न्यूरॉन्स में Intracellular परिवहन का विश्लेषण करने के लिए Caenorhabditis एलिगेंस के स्थिरीकरण
Summary
Caenorhabditis एलिगेंस (ग. एलिगेंस) axonal और intracellular परिवहन का अध्ययन करने के लिए एक अच्छा मॉडल है । यहां, मैं vivo रिकॉर्डिंग और सी. एलिगेंसमें axonal और intraflagellar परिवहन के विश्लेषण में के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन ।
Abstract
Axonal ट्रांसपोर्ट और intraflagellar ट्रांसपोर्ट (IFT) axon और cilia morphogenesis और फंक्शन के लिए जरूरी हैं । Kinesin superfamily प्रोटीन और dynein आणविक मोटर्स हैं जो क्रमशः anterograde और प्रतिगामी परिवहन को विनियमित करती हैं । इन मोटर्स रेल के रूप में microtubule नेटवर्क का उपयोग करें । Caenorhabditis एलिगेंस (सी. एलिगेंस) विवो मेंaxonal ट्रांसपोर्ट और IFT का अध्ययन करने वाला एक शक्तिशाली मॉडल जीव है । यहां, मैं एक प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए axonal परिवहन और IFT में रहने वाले सी. एलिगेंसका निरीक्षण । उत्पात कार्गो ऐसे ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) के रूप में फ्लोरोसेंट प्रोटीन का उपयोग कर कार्गो प्रोटीन टैगिंग द्वारा visualized किया जा सकता है । C. एलिगेंस पारदर्शी और GFP-चिह्नित कार्गो प्रोटीन सेल विशिष्ट प्रवर्तकों के तहत विशिष्ट कोशिकाओं में व्यक्त किया जा सकता है । जीवित कीड़े की हत्या या कीड़े anesthetizing बिना 10% agarose जेल पर microbeads द्वारा तय किया जा सकता है । इन शर्तों के तहत, कार्गो आंदोलन सीधे axons और विच्छेदन के बिना रहने वाले सी. एलिगेंस के cilia में मनाया जा सकता है । इस विधि को लक्षित प्रोटीन और/या वे में व्यक्त कर रहे है कोशिकाओं को संशोधित करके किसी भी कोशिकाओं में किसी भी कार्गो अणु के अवलोकन के लिए लागू किया जा सकता है । अधिकांश बुनियादी प्रोटीन जैसे आणविक मोटर्स और एडेप्टर प्रोटीन है कि axonal परिवहन और IFT में शामिल कर रहे हैं के संरक्षण में है C. एलिगेंस। अन्य मॉडल जीवों की तुलना में, म्यूटेंट को प्राप्त किया जा सकता है और अधिक आसानी से C. एलिगेंसमें बनाए रखा । विभिन्न सी. एलिगेंस म्यूटेंट के साथ इस विधि का मेल axonal परिवहन और IFT के आणविक तंत्र को स्पष्ट कर सकता है.
Introduction
लाइव सेल इमेजिंग intracellular परिवहन का विश्लेषण करने के लिए एक आवश्यक उपकरण है । न्यूरॉन सेल जीव विज्ञान में, लाइव सेल इमेजिंग के साथ axonal परिवहन के विश्लेषण ंयूरॉन समारोह और morphogenesis1समझने के लिए आवश्यक हैं । axonal परिवहन में दोष आबाद अनेक neurodegenerative विकार२. Kinesin superfamily प्रोटीन और dynein ले axonal परिवहन anterogradely और प्रतिगामी, क्रमशः1,2।
Cilia एक और सेलुलर कम्पार्टमेंट हैं जिसमें microtubule नेटवर्क और तस्करी मशीनरी को अत्यधिक विकसित किया गया है3. प्रोटीन संश्लेषण मशीनरी cilia में स्थानीयकृत नहीं है, जिसका अर्थ है कि सिलिअरी प्रोटीन को कोशिका से cilia युक्तियों तक पहुँचाया जाना चाहिए. Cilia-विशिष्ट kinesin और dynein, जिसे kinesin-2 और cytoplasmic dynein-2 कहा जाता है, क्रमशः Cilia ट्रांसपोर्ट (intraflagellar)5नामक एक घटना में,6-6 के घटकों का परिवहन करते हैं । IFT की हानि ciliopathies6नामक रोगों की एक स्पेक्ट्रम का कारण बनता है । इस प्रकार, लाइव सेल इमेजिंग द्वारा IFT तंत्र का विश्लेषण सिलिअरी गठन और रोगजनन के बुनियादी तंत्र को समझने की आवश्यकता है ।
Caenorhabditis एलिगेंस (ग. एलिगेंस) axonal परिवहन और IFT7,8,9का अध्ययन करने के लिए एक अच्छा मॉडल है । IFT का निरीक्षण करने के लिए, Chlamydomonas व्यापक रूप से एक मॉडल जीव5,6के रूप में इस्तेमाल किया गया है । के रूप में Chlamydomonas एक कोशिकीय जीव है, उंर बढ़ने के साथ IFT का रिश्ता, ंयूरॉन समारोह, और व्यवहार को विश्लेषण मुश्किल होगा । इसके अलावा, CRISPR/Cas9 जैसे आवश्यक आनुवंशिक तकनीकों को Chlamydomonasपर लागू नहीं किया गया है । उच्च मॉडल जीवों में, जैसे चूहों और Drosophila, axonal ट्रांसपोर्ट और IFT के व्यवधान अक्सर घातक phenotypes का कारण बनता है क्योंकि axonal ट्रांसपोर्ट और IFT जानवरों के morphogenesis और homeostasis के लिए जरूरी हैं , 11. चूहों के मामले में, सेल संस्कृति और अभिकर्मक आम तौर पर axonal परिवहन और IFT, जो कई कौशल और व्यापक समय12,13की आवश्यकता है निरीक्षण करने के लिए आवश्यक है । इसके अलावा, महत्वपूर्ण शारीरिक संदर्भ का एक बहुत संस्कृतिपूर्ण कोशिकाओं और सेल लाइनों में खो सकता है । क्योंकि तंत्रिका तंत्र कीड़े के अस्तित्व के लिए आवश्यक नहीं है, सी. एलिगेंस म्यूटेंट जिसमें axonal परिवहन या IFT बाधित कर रहे हैं अक्सर घातक नहीं है7,9,14. Axonal परिवहन और IFT सीधे विच्छेदन के बिना vivo में मनाया जा सकता है क्योंकि सी. एलिगेंस पारदर्शी है और यह इसलिए GFP-टैग मार्करों का पालन करने के लिए आसान है ।
C. एलिगेंस, जैसे एक microfluidic डिवाइस15, संज्ञाहरण16, या microbeads17के साथ agarose पैड का उपयोग कर के रूप में स्थिर करने के लिए कई प्रोटोकॉल हैं । संज्ञाहरण के शामिल होने के ंयूरॉंस में तस्करी की घटनाओं को बाधित कर सकते है15। microfluidic-युक्ति विधि का एक स्पष्ट दोष यह है कि एक microfluidic डिवाइस की तैयारी हमेशा आसान नहीं है । इसके बजाय, agarose पैड और microbeads द्वारा स्थिरीकरण C. एलिगेंसमें समय चूक इमेजिंग प्रदर्शन करने के लिए एक सुविधाजनक और आसान तरीका है । यहां, मैं सी. एलिगेंस में vivo में सी. एलिगेंस और टयूब axonal ट्रांसपोर्ट और IFT को मैटीरियल करने के लिए इस बुनियादी प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं । अंय तरीकों की तुलना में, विधि यहां वर्णित विशेष उपकरणों की आवश्यकता नहीं है और बहुत सस्ता है और प्रदर्शन करने के लिए आसान है ।
Protocol
1. नमुना वडा उत्पन्न एक ट्रांसजेनिक C. एलिगेंस तनाव का उपयोग ट्रांसजेनिक के तरीके से करना 18 . वैकल्पिक रूप से, Caenorhabditis जेनेटिक्स सेंटर (CGC) से उपयुक्त उपभेदों प्राप्त करते हैं । synaptic…
Representative Results
Discussion
मौजूदा तरीकों के संबंध में सीमा
विधि यहां वर्णित axonal परिवहन और IFT जैसे तेजी से घटनाओं का पालन करने के लिए अनुकूलित है । इस प्रकार, स्थिरीकरण अधिक अब गर्मी से प्राथमिकता है । जब तक हम महत्वपूर्ण गड़?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक गहराई से धंयवाद डॉ Asako Sugimoto (उसके सहायक चर्चा के लिए Tohoku विश्वविद्यालय) । wyIs251 डॉ कांग शेन (स्टैनफोर्ड विश्वविद्यालय) से एक उदार उपहार था । mnIs17 CGC द्वारा प्रदान किया गया था, जो अनुसंधान अवसंरचना कार्यक्रम (P40 OD010440) के NIH कार्यालय द्वारा वित्त पोषित है. इस काम को JSPS KAKENHI ग्रांट #17H05010 और #16H06536 और डायची Sankyo फाउंडेशन, ब्रेन साइंस फाउंडेशन और नैतो फाउंडेशन ने सपोर्ट किया था ।
Materials
| Slideglass (76 x 26 mm) | Matsunami | S1111 | |
| Coverglass (22 x 40 mm) | Matsunami | C024401 | |
| Agarose | Wako | 318-01195 | |
| Polystylene microbeads 0.1 micron | Polysciences | #00876 | |
| Heat block | TAITEC | 0063288-000 | CTU-mini |
| Microscope | Olympus | IX-71 | widefield microscope |
| Spinning disk Scanner | Yokogawa | CSU-X1 | spinning disc confocal scanner |
| Digital CCD camera | Hamamatsu Photonics | C10600-10B | ORCA-R2 degital CCD camera |
| Objective lens (x100, NA1.4) | Olympus | UPLSAPO 100XO | |
| Pasteur pipette (5 inch) | IWAKI | IK-PAS-5P | |
| Glass tube (1.5 cm diameter x 10.5 cm) | IWAKI | 9820TST15-105NP | |
| TV9211: wyIs251 | Laboratory of Kang Shen | N/A | |
| OTL11: mnIs17 | Ref. 27, 29 | N/A | SP2101 was backcrossed with wild type for 6 times |
| Stereo microscope | Carl Zeiss | 435064-9000-000 | STEMI 508 |
| Mirror transillumination unit | Carl Zeiss | 435425-9010-000 | |
| platinum wire (0.2 mm) | Nilaco Corporation | m78483501 | |
| 60 mm plastic dish | Falcon | #351007 | |
| Fiji | N/A | N/A | https://fiji.sc/ |
| nematode growth medium (NGM) | 1.7% (w/v) agarose, 50mM NaCl, 0.25% (w/v) Peptone, 1 mM CaCl2, 5 mg/mL Cholesterol, 25 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4 |
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