Ett förbättrat protokoll presenteras för mätning av transienta genuttryck från reporter konstruktioner i korn aleurone celler efter partikel beskjutning. Kombinationen av automatiserade spannmål slipning med plattan med 96 brunnar enzym analyser ger hög genomströmning för förfarandet.
Det aleurone lagret av kornkorn är ett viktigt modellsystem för hormon-reglerat genuttryck i växter. I aleurone celler, gener krävs för grobarhet eller tidig fröplanta utveckling aktiveras av gibberellin (GA), medan gener associerade med stressreaktioner som aktiveras av abscisic syra (ABA). Mekanismerna i GA och ABA signalering kan förhöras genom att införa reporter gen konstruktioner i aleurone celler via partikel beskjutning, med resulterande övergående uttryck mäts med hjälp av enzymet analyser. Ett förbättrat protokoll rapporteras som delvis automatiserar och effektiviserar steget korn homogenisering och enzym analyserna, att låta betydligt mer dataflöde än befintliga metoder. Homogenisering av korn proverna görs med ett automatiserat vävnad Homogenisatorer och GUS (β-glukuronidas) analyser utförs med hjälp av ett system för plattan med 96 brunnar. Representativa resultat med hjälp av protokollet föreslår att fosfolipas D aktivitet kan spela en viktig roll i aktiveringen av HVA1 genuttryck av ABA, genom Transkriptionfaktorn TaABF1.
Korn aleurone lagret är en väletablerad modellsystem för studier av hormon-reglerat genuttryck i växter1. Ett antal gener som krävs för grobarhet eller tidig fröplanta utveckling är särskilt aktiveras av gibberellin (GA), medan gener associerade med stressreaktioner som aktiveras av abscisic syra (ABA). De GA och ABA signalering vägar är sammanflätade, som ett uttryck för vissa GA-aktiverade gener hämmas av ABA, och vice versa1.
En värdefull strategi för att förstå rollen som vissa aktörer i GA/ABA signalering har varit införandet av effektor gen konstruktioner via partikel beskjutning, följt av övergående uttryck för reporter konstruktioner som tillåter den resulterande effekten på nedströms genuttryck som skall fastställas. Användning av reporter gener som GUS (β-glukuronidas) eller luciferas tillåter den känsliga och kvantitativa mätningen av genuttryck specifikt inom de celler som har fått den effektor konstruktion. Till exempel fastställs införandet av en effektor konstruktion kodning Transkriptionfaktorn TaABF15,6 att ABA-inducerad gener såsom HVA1 induceras av TaABF1, medan GA-inducerad gener som Amy32b förträngas. Partikel beskjutning som en experimentell strategi har använts av flera laboratorier för att undersöka olika aspekter av GA/ABA signalering. Sådant arbete har lett till identifiering av promotorn element viktigt för aktivering av både GA-inducerad2 och ABA-inducerad gener3och till upptäckten av protein kinaser4 och transkription faktorer5 som reglerar den uttryck av dessa gener.
De befintliga protokoll2,3,4,5,6 för partikel beskjutning med påföljande mätning av övergående genuttryck är ganska arbetskrävande, som varje uppsättning bombarderas knappt korn är homogeniserad för hand i en mortel och stöt och enzym analyserna utförs individuellt. Detta manuskript rapporterar ett förbättrat protokoll som delvis automatiserar och effektiviserar steget homogenisering och GUSEN analyser för att möjliggöra betydligt mer genomströmning, tillåter ett större antal behandlingar testas i samma experiment, eller den införandet av fler replikat för varje behandling för att få mer statistiskt robusta resultat. Representativa resultat visas för uttrycket av HVA1 och Amy32b reporter konstruktioner, regleras av Transkriptionfaktorn TaABF1 samt av GA, ABA och andra reglerande molekyler.
Införandet av effektor gen konstruerar via partikel beskjutning, följt av övergående uttryck för reporter konstruktioner är en värdefull strategi för dissekera rollen som vissa aktörer i GA/ABA signalering och i den resulterande hormon-reglerade genen uttryck.
Befintliga protokoll för att genomföra sådana experiment i korn aleurone celler2,3,4,5,6</su…
The authors have nothing to disclose.
Författarna tackar Greyson Butler och Margaret Barrett för hjälp vid utförandet av de experiment, Judy Stone för råd om spannmål homogenisering och Lynn Hannum för råd om fluorometry. Detta arbete stöddes av National Science Foundation (IOB 0443676), genom en institutionell utveckling Award (IDeA) från National Institute of General Medical Sciences av National Institutes of Health under licensnummer P20GM0103423 och genom bidrag från Colby College avdelningen för naturvetenskap.
GeneElute HP plasmid Maxiprep kit | Sigma | NA0310-1KT | |
UV-vis spectrophotometer | Nanodrop | ND-1000 | |
Himalaya barley grains | / | / | A variety of hulless barley (store in the dark at 4° C) |
sodium succinate | Sigma | S2378 | Reagent for Imbibing Solution |
calcium chloride (dihydrate) | Fisher | C79-500 | Reagent for Imbibing Solution |
Imbibing Solution | home made | / | 20 mM sodium succinate, 20 mM calcium chloride, pH 5.0. Sterilize by autoclaving before use. |
chloramphenicol | Sigma | C0378 | Prepare a 10 mg/mL stock solution in 70% ethanol. |
vermiculite | Fisher | NC0430369 | Used for vermiculite plates. |
filter paper circles (90 mm) | Whatman | 1001 090 | Used for vermiculite and for pre-bombardment grain preparation |
Vermiculite Plates | home made | / | Add 50 mL of vermiculite to a glass petri dish. Place a 90 mm paper circle on top of the vermiculite. Autoclave. |
forceps (fine pointed) | Fisher | 13-812-42 | Used for removing seed coat from barley grains. |
forceps (ultra fine point) | Fisher | 12-000-122 | Used for removing seed coat from barley grains. |
gold microcarriers (1.6 μm) | BioRad | 1652264 | |
macrocarriers | BioRad | 1652335 | |
calcium chloride (dihydrate) | Fisher | C79-500 | Prepare a 2.5 M stock solution and store 1 mL aliquots at -20° C. |
spermidine | Sigma | S0266 | Prepare a 100 mM stock solution and store 500 μL aliquots at -20° C (use within 2 months). |
rupture discs (1550 psi) | BioRad | 1652331 | |
stopping screens | BioRad | 1652336 | |
macrocarrier holders | BioRad | 1652322 | |
Biolistic particle delivery system | BioRad | PDS-1000/He | |
sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | S9638 | Reagent for 1M sodium phosphate pH 7.2 |
sodium phosphate dibasic | Sigma | S9763 | Reagent for 1M sodium phosphate pH 7.2 |
1M sodium phosphate pH 7.2 | home made | / | Combine 6.9 g of sodium phosphate monobasic monohydrate with 7.1 g of sodium phosphate dibasic. Add water to 100 mL. Add NaOH to get pH 7.2. |
dithiothrietol (DTT) | Sigma | 43819 | Dissolve in water to 1 M. Store at -20° in 1 mL aliquots. |
leupeptin | Sigma | L2884 | Dissolve in water to 10 mg/mL. Store at -20° C. |
glycerol | Sigma | G5516 | Prepare a 50% solution in water. |
Grinding Buffer | home made | / | Combine 10 mL of 1 M sodium phosphate pH 7.2, 500 μL of 1 M DTT, 100 μL of 10 mg/mL leupeptin, and 40 mL of 50% glycerol. Add water to 100 mL. |
stainlesss steel beads (5 mm) | Qiagen | 69989 | |
2.0 mL tubes | Eppendorf | 22363352 | This specific model of tube is recommended for use with the homogenizer. |
bead homogenizer (TissueLyser) | Qiagen | 85210 | |
12mm x 75 mm glass test tubes | Fisher | ||
luciferin | Goldbio | LUCK-100 | Prepare a 25 mM stock solution and store 1 mL aliquots at -20° C. |
ATP | Sigma | A7699 | Prepare a 100 mM stock solution and store 250 μL aliquots at -20° C. |
Tris base | Sigma | T1503 | Reagent for 1M Tris sulfate pH 7.7. |
sulfuric acid | Sigma | 258105 | Reagent for 1M Tris sulfate pH 7.7. |
1M Tris sulfate pH 7.7 | home made | / | Dissolve 12.1 g Tris base in 100 mL of water. Adjust pH to 7.7 with sulfuric acid. |
magnesium chloride | Sigma | M9397 | Dissolve in water to 2 M. |
Luciferase Assay Buffer (LAB) | home made | / | Combine 3 mL of 1 M Tris sulfate pH 7.7, 500 μL of 2 M magnesium chloride, 1 mL of 1 M DTT, and 200 μL of 0.5 M EDTA. Add water to 50 mL. |
Luciferase Assay Mixture | home made | / | Combine 15 mL of LAB, 800 μL of 25 mM luciferin, 200 μL of 100 mM ATP, and 4 mL of water. This makes enough assay mixture (20 mL) for 100 luciferase assays. |
luminometer (Sirius) | Berthold | / | |
4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide (MUG) | Goldbio | MUG1 | Dissolve in DMSO to 100 mM. |
sodium azide | Sigma | S8032 | Prepare a 2% stock solution in water and store 1 mL aliquots at -20° C. |
96 well plates (standard) | Fisher | 12565501 | |
GUS assay buffer | home made | / | Combine 2.5 mL of MUG, 5 mL of 1 M sodium phosphate pH 7.2, 400 μL of 0.5 M EDTA, 1 mL of 1 M DTT, 100 μL of 10 mg/ml leupeptin, 20 mL of methanol, and 1 mL of 2% sodium azide. Add water to 100 mL. |
TempPlate sealing film | USA Scientific | 2921-1000 | |
96 well plates (black) | Costar | 3916 | |
sodium carbonate | Sigma | S7795 | Prepare a 200 mM solution in water. |
4-methylumbelliferone | Sigma | M1381 | Prepare a 100 μM solution in water. Freeze 1 mL aliquots at -20° C. |
microplate fluouresence reader | Bio-Tek | FLX-800 |