Caenorhabditis elegans (C. elegans) is een goed model te bestuderen van axonale en intracellulair transport. Hier beschrijf ik een protocol voor in vivo opname en analyse van axonale en intraflagellair vervoer in C. elegans.
Axonale vervoer en intraflagellair (IFT) zijn essentieel voor de axon en cilia genuitdrukking en functie. Kinesin superfamilie eiwitten en dynein zijn moleculaire motoren die anterograde en retrograde vervoer, respectievelijk regelen. Deze motoren gebruiken microtubulus netwerken als rails. Caenorhabditis elegans (C. elegans) is een krachtige modelorganisme axonale vervoer en IFT in vivote studeren. Hier beschrijf ik een protocol om te observeren axonale vervoer en IFT in levende C. elegans. Vervoerde lading kan worden gevisualiseerd door tagging lading eiwitten met behulp van fluorescente proteïnen zoals groen fluorescente proteïne (GFP). C. elegans is transparant en lading GFP-gelabelde proteïnen kunnen worden uitgedrukt in specifieke cellen onder cel-specifieke initiatiefnemers. Levende wormen kunnen worden opgelost door microbeads op 10% agarose gel zonder doden of anesthetizing van de wormen. Onder deze omstandigheden, vracht verkeer kan direct worden waargenomen in de axonen en cilia van levende C. elegans zonder dissectie. Deze methode kan worden toegepast op de waarneming van elke lading molecule in cellen door aanpassing van de doel-eiwitten en/of de cellen die ze zijn uitgedrukt in. Meest elementaire eiwitten zoals moleculaire motoren en adaptor eiwitten die bij axonale vervoer en IFT betrokken zijn zijn bewaard in C. elegans. Vergeleken met andere modelorganismen, zijn mutanten verkregen en gemakkelijker te onderhouden in C. elegans. Deze methode te combineren met verschillende C. elegans mutanten kan verduidelijken de moleculaire mechanismen van axonale vervoer en IFT.
Levende cel imaging is een essentieel instrument voor het analyseren van intracellulair transport. In de neuronale celbiologie zijn analyses van axonale vervoer met levende cel beeldvorming essentieel voor een goed begrip van de neuronale functie en morfogenese1. Defecten in axonale vervoer ten grondslag liggen aan diverse neurodegeneratieve aandoeningen2. Kinesin superfamilie eiwitten en dynein dragen uit axonale vervoer anterogradely en retrogradely, respectievelijk1,2.
Cilia zijn een andere cellulaire compartiment waarin de microtubulus netwerk en mensenhandel machines hoogontwikkelde3 zijn. Eiwit synthese machines is niet vertaald in cilia, wat betekent dat Ciliaire eiwitten van het cytoplasma naar de cilia tips moeten worden vervoerd. Cilia-specifieke kinesin en dynein, kinesin-2 en cytoplasmatische dynein-2, respectievelijk genoemd, [LbMarket_Transport] de componenten van de cilia4, een verschijnsel genaamd intraflagellair vervoer (IFT)5. Bijzondere waardevermindering van IFT veroorzaakt een spectrum van ziekten genaamd ciliopathies6. Analyse van het mechanisme van de IFT door levende cel imaging is dus vereist om te begrijpen van de basismechanismen van Ciliaire vorming en pathogenese.
Caenorhabditis elegans (C. elegans) is een goed model axonale vervoer en IFT7,8,9te gaan studeren. Om te observeren IFT, is Chlamydomonas wijd verbeid gebruikt als een model organisme5,6. Zoals Chlamydomonas een eencellige organisme is, zou de relatie van IFT met veroudering, neuronale functie, en gedrag moeilijk te analyseren zijn. Essentiële genetische technieken zoals CRISPR/Cas9 zijn bovendien niet toegepast op Chlamydomonas. In hogere modelorganismen, zoals muizen en Drosophila, veroorzaakt verstoring van axonale vervoer en IFT vaak dodelijke fenotypen omdat axonale vervoer en IFT essentieel voor de voedselproductie en de homeostase van de dieren 10zijn, 11. In het geval van muizen, is celkweek en transfectie over het algemeen nodig om te observeren axonale vervoer en IFT, waarvoor veel vaardigheden en uitgebreide tijd12,13. Daarnaast kan een heleboel belangrijke fysiologische context in gekweekte cellen en cellijnen worden verloren. Omdat het zenuwstelsel niet essentieel voor het voortbestaan van de wormen is, C. elegans mutanten in welke axonale vervoer of IFT worden verstoord zijn vaak niet dodelijk7,9,14. Axonale vervoer en IFT direct waarneembaar in vivo zonder dissectie omdat C. elegans is het transparante en het is daarom gemakkelijk te observeren GFP-gelabeld markeringen.
Er zijn verschillende protocollen te immobiliseren C. elegans, zoals het gebruik van een microfluidic apparaat15, agarose pads met verdoving16of microbeads17. De opneming van de verdoving kan de mensenhandel gebeurtenissen in neuronen15remmen. Een duidelijk nadeel van de methode van de microfluidic-apparaat is dat voorbereiding van een microfluidic-apparaat niet altijd gemakkelijk is. In plaats daarvan, immobilisatie door agarose pads en microbeads is een handige en gemakkelijke manier om uit te voeren tijd vervallen imaging in C. elegans. Hier beschrijf ik dit basisprotocol te immobiliseren C. elegans en visualiseren van axonale vervoer en IFT in vivo in C. elegans. In vergelijking met de andere methoden, de hier beschreven methode vereist geen speciale apparatuur en is veel goedkoper en eenvoudiger uit te voeren.
Beperking met betrekking tot bestaande methoden
De hier beschreven methode is geoptimaliseerd om te zien hoe snel evenementen zoals axonale vervoer en IFT. Immobilisatie is dus meer prioriteit dan langer incubatie. Terwijl wij kunnen observeren van mensenhandel gebeurtenissen voor ten minste 20 min. zonder aanzienlijke verstoring hebben, deze methode mogelijk niet altijd geschikt voor het observeren van langzame gebeurtenissen waarvoor langere opmerkingen, zoals axon rek en cel migratie. Voor langere …
The authors have nothing to disclose.
De auteur dankt diep Dr. Asako Sugimoto (Tohoku University) voor haar nuttige discussie. wyIs251 was een gulle gift van Dr. Kang Shen (Stanford University). mnIs17 werd verstrekt door de CGC, die wordt gefinancierd door de NIH kantoor van infrastructuur onderzoeksprogramma (P40 OD010440). Dit werk werd gesteund door JSPS KAKENHI grant #17 H 05010 en #16 H 06536 en Daiichi Sankyo foundation, Brain Science Foundation en Naito Foundation.
Slideglass (76 x 26 mm) | Matsunami | S1111 | |
Coverglass (22 x 40 mm) | Matsunami | C024401 | |
Agarose | Wako | 318-01195 | |
Polystylene microbeads 0.1 micron | Polysciences | #00876 | |
Heat block | TAITEC | 0063288-000 | CTU-mini |
Microscope | Olympus | IX-71 | widefield microscope |
Spinning disk Scanner | Yokogawa | CSU-X1 | spinning disc confocal scanner |
Digital CCD camera | Hamamatsu Photonics | C10600-10B | ORCA-R2 degital CCD camera |
Objective lens (x100, NA1.4) | Olympus | UPLSAPO 100XO | |
Pasteur pipette (5 inch) | IWAKI | IK-PAS-5P | |
Glass tube (1.5 cm diameter x 10.5 cm) | IWAKI | 9820TST15-105NP | |
TV9211: wyIs251 | Laboratory of Kang Shen | N/A | |
OTL11: mnIs17 | Ref. 27, 29 | N/A | SP2101 was backcrossed with wild type for 6 times |
Stereo microscope | Carl Zeiss | 435064-9000-000 | STEMI 508 |
Mirror transillumination unit | Carl Zeiss | 435425-9010-000 | |
platinum wire (0.2 mm) | Nilaco Corporation | m78483501 | |
60 mm plastic dish | Falcon | #351007 | |
Fiji | N/A | N/A | https://fiji.sc/ |
nematode growth medium (NGM) | 1.7% (w/v) agarose, 50mM NaCl, 0.25% (w/v) Peptone, 1 mM CaCl2, 5 mg/mL Cholesterol, 25 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4 |