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Developmental Biology

Inmovilización de Caenorhabditis elegans para analizar el transporte intracelular en las neuronas

Published: October 18, 2017 doi: 10.3791/56690
Automatic Translation
1
1Frontier Research Institute for Interdisciplinary Sciences and Graduate School of Life Sciences, Tohoku University

Summary

Elegans de Caenorhabditis (C. elegans) es un buen modelo para estudiar el transporte axonal e intracelular. Aquí describo un protocolo para el análisis del transporte axonal e intraflagelar en C. elegansy grabación en vivo .

Abstract

Transporte axonal y el Transporte intraflagelar (IFT) son esenciales para la función y la morfogénesis axon y cilios. Proteínas del superfamilia de quinesina y dineína son motores moleculares que regulan anterograde y retrógrada transporte, respectivamente. Estos motores utilizan redes de microtúbulos como rieles. Elegans de Caenorhabditis (C. elegans) es un organismo modelo de gran alcance para estudiar transporte axonal y IFT en vivo. Aquí describo un protocolo para observar el transporte axonal y IFT en la vida del C. elegans. Transporte de carga puede visualizarse por selección de proteínas de carga utilizando proteínas fluorescentes como la proteína verde fluorescente (GFP). C. elegans es transparente y proteínas GFP-tagged carga pueden expresarse en células específicas bajo promotores específicos de la célula. Gusanos vivos pueden ser fijos por microesferas en gel de agarosa de 10% sin matar o anestesiar los gusanos. En estas condiciones, movimiento de carga se puede observar directamente en los axones y cilios de la vida de C. elegans sin disección. Este método puede ser aplicado a la observación de cualquier molécula de carga en las células mediante la modificación de las proteínas de la blanco o las células que expresan. Proteínas básicas como motores moleculares y proteínas adaptadoras que intervienen en el transporte axonal y IFT se conservan en C. elegans. Comparado con otros organismos modelo, mutantes pueden ser obtenidos y mantiene más fácilmente en C. elegans. Combinando este método con varios mutantes de C. elegans puede aclarar los mecanismos moleculares del transporte axonal y IFT.

Introduction

Proyección de imagen de células vivas es una herramienta esencial para el análisis de transporte intracelular. En biología de la célula neuronal, análisis de transporte axonal con proyección de imagen de células vivas son esenciales para la comprensión de la función y la morfogénesis neuronal1. Defectos en el transporte axonal subyacen varios neurodegenerativas trastornos2. Dynein y proteínas de Kinesin Superfamilia realicen transporte axonal anterogradely y retrogradely, respectivamente1,2.

Cilios son otro compartimento celular en el que la red de microtúbulos y tráfico de maquinaria son altamente desarrollada3. Maquinaria de síntesis de proteína no se localiza en los cilios, lo que significa que deberán transportarse ciliares proteínas desde el citoplasma a las puntas de los cilios. Cilios específicos quinesina y dineína, llamado kinesin-2 y citoplásmica dineína-2, respectivamente, el transporte de los componentes de los cilios4, en un fenómeno llamado Transporte intraflagelar (IFT)5. Deterioro de IFT causa un espectro de enfermedades llamadas ciliopathies6. Así, análisis del mecanismo IFT por proyección de imagen de células vivas es necesaria para entender los mecanismos básicos de formación ciliar y patogenia.

Elegans de Caenorhabditis (C. elegans) es un buen modelo para estudiar el transporte axonal y IFT7,8,9. Para observar el IFT, Chlamydomonas se ha utilizado ampliamente como un organismo modelo5,6. Chlamydomonas es un organismo unicelular, la relación de IFT con el envejecimiento, la función neuronal y comportamiento serían difícil de analizar. Además, no han aplicado técnicas genéticas esenciales como CRISPR/Cas9 a Chlamydomonas. En organismos más altos del modelo, tales como ratones y Drosophila, interrupción del transporte axonal y IFT a menudo causa fenotipos letal transporte axonal y IFT son esenciales para la morfogénesis y la homeostasis de los animales 10, 11. En el caso de ratones, transfección y el cultivo celular se necesita generalmente para observar el transporte axonal y IFT, que requiere muchas habilidades y tiempo extenso12,13. Además, se puede perder mucho del contexto fisiológico importante en líneas celulares y células cultivadas. Porque el sistema nervioso no es esencial para la supervivencia de las lombrices, se interrumpen los mutantes de C. elegans transporte axonal o IFT no son a menudo letales7,9,14. Transporte axonal y IFT pueden observarse directamente en vivo sin la disección ya que C. elegans es transparente y por lo tanto es fácil observar los marcadores etiquetados de GFP.

Hay varios protocolos para inmovilizar, C. elegans, como el uso de un dispositivo de microfluidos15, cojines de agarosa con anestesia16o17de microesferas. La inclusión de la anestesia puede inhibir los trata de personas eventos en neuronas15. Un claro inconveniente del método dispositivo de microfluidos es que preparar un dispositivo de microfluidos no siempre es fácil. En cambio, inmovilización por pastillas de agarosa y microesferas es una manera conveniente y fácil para realizar imágenes de lapso de tiempo en C. elegans. Aquí describo este protocolo básico para inmovilizar C. elegans y visualizar el transporte axonal y IFT en vivo en C. elegans. En comparación con los otros métodos, el método descrito aquí no requiere equipo especial y es mucho más barato y más fácil de realizar.

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Protocol

1. preparación de la muestra

  1. generar un transgénico C. elegans cepa de interés utilizando metodologías transgénicas 18. Por otra parte, obtener cepas adecuadas desde el centro de genética de Caenorhabditis (CGC). Para visualizar el transporte axonal de los precursores de la vesícula sináptica, utilice la línea transgénica wyIs251 [Pmig-13::gfp::rab-3] 7. Para observar el IFT, obtener la línea transgénica mnIs17 [osm-6::gfp] 19. Estas cepas se utilizan en el presente Protocolo.
    Nota: Ya sea matriz Extracromosómica, integración genómica o incluso GFP knock-en obras. Para reducir las señales de fondo, uso de promotores específicos de células, en lugar de pan-neuronal promotores.
    Nota: Mantenimiento de gusanos se describe en otros protocolos 20. Las cepas se mantuvieron en el césped de Escherischia coli OP50 alimentador sobre el crecimiento de nematodos placas de medio (NGM) (agarosa al 1,7% (w/v), 50 mM NaCl, 0,25% (w/v) peptona, 1 mM CaCl 2, 5 mg/mL de colesterol, 25 m m KH 2 PO 4, 1 mM MgSO 4 en platos de plástico de diámetro 60 mm) a 20 ° C.
  2. Crecer gusanos a 20 ° C en las placas de NGM a cualquier fase del ciclo de vida de los gusanos.
    Nota: Se pueden observar transporte axonal y IFT en cualquier etapa. L4 tarde a adulto joven es un buen control positivo ya que varias publicaciones han utilizado estas etapas y visualizar tráfico eventos 14 , 21 , 22 , 23.

2. Preparación del 10% agarosa

Nota: muchos proveedores ofrecen productos similares tales como agar, polvo de agar y agarosa. Utilizar la electroforesis en agarosa de grado (fuerza del gel > 1200 g/cm 2). Polvos de agar baratos no funcionan porque el gel resultante no es lo suficientemente fuerte para inmovilizar gusanos.

  1. Agarosa de 0.4 g de mezcla de 4 mL agua destilada (DW) en un tubo de vidrio (1,5 cm x 10,5 cm). Ponga una tapa en el tubo de vidrio para evitar la evaporación.
  2. Poner el tubo de vidrio en un bloque de calor de 95 ° C durante 90 minutos. Además, preparar otro tubo de vidrio (1,5 cm x 10,5 cm) llenado de DW y mantener a 95 ° C. poner una pipeta de Pasteur en la 95 ° C DW ( figura 1 A). Se verá un montón de pequeñas burbujas en el tubo de la agarosa y la solución debe ser turbia. Dejarlo hasta que la solución sea clara. Luego, mezclar mediante pipeteo arriba y abajo hasta que la solución de agarosa sea homogénea.
    Nota: Microondas no pueden utilizarse para preparar la solución de agarosa de 10% cuando hace de DW y agarosa. Pequeñas burbujas causadas por microondas evitar fusión de agarosa. Sin embargo, gel de agarosa de 10% solidificado puede fácilmente derretir otra vez usando un microondas. Tubos de vidrio que contiene gel de agarosa de 10% pueden ser preparados antes de tiempo y almacenados a 4 ° C durante al menos 6 meses. Si al hacerlo, derretir el caldo usando un microondas cuando sea necesario y comenzar desde el paso 3 en el presente Protocolo.
    Nota: Agarosa gradualmente pierde la capacidad de solidificarse si se incuban a 95 ° C durante mucho tiempo o después de repetidos solidificación y fusión. Si esto sucede, preparar nuevas 10% agarosa.

3. Preparación de agarosa almohadilla

  1. utilizando la pipeta Pasteur caliente preparada en el paso 2.2, colocar 2 gotas de 10% de agarosa sobre un portaobjetos de 76 x 22 mm.
  2. Rápidamente cubierta con un segundo portaobjetos de 76 x 22 mm 2 antes de la caída de la agarosa se solidifica como se muestra en la figura 1 B y empuje hacia abajo en la segunda diapositiva para aplanar la solución de agarosa. El espesor debe ser de 0.5-1 mm.
  3. Rápidamente Limpie la pipeta de Pasteur pipetas 95 ° C DW hacia arriba y hacia abajo hasta que la solución de agarosa es eliminada. De lo contrario, la pipeta que se obstruyen por gel de agarosa. Salir de la situación de la pipeta en la 95 ° C DW.
  4. Espere 1 minuto. La agarosa forma y se convierte en turbia. Luego, deslice el portaobjetos apartes a mano ( figura 1 C).

4. Montaje de gusanos

Nota: incluso las pequeñas cantidades de movimiento de gusano evitar buena observación. Levamisol se ha utilizado tradicionalmente para prevenir el movimiento del gusano en la agarosa pad 24 , 25. Sin embargo, levamisol inhibe los receptores neuronales en C. elegans y por lo tanto puede afectar tráfico eventos en neuronas 15. Utilizando microbeads del poliestireno descrito hereis una buena alternativa 17.

  1. Microscopio estéreo equipado con una transiluminación espejo desplazable, transferencia de ~ 30 gusanos transgénicos que expresan los marcadores adecuados a un nuevo NGM placa sin bacterias usando un alambre de platino selección.
    Nota: Una selección de alambre de platino se hace del alambre de platino y pipeta de Pasteur (5 pulgadas), y la punta del alambre de platino fue aplanada. La preparación de las selecciones de alambre de platino y manejo de lombrices con éstos se describen en el Wormbook (http://www.wormbook.org).
  2. Deja la placa durante 1 minuto las bacterias se eliminan automáticamente de las superficies de gusanos como los gusanos se mueven en gel de agarosa NGM sin bacterias.
  3. Puso un 0.5-1.0 μL caída de 2,6% microesferas poliestireno del diámetro de 100 nm en el agua sobre el bloque de agar ( figura 1 D). Transferencia de 10-20 gusanos de la placa NGM libre de bacterias a las microesferas. Gusano de gota y propagación de los gusanos usando el alambre de platino selección para evitar la superposición de cuerpos ( figura 1 E).
  4. Aplique 2 cubreobjetos 22 x 40 mm ( figura 1 F). Presionar suavemente para eliminar burbujas de aire, pero evitar la trituración de gusanos. La muestra está ahora lista para la proyección de imagen de.
    Nota: Porque anestesia no es administrado, gusanos se fijan sólo por la fuerza de fricción generada por la almohadilla agar microbeads del poliestireno y cubreobjetos 17. La presencia de bacterias de alimentador o demasiada solución hará más débil la fuerza friccional.
    Nota: Diferentes tamaños de trabajo cubreobjetos (p. ej., 22 x 22 mm 2, 18 x 18 mm 2). Sin embargo, pueden prevenir el cubreobjetos mayor inmersión agua o aceite de la lente del objetivo que se escapa en las muestras durante la observación.

5. Observación

Nota: parámetros apropiados de la proyección de imagen (energía del laser, ganancia, binning, etc.) serán diferente para cada sistema de microscopio y cámara. Aquí, se utiliza un microscopio de campo amplio equipado con un escáner confocal de disco giratorio y una cámara CCD digital.

  1. Regular la temperatura de la etapa a 20 ° C, o ajustar la temperatura a 20 ° C.
  2. Colocar la corredera de la muestra sobre la platina del microscopio. Utilizar 100 x (apertura numérica = 1.3 o mejor) objetivo.
  3. Busca de las esferas indicadas en la figura 2 A (para wyIs251 y transporte axonal) o figura 2 B (para mnIs17 y IFT) como controles positivos . Otras áreas pueden ser analizadas como bien 22.
  4. Conjunto de parámetros (aumento de CCD = 200, Binning = 1 o 2, energía del laser a 488 nm = 1.0-1.3 mW). Realizar la grabación de lapso de tiempo en 4 cuadros/s hasta 1 min guardar archivos en formato TIFF de páginas múltiples.
    Nota: Si GFP señales desaparecen y es difícil de seguir observando OSM-6::GFP o GFP::RAB-3 por 30 s, la potencia del láser es demasiado fuerte. En ese caso, reduzca la potencia del láser. Por el contrario, si no se registra ningún movimiento vesicular, la potencia del láser es demasiado débil. En ese caso, aumentar la energía del laser.
  5. Observar un gusano diferente y repetir 5.3 y 5.4. Las observaciones pueden durar hasta 20 minutos, pero cada gusano debe registrarse una sola vez para evitar los efectos de photo daños.
    Nota: Los gusanos se han observado por al menos 20 min sin defectos importantes 7 , 27 , 28. Una observación más larga posible pero asilo ' t sido probado todavía. Una clara señal de la muerte neuronal es el cambio de morfología neuronal como hinchazón de la neurita. Como pueden verse las señales débiles de GFP en axones y dendritas en wyIs251 y mnIs17, neurite morfología puede comprobarse fácilmente mirando a axones o dendritas. Morfología neuronal se muestra en la figura 2.
  6. Generar archivos de película.
    1. Abrir el multi-TIFF archivo utilizando el software de Fiji. Ir a archivo > abrir Seleccione el archivo multi-TIFF guardó en el paso 5.4.
      Nota: Fiji se puede descargar en jttps://fiji.sc. Imagen J y plugins también pueden usarse para generar kymographs. Si al hacer esto, siga las instrucciones para el plugin solicitadas.
    2. , haga clic en el " selección Rectangular " botón ( figura 3, flecha) y seleccione el área de interés por dibujar un rectángulo con un ratón de ordenador (rectángulo amarillo en la figura 3 A). Ir a la imagen > pilas > herramientas > Substacks y seleccione los números de segmento que se incluyen en la película. Se genera un substack.
    3. Activar la ventana de substack haciendo clic y vamos a imagen > ajuste > brillo y contraste. Aparece una ventana para ajustar el brillo y contraste. En la ventana, deslice la parte superior de la barra (mínimo) a la derecha para que la señal de fondo desaparece y el segundo superior de la barra (máximo) a la izquierda así que el movimiento de vesículas y partículas pueden verse bastante bien sobre el fondo.
    4. Vamos a imagen > pilas > tiempo matriz. Como la película se graba en 4 cuadros/s en el paso 5.4, el intervalo de tiempo es de 0.25 s. Así, tipo " 0,25 " en intervalo de.
    5. Generar un archivo de película seleccionando Guardar como > AVI desde el menú de archivo (pelicula 1 y 2).
      Nota: Mediante el uso de plugins apropiados, usted puede guardar el archivo como otros formatos tales como " mpeg4 " o " mov " archivos.
  7. Genere kymographs.
    1. Abra los archivos originales de la película utilizando otra vez el software de FIji y repita los pasos 5.6.2 y 5.6.3 para ajustar el brillo y contraste.
    2. Clic " segmentado línea " ( figura 3 B, flecha). Utilizando un ratón, dibuje una línea segmentada a lo largo de la cilia o axón (línea amarilla, en la figura 3 B).
    3. Ir a analizar > Multi Kymograph > Multi Kymograph ( figura 3 C). Aparece la ventana de ancho de línea ( figura 3 D). Tipo " 3 " en la ventana de grosor de línea y haga clic en Aceptar ( figura 3 D).
      4. Se crea la ventana de kymograph de
    4. . Guardar la imagen en formato TIFF o JPEG.

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Representative Results

Transporte axonal de neuronas DA9
Utilizando la línea de wyIs251 , la anterógrada y el transporte axonal retrógrado de GFP::RAB-3 se puede grabar simultáneamente en la neurona de motor DA9. La velocidad media de anterograde y transporte retrógrado en el axón proximal dorsal de la neurona DA9 es aproximadamente 1,8 y 2,6 μm/s, respectivamente22. El número de vesículas móviles es 0.03 y 0.018 por μm del axón por s. Así, para una observación de s 30 de 10 μm de axón DA9 utilizando una lente de 100 x, se encuentra cerca de 9 y 5 movimiento de vesículas en el axón (figura 4 y 1 película). Si ningún movimiento vesicular puede ser observado, es posible que la potencia del láser es demasiado débil. Además de carreras de largo alcance, corto alcance movimiento de piscinas de vesícula puede ser registrado (película 1). Algunas vesículas paren en estas piscinas de vesícula, mientras que otros disocian de allí7,23. Estos parámetros se pueden supervisar y utilizar para analizar los fenotipos mutantes.

IFT en neuronas de cola
Cilios se localizan en la punta de las dendritas en C. elegans (figura 2B). La cepa de mnIs17 expresa tagged GFP OSM-6, una de las subunidades IFT29. OSM-6 se expresa en ambos cabeza y cola de neuronas19. Mientras que muchos cilios cabeza están marcados por mnIs17, sólo dos cilios se observan claramente en la neurona de la cola. Así, observando estos cilios es más fácil que cabeza cilios (véase también). OSM-6::GFP es difuso en el citoplasma neuronal como el axón, cuerpo celular y dendrita. Sin embargo, cilios, 6::GFP OSM es concentrado en a cilios e incorporado en el movimiento de las partículas. La longitud de los cilios PHA y PHB son aproximadamente 6,5 μm. IFT Anterograde es bifásica 8,9. La velocidad de anterograde IFT es sobre 0,7 y 1,3 μm/s en los segmentos mediados y distales de los cilios, respectivamente (figura 5 y película 2).

Figure 1
Figura 1 : Demostración de la preparación de la muestra. (A) caliente DW, pipeta Pasteur y 10% de agarosa en el bloque de calor. (B y C) Preparación de las almohadillas de agarosa: se forma un cojín de agarosa entre diapositivas (B). La diapositiva superior se quita después forma un cojín de agarosa (C). (D) esquema dibujo mostrando cómo poliestireno solución grano se coloca en la almohadilla de agarosa. Dibujo que muestra cómo los gusanos se ponen en la solución de poliestireno del grano mediante un alambre de platino de esquemático de (E) escoger. (F) A cubreobjetos (22 x 44 mm2) se ponen en el teclado de la agarosa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 : Área de la proyección de imagen. (A) dibujo esquemático del neuronas DA9 y VA12 y una imagen representativa de wyIs251. En DA9 las neuronas, el axón ventral comisura y axón proximal no tiene sinapsis maduritas. Pero los precursores de la vesícula sináptica se transportan desde el cuerpo celular a sinapsis a través de estas regiones axonales. Se muestra la región que debe ser observada por las cajas. (B) dibujo esquemático del PHA y PHB neuronas y sus cilios. Se muestra la región que debe ser observada por las cajas. Barra de escala = 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 : Generación de películas y kymographs utilizando el software de Fiji. (A) haga clic en el botón "Selección Rectangular" (flecha) y seleccione el área que uno quisiera concentrarse dibujando un rectángulo (caja amarilla) para generar substacks. (B) haga clic en el botón de línea segmentada (flecha) y trace una línea segmentada a lo largo de los cilios usando un ratón (línea amarilla). (C) seleccionar "Analizar", "Multi Kymograph" y "Multi Kymograph" para iniciar un plugin para generar kymographs. (S) grosor de línea de entrada, haga clic en "Aceptar" y generar kymographs (figura 5 y figura 7). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4 : Kymograph representante de transporte axonal de los precursores de la vesícula sináptica. GFP::Rab-3 movimiento se observa en la región proximal de la asynaptic de DA9 neurona y la kymograph fue generado con Multi Kymograph de Fiji. Barras horizontales y verticales representan la longitud y tiempo, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5 : Representante kymograph de IFT. OSM-6::GFP se observa en PHA y PHB cilios y esta kymograph se genera el evento trata de personas en cada una de ellas. El kymograph fue generado con Multi Kymograph de Fiji. Barras horizontales y verticales representan la longitud y tiempo, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Movie 1
1 de la película: película representativa del transporte axonal de los precursores de la vesícula sináptica. GFP::Rab-3 movimiento se observa en la región proximal de la asynaptic de la neurona DA9. GFP::Rab-3 se incorpora en precursores de la vesícula sináptica y transportado. Anterógrada y transporte axonal retrógrado se registran. Algunas vesículas pararan pero reiniciar de nuevo. La película fue grabada en 4 cuadros/s y los juegos en 15 fotogramas/s. Scale bar = 5 μm. Por favor haga clic aquí para ver este video. (Clic derecho para descargar)

Movie 2
2 de la película: película representativa de IFT. OSM-6::GFP se observa en cilios PHA y PHB. OSM-6::GFP se integra en el IFT complejo y se mueve a lo largo de los cilios. La película fue grabada en 4 cuadros/s y los juegos en la barra de escala de 15 fotogramas/s. = 5 μm. Por favor haga clic aquí para ver este video. (Clic derecho para descargar)

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Discussion

Limitación con respecto a los métodos existentes
El método descrito aquí está optimizado para observar eventos rápidas como transporte axonal y IFT. Así, la inmovilización se priorice más de incubación más largo. Aunque hemos podido observar eventos de tráfico por al menos 20 min sin perturbación significativa, este método no sea siempre conveniente observar eventos lentos que requieren más observaciones, como la elongación del axón y migración celular. Para más observaciones, es necesario optimizar las condiciones de reducir el porcentaje de la agarosa (es decir, aumentar el agua para evitar la desecación y reducción de la presión que potencialmente causa daño). Alternativamente, el dispositivo de microfluidos descrito15 o inmovilización de los gusanos usando anestesia y almohadillas de agarosa puede ser más conveniente16 mientras que los efectos secundarios deben ser cuidadosamente evaluados.

Pasos críticos en el protocolo
Para la observación adecuada, los marcadores son críticos. Marcadores necesitan incorporarse a vesículas o partículas y ser de suficiente brillo. Pueden utilizarse matrices extracromosómicos o líneas integradas. Para la visualización del transporte axonal de los precursores de la vesícula sináptica en neuronas DA9, la cepa de wyIs251 es útil7,23. jsIs821 se ha utilizado para observar el transporte axonal en mechanosensory neuronas en algunos estudios26,27. Cuando se analizan otras neuronas, proteínas de vesículas sinápticas deben expresarse en las neuronas interesadas utilizando promotores específicos de la célula. Estos promotores deben ser lo suficientemente fuertes. RAB-3 y SNB-1 son ampliamente utilizados para etiquetar vesícula sináptica precursores22,23,26. Para observar el IFT, los componentes de lo complejo EIF deben etiquetarse. Como control positivo la cepa de mnIs17 es una buena opción29. Cilios de 8 celdas (ASE, ASG, ASI, ASL, ceniza, ASK, ADF y ADL) son agrupadas en la cabeza (amphid) mientras que los cilios de las 2 células (PHA y PHB) están incluidos en la cola (fantasmáticos). Porque OSM-6::GFP se expresa en todas las neuronas ciliadas en mnIs17, puede ser difícil de analizar el IFT en detalle en cabeza cilios. Sin embargo, en la región de la cola, sólo las neuronas PHA y PHB son etiquetadas y IFT en cada celda puede ser fácilmente resuelto. Otras proteínas IFT por proteínas fluorescentes pueden ser utilizados para observar IFT21,28. Si se desea analizar las neuronas cabeza, promotores específicos de la célula podría ser útiles. Mientras que los cilios cabeza tienen morfologías diferentes, transporte eventos pueden ser registrados29. Mediante el cruce de mutantes con estos marcadores, las funciones de cualquier genes en el transporte axonal y IFT pueden ser analizado en vivo. Se han descrito los parámetros que pueden ser analizados en el anterior trabajo22,23,26,27. GFP es la mejor opción y la primaria. mCherry y tdTomato pueden también ser usados22, sin embargo, es mucho más dévil que GFP mCherry. tdTomato es un dímero de tándem y más grande que las proteínas fluorescentes monoméricas, que a veces afecta a la dinámica de las proteínas de fusión30. Por lo tanto, los resultados deben ser analizados e interpretaron con cautela cuando se utiliza tdTomato. mScarlet, una proteína fluorescente roja monomérica brillante que recientemente se ha desarrollado, es una alternativa31.

Mientras giro microscopia confocal de disco es ampliamente utilizado para observar el transporte axonal y IFT7,21, el equipo es caro y puede ser de difícil acceso en algunos entornos de investigación. Sin embargo, estos fenómenos también pueden ser registrados y analizados en C. elegans utilizando microscopios fluorescentes estándar, si está equipado con lentes de alta NA, ya que C. elegans es un pequeño y transparente animal y fáciles de observar.

Aplicación en el futuro
Por el método de inmovilización similar descrito aquí, IFT se observó en la resolución de molécula única en vivo32. Por otra parte, se han desarrollado varios tipos de microscopia de la estupendo-resolución. Uno puede aplicar directamente los métodos descritos aquí al análisis microscópico de la estupendo-resolución. En mi experiencia, el modo rápido de Airyscan33 funciona muy bien para analizar IFT. Teóricamente, un microscopio de súper-resolución disco de spinning (SDSRM) sería una buena opción como bien34. En conclusión, mediante la combinación de bibliotecas mutantes y estas nuevas técnicas, el método descrito aquí debería ser útil para aclarar los mecanismos moleculares del transporte axonal y IFT en vivo.

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Disclosures

El autor no tiene nada que revelar.

Acknowledgments

El autor agradece profundamente Dr. Asako Sugimoto (Tohoku University) para su discusión útil. wyIs251 fue un generoso regalo del Dr. Kang Shen (Stanford University). mnIs17 fue proporcionado por la CGC, que es financiada por los NIH oficina de programas de infraestructura de investigación (P40 OD010440). Este trabajo fue apoyado por JSPS KAKENHI grant #17 H 05010 y #16 H 06536 y Daiichi Sankyo Fundación, Brain Science Foundation y la Fundación de Naito.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Slideglass (76  x 26 mm) Matsunami S1111
Coverglass (22  x 40 mm) Matsunami C024401
Agarose Wako 318-01195
Polystylene microbeads 0.1 micron Polysciences #00876
Heat block TAITEC 0063288-000 CTU-mini
Microscope Olympus IX-71 widefield microscope
Spinning disk Scanner Yokogawa CSU-X1 spinning disc confocal scanner 
Digital CCD camera Hamamatsu Photonics C10600-10B ORCA-R2 degital CCD camera
Objective lens (x100, NA1.4) Olympus UPLSAPO 100XO
Pasteur pipette (5 inch) IWAKI IK-PAS-5P
Glass tube (1.5 cm diameter x 10.5 cm) IWAKI 9820TST15-105NP
TV9211: wyIs251 Laboratory of Kang Shen N/A
OTL11: mnIs17 Ref. 27, 29 N/A SP2101 was backcrossed with wild type for 6 times
Stereo microscope Carl Zeiss 435064-9000-000 STEMI 508 
Mirror transillumination unit Carl Zeiss 435425-9010-000
platinum wire (0.2 mm) Nilaco Corporation m78483501
60 mm plastic dish Falcon #351007
Fiji N/A N/A https://fiji.sc/
nematode growth medium (NGM)   1.7% (w/v) agarose, 50mM NaCl, 0.25% (w/v) Peptone, 1 mM CaCl2, 5 mg/mL Cholesterol, 25 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Biología del desarrollo número 128 transporte Axonal Transporte intraflagelar elegans de Caenorhabditis microscopia neurona cilios
Inmovilización de <em>Caenorhabditis elegans</em> para analizar el transporte intracelular en las neuronas
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Niwa, S. Immobilization of… More

Niwa, S. Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons. J. Vis. Exp. (128), e56690, doi:10.3791/56690 (2017).

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