
- Ishikawa, H., Marshall, W. F. Ciliogenesis: building the cell's antenna. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (4), 222-234 (2011).
- Niwa, S., et al. Autoinhibition of a Neuronal Kinesin UNC-104/KIF1A Regulates the Size and Density of Synapses. Cell Rep. 16 (8), 2129-2141 (2016).
- Snow, J. J., et al. Two anterograde intraflagellar transport motors cooperate to build sensory cilia on C. elegans neurons. Nat Cell Biol. 6 (11), 1109-1113 (2004).
- Ou, G., Blacque, O. E., Snow, J. J., Leroux, M. R., Scholey, J. M. Functional coordination of intraflagellar transport motors. Nature. 436 (7050), 583-587 (2005).
- Zhou, R., Niwa, S., Homma, N., Takei, Y., Hirokawa, N. KIF26A is an unconventional kinesin and regulates GDNF-Ret signaling in enteric neuronal development. Cell. 139 (4), 802-813 (2009).
- Zhao, C., et al. Charcot-Marie-Tooth disease type 2A caused by mutation in a microtubule motor KIF1Bbeta. Cell. 105 (5), 587-597 (2001).
- Niwa, S., Tanaka, Y., Hirokawa, N. KIF1Bbeta- and KIF1A-mediated axonal transport of presynaptic regulator Rab3 occurs in a GTP-dependent manner through DENN/MADD. Nat Cell Biol. 10 (11), 1269-1279 (2008).
- Zhou, R., Niwa, S., Guillaud, L., Tong, Y., Hirokawa, N. A molecular motor, KIF13A, controls anxiety by transporting the serotonin type 1A receptor. Cell Rep. 3 (2), 509-519 (2013).
- Klassen, M. P., et al. An Arf-like small G protein, ARL-8, promotes the axonal transport of presynaptic cargoes by suppressing vesicle aggregation. Neuron. 66 (5), 710-723 (2010).
- Mondal, S., Ahlawat, S., Koushika, S. P. Simple microfluidic devices for in vivo imaging of C. elegans, Drosophila and zebrafish. J Vis Exp. (67), (2012).
- Chai, Y., et al. Live imaging of cellular dynamics during Caenorhabditis elegans postembryonic development. Nat Protoc. 7 (12), 2090-2102 (2012).
- Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. Long-term imaging of Caenorhabditis elegans using nanoparticle-mediated immobilization. PLoS One. 8 (1), 53419 (2013).
- Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection. J Vis Exp. (18), (2008).
- Collet, J., Spike, C. A., Lundquist, E. A., Shaw, J. E., Herman, R. K. Analysis of osm-6, a gene that affects sensory cilium structure and sensory neuron function in Caenorhabditis elegans. Genetics. 148 (1), 187-200 (1998).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
- Niwa, S. The nephronophthisis-related gene ift-139 is required for ciliogenesis in Caenorhabditis elegans. Sci Rep. 6, 31544 (2016).
- Maeder, C. I., San-Miguel, A., Wu, E. Y., Lu, H., Shen, K. In vivo neuron-wide analysis of synaptic vesicle precursor trafficking. Traffic. 15 (3), 273-291 (2014).
- Wu, Y. E., Huo, L., Maeder, C. I., Feng, W., Shen, K. The balance between capture and dissociation of presynaptic proteins controls the spatial distribution of synapses. Neuron. 78 (6), 994-1011 (2013).
- Dwyer, N. D., Adler, C. E., Crump, J. G., L'Etoile, N. D., Bargmann, C. I. Polarized dendritic transport and the AP-1 mu1 clathrin adaptor UNC-101 localize odorant receptors to olfactory cilia. Neuron. 31 (2), 277-287 (2001).
- Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D., Bargmann, C. I., Avery, L. Laser microsurgery in Caenorhabditis elegans. Methods Cell Biol. 107, 177-206 (2012).
- Kumar, J., et al. The Caenorhabditis elegans Kinesin-3 motor UNC-104/KIF1A is degraded upon loss of specific binding to cargo. PLoS Genet. 6 (11), 1001200 (2010).
- Zheng, Q., et al. The vesicle protein SAM-4 regulates the processivity of synaptic vesicle transport. PLoS Genet. 10 (10), 1004644 (2014).
- Blacque, O. E., et al. The WD repeat-containing protein IFTA-1 is required for retrograde intraflagellar transport. Mol Biol Cell. 17 (12), 5053-5062 (2006).
- Evans, J. E., et al. Functional modulation of IFT kinesins extends the sensory repertoire of ciliated neurons in Caenorhabditis elegans. J Cell Biol. 172 (5), 663-669 (2006).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
- Bindels, D. S., et al. mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging. Nat Methods. 14 (1), 53-56 (2017).
- Prevo, B., Mangeol, P., Oswald, F., Scholey, J. M., Peterman, E. J. Functional differentiation of cooperating kinesin-2 motors orchestrates cargo import and transport in C. elegans cilia. Nat Cell Biol. 17 (12), 1536-1545 (2015).
- Robison, P., et al. Detyrosinated microtubules buckle and bear load in contracting cardiomyocytes. Science. 352 (6284), 0659 (2016).
- Hayashi, S., Okada, Y. Ultrafast superresolution fluorescence imaging with spinning disk confocal microscope optics. Mol Biol Cell. 26 (9), 1743-1751 (2015).
