Summary
ايليجانس كاينورهابديتيس (C. ايليجانس) نموذج جيد لدراسة النقل محواري وداخل الخلايا. وهنا أصف على بروتوكول في فيفو تسجيل وتحليل للنقل محواري وإينترافلاجيلار في C. ايليجانس.
Abstract
محواري النقل والنقل إينترافلاجيلار (ايفت) ضرورية ل morphogenesis إكسون واهداب والدالة. Kinesin فوق عائلة البروتينات ودينين من المحركات الجزيئية التي تنظم أنتيروجرادي والنقل إلى الوراء، على التوالي. هذه المحركات تستخدم شبكات microtubule كالقضبان. ايليجانس كاينورهابديتيس (C. ايليجانس) كائن نموذج قوية لدراسة النقل محواري وايفت في فيفو. هنا، أود أن أصف بروتوكول لمراقبة النقل محواري وايفت في المعيشة C. ايليجانس. يمكن تصور البضائع المشحونة بعلامات البضائع البروتينات باستخدام البروتينات الفلورية مثل البروتينات الفلورية الخضراء (التجارة والنقل). C. ايليجانس يتسم بالشفافية ويمكن التعبير عن البروتينات البضائع معلم بروتينات فلورية خضراء في خلايا معينة تحت المروجين خلية على حدة. يمكن أن تكون ثابتة الديدان الحية التي ميكروبيدس على 10% [اغروس] هلام دون قتل أو أنيسثيتيزينج الديدان. في ظل هذه الظروف، حركة نقل البضائع مباشرة يلاحظ في محاور عصبية واهداب المعيشة C. ايليجانس دون تشريح. يمكن تطبيق هذه الطريقة لمراقبة أي جزيء البضائع في أي من الخلايا عن طريق تعديل بروتينات المستهدفة و/أو الخلايا يتم التعبير عنها في. هي المصانة البروتينات الأساسية مثل المحركات الجزيئية ومحول البروتينات التي تشارك في نقل محواري وايفت في C. ايليجانس. بالمقارنة مع غيرها من الكائنات نموذج، يمكن الحصول على طفرات وصيانتها بسهولة أكبر في C. ايليجانس. يمكن دمج هذا الأسلوب مع مختلف C. ايليجانس طفرات لتوضيح الآليات الجزيئية للنقل محواري وايفت.
Introduction
تصوير الخلية الحية أداة أساسية لتحليل النقل داخل الخلايا. في بيولوجيا الخلايا العصبية، تحليلات للنقل محواري مع تصوير الخلية الحية ضرورية لفهم العصبية الدالة و morphogenesis1. عيوب في النقل محواري تكمن وراء عدة اضطرابات الأعصاب2. Kinesin فوق عائلة البروتينات ودينين القيام بالنقل محواري أنتيروجراديلي وريتروجراديلي، على التوالي1،2.
أهداب هي آخر حجرة الخلوية التي هي الشبكة ميكروتوبولي وآلية الاتجار المتقدمة جداً3. يتم ترجمة البروتين التوليف إليه لا بأهداب، مما يعني أنه يتعين نقل البروتينات الهدبية من السيتوبلازم إلى نصائح أهداب. Kinesin الخاصة بأهداب ودينين، يسمى kinesin-2 وهيولى دينين-2، على التوالي، ونقل مكونات أهداب4، في ظاهرة تسمى النقل إينترافلاجيلار (ايفت)5. أسباب إعاقة IFT طائفة أمراض تسمى سيليوباثيس6. وهكذا، مطلوب تحليل إليه ايفت بتصوير الخلايا الحية لفهم الآليات الأساسية لتشكيل الهدبية والمرضية.
ايليجانس كاينورهابديتيس (C. ايليجانس) نموذج جيد لدراسة النقل محواري وايفت7،،من89. لمراقبة ايفت، Chlamydomonas قد استخدمت على نطاق واسع كنموذج كائن5،6. كما تشلاميدوموناس كائن أحادي الخلية، سيكون من الصعب لتحليل علاقة ايفت بالشيخوخة ووظيفة الخلايا العصبية والسلوك. وبالإضافة إلى ذلك، طبقت لا التقنيات الوراثية الأساسية مثل كريسبر/Cas9 إلى تشلاميدوموناس. في أعلى نموذج الكائنات، مثل الفئران و المورفولوجية، يسبب تعطل النقل محواري و IFT وكثيراً ما تعمل قاتلة لأن النقل محواري و IFT ضرورية ل morphogenesis والتوازن من الحيوانات 10، 11. في حالة الفئران، خلية ثقافة وتعداء عموما مطلوب لمراقبة النقل محواري وإيفت، الأمر الذي يتطلب الكثير من المهارات والوقت واسعة12،13. وبالإضافة إلى ذلك، قد فقدت الكثير من سياق الفسيولوجية الهامة في الخلايا المستزرعة وخطوط الخلية. للجهاز العصبي ليست ضرورية للبقاء على قيد الحياة الديدان، تعطلت C. ايليجانس طفرات في النقل محواري أو إيفت التي غالباً ما تكون غير قاتلة7،،من914. النقل محواري وايفت يمكن مباشرة ملاحظة في فيفو دون تشريح لأن C. ايليجانس شفافة وذلك من السهل ملاحظة علامات معلم بروتينات فلورية خضراء.
وهناك العديد من البروتوكولات شل C. ايليجانس، مثل استخدام جهاز موائع جزيئية15ومنصات [اغروس] مع التخدير16أو17من ميكروبيدس. إدراج التخدير قد تمنع الاتجار الأحداث في الخلايا العصبية15. عيب واضح من الأسلوب موائع جزيئية-الجهاز أن إعداد جهاز موائع جزيئية ليس دائماً أمرا سهلاً. بدلاً من ذلك، يتم التثبيت قبل ميكروبيدس ومنصات [اغروس] طريقة مريحة وسهلة لإجراء تصوير مرور الزمن في C. ايليجانس. وهنا أصف هذا البروتوكول الأساسية شل C. ايليجانس ووضع تصور للنقل محواري وايفت في فيفو في C. ايليجانس. مقارنة بالأساليب الأخرى، الطريقة الموضحة هنا لا تتطلب معدات خاصة، وهو أرخص بكثير وأسهل لتنفيذ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-"إعداد نموذج"
سلالة- توليد المعدلة وراثيا C. ايليجانس الاهتمام باستخدام منهجيات المعدلة وراثيا 18. وبدلاً من ذلك، الحصول على سلالات ملائمة من مركز علم الوراثة كاينورهابديتيس (كجك). لتصور النقل محواري السلائف حويصلة متشابك، استخدم خط المعدلة وراثيا wyIs251 [بميج-13::gfp::rab-3] 7. لمراقبة ايفت، الحصول على mnIs17 [osm-6::gfp] خط المعدلة وراثيا 19. وتستخدم هذه السلالات في هذا البروتوكول-
ملاحظة: أما الصفيف اكستراتشروموسومال، ودمج الجينوم، أو حتى بروتينات فلورية خضراء تدق في الأشغال. لتقليل الإشارات الخلفية، استخدم المروجين خلية على حدة، بدلاً من المروجين عموم العصبية.
ملاحظة: يصف البروتوكولات الأخرى 20 صيانة ديدان. وأبقى سلالات في مروج OP50 اشيريشيا كولاي التغذية على نمو السلكية لوحات (NGM) متوسطة (1.7 في المائة (w/v) [اغروس]، 50 مم كلوريد الصوديوم، ببتون 0.25% (w/v)، 1 مم كاكل 2، 5 ملغ/مل الكولسترول، 25 مم خ 2 ص 4، 1 مم MgSO 4 الأطباق البلاستيك قطرها 60 ملم) في 20 درجة مئوية. - تنمو الديدان عند 20 درجة مئوية على لوحات NGM في أي مرحلة من مراحل دورة حياة الديدان.
ملاحظة: أحد مراقبة النقل محواري وايفت في أي مرحلة. L4 الراحل للشباب البالغين عنصر تحكم إيجابية جيدة لمنشورات متعددة قد استخدمت هذه المراحل وتصور الاتجار الأحداث 14 ، ، من 21 22 ، 23-
2. إعداد 10% [اغروس]
ملاحظة: العديد من البائعين تقديم منتجات مماثلة مثل أجار واجار مساحيق [اغروس]. استخدام التفريد الصف [اغروس] (جل قوة > 1200 غ/سم 2). مساحيق أجار رخيصة لا تعمل بسبب الجل الناتجة ليست قوية بما فيه الكفاية لشل الديدان.
- ميكس ز 0.4 [اغروس] في 4 مل المقطر المياه (DW) في أنبوب زجاج (1.5 سم x 10.5 سم). وضع غطاء على أنبوب الزجاج لتجنب التبخر.
- وضع أنبوب الزجاج على كتلة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة. وبالإضافة إلى ذلك، تعد آخر زجاج الأنبوبة (1.5 سم x 10.5 سم) مليئة DW وإبقائه في 95 ° C. وضع بيبيت باستور في 95 درجة مئوية دويتشه فيلة ( الشكل 1 أ). سوف ينظر الكثير من الفقاعات الصغيرة في الأنبوب [اغروس] وينبغي أن يكون الحل عكر. اتركه حتى يصبح الحل واضح. ثم، مزيج من بيبيتينج صعودا وهبوطاً حتى يصبح الحل [اغروس] متجانسة.
ملاحظة: لا يمكن استخدام أفران الميكروويف لإعداد 10% [اغروس] الحل عندما قدم من دويتشه فيلة و [اغروس]. فقاعات صغيرة الناجمة عن الموجات الدقيقة تمنع ذوبان [اغروس]. ومع ذلك، طدت 10% [اغروس] هلام يمكن بسهولة أن ذاب مرة أخرى باستخدام ميكروويف. أنابيب زجاجية تحتوي على 10% [اغروس] هلام يمكن أعد قبل الوقت المحدد وتخزينها عند 4 درجة مئوية لمدة 6 أشهر على الأقل. في حالة القيام بذلك، تذوب المخزون باستخدام ميكروويف عند الحاجة وابدأ من الخطوة 3 في هذا البروتوكول-
ملاحظة: [اغروس] تدريجيا يفقد القدرة على ترسيخ إذا المحتضنة في 95 درجة مئوية لمدة طويلة أو بعد تكرار التجميد والذوبان. إذا حدث هذا، تعد الجديدة 10% [اغروس]-
3. إعداد لوحة [اغروس]
- باستخدام بيبيت باستور المعالجون إعدادها في الخطوة 2، 2، ضع قطرات 2 من 10% [اغروس] على شريحة 76 × 22 مم.
- بسرعة غطاء مع شريحة 76 × 22 مم 2 ثانية قبل الهبوط [اغروس] يتصلب كما هو مبين في الشكل 1 ب، ودفع إلى أسفل في الشريحة الثانية تسطيح الحل [اغروس]. يجب أن يكون السمك 0.5-1 مم-
- بسرعة تدفق ماصة باستور قبل بيبيتينج 95 درجة مئوية DW صعودا ونزولاً حتى يتم غسلها الحل [اغروس]. خلاف ذلك، سوف انسداد بيبيت واسطة [اغروس] هلام. ترك مكانة ماصة في 95 درجة مئوية DW.
- انتظر 1 دقيقة. أشكال لوحة المفاتيح [اغروس] ويصبح غائم. ثم الشرائح الشرائح عن بعضها باليد ( الشكل 1 ج)-
4. تصاعد من الديدان
ملاحظة: حتى كميات صغيرة من حركة الدودة منع مراقبة جيدة. وقد استخدمت Levamisole تقليديا لمنع حركة الدودة على 24 ، لوح [اغروس] 25. ومع ذلك، Levamisole يثبط مستقبلات الخلايا العصبية في C. ايليجانس، وبالتالي قد تؤثر على الاتجار الأحداث التي وقعت في 15 من الخلايا العصبية. استخدام البوليسترين ميكروبيدس وصف hereis بديل جيد 17-
- تحت مجهر ستيريو مجهزة تضوء مرآة القابل للانزلاق الموجود، نقل ~ 30 لوحة الديدان المعدلة وراثيا معربا عن العلامات المناسبة إلى NGM جديدة دون انتقاء البكتيريا باستخدام سلك البلاتين.
ملاحظة: اختيار سلك البلاتين مصنوع من سلك البلاتين وماصة باستور (5 بوصة)، وكان غيض سلك البلاتين بالأرض. إعداد اللقطات سلك البلاتين، ومعالجة الديدان مع هذه موصوفة في وورمبوك (http://www.wormbook.org)- - ترك اللوحة للحد الأدنى 1 البكتيريا يتم تلقائياً إزالة من سطوح الديدان الديدان تتحرك على NGM [اغروس] هلام دون البكتيريا. إسقاط
- وضعت 0.5-1.0 ميليلتر من 2.6% 100 نانومتر القطر البوليسترين ميكروبيدس في الماء على لوحة المفاتيح أجار ( الشكل 1 د). نقل الديدان 10-20 من لوحة NGM خالية من البكتيريا إلى ميكروبيدس. قطره وانتشار الديدان باستخدام سلك البلاتين بيك لتجنب تداخل دودة الهيئات ( الشكل 1 ﻫ)- تطبيق
- ساترة 2 22 × 40 ملم ( الشكل 1 و). دفع برفق إزالة فقاعات الهواء، ولكن تجنب سحق الديدان. العينة الآن جاهزة للتصوير-
ملاحظة: نظراً لأن إدارته لا التخدير، يتم إصلاحها الديدان فقط بقوة الاحتكاك الناجمة عن لوح أجار، ميكروبيدس البوليستيرين، وساترة 17. وجود وحدة تغذية البكتيريا و/أو حل الكثير سيجعل القوة احتكاكي الأضعف.
ملاحظة: أحجام مختلفة لعمل كوفيرسليبس (مثلاً، 22 × 22 مم 2، 18 × 18 مم 2). ومع ذلك، يمكن منع كوفيرسليبس أكبر غمر المياه أو النفط من العدسة الهدف تتسرب إلى عينات من خلال الملاحظة.
5. المراقبة
ملاحظة: سوف تختلف المعلمات التصوير المناسبة (طاقة الليزر، كسب، binning، إلخ) لكل نظام المجهر والكاميرا. هنا، يتم استخدام مجهر ويديفيلد مجهزة [كنفوكل] قرص غزل في الماسح ضوئي وكاميرا رقمية CCD.
- التحكم في درجة الحرارة للمرحلة إلى 20 درجة مئوية، أو ضبط درجة حرارة الغرفة إلى 20 درجة مئوية.
- وضع الشريحة عينة على المسرح المجهر. استخدم 100 x (الفتحة العددية = 1.3 أو أفضل) عدسة الهدف.
- البحث عن المجالات المبينة في الشكل 2 أ (بالنسبة wyIs251 والنقل محواري) أو الرقم 2 ب (بالنسبة mnIs17 وايفت) كعناصر إيجابية . يمكن تحليل مجالات أخرى ك جيدا 22-
- مجموعة المعلمات (مكاسب اتفاقية مكافحة التصحر = 200، بينينج = 1 أو 2، طاقة الليزر في 488 نانومتر = ميغاواط 1.0-1.3). إجراء تسجيل مرور الوقت 4 إطارات في الثانية لتصل إلى 1 دقيقة حفظ الملفات بتنسيق mutli TIFF-
ملاحظة: إذا كانت التجارة والنقل إشارات تختفي ومن الصعب الاستمرار في مراقبة GFP::RAB-3 أو OSM-6::GFP لمدة 30 ق، قوة الليزر قوية جداً. وفي هذه الحالة، تقليل قوة الليزر. على العكس من ذلك، إذا كان يتم تسجيل لا حركة حويصلية، قوة الليزر ضعيفة جداً. وفي هذه الحالة، زيادة قوة الليزر- - مراقبة دودة مختلفة وكرر 5.3 و 5.4. الملاحظات التي يمكن أن تستمر لمدة تصل إلى 20 دقيقة، ولكن ينبغي أن تسجل كل دودة مرة واحدة فقط لتجنب آثار فالأضرار النموذجية-
ملاحظة: الديدان، وقد لوحظت لمدة 20 دقيقة على الأقل دون عيوب كبيرة 7 ، ، من 27 28. من الممكن مراقبة أطول لكن ملاذ ' تي تم اختباره بعد. إشارة واضحة لموت الخلايا العصبية هو تغير مورفولوجيا الخلايا العصبية مثل تورم نيوريتي. كما يتبين إشارات ضعيفة في التجارة والنقل في محاور عصبية و dendrites في wyIs251 و mnIs17، يمكن بسهولة التحقق مورفولوجيا نورت بمجرد النظر في محاور عصبية أو dendrites. ويبين الشكل 2 مورفولوجيا الخلايا العصبية. - إنشاء ملفات الفيلم.
ملف
- فتح TIFF متعددة باستخدام البرمجيات فيجي. انتقل إلى الملف > ثم حدد فتح ملف TIFF متعدد بحفظه في الخطوة 5، 4-
ملاحظة: يمكن تحميل فيجي في jttps://fiji.sc. يمكن أيضا استخدام الصور ي والإضافات لتوليد كيموجرافس. في حالة القيام بذلك، اتبع الإرشادات ذات الصلة للبرنامج المساعد الذي تم اختياره. - انقر فوق " مستطيل التحديد " زر ( الشكل 3 ، سهم) وتحديد مجال الاهتمام برسم مستطيل مع فأرة كمبيوتر (المستطيل الأصفر في الشكل 3 أ). انتقل إلى الصورة > أكوام > أدوات > سوبستاكس وحدد أرقام الشرائح التي يتم تضمينها في الفيلم. يتم إنشاء سوبستاك. تنشيط الإطار سوبستاك بواسطة النقر فوق
- وانتقل إلى الصورة > ضبط > السطوع/. تظهر نافذة لضبط السطوع والتباين. في الإطار الشريحة الأعلى بار (الحد الأدنى) إلى اليمين حتى أن يختفي الإشارات الخلفية والثاني بار (الحد الأقصى) إلى اليسار حتى أن أعلى حويصلات تتحرك والجسيمات يمكن أن يرى جيدا على الخلفية-
- انتقل إلى الصورة > أكوام > الوقت محرد. كما يتم تسجيل الفيلم على 4 إطارات/ثانية في الخطوة 5، 4، الفاصل الزمني هو 0.25 s. وهكذا، اكتب " 0.25 " في الفاصل الزمني.
- بإنشاء ملف فيلم بتحديد حفظ باسم > AVI من القائمة ملف (فيلم 1 و 2)-
ملاحظة: باستخدام الإضافات المناسبة، يمكنك حفظ الملف بتنسيقات أخرى مثل " mpeg4 " أو " موف " الملفات.
- فتح TIFF متعددة باستخدام البرمجيات فيجي. انتقل إلى الملف > ثم حدد فتح ملف TIFF متعدد بحفظه في الخطوة 5، 4-
- تولد كيموجرافس.
- فتح الملفات الفيلم الأصلي باستخدام البرمجيات فيجي مرة أخرى، ثم كرر الخطوات من 5.6.2 و 5.6.3 لضبط السطوع والتباين.
- انقر فوق " تقسيم خط " ( الشكل 3 ب، السهم). استخدام ماوس, رسم خط مجزأة على طول أهداب أو إكسون (الخط الأصفر، في الشكل 3 ب)-
- الذهاب إلى تحليل > كيموجراف متعدد > متعدد كيموجراف ( الشكل 3 ج). يظهر إطار عرض الخط ( الشكل 3 د). نوع " 3 " في نافذة لينيويدث وانقر فوق موافق ( الشكل 3 د)- يتم إنشاء إطار كيموجراف
- . حفظ الصورة بتنسيق TIFF أو JPEG.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
النقل محواري في الخلايا العصبية DA9
استخدام خط wyIs251 ، أنتيروجرادي والنقل إلى الوراء محواري GFP::RAB-3 يمكن في نفس الوقت تسجيل في العصبون DA9. متوسط سرعة anterograde والنقل إلى الوراء في إكسون الظهرية الدانية من العصبية DA9 هو حوالي 1.8 و 2.6 ميكرومتر/s، على التوالي22. عدد حويصلات تتحرك عن 0.03 و 0.018 الواحدة ميكرومترات إكسون كل ثانية. وهكذا، لمراقبة s 30 من 10 ميكرومترات من إكسون DA9 باستخدام عدسة 100 x، أحد إيجاد حوالي 9 و 5 تتحرك الحويصلات في إكسون (الشكل 4 و 1 فيلم). إذا كان يمكن ملاحظة لا حركة حويصلية، من الممكن أن قوة الليزر ضعيفة جداً. بالإضافة إلى تشغيل طويلة المدى، ويمكن أن تكون حركة قصيرة المدى من تجمعات حويصلة المسجلة (1 الفيلم). إيقاف بعض الحويصلات في هذه المجمعات حويصلة، بينما البعض الآخر ننأى عن وجود7،في الفترة من23. ويمكن رصد هذه المعلمات والمستخدمة لتحليل تعمل المسخ.
إيفت في ذيل الخلايا العصبية
يتم ترجمة أهداب إلى غيض dendrites في C. ايليجانس (الشكل 2ب). سلالة mnIs17 تعرب عن معلم بروتينات فلورية خضراء OSM-6، واحدة من مفارز IFT29. OSM-6 هو المعرب عنها في كل رأس وذيل الخلايا العصبية19. حين تتم تسمية أهداب الرأس العديد من قبل mnIs17، وضوح لوحظت أهداب اثنين فقط في الخلايا العصبية الذيل. وهكذا، مراقبة هذه أهداب أسهل من أهداب الرأس (انظر أيضا المناقشة). OSM-6::GFP منتشر في السيتوبلازم الخلايا العصبية مثل التي وجدت في محور عصبي، وجسم الخلية وتغصن. ومع ذلك، في أهداب، OSM-6::GFP هو يتركز بأهداب وإدراجها في تتحرك الجسيمات. طول أهداب فا و PHB بحوالي 6.5 ميكرومتر. ايفت Anterograde هو ثنائية الطور 8،9. هو سرعة anterograde ايفت عن 0.7 و 1.3 ميكرومتر/s في القطاعات المتوسطة والبعيدة من أهداب، على التوالي (الشكل 5 و 2 الفيلم).
الشكل 1 : البيان العملي لإعداد عينة- (أ) "دويتشه الساخنة"، بيبيت باستور و 10% [اغروس] في كتلة الحرارة. (ب وج) إعداد منصات [اغروس]: تم تشكيل جهاز pad [اغروس] بين الشرائح (ب). تتم إزالة الشريحة العليا بعد أشكال لوح [اغروس] (ج). يتم وضع التخطيطي (د) رسم يظهر كيف البوليستيرين حبة الحل على منصة [اغروس]. (ﻫ) التخطيطي الرسم تبين كيف يتم وضع الديدان في الحل حبة البوليستيرين باستخدام سلك البلاتين بيك. (و) ساترة (22 × 44 مم2) يوضع على لوحة المفاتيح [اغروس]. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : منطقة التصوير- (أ) التخطيطي رسم الخلايا العصبية DA9 و VA12 وصورة تمثيلية من wyIs251. في الخلايا العصبية DA9، ليس لدى إكسون البطني، كوميسوري، والدانية إكسون نهايات ناضجة. ولكن يتم نقل السلائف حويصلة متشابك من جسم الخلية إلى نهايات عبر هذه المناطق محواري. يتم عرض المنطقة التي ينبغي أن تراعي بمربعات. (ب) التخطيطي الرسم فا و PHB الخلايا العصبية وعلى أهداب. يتم عرض المنطقة التي ينبغي أن تراعي بمربعات. شريط المقياس = 10 ميكرومترات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : جيل من أفلام واستخدام البرمجيات فيجي كيموجرافس. انقر فوق الزر "تحديد مستطيلي" (السهم) (A) وقم بتحديد منطقة واحدة أود أن أركز على عن طريق رسم مستطيل (المربع الأصفر) لتوليد سوبستاكس. (ب) انقر فوق الزر خط مجزأة (السهم)، ورسم خط مجزأة على طول أهداب استخدام ماوس (الخط الأصفر). (ج) حدد "تحليل" و "متعددة كيموجراف" و "متعددة كيموجراف" لبدء تشغيل البرنامج المساعد لتوليد كيموجرافس. (ق) الإدخال لينيويدث، انقر فوق "موافق" وتوليد كيموجرافس (الشكل 5 و رقم 7). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 : كيموجراف الممثل للنقل محواري السلائف حويصلة متشابك. ويلاحظ حركة GFP::RAB 3 في منطقة أسينابتيك القريبة من DA9 العصبية وتم إنشاؤها في كيموجراف مع كيموجراف متعددة من فيجي. أشرطة أفقية وعمودية تمثل طول والوقت، على التوالي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5 : كيموجراف الممثل من ايفت. OSM-6::GFP في أهداب فا و PHB ويتم إنشاء هذه كيموجراف من الحدث الاتجار في أي واحد منهم. تم إنشاؤها في كيموجراف مع كيموجراف متعددة من فيجي. أشرطة أفقية وعمودية تمثل طول والوقت، على التوالي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
1 فيلم: فيلم الممثل للنقل محواري السلائف حويصلة متشابك. ويلاحظ GFP::RAB-3 الحركة في منطقة أسينابتيك القريبة من العصبية DA9. GFP::RAB-3 إدراج السلائف حويصلة متشابك ونقلها. وتسجل أنتيروجرادي والنقل محواري إلى الوراء. إيقاف بعض حويصلات لكن إعادة تشغيل مرة أخرى. تم تسجيل الفيلم في 4 إطارات/ثانية ويلعب في إطارات 15/Sca س.لو بار = 5 ميكرومترات. من فضلك انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)
2 فيلم: فيلم الممثل من ايفت. ولوحظ في أهداب فا و PHB OSM-6::GFP. OSM-6::GFP هو إدماج ايفت المعقدة، وتتحرك على طول أهداب. تم تسجيل الفيلم في 4 إطارات/ثانية ويلعب في 15 شريط مقياس الإطارات/س = 5 ميكرومترات. من فضلك انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
التقادم فيما يتعلق بالأساليب القائمة
الأسلوب الموصوفة هنا هو الأمثل لمراقبة الأحداث سريعة مثل النقل محواري وايفت. وهكذا، الأولوية لتجميد أكثر من حضانة أطول. بينما تمكنا من مراقبة الاتجار الأحداث لمدة 20 دقيقة على الأقل دون اضطراب كبير، هذا الأسلوب قد لا تكون دائماً مناسبة لمراقبة الأحداث بطيئة تتطلب الملاحظات أطول، مثل إكسون استطالة والهجرة الخلية. ملاحظات أطول، يحتاج المرء تحسين الظروف بتخفيض النسبة المئوية [اغروس] (زيادة الماء لتجنب تجفيف وتقليل الضغوط التي يحتمل أن يسببأيضرر). وبدلاً من ذلك، قد يكون الجهاز موائع جزيئية الموصوفة أعلاه15 أو التثبيت من الديدان باستخدام التخدير ومنصات [اغروس] أكثر مناسبة16 بينما ينبغي أن تقيم بعناية في الآثار الجانبية.
الخطوات الحاسمة في إطار البروتوكول
لمراقبة كافية، علامات الحرج. علامات تحتاج إلى إدراجها في حويصلات أو الجسيمات ويكون سطوع كافية. ويمكن استخدام صفائف اكستراتشروموسومال أو خطوط متكاملة. للتصور للنقل محواري السلائف حويصلة متشابك في الخلايا العصبية DA9، من سلالة wyIs251 مفيدة7،23. وقد استخدمت jsIs821 لمراقبة النقل محواري في الخلايا العصبية ميتشانوسينسوري في بعض الدراسات26،27. عندما يتم تحليل الخلايا العصبية الأخرى، ينبغي التعبير عن حويصلة متشابك البروتينات في الخلايا العصبية المهتمة باستخدام الخلية المحددة المروجين. مروجي هذه ينبغي أن تكون قوية بما يكفي. RAB-3 والسويسري-1 تستخدم على نطاق واسع لتسمية حويصلة متشابك السلائف22،،من2326. لمراقبة إيفت، يجب أن يكون المسماة مكونات IFT المعقدة. كعنصر إيجابي، من سلالة mnIs17 حسن اختيار29. هي أهداب النابعة من 8 خلايا (بورصة عمان، الأمين العام المساعد وعاصي، ASL، الرماد، وأسأل، والقوات الديمقراطية المتحالفة و ADL) المجمعة معا في الرأس (أمفيد) بينما يتم المحزوم أهداب من الخلايا 2 (فا و PHB) في الذيل (فاسميد). لأنه يتم التعبير عن OSM-6::GFP في جميع الخلايا العصبية عضو في mnIs17، قد يكون صعباً لتحليل ايفت بالتفصيل في أهداب الرأس. ومع ذلك، في منطقة الذيل، المسماة فقط من الخلايا العصبية فا و PHB و IFT في كل خلية يمكن حلها بسهولة. يمكن استخدام البروتينات ايفت الأخرى المسماة بالبروتينات الفلورية لمراقبة ايفت21،28. إذا كان أحد يرغب في تحليل الخلايا العصبية الرأس، سيكون من المفيد المروجين خلية على حدة. بينما أهداب رئيس مورفولوجيس مختلفة، يمكن أن تكون الأحداث النقل المسجلة29. طريق عبور طفرات مع هذه العلامات، مهام أي الجينات في النقل محواري وايفت يمكن تحليلها في فيفو. وقد وصف المعلمات التي يمكن تحليلها في السابق العمل22،،،من2326،27. التجارة والنقل هو الخيار الأفضل والابتدائي. مشري وتدتوماتو ويمكن أيضا استخدام22، غير أن مشري باهتة كثير من التجارة والنقل. تدتوماتو ديمر جنبا إلى جنب وأكبر من البروتينات الفلورية أحادي، مما يؤثر في بعض الأحيان ديناميات الانصهار البروتينات30. ولذلك، ينبغي تحليل النتائج وتفسيرها بحذر عند استخدام تدتوماتو. مسكارليت، بروتين فلورسنت أحمر أحادي الساطع الذي تم تطويره مؤخرا، هو خيار بديل31.
بينما الغزل القرص المجهري [كنفوكل] يستخدم على نطاق واسع لمراقبة النقل محواري وايفت7،21، المعدات مكلفة وقد يكون من الصعب على الوصول في بعض البيئات للبحث. ومع ذلك، يمكن أيضا تسجيل هذه الظواهر وتحليلها في C. ايليجانس استخدام المجاهر الفلورسنت القياسية، إذا كانت مجهزة بعدسات نا عالية، لأن C. ايليجانس صغيرة وشفافة الحيوان وسهلة لمراقبة.
تطبيقها في المستقبل
ولوحظ ايفت بأسلوب التثبيت مشابه الموصوفة هنا، في القرار جزيء واحد في فيفو32. وعلاوة على ذلك، تم وضع عدة أنواع من الفحص المجهري القرار فائقة. واحد مباشرة تطبيق الأساليب الموصوفة هنا للتحليل المجهري القرار فائقة. في تجربتي، يعمل طريقة سريعة أيريسكان33 جيد جداً لتحليل ايفت. نظرياً، سيكون مجهر قرار فائقة قرص غزل (سدسرم) اختياراً جيدا ك جيد34. وفي الختام، عن طريق الجمع بين المكتبات متحولة وهذه التقنيات الجديدة، والأسلوب الموصوفة هنا ينبغي مفيدة لتوضيح الآليات الجزيئية للنقل محواري وايفت في فيفو.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس له علاقة بالكشف عن صاحب البلاغ.
Acknowledgments
عميق شكرا مقدم البلاغ الدكتور أساكو Sugimoto (جامعة توهوكو) لمناقشة مفيدة لها. وكان wyIs251 هدية سخية من الدكتورة كانغ شين (جامعة ستانفورد). قدم mnIs17 كجك، الذي يموله مكتب المعاهد الوطنية للصحة "برامج الهياكل الأساسية للبحوث" (P40 OD010440). أيد هذا العمل دايتشي سانكيو مؤسسة، مؤسسة علوم المخ ومؤسسة نايتو ومنحة كاكينهي JSPS #17 ح 05010 و #16 ح 06536.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Slideglass (76 x 26 mm) | Matsunami | S1111 | |
| Coverglass (22 x 40 mm) | Matsunami | C024401 | |
| Agarose | Wako | 318-01195 | |
| Polystylene microbeads 0.1 micron | Polysciences | #00876 | |
| Heat block | TAITEC | 0063288-000 | CTU-mini |
| Microscope | Olympus | IX-71 | widefield microscope |
| Spinning disk Scanner | Yokogawa | CSU-X1 | spinning disc confocal scanner |
| Digital CCD camera | Hamamatsu Photonics | C10600-10B | ORCA-R2 degital CCD camera |
| Objective lens (x100, NA1.4) | Olympus | UPLSAPO 100XO | |
| Pasteur pipette (5 inch) | IWAKI | IK-PAS-5P | |
| Glass tube (1.5 cm diameter x 10.5 cm) | IWAKI | 9820TST15-105NP | |
| TV9211: wyIs251 | Laboratory of Kang Shen | N/A | |
| OTL11: mnIs17 | Ref. 27, 29 | N/A | SP2101 was backcrossed with wild type for 6 times |
| Stereo microscope | Carl Zeiss | 435064-9000-000 | STEMI 508 |
| Mirror transillumination unit | Carl Zeiss | 435425-9010-000 | |
| platinum wire (0.2 mm) | Nilaco Corporation | m78483501 | |
| 60 mm plastic dish | Falcon | #351007 | |
| Fiji | N/A | N/A | https://fiji.sc/ |
| nematode growth medium (NGM) | 1.7% (w/v) agarose, 50mM NaCl, 0.25% (w/v) Peptone, 1 mM CaCl2, 5 mg/mL Cholesterol, 25 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4 |
References
- Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. Molecular motors in neurons: transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease. Neuron. 68 (4), 610-638 (2010).
- Holzbaur, E. L., Scherer, S. S. Microtubules, axonal transport, and neuropathy. N Engl J Med. 365 (24), 2330-2332 (2011).
- Kamiya, R. Functional diversity of axonemal dyneins as studied in Chlamydomonas mutants. Int Rev Cytol. 219, 115-155 (2002).
- Scholey, J. M. Intraflagellar transport motors in cilia: moving along the cell's antenna. J Cell Biol. 180 (1), 23-29 (2008).
- Rosenbaum, J. L., Witman, G. B. Intraflagellar transport. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (11), 813-825 (2002).
- Ishikawa, H., Marshall, W. F. Ciliogenesis: building the cell's antenna. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (4), 222-234 (2011).
- Niwa, S., et al. Autoinhibition of a Neuronal Kinesin UNC-104/KIF1A Regulates the Size and Density of Synapses. Cell Rep. 16 (8), 2129-2141 (2016).
- Snow, J. J., et al. Two anterograde intraflagellar transport motors cooperate to build sensory cilia on C. elegans neurons. Nat Cell Biol. 6 (11), 1109-1113 (2004).
- Ou, G., Blacque, O. E., Snow, J. J., Leroux, M. R., Scholey, J. M. Functional coordination of intraflagellar transport motors. Nature. 436 (7050), 583-587 (2005).
- Zhou, R., Niwa, S., Homma, N., Takei, Y., Hirokawa, N. KIF26A is an unconventional kinesin and regulates GDNF-Ret signaling in enteric neuronal development. Cell. 139 (4), 802-813 (2009).
- Zhao, C., et al. Charcot-Marie-Tooth disease type 2A caused by mutation in a microtubule motor KIF1Bbeta. Cell. 105 (5), 587-597 (2001).
- Niwa, S., Tanaka, Y., Hirokawa, N. KIF1Bbeta- and KIF1A-mediated axonal transport of presynaptic regulator Rab3 occurs in a GTP-dependent manner through DENN/MADD. Nat Cell Biol. 10 (11), 1269-1279 (2008).
- Zhou, R., Niwa, S., Guillaud, L., Tong, Y., Hirokawa, N. A molecular motor, KIF13A, controls anxiety by transporting the serotonin type 1A receptor. Cell Rep. 3 (2), 509-519 (2013).
- Klassen, M. P., et al. An Arf-like small G protein, ARL-8, promotes the axonal transport of presynaptic cargoes by suppressing vesicle aggregation. Neuron. 66 (5), 710-723 (2010).
- Mondal, S., Ahlawat, S., Koushika, S. P. Simple microfluidic devices for in vivo imaging of C. elegans, Drosophila and zebrafish. J Vis Exp. (67), (2012).
- Chai, Y., et al. Live imaging of cellular dynamics during Caenorhabditis elegans postembryonic development. Nat Protoc. 7 (12), 2090-2102 (2012).
- Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. Long-term imaging of Caenorhabditis elegans using nanoparticle-mediated immobilization. PLoS One. 8 (1), 53419 (2013).
- Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection. J Vis Exp. (18), (2008).
- Collet, J., Spike, C. A., Lundquist, E. A., Shaw, J. E., Herman, R. K. Analysis of osm-6, a gene that affects sensory cilium structure and sensory neuron function in Caenorhabditis elegans. Genetics. 148 (1), 187-200 (1998).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
- Niwa, S. The nephronophthisis-related gene ift-139 is required for ciliogenesis in Caenorhabditis elegans. Sci Rep. 6, 31544 (2016).
- Maeder, C. I., San-Miguel, A., Wu, E. Y., Lu, H., Shen, K. In vivo neuron-wide analysis of synaptic vesicle precursor trafficking. Traffic. 15 (3), 273-291 (2014).
- Wu, Y. E., Huo, L., Maeder, C. I., Feng, W., Shen, K. The balance between capture and dissociation of presynaptic proteins controls the spatial distribution of synapses. Neuron. 78 (6), 994-1011 (2013).
- Dwyer, N. D., Adler, C. E., Crump, J. G., L'Etoile, N. D., Bargmann, C. I. Polarized dendritic transport and the AP-1 mu1 clathrin adaptor UNC-101 localize odorant receptors to olfactory cilia. Neuron. 31 (2), 277-287 (2001).
- Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D., Bargmann, C. I., Avery, L. Laser microsurgery in Caenorhabditis elegans. Methods Cell Biol. 107, 177-206 (2012).
- Kumar, J., et al. The Caenorhabditis elegans Kinesin-3 motor UNC-104/KIF1A is degraded upon loss of specific binding to cargo. PLoS Genet. 6 (11), 1001200 (2010).
- Zheng, Q., et al. The vesicle protein SAM-4 regulates the processivity of synaptic vesicle transport. PLoS Genet. 10 (10), 1004644 (2014).
- Blacque, O. E., et al. The WD repeat-containing protein IFTA-1 is required for retrograde intraflagellar transport. Mol Biol Cell. 17 (12), 5053-5062 (2006).
- Evans, J. E., et al. Functional modulation of IFT kinesins extends the sensory repertoire of ciliated neurons in Caenorhabditis elegans. J Cell Biol. 172 (5), 663-669 (2006).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
- Bindels, D. S., et al. mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging. Nat Methods. 14 (1), 53-56 (2017).
- Prevo, B., Mangeol, P., Oswald, F., Scholey, J. M., Peterman, E. J. Functional differentiation of cooperating kinesin-2 motors orchestrates cargo import and transport in C. elegans cilia. Nat Cell Biol. 17 (12), 1536-1545 (2015).
- Robison, P., et al. Detyrosinated microtubules buckle and bear load in contracting cardiomyocytes. Science. 352 (6284), 0659 (2016).
- Hayashi, S., Okada, Y. Ultrafast superresolution fluorescence imaging with spinning disk confocal microscope optics. Mol Biol Cell. 26 (9), 1743-1751 (2015).
