Summary
Gelişmiş bir iletişim kuralı muhabir yapıları arpa aleurone hücrelerdeki geçici gen ifadeden sonra partikül bombardımanı ölçümü için sunulmaktadır. Otomatik tahıl 96-şey plaka enzim deneyleri ile bileme yordamı için yüksek üretilen iş sağlar.
Abstract
Arpa taneleri aleurone tabakası bir hormon düzenlenir gen ekspresyonu tesislerinde önemli model sistemidir. Aleurone hücrelerdeki genler çimlenmesi için gerekli ya da stres yanıt ile ilişkili genlerin absisik asit (ABA) tarafından aktif hale gelir iken erken fide geliştirme Giberellin (GA), tarafından aktive. GA ve ABA sinyal verme mekanizmaları muhabir gen yapıları partikül bombardımanı, via aleurone hücreye enzim deneyleri kullanarak ölçülen elde edilen geçici ifadesi ile tanıtımı tarafından sorguya çekilmeyi. Gelişmiş bir iletişim kuralı bu kısmen otomatikleştirir ve tahıl homojenizasyon adım ve enzim deneyleri düzene bildirilmektedir varolan yöntemlerine göre önemli ölçüde daha fazla üretilen iş sağlar. Homojenizasyon tahıl örneklerinden bir otomatik doku homogenizer kullanarak gerçekleştirilir ve GUS (β-glucuronidase) deneyleri bir 96-şey plaka sistemi kullanılarak yapılmaktadır. Temsilcisi sonuçları iletişim kuralını kullanarak fosfolifaz D faaliyet HVA1 gen ekspresyonu ABA tarafından transkripsiyon faktörü TaABF1 aracılığıyla etkinleştirme önemli bir rol oynamaktadır öneririz.
Introduction
Arpa aleurone katman hormon düzenlenir gen ekspresyonu bitkiler1incelenmesi için köklü modeli sistemidir. Özellikle, stres yanıt ile ilişkili genlerin absisik asit (ABA) tarafından aktif hale gelir iken çimlenme veya erken fide gelişimi için gerekli genler bir dizi Giberellin (GA), tarafından etkinleştirilir. GA-aktive bazı genlerin ifade ABA ve ahlak bozukluğu-çok yönlü1tarafından inhibe gibi GA ve yolları sinyal ABA, iç içe geçmiş bulunmaktadır.
GA/ABA sinyal içinde belirli aktörlerin rolü efektör gen yapıları partikül bombardımanı, üzerinde oluşturduğu efekt izin muhabir yapıları, geçici ifade tarafından takip yoluyla getirilmesi olmuştur anlamak için değerli bir strateji aşağı akım gen ekspresyonu belirlenecek. Muhabir gen GUS (β-glucuronidase) veya Luciferase gibi özellikle efektör yapı almış hücrelerde gen ekspresyonu hassas ve nicel ölçüm sağlar. Örneğin, ABA kaynaklı genlerin HVA1 gibi Amy32b gibi GA kaynaklı genlerin ise TaABF1 tarafından indüklenir kodlama transkripsiyon faktörü TaABF15,6 bir efektör yapı getirilmesi kurulan baskı. Partikül bombardımanı deneysel bir strateji olarak GA/ABA sinyal çeşitli yönlerini incelemek için birden fazla Laboratuvarları tarafından kullanılmıştır. Bu iş yol organizatörü öğeleri2 GA kaynaklı ve ABA kaynaklı genlerin3aktivasyonu için önemli tanımlaması ve protein kinaz4 keşfi ve transkripsiyon faktörleri düzenleyen5 Bu genlerin ifade.
Varolan iletişim kuralları2,3,4,5,6 partikül bombardımanı ve geçici gen ekspresyonu sonraki ölçümü için oldukça emek yoğun, her kümesi, bombardıman olarak vardır güç bela taneleri bir harç ve havan Tokmağı elle homojenize ve enzim deneyleri ayrı ayrı yapılmaktadır. Bu el yazması kısmen otomatikleştirir ve homojenizasyon adım akıcılık, gelişmiş bir iletişim kuralını raporları ve GUS anlamlı olarak daha fazla işlem hacmi, izin vermek için aynı deneyde, test edilecek tedaviler daha çok sayıda izin deneyleri ve/veya Her tedavi daha istatistiksel olarak sağlam sonuçlar elde etmek için daha fazla çoğaltır eklenmesi. Temsilcisi sonuçları muhabir yapıları, HVA1 ve Amy32b de GA, ABA ve diğer düzenleyici molekül transkripsiyon faktörü TaABF1 tarafından düzenlenir, ifade için gösterilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. hazırlanması efektör ve muhabir gen yapıları
- Kurucu organizatörü (örneğin Mısır Ubikuitin, UBI) istihdam efektör yapıları için sürücü ifade istenen açık okuma çerçevesi oluşturun. Örneğin, sürücü güçlü kurucu ifade TaABF15 UBI::TaABF1 içeren bir plazmid oluşturmak.
- Olan faaliyet ölçülebilir olmaktır, organizatörü içerir muhabir yapıları GUSgibi bir açık okuma çerçevesi, ters yönde yerleştirilir kurmak. Örneğin, ifade HVA1 organizatörü2,5ölçmek için HVA1::GUS içeren bir plazmid oluşturmak.
- Bir iç kontrol inşa inşa (örneğin UBI::luciferase).
- Silis bağlama sütun kullanarak ( Tablo malzemelerigörmek) protokol, yüksek kaliteli plazmid gerekli gen yapıları, her biri için hazırlamak. Morötesi Spektroskopi kullanarak ( Tablo malzemeleri, dikkatle bakınız) her plazmid hazırlık konsantrasyonu ölçmek.
2. bombardıman için arpa taneleri hazırlanması
- Bir e-tablo ayarlamak (bir örnek için bkz: şekil 1 ) bombardıman edilecektir plazmid, uygun hormon tedavileri ve deneyin bir parçası olacak her tedavi için diğer ilgili bilgileri gösteren.
- Bir kesme tahtası ve steril bir jilet kullanarak, tahıl Himalaya arpa (40 denemeye dahil her tedavi için) gelen embriyo kesti. Renksiz ya da ortalamadan daha önemli ölçüde daha küçük taneler hariç.
- Embryoless tahıl 50 mL tüp içine yerleştirin. Su ve rock 40 mL 10 dakika için ekleyin.
- 40 mL % 10 çamaşır suyu ekleyin ve dikkatle (tahıl kaybetmemek için) suyu dökün. Kaya 20 dakikadır.
- Çamaşır suyu dökmek ve 40 mL steril su ekleyin. Rock 5 dakika. Bu steril su yıkama dört kez daha tekrarlayın.
- 40 mL Imbibing çözeltisi (20 mM sodyum süksinat, 20 mM Kalsiyum klorür, pH 5,0) ekleyin ve 40 μL kloramfenikol hisse senedi çözüm (10 mg/mL).
- Imbibing Çözümle (kloramfenikol) çoğunu tüp sizden bir vermikülit tabak aktarmak ( Tablo malzemelerigörmek). Ardından taneleri ıslak filtre kağıdı vermikülit plaka yüzeyi üzerine aktarın. Tahıl eşit yayılmış. Pour kısmen (ama tamamen değil) olduğu tohumlar tutmak için yeterli imbibing çözümde sular altında. Vermikülit plaka üzerine kapak koyun.
- 48 h ile floresan lambalı aydınlatma için 24 ° C'de embryoless tahıl kuluçkaya. Ek Imbibing çözüm gerektiği gibi ekleyin.
- 90 mm plastik petri kabına kadar açın ve çözüm Imbibing 20 mL çanak içine kendisi ve 20 mL ters kapağı dökün. Kloramfenikol (10 mg/mL) 20 μL her ekleyin. İyi noktası forseps iki çift alkol daldırma tarafından sterilize.
- Birkaç embryoless tahıl petri kabına kapağı yerleştirin. Forseps kullanarak, her tahıl (saydam) tohum kat yavaşça çıkarın. Tohum kat tahıl pürüzsüz kısmından kaldırılırken, altındaki (aleurone) hücreler zarar vermeyen. Soyulmuş tahıl Imbibing solüsyon içeren petri kabına aktarın.
- Tohum kat tüm taneleri soyma sonra onları vermikülit plakasına geri. Soyulmuş embryoless tahıl 24 ° c 16-20 saat boyunca kuluçkaya.
- Sadece tahıl bombardıman için kullanmadan önce yüzey nemi petri kabına gazetelerde filtre arasında sallayarak kaldırın.
3. bombardıman için plazmid DNA hazırlanması
- 1.5 mL tüp bombardıman denemeye dahil edilecek her tedavi için etiket. Her tüpün UBI2,5 µg ekle::luciferase iç kontrol plazmid, 2,5 µg GUS muhabir Plazmid ve bir efektör plazmid istenilen miktarda (genellikle 0.025 µg 2,5 µg için). Toplam hacim için 5 µL getirmek için su ekleyin.
- (Bkz: Malzemeler tablo) 1.6 µm altın microcarriers hazırlamak aşağıdaki protokolleri6yayınlandı.
- Her tedavi için askıya alınmış microcarriers 50 µL plazmid DNA içeren 1,5 mL tüp içine ekleyin. Plazmid DNA ile microcarriers göre üreticinin iletişim kuralları6kat.
- Plazmid kaplı microcarriers 48 µL % 100 etanol, damlalıklı 8 μL her beş macrocarriers askıya alınmış microcarriers, askıya alınır ve hava için izin zaman son adımda, Kuru.
4. partikül bombardımanı Embryoless arpa taneleri
- (Bkz: Malzemeler tablo) partikül bombardımanı aparatı ayarla6.
- 1550 psi rüptürü disk istinat kap yerleştirin ve araç üzerinde monte edin.
- (Birlikte bir durdurma ekran) istenen plazmid kombinasyonu içeren bir macrocarrier microcarrier denize indirmek derleme yerleştirin. Derleme bombardımanı odası en iyi yuvasına takın. Kap ve macrocarrier kapak kapak standart uzaklık (6 mm) istinat rüptürü disk arasındaki mesafeyi ayarlamak ve durdurma ekran desteği sağlayan bir macrocarrier seyahat etmek mesafe 11 mm (şekil 2A) (Standart) orta konumda yer.
- 8 embryoless tahıl sıkı bir Radyal desen aşağı düz'e 90 mm petri kabına kapağı bantlanmış bir filtre kağıdı daire (içe dönük ince uçları) ile düzenlemek (bkz. şekil 2B).
- Durdurma ekranından 6 cm mesafeden bombardımanı odası taneleri ile çanak yerleştirin.
- Bombardıman odası için 95 kPa tahliye ve örnek ile bombardıman.
- Vakum bırakmadan sonra alı tahıl 4 mL Imbibing 1 mg/ml kloramfenikol içeren çözeltisi içeren bir etiketli 60 mm petri kabına aktarın.
- Tüm bombardımanları tamamlayıncaya kadar yineleyin. (Bir platformda sallayarak 100 rpm) 24 ° C'de 24 saat boyunca kuluçkaya.
5. çıkarma çözünür protein alı tahıl
- Forseps kullanarak, 60 mm petri kabına 8 alı tahıl kaldırmak ve onları bir kağıt havlu üzerinde leke. Taneleri her 800 μL içeren iki etiketli 2.0 mL tüpler (tüp başına 4 tahıl) içine bölmek taşlama arabellek (100 mM Na fosfat pH 7.2, 5 mM DTT, 10 µg/mL leupeptin, % 20 gliserol) ve 5 mm paslanmaz çelik boncuk. Tüm alı tahıl için bu adımları tekrarlayın.
- (48) 2.0 mL tüpler boncuk homogenizer iki rafları yerleştirin (bkz. Tablo malzeme). Raflar üzerinde homogenizer bağlayın.
- Örnekleri 30 Hz'de 3 dakika çalkalanır.
- Homogenizer raflar homogenizer kaldırmak ve yeniden örnekleri soğuması için buza (5 dk) koyun.
- Rafları geri homogenizer - ters yönde bağlama. Örnekleri daha 30 Hz'de 3 dakika çalkalanır.
- Raflar on Ice, serin o tekrar adımları 5.3 5.5 için. Bu sallayarak 12 dakika toplam için eklemek olacaktır.
- 16.000 x g 4 ° c de tahıl özler 10 dakika santrifüj kapasitesi.
- Hemen sonra Santrifüjü dikkatle boşaltmak açık supernatants microcentrifuge tüpler ikinci bir dizi içine. Her tüpün hızlı bir girdap verin. Tüpler buza saklayın.
- Bu yüzden onlar yıkanmış ve yeniden süpernatant aktardıktan sonra çelik boncuk çökeltilerini kurtarmak.
6. ölçüm tahıl özler Luciferase etkinliği
- 12 x 75 mm cam 200 μL Luciferase tahlil karışımı içeren tüp bebek denetlesinler için tahıl özü her tüp için hazırlamak (45 mM Tris pH 7,7, 15 mM MgCl2, 20 mM DTT, 1.5 mM EDTA, 1 mM biyoluminesans, 1 mM ATP sülfat).
- İlk tahıl ekstresinin 100 μL ilk tahlil tüp ekleyin. Girdap hızla karıştırın. Hemen tüp luminometer tüp yuvasına yerleştirin ve kapıyı kapat. Ölçüm sona erdiğinde, tüp kapıyı sonraki tüp yerleştirilmesi için açık bırakarak luminometer – kaldırın.
- Tüm örnekleri ölçülen kadar bu işlemi yineleyin.
7. ölçüm tahıl GUS etkinliği ayıklar
- GUS tahlil arabelleği (50 mM Na fosfat pH 7.2, 2.5 mM 4-methylumbelliferyl - D-glucuronide, 10 mM DTT, 2 mM EDTA, 10 µg/mL leupeptin, % 20 metanol, % 0.02 sodyum azid) 200 μL 96 iyi plaka her şey için ekleyin.
- Yer 50 μL her tahıl özü de buna karşılık gelen içine. Ucu ile ekledikten sonra karıştırın. Üst film mühürleme ile kapatın.
- 96 iyi plaka karanlıkta 37 ° C'de 20 saat boyunca kuluçkaya.
- 96 iyi plaka 4.000 x g 4 ° c de 10 dakika santrifüj kapasitesi ve buz üzerinde yerleştirin.
- 250 μL 0.2 M Na2CO3 siyah 96 iyi plaka her şey için ekleyin.
- Her centrifuged GUS tahlil karışımı 6.25 μL karşılık gelen içine eklemek iyi (içeren 0.2 M Na2CO3) siyah 96 de plaka. Ucu ile ekledikten sonra karıştırın. Wells ile 10 mikron, 40 mikron ve 100 mikron 4-methylumbelliferone 6.25 μL standartları olarak içerir.
- Siyah plaka plaka yer yerleştirin ve methylumbelliferone floresan okuyun. 360 bir uyarma dalga boyu okumalar alıp nm ve emisyon dalga boyu 460 nm. Verir bir okuma 1000 Floresans birimlerinin 40 mikron 4-methylumbelliferone bir de içeren 6.25 μL ve 250 μL 0.2 M Na2CO3 kazanç enstrümanın ayarlayın.
8. veri analizi
- Değerleri luciferase ve GUS deneyleri için bir elektronik tabloya girin. Bu gen yapıları başarıyla aleurone hücrelere teslim değil anlamına gelir olarak dikkate herhangi bir örnek bir luciferase okuma ile 20.000 göreli ışıldama birimleri s-1, daha düşük hariç.
- (Dört embryoless tahıl grubu temsil eden) için başarıyla alı her tahıl özü, ham GUS ve luciferase veri normalleştirilmiş GUS ifadeden aşağıdaki gibi hesaplar: GUS normalleştirilmiş = [(GUS ifade - GUS boş) (2.000.000) x] / (luciferase ifade-luciferase boş).
Not: Bu ne 2.000.000 bir luciferase okuma verdi bir bombardıman gözlenen için GUS etkinliğinin miktarı normalleştirir. - Bir özel muhabir yapı efektör yapıları veya effectors veya hormon yokluğunda ifade seviyeye karşılaştırarak test edilen hormon tedavileri huzurunda ifade göreli düzeyini rapor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada açıklanan teknik herhangi bir test gen yapısı arpa taneleri aleurone hücrelere tanıtmak için kullanılabilir. Test gen ifade düzeyini daha sonra olabilir uygun ölçülen (Şekil 2). Burada büyük ölçüde açıklanan yüksek üretilen iş Protokolü tohum öğütme ve enzim tahlil adımları verimliliğini artırır. Bu yöntem transkripsiyon faktörü TaABF15,6 ifade ABA kaynaklı gen HVA17etkinleştirme yeteneği değerlendirmek için kullanılmıştır. Burada sunulan temsilcisi sonuçlarında bir HVA1::GUS muhabir inşa aleurone hücrelere bir UBI::TaABF1 efektör yapı (şekil 3A) ile birlikte kullanılmaya başlandı. Süre bir TaABF1/HVA1 oranı sadece 0,01 HVA1 muhabir gen 3 kat bir indüksiyon eksojen ABA yokluğunda neden için yeterli, TaABF1 yapı yüksek düzeyde sonuçlandı giderek daha büyük HVA1 ifade, bir doz bağımlı şekilde (şekil 3BC).
Bu deneysel protokol Ayrıca hormonlar veya diğer bileşikler kullanımı sırasında bu molekülleri gen ifadesinin düzenlenmesinde rol değerlendirmek için sonrası bombardımanı kuluçka dönemi dahil. Diğer araştırmacılar tarafından önceki çalışma fosfolifaz D bazı yönlerini ABA sinyal önemi önerdi. Özellikle, ürün fosfolifaz D faaliyet, phosphatidic asit, bir ara ABA8,9bazı yanıtlarında olarak karıştığı olmuştur. 1-butanol, fosfolifaz D (PLD), bir inhibitörü kanıtlanmıştır ki ABA kaynaklı gen ekspresyonu aleurone hücrelerdeki önlemek için PLD ABA bu doku sinyal ayrılmaz bir parçası olabileceğini gösteriyor. Bombardıman Protokolü 1-butanol ABA kaynaklı veya TaABF1 kaynaklı HVA1 ifade inhibe olup olmadığını test etmek için kullanılmıştır. Beklendiği gibi eksojen ABA veya TaABF1 kuvvetle ifade HVA1::GUS muhabir yapı (şekil 3 c) neden. Her iki durumda da, 1-butanol varlığı kuvvetle HVA1 indüksiyon inhibe. Bu PLD HVA1 gen ekspresyonu ABA, TaABF1 aracılığıyla tarafından aktivasyonu yılında önemli bir rol oynayabilir göstermektedir.
Gelişmekte olan ve tahıl takımıdır rolüne ek olarak, ABA da yaprakları stomatal diyafram düzenleyen için önemlidir. Stoma bantlı guard hücrelerde, nitrik oksit (NO), phosphatidic asit üretimi uyarılır hangi sırayla hidrojen peroksit (H2O2) tarafından indüklenen. Bazı tepkiler için Hayır ve H2O2 ABA9için yedek. Bu da aleurone hücreleri durumda olup olmadığını belirlemek için bombardıman Protokolü NO donör sodyum nitroprusside (SNP) veya H2O2 ABA için GA kaynaklı Amy32b ifade inhibe yerine olabilir olup olmadığını test etmek için kullanılmıştır gen. ABA şiddetle GA kaynaklı ifade inhibe iken Amy32b::GUS muhabir oluşturmak, için ne H2O2 ne de SNP neden herhangi bir önemli azalma (şekil 3D). Bu sonuçlar, bu nedenle, hayır için bir rol desteklemez ve aleurone hücre ABA yanıtlarında H2O2 .
Resim 1 : Elektronik tablo tipik bombardımanı deneme için. Her bombardıman için tüp yerleştirilmesi her plazmid hazırlık miktarı gösterilir. Bu deneyde, her tedavi için toplam sekiz olası örnekleri (4 her tahıl) vermek için her tedavi dört el (8 her tahıl) kullanılmıştır. Her bombardımanı aynı toplam DNA konsantrasyon sağlamak için bazı durumlarda UBI::TaBF1 efektör plazmid yerine bir "kukla" efektör plazmid kullanıldı. A GUS ve luciferase faaliyet aleurone hücrelerdeki arka plan düzeyine kurmak için "boş" bir bombardıman tedavisidir. Bu elektronik tabloda özetlenen bombardımanı denemenin sonuçları şekil 3B' gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Diyagramı Protokolü'nün. (A) şeması bombardımanı cihazın. (B) sahip bir muhabir yapı test edilecek organizatörü, (gerekirse) bir efektör ve bir iç kontrol (UBI::luciferase) taşıyan kaplı altın parçacıkları arpa aleurone hücrelere partikül bombardımanı tarafından tanıtıldı. Kuluçka (genellikle için 24 h) sonra taneleri yere vardır ve GUS faaliyet ve luciferase etkinliği için denetlesinler. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : HVA1 ve Amy32b rehberleri TaABF1, ABA ve ABA sinyal potansiyel arabulucu tarafından düzenlenmesi. (A) deneylerinde kullanılan muhabir ve efektör yapıları. (B) efektör yapı UBI::TaABF1 aleurone hücrelere HVA1::GUS muhabir ve iç kontrol yapısı (UBI::luciferase) ile birlikte bombardıman. UBI::TaABF1 efektör (görece HVA1::GUS muhabir) miktarı 0 ile 0.1, barlar belirtildiği gibi çeşitli. GUS ve luciferase faaliyetleri kuluçka 24 h sonra ölçüldü. Gösterilen veriler 6-8 biyolojik çoğaltır anlamı (± SE) vardır. (C) HVA1::GUS muhabir iç kontrol yapısı (UBI::luciferase) ile aleurone hücreye efektör yapı UBI::TaABF1içinde co bombardıman. TaABF1 efektör (muhabir) göreli miktarı 1.0 oldu. GUS ve luciferase faaliyetleri, kuluçka veya 20 µM ABA ve %0,4 1-butanol olmadan 24 saat sonra ölçüldü. (D) Amy32b::GUS muhabir aleurone hücrelere iç kontrol yapısı (UBI::luciferase) ile birlikte alı. GUS ve luciferase faaliyetleri, kuluçka 1 mM GA ile veya olmadan 20 µM ABA, 1 mM H2O2veya 100 µM sodyum nitroprusside (SNP) huzurunda 24 saat sonra ölçüldü. GUS etkinlik değerleri Amy32b::GUS muhabir GA yokluğunda ifade göre Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Efektör gen getirilmesi yolu ile partikül bombardımanı oluşturur, geçici muhabir yapıları, deyimden GA/ABA sinyal ve ortaya çıkan hormon düzenlenir gen belirli aktörlerin rolü dissekan için değerli bir stratejidir ifade.
Ancak, bu tür deneyleri arpa aleurone hücreleri2,3,4,5,6 taşımak için varolan çok emek yoğun iletişim kurallarıdır. Her grup alı zar zor tahıl bir harç ve havaneli homojenize el olmalı ve elde edilen özler GUS ve luciferase etkinliği için ayrı ayrı denetlesinler. Geçerli iletişim kuralları bu nedenle aynı deneyde dahil edilebilir ve makul her tedavi için dahil edilebilir biyolojik çoğaltır sayısını sınırlamak ayrı tedaviler sayısını sınırlayın. Bu sınırlamalar daha kapsamlı ve aynı anda birden fazla tedaviler arasında karşılaştırmalar yapmak zor yapmak. Tür karşılaştırmalarda gen ekspresyonu tedaviler arasında fark düşüktür ve biyolojik çoğaltır nispeten çok sayıda istatistiksel anlamlılık kurmak için gereken özellikle zor olabilir.
Akıcı bir protokol burada kısmen tahıl özü hazırlık otomatikleştiren sunulur ve önemli ölçüde daha yüksek aktarıma izin vermek için GUS deneyleri. Bu yeni sürümü her iki deneme ve daha fazla ücret daha farklı tedaviler eklenmesi için izin veren bir deney, çok daha büyük bir toplam sayı örnekleri dahil etmek mümkün bunun için her tedavi çoğaltır Protokolü yapar. Bombardıman ve kuluçka sonra tahıl özleri hazırlanması için 48 örnekleri aynı anda (yaklaşık 20 dakika içinde) işleyebilir bir boncuk homogenizer kullanır büyük ölçüde otomatik bileme Protokolü yerine var. Böylece, tek bir dedektif çözünür protein yaklaşık 200 özler hazırlayabilirsiniz dört müfettişler oluşan bir ekip el süreceğini daha az zaman örnekleri yalnızca 100 örnek eziyet. 96 iyi levha, yürütülen değiştirilmiş GUS tahlil de bireysel tüp istihdam özgün iletişim kuralını deneyleri daha az emek gerektirir.
Plazmid karışımları bombardımanı (Adım 3.1) için hazırlanmasında, bir efektör muhabir oranı belirli bir efektör herhangi bir etkisi olup olmadığını belirlemek özellikle Ön testler için 1.0 kullanmak mümkündür. Ancak, Mısır Ubikuitin (UBI) organizatörü gücü nedeniyle, güçlü bir etki genellikle çok daha düşük oranları ile şekil 2B ve daha önce yayımlanmış Raporlar4,5,6' da görüyoruz görülebilmektedir. Bu iletişim kuralı diğer kritik adımlarda bombardımanı aparatı tohum mantoyu üzerinden arpa taneleri soyma ve dikkatlice tanımlanmış ayarların kullanımını içerir. Tohum kat tamamen kaldırılmazsa, altın microcarriers subtending aleurone hücreleri girmeniz engellenir. Altın microcarriers başarılı teslim aleurone hücre içine aynı zamanda oldukça kullanılan rüptürü disk, microcarrier kapak kapak, durdurma ekran ve doku bombardıman konumunu belirli türüne bağlıdır. Koşulları genellikle başarılı teslim sonucu (bkz. Adım 8.1) gen yapıları, bir alı arpa tahıl örnekleri yüksek yüzdesi (≥70%) rapor burada. Diğer biyolojik malzemeler farklı koşulları için en uygun gen teslim gerektirecektir beklenmelidir.
Her ne kadar burada açıklanmayan, flash luciferase deneyleri 96 iyi tabak içinde gerçekleştirerek yordamı daha da kolaylaştırmak mümkün olacaktır. Olarak luciferase ışık üretiminden bir luminometer hemen protein özü substrat (biyoluminesans) ile karıştırdıktan sonra ölçülen gerekir, ancak, bu plaka flash luminometer çok daha fazla bir araç ile enjektörler, kullanımı gerektirir bir tek tüp luminometer daha pahalı.
Rapor burada temsilcisi sonuçları transkripsiyon faktörü TaABF1 yokluğunda HVA1 ifade eksojen ABA5,6etkinleştirebilirsiniz onaylayın. HVA1 TaABF1 ya da eksojen ABA aktivasyonu PLD tarafından phosphatidic asit üretimini HVA1 harekete geçirmek için gerekli olabilir düşündüren PLD inhibitörü 1-butanol tarafından engellendi. Bu sonuçlar HVA1 düzenleme TaABF1 ve ABA Zou vd tarafından elde edilen benzer transkripsiyon faktörü LtWRKY21 ve ABA HVA22 aktivasyonu için 10 . H2O2 veya SNP değil yerine eksojen ABA, Amy32b, aleurone ifade bastırmak için bulgu ABA hububat içinde sinyal bazı açıları stomatal guard hücrelerinde oluşur dan farklıdır onaylar. H2O2 değil tümleyici Amy32b ifade yapar bulma Ishibashi vd tarafından gözlenen sonuçlar ile tutarlıdır amilaz enzimi etkinlik için 11 .
Artan işlem hacmi Protokolü şimdi TaABF1 fosforilasyon aşağı akım gen ekspresyonu düzenlemek için onun yetenek üzerinde etkileri kapsamlı bir çalışma yürütmek için kullanılıyor. ABF diğer üyeleri olarak transkripsiyon faktörleri ailesinin farklı siteler12,13,14,15,16, birden çok sözde fosforilasyon numaradan fosforile TaABF1 sitelerinde test edilmesi gerekiyor. Bu iletişim kuralı tarafından izin verilen en yüksek üretimi TaABF1 mutant sürümleri (potansiyel olarak phosphorylatable serin ve treonin artıkları Modifiye ile) çok sayıda izin verir her biri çok sayıda biyolojik sorgulanmak için çoğaltır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Yazarlar Greyson Butler ve Margaret Barrett deneyler, tahıl homojenizasyon tavsiye için Judy taş ve Lynn Hannum tavsiye fluorometry için yürütmek yardım için teşekkür ederiz. Bu eser Ulusal Bilim Vakfı tarafından (IOB 0443676), bir kurumsal geliştirme Ödülü (fikir) üzerinden Ulusal Genel tıbbi Bilimler Enstitüsü Ulusal Sağlık Enstitüleri grant numarası P20GM0103423 altında ve gelen hibe tarafından desteklenmiştir Doğa Bilimleri Colby üniversite bölümü.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GeneElute HP plasmid Maxiprep kit | Sigma | NA0310-1KT | |
| UV-vis spectrophotometer | Nanodrop | ND-1000 | |
| Himalaya barley grains | / | / | A variety of hulless barley (store in the dark at 4° C) |
| sodium succinate | Sigma | S2378 | Reagent for Imbibing Solution |
| calcium chloride (dihydrate) | Fisher | C79-500 | Reagent for Imbibing Solution |
| Imbibing Solution | home made | / | 20 mM sodium succinate, 20 mM calcium chloride, pH 5.0. Sterilize by autoclaving before use. |
| chloramphenicol | Sigma | C0378 | Prepare a 10 mg/mL stock solution in 70% ethanol. |
| vermiculite | Fisher | NC0430369 | Used for vermiculite plates. |
| filter paper circles (90 mm) | Whatman | 1001 090 | Used for vermiculite and for pre-bombardment grain preparation |
| Vermiculite Plates | home made | / | Add 50 mL of vermiculite to a glass petri dish. Place a 90 mm paper circle on top of the vermiculite. Autoclave. |
| forceps (fine pointed) | Fisher | 13-812-42 | Used for removing seed coat from barley grains. |
| forceps (ultra fine point) | Fisher | 12-000-122 | Used for removing seed coat from barley grains. |
| gold microcarriers (1.6 μm) | BioRad | 1652264 | |
| macrocarriers | BioRad | 1652335 | |
| calcium chloride (dihydrate) | Fisher | C79-500 | Prepare a 2.5 M stock solution and store 1 mL aliquots at -20° C. |
| spermidine | Sigma | S0266 | Prepare a 100 mM stock solution and store 500 μL aliquots at -20° C (use within 2 months). |
| rupture discs (1550 psi) | BioRad | 1652331 | |
| stopping screens | BioRad | 1652336 | |
| macrocarrier holders | BioRad | 1652322 | |
| Biolistic particle delivery system | BioRad | PDS-1000/He | |
| sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | S9638 | Reagent for 1M sodium phosphate pH 7.2 |
| sodium phosphate dibasic | Sigma | S9763 | Reagent for 1M sodium phosphate pH 7.2 |
| 1M sodium phosphate pH 7.2 | home made | / | Combine 6.9 g of sodium phosphate monobasic monohydrate with 7.1 g of sodium phosphate dibasic. Add water to 100 mL. Add NaOH to get pH 7.2. |
| dithiothrietol (DTT) | Sigma | 43819 | Dissolve in water to 1 M. Store at -20° in 1 mL aliquots. |
| leupeptin | Sigma | L2884 | Dissolve in water to 10 mg/mL. Store at -20° C. |
| glycerol | Sigma | G5516 | Prepare a 50% solution in water. |
| Grinding Buffer | home made | / | Combine 10 mL of 1 M sodium phosphate pH 7.2, 500 μL of 1 M DTT, 100 μL of 10 mg/mL leupeptin, and 40 mL of 50% glycerol. Add water to 100 mL. |
| stainlesss steel beads (5 mm) | Qiagen | 69989 | |
| 2.0 mL tubes | Eppendorf | 22363352 | This specific model of tube is recommended for use with the homogenizer. |
| bead homogenizer (TissueLyser) | Qiagen | 85210 | |
| 12mm x 75 mm glass test tubes | Fisher | ||
| luciferin | Goldbio | LUCK-100 | Prepare a 25 mM stock solution and store 1 mL aliquots at -20° C. |
| ATP | Sigma | A7699 | Prepare a 100 mM stock solution and store 250 μL aliquots at -20° C. |
| Tris base | Sigma | T1503 | Reagent for 1M Tris sulfate pH 7.7. |
| sulfuric acid | Sigma | 258105 | Reagent for 1M Tris sulfate pH 7.7. |
| 1M Tris sulfate pH 7.7 | home made | / | Dissolve 12.1 g Tris base in 100 mL of water. Adjust pH to 7.7 with sulfuric acid. |
| magnesium chloride | Sigma | M9397 | Dissolve in water to 2 M. |
| Luciferase Assay Buffer (LAB) | home made | / | Combine 3 mL of 1 M Tris sulfate pH 7.7, 500 μL of 2 M magnesium chloride, 1 mL of 1 M DTT, and 200 μL of 0.5 M EDTA. Add water to 50 mL. |
| Luciferase Assay Mixture | home made | / | Combine 15 mL of LAB, 800 μL of 25 mM luciferin, 200 μL of 100 mM ATP, and 4 mL of water. This makes enough assay mixture (20 mL) for 100 luciferase assays. |
| luminometer (Sirius) | Berthold | / | |
| 4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide (MUG) | Goldbio | MUG1 | Dissolve in DMSO to 100 mM. |
| sodium azide | Sigma | S8032 | Prepare a 2% stock solution in water and store 1 mL aliquots at -20° C. |
| 96 well plates (standard) | Fisher | 12565501 | |
| GUS assay buffer | home made | / | Combine 2.5 mL of MUG, 5 mL of 1 M sodium phosphate pH 7.2, 400 μL of 0.5 M EDTA, 1 mL of 1 M DTT, 100 μL of 10 mg/ml leupeptin, 20 mL of methanol, and 1 mL of 2% sodium azide. Add water to 100 mL. |
| TempPlate sealing film | USA Scientific | 2921-1000 | |
| 96 well plates (black) | Costar | 3916 | |
| sodium carbonate | Sigma | S7795 | Prepare a 200 mM solution in water. |
| 4-methylumbelliferone | Sigma | M1381 | Prepare a 100 μM solution in water. Freeze 1 mL aliquots at -20° C. |
| microplate fluouresence reader | Bio-Tek | FLX-800 |
References
- Chen, K., An, Y. Q. C. Transcriptional responses to gibberellin and abscisic acid in barley aleurone. J. Integ. Plant Biol. 48, 591-612 (2006).
- Lanahan, M. B., Ho, T. H. D., Rogers, S. W., Rogers, J. C. A gibberellin response complex in cereal alpha-amylase gene promoters. Plant Cell. 4, 203-211 (1992).
- Shen, Q., Zhang, P., Ho, T. H. D. Modular nature of abscisic acid (ABA) response complexes; composite promoter units that are necessary and sufficient for ABA induction of gene expression. Plant Cell. 8, 1107-1119 (1996).
- Gómez-Cadenas, A., Zentella, R., Walker-Simmons, M. K., Ho, T. H. D. Gibberellin/abscisic acid antagonism in barley aleurone cells: site of action of the protein kinase PKABA1 in relation to gibberellin signaling molecules. Plant Cell. 13, 667-679 (2001).
- Johnson, R. R., Shin, M., Shen, J. Q. The wheat PKABA1-interacting factor TaABF1 mediates both abscisic acid-suppressed and abscisic acid-induced gene expression in bombarded aleurone cells. Plant Mol. Biol. 68, 93-103 (2008).
- Harris, L. J., Martinez, S. A., Keyser, B. R., Dyer, W. E., Johnson, R. R. Functional analysis of TaABF1 during abscisic acid and gibberellin signaling in aleurone cells of cereal grains. Seed Science Res. 23, 89-98 (2013).
- Shen, Q., Casaretto, J., Zhang, P., Ho, T. H. D. Functional definition of ABA-response complexes: the promoter units necessary and sufficient for ABA induction of gene expression in barley (Hordeum vulgare). Plant Mol. Biol. 54, 111-124 (2004).
- Ritchie, S., Gilroy, S. Abscisic acid signal transduction in the barley aleurone is mediated by phospholipase D activity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 2697-2702 (1998).
- Takemiya, A., Shimazaki, K. Phosphatidic acid inhibits blue light-induced stomatal opening via inhibition of protein phosphatase 1. Plant Physiol. 153, 1555-1562 (2010).
- Zou, X., Seeman, J. R., Neuman, D., Shen, Q. J. A WRKY gene from creosote bush encodes an activator of the abscisic acid signaling pathway. J. Biol. Chem. 279, 55770-55779 (2004).
- Ishibashi, Y., et al. Reactive oxygen species are involved in gibberellin/abscisic acid signaling in barley aleurone cells. Plant Physiol. 158, 1705-1714 (2012).
- Piskurewicz, U., et al. The gibberellic acid signaling repressor RGL2 inhibits Arabidopsis seed germination by stimulating abscisic acid synthesis and ABI5 activity. Plant Cell. 20, 2729-2745 (2008).
- Hong, J. Y., et al. Phosphorylation-mediated regulation of a rice ABA responsive element binding factor. Phytochemistry. 72, 27-36 (2011).
- Lopez-Molina, L., Mongrand, S., McLachlin, D. T., Chait, B. T., Chua, N. H. ABI5 acts downstream of ABI3 to execute an ABA-dependent growth arrest during germination. Plant J. 32, 317-328 (2002).
- Zhou, X., et al. SOS2-LIKE PROTEIN KINASE5, an SNF1-RELATED PROTEIN KINASE3-Type protein kinase, is important for abscisic acid responses in Arabidopsis through phosphorylation of ABSCISIC ACID-INSESENSITIVE5. Plant Physiol. 168, 659-676 (2015).
- Zong, W., et al. Feedback regulation of ABA signaling and biosynthesis by a bZIP transcription factor targets drought-resistance-related genes. Plant Physiol. 171, 2810-2825 (2016).
