Summary
Caenorhabditis elegans (C. elegans) è un buon modello per studiare il trasporto assonale e intracellulare. Qui, descrivo un protocollo per la registrazione in vivo e l'analisi del trasporto assonale e intraflagellare c.elegans.
Abstract
Trasporto assonale e trasporto intraflagellare (IFT) sono essenziali per la funzione e la morfogenesi dell'assone e le ciglia. Dineina e chinesina superfamiglia delle proteine sono motori molecolari che regolano anterograda e retrograda trasporto, rispettivamente. Questi motori utilizzano microtubule network come rotaie. Caenorhabditis elegans (C. elegans) è un organismo potente modello per studiare il trasporto assonale e IFT in vivo. Qui, descrivo un protocollo per osservare il trasporto assonale e IFT nella vita di c. elegans. Merce trasportata può essere visualizzato mediante codifica proteine cargo utilizzando proteine fluorescenti come proteina fluorescente verde (GFP). C. elegans è trasparente e proteine GFP-etichettato cargo possono essere espresso in cellule specifiche sotto promotori di cellula-specifico. Viti senza fine viventi possono essere risolto microsfere su gel di agarosio 10% senza uccidere o anestetizzare i vermi. In queste condizioni, movimento di carico può essere osservato direttamente negli assoni e ciglia di vivere c. elegans senza dissezione. Questo metodo può essere applicato per l'osservazione di qualsiasi molecola di carico in tutte le cellule modificando proteine bersaglio e/o le cellule in che si sono espressi. Le proteine più elementari quali motori molecolari e proteine adattatrici che sono coinvolti nel trasporto assonale e IFT sono conservate in c. elegans. Rispetto ad altri organismi di modello, mutanti possono essere ottenute e mantenute più facilmente in c. elegans. Combinando questo metodo con vari mutanti di c. elegans può chiarire i meccanismi molecolari del trasporto assonale e IFT.
Introduction
Live cell imaging è uno strumento essenziale per l'analisi di trasporto intracellulare. Nella biologia delle cellule neuronali, sono essenziali per comprendere la funzione e la morfogenesi neuronale1analisi del trasporto assonale con formazione immagine di cellule vive. Difetti nel trasporto assonale sono alla base di disordini neurodegenerative diversi2. Dineina e chinesina superfamiglia proteine svolgere trasporto assonale anterograda e retrogradely, rispettivamente1,2.
Le ciglia sono un altro compartimento cellulare in cui la rete dei microtubuli e traffico macchine sono altamente sviluppato3. Macchinario di sintesi proteica non è localizzata nelle ciglia, il che significa che ciliare proteine devono essere trasportati dal citoplasma verso le punte di ciglia. Cilia-specifiche chinesina e dineina, chiamato chinesina-2 e citoplasmatici dineina-2, rispettivamente, i componenti di ciglia4, in un fenomeno chiamato trasporto intraflagellare (IFT)5di trasporto. Il danno dell'IFT causa uno spettro di malattie chiamate ciliopatie6. Così, per capire i meccanismi di base della formazione ciliare e la patogenesi sono necessaria analisi del meccanismo IFT da formazione immagine di cellule vive.
Caenorhabditis elegans (C. elegans) è un buon modello per studiare il trasporto assonale e IFT7,8,9. Per osservare IFT, Chlamydomonas è stato ampiamente utilizzato come organismo modello5,6. Essendo un organismo unicellulare Chlamydomonas , il rapporto dell'IFT con invecchiamento, funzione di un neurone e comportamento sarebbe difficile da analizzare. Inoltre, tecniche di genetiche essenziale come CRISPR/Cas9 non siano state applicate a Chlamydomonas. Negli più alti organismi di modello, come topi e Drosophila, interruzione del trasporto assonale e IFT spesso provoca fenotipi letali perché trasporto assonale e IFT sono essenziali per la morfogenesi e l'omeostasi del animali 10, 11. Nel caso di topi, trasfezione e coltura delle cellule è generalmente necessario osservare trasporto assonale e IFT, che richiede molte competenze e tempo estesa12,13. Inoltre, un sacco di contesto fisiologico importante può essere perso in linee cellulari e cellule coltivate. Poiché il sistema nervoso non è essenziale per la sopravvivenza dei vermi, c. elegans mutanti in cui trasporto assonale o IFT sono interrotti non sono spesso letali7,9,14. Trasporto assonale e IFT può essere osservato direttamente in vivo senza dissezione perché c. elegans è trasparente ed è quindi facile osservare GFP-etichettato marcatori.
Esistono diversi protocolli per immobilizzare c. elegans, come l'utilizzo di un dispositivo di microfluidica15, pastiglie di agarosio con anestesia16o microsfere17. L'inclusione dell'anestesia può inibire gli eventi traffici in neuroni15. Un chiaro svantaggio del metodo microfluidici-periferica è che preparando un dispositivo microfluidico non è sempre facile. Invece, l'immobilizzazione di agarosio pastiglie e microsfere è un modo conveniente e facile per eseguire imaging lasso di tempo in c. elegans. Qui, descrivo questo protocollo di base per immobilizzare c. elegans e visualizzare trasporto assonale e IFT in vivo in elegans del c. Rispetto agli altri metodi, il metodo qui descritto non richiede attrezzature speciali ed è molto più economico e più facile da eseguire.
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Protocol
1. preparazione del campione
- genera un transgenico c. elegans ceppo di interesse utilizzando metodologie transgeniche 18. In alternativa, ottenere ceppi appropriati da Caenorhabditis Genetics Center (CGC). Per visualizzare il trasporto assonale dei precursori delle vescicole sinaptiche, utilizzare la linea transgenica wyIs251 [Pmig-13::gfp::rab-3] 7. Per osservare IFT, ottenere la linea transgenica mnIs17 [osm-6::gfp] 19. Questi ceppi sono utilizzati in questo protocollo.
Nota: Una matrice extracromosomico, integrazione genomica o anche GFP knock-in works. Per ridurre i segnali di fondo, utilizzare promotori di cellula-specifico, piuttosto che pan-neuronale promotori.
Nota: Manutenzione di worms è descritto in altri protocolli 20. Ceppi sono stati mantenuti su prati dell'alimentatore Escherischia coli OP50 sulla crescita del nematode piastre di terreno (NGM) (agarosio 1,7% (p/v), 50 mM NaCl, 0,25% (p/v) di peptone, 1 mM CaCl 2, 5mg/mL colesterolo, 25mm KH 2 PO 4, 1mm MgSO 4 su piatti di plastica di diametro 60 mm) a 20 ° C. - Crescere i vermi a 20 ° C sulle piastre di NGM a qualsiasi fase del ciclo di vita dei vermi.
Nota: Si può osservare sia trasporto assonale e IFT in qualsiasi fase. L4 tardivo a giovane adulto è un buon controllo positivo perché più pubblicazioni hanno utilizzato queste fasi e visualizzato in quel momento 22 eventi traffico 14 , 21 , , 23.
2. Preparazione del 10% dell'agarosi
Nota: molti fornitori offrono prodotti simili, quali polveri di agar agar e agarosio. Utilizzare agarosio per elettroforesi (resistenza del gel > 1200 g/cm 2). Polveri di agar a buon mercato non funzionano perché il gel risultante non è abbastanza forte per immobilizzare worm.
- Mix 0,4 g agarosio in 4 mL di acqua distillata acqua (DW) in un tubo di vetro (1,5 x 10,5 cm). Mettere un coperchio sul tubo di vetro per evitare l'evaporazione.
- Mettere il tubo di vetro su un blocco di calore di 95 ° C per 90 min. Inoltre, preparare un altro tubo di vetro (1,5 x 10,5 cm) riempito con DW e tenerlo a 95 ° C. mettere una pipetta Pasteur a 95 ° C DW ( Figura 1 A). Un sacco di piccole bolle sarà visibili nel tubo di agarosio e la soluzione deve essere torbida. Lasciare fino a quando la soluzione diventa chiara. Quindi, mescolare pipettando su e giù fino a quando la soluzione di agarosio diventa omogenea.
Nota: Forno a microonde non può essere utilizzato per preparare la soluzione di agarosio 10% quando effettuata in DW e dell'agarosi. Piccole bolle causate dalle microonde evitare la fusione dell'agarosi. Tuttavia, gel di agarosio solidificato 10% facilmente possono essere fusi nuovamente utilizzando un forno a microonde. Tubi di vetro contenenti gel di agarosio al 10% possono essere preparati in anticipo e conservati a 4 ° C per almeno 6 mesi. Se in questo modo, sciogliere il brodo utilizzando un forno a microonde quando necessario e iniziare dal passaggio 3 in questo protocollo.
Nota: Agarosio perde gradualmente la capacità di solidificare se incubate a 95 ° C per un tempo lungo o dopo ripetute solidificazione e fusione. Se questo accade, preparare nuove 10% agarosio.
3. Preparazione di agarosio Pad
- usando la pipetta di Pasteur riscaldata preparata al punto 2.2, inserire 2 gocce di agarosio al 10% in una diapositiva di 76 x 22 mm.
- Rapidamente coprire con una seconda diapositiva 2 76 x 22 mm prima della caduta dell'agarosi si solidifica come mostrato in Figura 1 B e spingere verso il basso della seconda diapositiva per appiattire la soluzione di agarosio. Lo spessore deve essere di 0,5-1 mm.
- Rapidamente svuotare la pipetta di Pasteur di pipettaggio 95 ° C DW su e giù fino a quando la soluzione di agarosio è lavata fuori. In caso contrario, la pipetta sarà ostruirsi di gel di agarosio. Lasciare la pipetta a 95 ° C DW.
- Attesa per 1 min. Il pad di agarosio forma e diventa torbida. Quindi, far scorrere le diapositive apart a mano ( Figura 1 C).
4. Montaggio di vermi
Nota: anche piccole quantità di movimento verme prevenire buona osservazione. Levamisole è stato tradizionalmente usato per impedire il movimento della vite senza fine sull'agarosio pad 24 , 25. Tuttavia, Levamisole inibisce i recettori neuronali in c. elegans e pertanto può influenzare eventi di traffici in neuroni 15. Utilizzando microsfere di polistirolo descritto qui una buona alternativa 17.
- Sotto un microscopio stereo equipaggiato con una transilluminazione specchio scorrevole, trasferire ~ 30 vermi transgenici che esprimono gli indicatori appropriati per un nuovo NGM piastra senza batteri utilizzando un filo di platino pick.
Nota: Un filo di platino pick è costituito da filo di platino e pipetta Pasteur (5 pollici), e la punta del filo platino è stata appiattita. La preparazione dei picconi filo di platino e la manipolazione di vermi con questi sono descritti in Wormbook (http://www.wormbook.org). - Lasciare la piastra per 1 min. batteri vengono rimossi automaticamente dalle superfici di vermi come i vermi muoversi su gel di agarosio NGM senza batteri.
- Put a 0,5-1,0 µ l goccia del 2,6% 100 microsfere di polistirolo del diametro nm in acqua sul blocchetto di agar ( Figura 1 D). Consente di trasferire le microsfere 10-20 vermi dalla piastra di NGM esente da batteri. Goccia e la diffusione di worm usando il legare di platino pick per evitare la sovrapposizione di verme corpi ( Figura 1 E).
- Applicare un vetrino coprioggetti 2 di 22 x 40 mm ( Figura 1, F). Spingere delicatamente per rimuovere le bolle d'aria, ma evitare di schiacciare le viti senza fine. Il campione è pronto per l'imaging.
Nota: Poiché non è amministrata anestesia, vermi vengono risolti solo dalla forza di attrito generata da agar pad, microsfere di polistirolo e coprioggetto 17. La presenza di batteri di alimentatore e/o troppo soluzione renderà la forza di attrito più debole.
Nota: Diverse dimensioni del lavoro di vetrini coprioggetti (ad es., 22 x 22 mm 2, 18 x 18 mm 2). Tuttavia, le lamelle più grandi possono impedire immersione acqua o olio dalla lente dell'obiettivo che perde in campioni durante l'osservazione.
5. Osservazione
Nota: appropriati parametri di imaging (potenza laser, guadagno, binning, ecc.) saranno diverso per ogni sistema di microscopio e la fotocamera. Qui, viene utilizzato un microscopio widefield equipaggiato con uno scanner confocale del disco rotante e una macchina fotografica digitale del CCD.
- Impostare il controllo della temperatura della fase a 20 ° C, o regolare la temperatura a 20 ° C.
- Mettere il vetrino sul tavolino del microscopio. Utilizzare x 100 (apertura numerica = 1.3 o superiore) dell'obiettivo.
- Cercare le aree indicate in Figura 2 A (per wyIs251 e trasporto assonale) o Figura 2 B (per mnIs17 e IFT) come controlli positivi . Altre zone possono essere analizzati come ben 22.
- Set di parametri (CCD guadagno = 200, Binning = 1 o 2, potenza laser a 488 nm = 1.0-1.3 mW). Eseguire la registrazione continua a 4 fotogrammi/s per fino a 1 min Salva file come formato mutli-TIFF.
Nota: Se GFP segnali scomparire ed è difficile continuare a osservare GFP::RAB-3 o OSM-6::GFP per 30 s, la potenza del laser è troppo forte. In tal caso, ridurre la potenza del laser. Al contrario, se non è registrato nessun movimento vescicolare, la potenza del laser è troppo debole. In tal caso, aumentare la potenza del laser. - Osservare un worm diverso e ripetere 5.3 e 5.4. Le osservazioni possono durare fino a 20 min, ma ogni verme deve essere registrati una sola volta per evitare gli effetti di pdanni di Hoto.
Nota: I vermi sono stati osservati per almeno 20 min senza difetti significativi 7 , 27 , 28. Osservazione più lunga può essere possibile, ma porto ' t stato ancora testato. Un chiaro segno della morte neuronale è il cambiamento della morfologia neuronale come gonfiore del neurite. Segnali deboli di GFP possono essere visto negli assoni e dendriti sia wyIs251 e mnIs17, morfologia del neurite può essere facilmente controllato da solo guardando gli assoni o dendriti. Morfologia neuronale è illustrato nella Figura 2. - Generare filmati.
- Apri il file Multi-TIFF file utilizzando software di Fiji. Vai a File > Open quindi selezionare il file Multi-TIFF salvato al passaggio 5.4.
Nota: Fiji può essere scaricato presso jttps://fiji.sc. Immagine J e plugin può anche essere utilizzato per generare chimografi. Se in questo modo, seguire le istruzioni pertinenti per il plugin scelto. - scegliere la " selezione rettangolare " ( Figura 3 A, freccia) e seleziona l'area di interesse disegnando un rettangolo con un mouse del computer (rettangolo giallo in Figura 3 A). Vai a immagine > stack > strumenti > fare Substacks e selezionare i numeri di fetta che sono inclusi nel film. Viene generato un substack.
- Attivare la finestra di substack cliccando e passare all'immagine > regolare > luminosità/contrasto. Una finestra per regolare la luminosità e il contrasto si presenta. Nella finestra, fare scorrere la parte superiore bar (minimo) a destra così che il segnale di fondo sparisce e il secondo bar top (massimo) a sinistra così che le particelle e le vescicole commovente possono essere visto abbastanza bene sullo sfondo.
- Vai a immagine > stack > tempo Stamper. Come il film è registrato a 4 fotogrammi/s al punto 5.4, l'intervallo di tempo è 0,25 s. Quindi, digitare " 0.25 " nell'intervallo di.
- Generare un file di filmato selezionando Salva come > AVI dal menu File (film 1 e 2).
Nota: Utilizzando il plugin appropriato, è possibile salvare il file come altri formati come " mpeg4 " o " mov " file.
- Apri il file Multi-TIFF file utilizzando software di Fiji. Vai a File > Open quindi selezionare il file Multi-TIFF salvato al passaggio 5.4.
- Generare chimografi.
- Aprire i file del filmato originale utilizzando software di FIji nuovamente e ripetere i passaggi 5.6.2 e 5.6.3 per regolare la luminosità e il contrasto.
- Clic " segmentato linea " ( Figura 3 B, freccia). Usando un mouse, disegnare una linea segmentata lungo le ciglia o assone (linea gialla, in Figura 3 B).
- Andare a analizzare > Multi Kymograph > Multi Kymograph ( Figura 3 C). Linea larghezza finestra ( Figura 3 D). Tipo " 3 " nella finestra di Linewidth e fare clic su OK ( Figura 3 D).
- Kymograph finestra viene creata. Salvare l'immagine in formato TIFF o JPEG.
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Representative Results
Trasporto assonale nel neurone DA9
Utilizzando la riga di wyIs251 , l'anterograda e il trasporto assonale retrogrado di GFP::RAB-3 possa essere registrata simultaneamente nel neurone motore DA9. La velocità media di anterograda e retrograda trasporto nell'assone dorsale prossimale del neurone DA9 è circa 1,8 e 2,6 μm/s, rispettivamente22. Il numero delle vescicole commovente è circa 0,03 e 0,018 a μm di assone a s. Così, per un'osservazione s 30 10 μm di assone DA9 utilizza un obiettivo 100x, uno può trovare circa 9 e 5 vescicole in movimento nell'assone (Figura 4 e Movie 1). Se nessun movimento vescicolare può essere osservato, è possibile che la potenza del laser è troppo debole. Oltre alle esecuzioni di lungo raggio, movimento di corto raggio delle piscine della vescicola può essere registrata (1 film). Alcune vescicole smettere queste piscine della vescicola, mentre gli altri dissociare da lì7,23. Questi parametri possono essere monitorati e utilizzati per analizzare i fenotipi mutanti.
IFT in neuroni di coda
Ciglia è localizzati all'estremità dei dendriti in c. elegans (Figura 2B). Il ceppo di mnIs17 esprime GFP-etichettato OSM-6, una delle subunità IFT29. OSM-6 è espresso in entrambi testa e coda neuroni19. Mentre molte ciglia testa è etichettati da mnIs17, solo due ciglia è chiaramente osservato nel neurone coda. Così, osservando queste ciglia è più facile che testa ciglia (veda inoltre la discussione). OSM-6::GFP è diffuso nel citoplasma neuronale come quello trovato nell'assone, corpo cellulare e dendrite. Tuttavia, nelle ciglia, OSM-6::GFP è concentrato a cilia e incorporata in particelle in movimento. La lunghezza delle ciglia PHA e PHB sono circa 6,5 μm. Anterograde IFT è bifasica 8,9. La velocità di anterograda IFT è di circa 0,7 e 1.3 μm/s nei segmenti medio e distali delle ciglia, rispettivamente (Figura 5 e Movie 2).
Figura 1 : Dimostrazione della preparazione del campione. (A) Hot DW, pipetta Pasteur e 10% di agarosio su blocco di calore. (B e C) Preparazione di pastiglie di agarosio: un pad dell'agarosi è formato tra le diapositive (B). Slittone superiore viene rimosso dopo un forme di rilievo di agarosio (C). (D) schema mostrando come polistirolo tallone soluzione è mettere sul pad di agarosio. Schema elettrico (E) disegno illustrante come vermi sono messi nella soluzione perlina polistirolo usando un filo di platino pick. (F) un vetrino coprioggetto (22 x 44 mm2) è messo sul pad di agarosio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Area di imaging. (A) disegno schematico del DA9 e VA12 neuroni e un'immagine rappresentativa di wyIs251. Nei neuroni DA9, il ventrale dell'assone e la commessura prossimale dell'assone non dispone di sinapsi mature. Ma precursori delle vescicole sinaptiche vengono trasportati dal corpo cellulare alla sinapsi attraverso queste regioni assonale. La regione che deve essere osservata è mostrata dalle scatole. (B) disegno schematico del PHA e PHB i neuroni e le loro ciglia. La regione che deve essere osservata è mostrata dalle scatole. Barra della scala = 10 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Generazione di film e chimografi utilizzando software di Fiji. (A) fare clic sul pulsante "Selezione rettangolare" (freccia) e selezionare l'area che uno vorrebbe concentrarsi su disegnando un rettangolo (scatola gialla) per generare substacks. (B) fare clic sul pulsante linea segmentata (freccia) e disegnare una linea segmentata lungo le ciglia con un mouse (linea gialla). (C) selezionare "Analizza", "Multi Kymograph" e "Multi Kymograph" per avviare un plugin per generare chimografi. (S) Input linewidth, fare clic su "OK" e generare chimografi (Figura 5 e Figura 7). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : Kymograph rappresentante del trasporto assonale dei precursori delle vescicole sinaptiche. GFP::Rab-3 movimento è osservato a asynaptic regione prossimale del neurone DA9 e il kymograph è stato generato con Multi Kymograph di Fiji. Barre orizzontali e verticali rappresentano rispettivamente la lunghezza e tempo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 : Kymograph rappresentante dell'IFT. OSM-6::GFP è osservato nelle ciglia di PHA e PHB e questo kymograph è generato dall'evento traffico in uno di essi. Il kymograph è stato generato con Multi Kymograph di Fiji. Barre orizzontali e verticali rappresentano rispettivamente la lunghezza e tempo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Movie 1: film rappresentativo del trasporto assonale dei precursori delle vescicole sinaptiche. GFP::Rab-3 movimento è osservato a asynaptic regione prossimale del neurone DA9. GFP::Rab-3 è incorporato in precursori delle vescicole sinaptiche e trasportati. Vengono registrati sia anterograda e trasporto assonale retrogrado. Alcune vescicole interrompere ma riavviare nuovamente. Il film è stato registrato a 4 frame/s e riproduce a 15 fotogrammi/s. Scabar le = 5 μm. Per favore clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro per scaricare.)
Movie 2: il film rappresentativo dell'IFT. OSM-6::GFP è osservato nelle ciglia di PHA e PHB. OSM-6::GFP è incorporata l'IFT complesse e si muove lungo le ciglia. Il film è stato registrato a 4 frame/s e riproduce a 15 fotogrammi/s. scala bar = 5 μm. Per favore clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro per scaricare.)
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Discussion
Limitazione per quanto riguarda i metodi esistenti
Il metodo qui descritto è ottimizzato per osservare eventi veloci come trasporto assonale e IFT. Così, l'immobilizzazione è più una priorità di incubazione più lungo. Mentre siamo stati in grado di osservare eventi di traffici per almeno 20 min senza perturbazione significativa, questo metodo potrebbe non essere sempre adatto per osservare eventi lenti che richiedono osservazioni più lungo, ad esempio allungamento dell'assone e migrazione cellulare. Per le osservazioni più lungo, uno ha bisogno di ottimizzare le condizioni di riduzione della percentuale di agarosio (cioè, aumentando l'acqua per evitare il prosciugamento e riducendo la pressione che potenzialmente provoca danni). In alternativa, il dispositivo microfluidico descritto sopra15 o immobilizzazione di vermi utilizzando anestesia e pastiglie di agarosio può essere più adatto16 , mentre gli effetti collaterali dovrebbero essere valutati con attenzione.
Fasi critiche all'interno del protocollo
Per un'adeguata osservazione, gli indicatori sono fondamentali. Marcatori devono essere incorporati in vescicole o particelle ed essere di sufficiente luminosità. Extracromosomico matrici o linee integrate possono essere utilizzati. Per la visualizzazione del trasporto assonale dei precursori della vescicola sinaptica nei neuroni DA9, il ceppo di wyIs251 è utile7,23. jsIs821 è stato usato per osservare il trasporto assonale in neuroni che mechanosensory in alcuni studi26,27. Quando vengono analizzati altri neuroni, proteine delle vescicole sinaptiche dovrebbero essere espresso nei neuroni interessati utilizzando promotori specifici delle cellule. Questi promotori dovrebbero essere abbastanza forti. RAB-3 e SNB-1 sono ampiamente usati per etichettare delle vescicole sinaptiche precursori22,23,26. Per osservare IFT, i componenti dei complessi IFT devono essere etichettati. Come controllo positivo, il ceppo di mnIs17 è una buona scelta di29. Ciglia che emana da 8 celle (ASE, ASG, ASI, ASL, ASH, ASK, ADF e ADL) è raggruppati in testa (amphid) mentre ciglia da 2 celle (PHA e PHB) è in bundle nella coda (fasmide). Perché OSM-6::GFP è espresso nei neuroni tutti i ciliati in mnIs17, può essere difficile da analizzare l'IFT dettagliatamente nelle ciglia di testa. Tuttavia, nella regione della coda, solo i neuroni PHA e PHB sono etichettati e IFT in ogni cella può essere facilmente risolto. Altre proteine IFT etichettati da proteine fluorescenti possono essere utilizzati per osservare IFT21,28. Se si vuole analizzare i neuroni testa, promotori di cellula-specifico sarebbe utili. Mentre testa ciglia hanno diverse morfologie, gli eventi di trasporto possono essere registrato29. Incrociando i mutanti con questi marcatori, le funzioni di qualsiasi geni nel trasporto assonale e IFT può essere analizzato in vivo. I parametri che possono essere analizzati sono stati descritti nel precedente lavoro22,23,26,27. GFP è la scelta migliore e primaria. mCherry e tdTomato possono anche essere usate22, tuttavia, è molto più opaca del GFP mCherry. tdTomato è un dimero di tandem e maggiore di proteine fluorescenti monomeriche, che a volte colpisce la dinamica delle proteine di fusione30. Pertanto, i risultati devono essere analizzati e interpretati con cautela quando si utilizza tdTomato. mScarlet, una proteina fluorescente rossa monomerica brillante che recentemente è stata sviluppata, è una scelta alternativa31.
Mentre la filatura microscopia confocale disco è ampiamente usato per osservare il trasporto assonale e IFT7,21, l'apparecchiatura è costoso e può essere di difficile accesso in alcuni ambienti di ricerca. Tuttavia, questi fenomeni possono essere anche registrati e analizzati in c. elegans utilizzando microscopi fluorescenti standard, se dotato di alta NA lenti, perché c. elegans è un piccolo e trasparente animale e facile da osservare.
Applicazioni future
Dal metodo di immobilizzazione simili descritto qui, è stata osservata la risoluzione di singola molecola in vivo32IFT. Inoltre, sono stati sviluppati diversi tipi di microscopia di Super-risoluzione. Si possono applicare direttamente i metodi descritti qui all'analisi microscopica di Super-risoluzione. Nella mia esperienza, la modalità veloce di Airyscan33 funziona molto bene per analizzare IFT. Teoricamente, un microscopio di Super-risoluzione di disco rotante (SDSRM) sarebbe una buona scelta come ben34. In conclusione, combinando mutanti biblioteche e queste nuove tecniche, il metodo descritto qui dovrebbe essere utile per chiarire i meccanismi molecolari del trasporto assonale e IFT in vivo.
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Disclosures
L'autore non ha nulla di divulgare.
Acknowledgments
L'autore ringrazia profondamente Dr. Asako Sugimoto (Università di Tohoku) per la sua discussione utile. wyIs251 era un dono generoso da Dr. Kang Shen (Stanford University). mnIs17 è stato fornito dalla CGC, che è finanziato dall'ufficio di NIH di programmi di ricerca dell'infrastruttura (P40 OD010440). Questo lavoro è stato supportato da grant JSPS KAKENHI #17 H 05010 e #16 H 06536 e Fondazione di Daiichi Sankyo, Brain Science Foundation e Naito Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Slideglass (76 x 26 mm) | Matsunami | S1111 | |
| Coverglass (22 x 40 mm) | Matsunami | C024401 | |
| Agarose | Wako | 318-01195 | |
| Polystylene microbeads 0.1 micron | Polysciences | #00876 | |
| Heat block | TAITEC | 0063288-000 | CTU-mini |
| Microscope | Olympus | IX-71 | widefield microscope |
| Spinning disk Scanner | Yokogawa | CSU-X1 | spinning disc confocal scanner |
| Digital CCD camera | Hamamatsu Photonics | C10600-10B | ORCA-R2 degital CCD camera |
| Objective lens (x100, NA1.4) | Olympus | UPLSAPO 100XO | |
| Pasteur pipette (5 inch) | IWAKI | IK-PAS-5P | |
| Glass tube (1.5 cm diameter x 10.5 cm) | IWAKI | 9820TST15-105NP | |
| TV9211: wyIs251 | Laboratory of Kang Shen | N/A | |
| OTL11: mnIs17 | Ref. 27, 29 | N/A | SP2101 was backcrossed with wild type for 6 times |
| Stereo microscope | Carl Zeiss | 435064-9000-000 | STEMI 508 |
| Mirror transillumination unit | Carl Zeiss | 435425-9010-000 | |
| platinum wire (0.2 mm) | Nilaco Corporation | m78483501 | |
| 60 mm plastic dish | Falcon | #351007 | |
| Fiji | N/A | N/A | https://fiji.sc/ |
| nematode growth medium (NGM) | 1.7% (w/v) agarose, 50mM NaCl, 0.25% (w/v) Peptone, 1 mM CaCl2, 5 mg/mL Cholesterol, 25 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4 |
References
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