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Cancer Research

दो आयामी जेल मानव पिट्यूटरी ग्रंथ्यर्बुद ऊतक Proteome के एक विश्लेषण के लिए जन स्पेक्ट्रोमेट्री तरीकों के साथ युग्मित ट्रो

Published: April 2, 2018 doi: 10.3791/56739
Automatic Translation
1,2,3,4, 1,2,3, 1,2,3
1Key Laboratory of Cancer Proteomics of Chinese Ministry of Health, Xiangya Hospital, Central South University, 2Hunan Engineering Laboratory for Structural Biology and Drug Design, Xiangya Hospital, Central South University, 3State Local Joint Engineering Laboratory for Anticancer Drugs, Xiangya Hospital, Central South University, 4The State Key Laboratory of Medical Genetics, Central South University

Summary

यहां, हम एक दो आयामी जेल ट्रो (2DE) मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) के साथ युग्मित करने के लिए अलग और मानव पिट्यूटरी ग्रंथ्यर्बुद ऊतक proteome, जो एक अच्छा और reproducible 2DE पैटर्न प्रस्तुत की पहचान पेश करते हैं । उच्च संवेदनशीलता एमएस के उपयोग के साथ जटिल कैंसर proteome का विश्लेषण करते समय कई प्रोटीन प्रत्येक 2DE स्थान में मनाया जाता है ।

Abstract

मानव पिट्यूटरी ग्रंथ्यर्बुद (फिलीस्तीनी अथॉरिटी) एक आम ट्यूमर है कि hypothalamus-पिट्यूटरी-लक्षित अंग अक्ष प्रणालियों में मानव पिट्यूटरी ग्रंथि में होता है, और या तो नैदानिक कार्यात्मक या गैर-क्रियात्मक PA (FPA और NFPA) के रूप में वर्गीकृत किया जा सकता है । NFPA जल्दी चरण निदान और FPA की तुलना में रक्त में मुश्किल से हार्मोन के कारण चिकित्सा के लिए मुश्किल है । हमारी लंबी अवधि के लक्ष्य के लिए प्रोटियोमिक् तरीकों का उपयोग करने के लिए फिलीस्तीनी अथॉरिटी आणविक तंत्र और प्रभावी नैदानिक, शकुन मार्करों और चिकित्सीय लक्ष्यों की मांयता के स्पष्टीकरण के लिए विश्वसनीय मार्क्स की खोज है । प्रभावी दो आयामी जेल ट्रो (2DE) बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) तरीकों के साथ युग्मित यहां मानव PA proteomes, नमूनों की तैयारी, 2d जेल ट्रो, प्रोटीन दृश्य, छवि विश्लेषण, जेल में शामिल करने का विश्लेषण करने के लिए प्रस्तुत किया गया trypsin पाचन, पेप्टाइड मास फिंगरप्रिंट (PMF), और मिलकर बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस/ 2-आयामी जेल ट्रो मैट्रिक्स असिस्टेड लेजर desorption/ionization मास स्पेक्ट्रोमेट्री PMF (2DE-मालदी ms PMF), 2DE-मालदी एमएस/ms, और 2DE-लिक्विड क्रोमैटोग्राफी (LC) ms/ms कार्यविधियाँ सफलतापूर्वक NFPA proteome के एक विश्लेषण में लागू किया गया है । एक उच्च संवेदनशीलता जन स्पेक्ट्रोमीटर के उपयोग के साथ, कई प्रोटीन जटिल पीए ऊतक के एक विश्लेषण में मानव PA proteome के कवरेज को अधिकतम करने के लिए प्रत्येक 2d जेल स्पॉट में 2DE-नियंत्रण रेखा के साथ एमएस/

Introduction

PA एक आम ट्यूमर है कि hypothalamus में मानव पिट्यूटरी ग्रंथि में होता है-पिट्यूटरी-लक्षित अंग अक्ष प्रणालियों, जो मानव अंत में स्रावी प्रणाली में महत्वपूर्ण भूमिका निभा. PA नैदानिक कार्यात्मक और क्रियात्मक क़दम (FPA और NFPA)1,2शामिल हैं । NFPA के प्रारंभिक चरण निदान और चिकित्सा में मुश्किल है क्योंकि केवल थोड़ा ऊंचा हार्मोन का स्तर (जैसे, LH, और FSH) रक्त में FPA की तुलना में, जो काफी वृद्धि हुई है रक्त में इसी हार्मोन का स्तर3,4 ,5. आणविक तंत्र और प्रभावी के निशान की खोज के स्पष्टीकरण निदान, चिकित्सा में महत्वपूर्ण नैदानिक महत्व है, और NFPA का पूर्वानुमान । हमारी दीर्घकालिक लक्ष्य को विकसित करने और proteomic तरीकों का उपयोग करने के लिए विश्वसनीय NFPA की खोज के लिए अपने आणविक तंत्र स्पष्ट करने के लिए अध्ययन है, और प्रभावी चिकित्सीय लक्ष्यों को पहचान के रूप में अच्छी तरह से नैदानिक और शकुन मार्करों । 2-डी एमएस तरीकों के साथ मिलकर बड़े पैमाने पर किया गया है हमारे दीर्घकालिक अनुसंधान मानव पीए proteome के बारे में कार्यक्रम1,2,6,7, proteome संदर्भ की स्थापना सहित मैप्स3,8, विभेदक व्यक्त प्रोटीन का विश्लेषण प्रोफाइल9,10,11,12,13, हार्मोन वेरिएंट14 ,15, पद-शोधों के संशोधनों जैसे फास्फारिलीकरण14 और tyrosine nitration16,17,18, इनवेसिव सापेक्ष के proteomic रूपांतर इनवेसिव NFPAs19, और NFPA उपप्रकार के proteomic विविधता13, जो कई महत्वपूर्ण मार्ग नेटवर्क की खोज के लिए नेतृत्व (mitochondrial शिथिलता, कोशिका चक्र dysregulation, ऑक्सीडेटिव तनाव, और MAPK संकेतन प्रणाली विषमता) है कि NFPA13,19,20में बदल रहे हैं ।

2DE प्रोटीन को उनके isoelectric पॉइंट (pI) (isoelectric focusing, आईईएफ) और आणविक भार के अनुसार अलग करता है (सोडियम dodecyl सल्फेट polyacrylamide जेल ट्रो, एसडीएस-PAGE)1,2,3, 4 , 5 , ६ , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23. यह प्रोटियोमिक् के क्षेत्र में एक आम और शास्त्रीय पृथक्करण तकनीक है, 1995 में proteome और प्रोटियोमिक् की अवधारणाओं की शुरूआत के बाद से24। एमएस PMF और एमएस सहित 2DE-अलग प्रोटीन की पहचान, बाहर खोजने के लिए महत्वपूर्ण तकनीक है/ विशेष रूप से पता लगाने संवेदनशीलता और संकल्प के पहलुओं में एमएस इंस्ट्रूमेंट्स के बहुत तेजी से विकास, नियंत्रण रेखा प्रणाली के सुधार के साथ संयोजन में, बहुत कम या बहुत कम बहुतायत में प्रोटीन की पहचान में सुधार एक proteome को अधिकतम करने के लिए एक proteome की कवरेज । यह भी हमारे पारंपरिक अवधारणाओं कि केवल एक या दो प्रोटीन जटिल मानव ऊतक proteome के एक विश्लेषण में एक 2d जेल स्थान में मौजूद है और एक जटिल मानव ऊतक के एक विश्लेषण में एक 2d जेल स्थान में कई प्रोटीन की पहचान करने का अवसर प्रदान करता है चुनौतियों proteome और NFPA proteome के कवरेज को अधिकतम ।

यहां हम 2DE के विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन-मालदी ms PMF, 2DE-मालदी एमएस/ms, और 2DE-LC-ms/ms जो सफलतापूर्वक मानव NFPA proteome के विश्लेषण में इस्तेमाल किया गया है । प्रोटोकॉल नमूनों की तैयारी में शामिल हैं, पहले आयाम (isoelectric ध्यान केंद्रित, आईईएफ), दूसरा आयाम (एसडीएस-पृष्ठ), प्रोटीन के दृश्य (रजत धुंधला और Coomassie नीले दाग), 2d जेल की छवि विश्लेषण, जेल trypsin पाचन में, tryptic पेप्टाइड्स, PMF, एमएस/ms, और3,8,25,26को भेदने डाटाबेस का शुद्धिकरण । इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल आसानी से अंय मानव ऊतक proteomes के विश्लेषण के लिए अनुवाद ।

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Protocol

वर्तमान प्रोटोकॉल मध्य दक्षिण विश्वविद्यालय, चीन के Xiangya अस्पताल चिकित्सा आचार समिति के दिशा निर्देशों का पालन करता है । एक सिर टोपी और दस्ताने पूरे प्रयोगात्मक प्रक्रिया के लिए पहना जाना चाहिए त्वचा और बाल8से केरातिन संदूषण से बचने के लिए ।

1. नमूनों की तैयारी

  1. तंत्रिकाशल्यक विभाग से पीए ऊतकों (0.2-0.5 मिलीग्राम) ले लीजिए । तुरंत तरल नाइट्रोजन में फ्रीज, और फिर भंडारण के लिए-80 डिग्री सेल्सियस के लिए स्थानांतरण ।
  2. NaCl आसुत जल (ddH2O) में 0.9% की 2 मिलीलीटर जोड़ें । ऊतकों की सतह (3x) से खून को हल्के से धोने के लिए इस घोल का प्रयोग करें ।
    नोट: ddH2O की एक चालकता के साथ 18.2 MΩ/ tissuemight के कुछ खो दिया है जब एक ऊतक की सतह से खून धोने ।
  3. कोई वॉल्यूम जोड़ें (10 mL; 4 ° c) 2 M एसिटिक अम्ल और 0.1% (v/v) युक्त समाधान के β-mercaptoethanol ऊतक के हर 0.5-0.6 जी के लिए, homogenize (1 मिनट, 13,000 rpm, 4 डिग्री सेल्सियस, 10x) एक ऊतक homogenizer के साथ, sonicate के लिए homogenate 20 एस, lyophilize , और − 80 ° c पर स्टोर करें ।
  4. lyophilized, homogenized bicinchoninic एसिड (बीसीए) परख किट का उपयोग कर नमूने के प्रोटीन सामग्री को मापने ।
    नोट: बीसीए ठहराव एक निरपेक्ष ठहराव नहीं है, और मापा परिणाम एक अलग तकनीशियन और प्रयोगात्मक एजेंट के साथ बदल जाएगा. एक निश्चित एकाग्रता नमूना मानक विभिन्न प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए. इसलिए, प्रत्येक 2d जेल के लिए प्रोटीन के अंतिम लोड हो रहा है राशि चांदी के साथ निर्धारित किया जाएगा दाग या Coomassie-पूर्व डिजाइन प्रयोगों में दाग अच्छा संकल्प छवि ।
    1. एक मात्रा (282 µ एल) प्रोटीन निकालने बफर के lyophilized homogenized नमूना के बारे में 300 µ जी जोड़ें (8 एम यूरिया और 4% लोग), 2 ज, 5 मिनट के लिए एक पानी के स्नान में sonicating के लिए खड़े द्वारा पीछा किया, 1 ज के लिए घूर्णन, 5 मिनट के लिए पानी के स्नान में फिर से sonicating , 1 घंटे के लिए फिर से घूर्णन, और 20 मिनट के लिए 15,000 x जी में केंद्रापसारक ।
    2. उल्लेख के रूप में सांद्रता के साथ BSA मानक समाधान तैयार: 0, 25, 125, 250, 500, 750, 1,500, 2,000 µ g/एमएल वाणिज्यिक BSA मानक (2 मिलीग्राम/एमएल) के साथ ।
    3. बीसीए रिएजेंट ए और बी (A:B = 50:1) का उपयोग करने से पहले काम कर समाधान बीसीए के रूप में मिक्स ।
    4. नमूना या एक microfuge ट्यूब में बीसीए काम कर समाधान के 2 मिलीलीटर के लिए मानक समाधान के 0.1 मिलीलीटर जोड़ें, मिश्रण के बाद और फिर 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए मशीनिंग । अंत में 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर शांत और एक562 एनएम ओडी मूल्य उपाय ।
    5. एक562nm मूल्य के साथ नमूना प्रोटीन सामग्री की गणना के लिए एक प्रतीपगमन समीकरण प्राप्त करने के लिए मानक रेखीय रेखा (एक562 एनएम बनाम BSA एकाग्रता) की गणना करें ।
  5. चांदी के दाग के लिए प्रोटीन समकक्ष lyophilized नमूना के 150 µ जी, या Coomassie धुंधला के लिए प्रोटीन के 500 µ जी का प्रयोग करें, एक 18 सेमी मैटीरियल पीएच ढाल (IPG) पट्टी पीएच 3-10 रैखिक (NL) के लिए ।
    नोट: IPG सूखी पट्टी 0.5 मिमी मोटी और 3 मिमी चौड़ा है, 7, 11, 13, 18, और 24 सेमी सहित विभिंन लंबाई के साथ, और पीएच 4-5, 4, 6-9, और 3-10 सहित अलग पीएच पर्वतमाला में या तो एक रैखिक या गैर रेखीय पीएच ढाल । इस्तेमाल किया IPG बफर पट्टी27,28फिट होना चाहिए ।
  6. 1.6. जोड़ने बफर के 250 µ एल जोड़ें (7 एम यूरिया, 2 एम thiourea, 4% (डब्ल्यू/वी) लोग, 100 मिमी डीटीटी (उपयोग करने के लिए पहले जोड़ें), 0.5% v/v pharmalyte (पहले उपयोग करने के लिए जोड़ें), और bromophenol नीला का पता लगाएं) ।
  7. 30 डिग्री सेल्सियस के नीचे समाधान रखें, 5 मिनट के लिए sonicating, 5 मिनट के लिए भंवर के बाद, और 50 मिनट के लिए घूर्णन ।
  8. निर्जलीकरण बफर के 110 µ एल जोड़ें (7 एम यूरिया, 2 एम thiourea, 4% (डब्ल्यू/वी) लोग, 60 मिमी डीटीटी (प्रयोग करने से पहले जोड़ें), 0.5% वी/वी IPG बफर (प्रयोग करने से पहले जोड़ें), और bromophenol नीले रंग का पता लगाने) । 5 मिनट के लिए Sonicate । तो 50 मिनट, भंवर के लिए 5 मिनट के लिए नमूना घुमाएं, और 15,000 x जी में 20 मिनट के लिए केंद्रापसारक
  9. supernatant (350 µ एल) के रूप में ले लीजिए प्रोटीन नमूना समाधान8।

2. दो आयामी जेल ट्रो

  1. आईईएफ (पहला आयाम): isoelectric ध्यान केंद्रित प्रणाली पर आईईएफ प्रदर्शन के रूप में नीचे वर्णित है ।
    1. एक 18 सेमी IPG स्ट्रिप धारक के स्लॉट में प्रोटीन नमूना समाधान के 350 µ एल जोड़ें ।
    2. एक 18 सेमी IPG पट्टी जेल-पक्ष-नीचे प्रोटीन नमूना समाधान पर रखो (बुलबुले से बचें) ।
    3. IPG पट्टी को कवर करने के लिए खनिज तेल की 3-4 मिलीलीटर जोड़ें ।
    4. isoelectric में IPG स्ट्रिप धारक को इकट्ठा systemwith पर ध्यान केंद्रित अंत (+) प्लेट और सामने (−) प्लेट पर वर्गाकार छोर ।
    5. रात भर हाइड्रेट (~ कमरे के तापमान पर 18 घंटे) ।
    6. आईईएफ पैरामीटर सेट करें: अधिकतम वर्तमान 30 µA प्रति पट्टी, 20 डिग्री सेल्सियस; २५० वी, १ एच, १२५ Vh, स्टेप एंड होल्ड; 1,000 वी, 1 ज, 500 Vh, ढाल; 8,000 V, 1 ज, 4,000 Vh, ढाल; 8,000 वी, 4 एच, 32,000 Vh, कदम और पकड़; और 500 वी, 0.5 एच, 250 Vh, स्टेप और होल्ड करें । इसे 7.5 h और ३६,८७५ Vh के कुल समय तक चलाते रहने दें ।
    7. आईईएफ के बाद, एक IPG पट्टी बाहर ले और एक अघुलनशील कागज तौलिया के साथ अतिरिक्त खनिज तेल हटा दें । अब प्लास्टिक की चादर की चादर में पट्टी लपेट लें, और − 80 ° c पर स्टोर करें ।
      नोट: IPGstrip धारक IPGstrip धारक सफाई समाधान और आसुत जल के साथ साफ किया जाना चाहिए ।
  2. एसडीएस-पृष्ठ (दूसरा आयाम): किसी अनुलंब कक्ष ट्रो सिस्टम में एसडीएस-पृष्ठ निष्पादित करें
    नोट: प्रत्येक एसडीएस-पृष्ठ जेल का आकार 255 x 190 x 1 मिमी होना चाहिए ।
    1. 12% पृष्ठ संपति जैल कास्ट करने के लिए एक बहु जेल कास्टर का उपयोग करें । 12% पृष्ठ जैल कास्टिंग के लिए, निम्न चरणों का पालन करें ।
      1. इसमें 270 एमएल का ddH2ओ, 150 एमएल का 1.5 मीटर Tris-एचसीएल (pH 8.8), 180 मिलीलीटर की 40% (w/v) acrylamide/bisacrylamide स्टॉक समाधान (29:1, 40% w/v acrylamide और 1.38% w/v N, N'-methylenebisacrylamide), 10% अमोनियम persulfate की 3 मिलीलीटर, और µ के 150 TEMED l को जेल बनाने के लिए एक चोंच में हल । धीरे मिश्रण और बुलबुले से बचें ।
      2. जेल समाधान धीरे से मल्टिकास्ट कक्ष में करने के लिए अपेक्षित जेल ऊंचाई (19 सेमी) डालो ।
      3. तुरंत जैल कवर करने के लिए प्रत्येक संपति जेल पर लगभग 3 मिलीलीटर ddH2हे जोड़ें । के बारे में 1 ज के लिए जेल polymerize चलो ।
    2. ट्रो बफर के 20 एल तैयार (25 मिमी Tris, 192 मिमी ग्लिसरीन, और 0.1% एसडीएस). इस बफ़र के साथ ट्रो पृथक्करण इकाई बफ़र टैंक भरें ।
    3. फ्रीजर से ध्यान केंद्रित IPG स्ट्रिप्स बाहर ले लो, और धीरे संतुलन बफर को कम करने के 4 मिलीलीटर (375 mM Tris-एचसीएल (पीएच 8.8) में कमाल करके 10 मिनट के लिए स्ट्रिप्स equilibrate, 6 M यूरिया, 2% (w/v) एसडीएस, 20% (v/v) ग्लिसरॉल, 2% w/v डीटीटी (उपयोग करने के लिए पहले जोड़ें) , और bromophenol नीला का एक निशान) ।
    4. Equilibrate 10 मिनट के लिए धीरे से 4 मिलीलीटर alkylation संतुलन बफर (375 मिमी Tris-एचसीएल (पीएच 8.8) में कम IPG स्ट्रिप्स का घोड़ा, 6 M यूरिया, 2% (w/v) एसडीएस, 20% (v/v) ग्लिसरॉल, 2.5% w/v iodoacetamide (पहले उपयोग करने के लिए जोड़ें), और bromophenol नीला का पता लगाएं) ।
    5. जेल संतुलन के दौरान, मल्टिकास्ट चैंबर जुदा है, और बाहर तैयार संपति जेल कैसेट ले । ddH के साथ 3x कुल्ला2हे एक अघुलनशील कागज तौलिया के साथ अतिरिक्त ddH2हे निकालें, और एक जेल स्टैंडर में डाल दिया ।
    6. ट्रो बफर के साथ equilibrated IPG स्ट्रिप्स कुल्ला, और अघुलनशील पेपर तौलिया के साथ IPG पट्टी सतह पर अतिरिक्त तरल निकालें ।
    7. संपति एसडीएस-पृष्ठ जेल पर एक IPG पट्टी रखो, और IPG पट्टी के प्लास्टिक की ओर अब कांच की थाली से संपर्क करें और छोड़ दिया करने के लिए कहा अंत करते हैं ।
    8. एसडीएस ट्रो बफर (~ 80 डिग्री सेल्सियस) में गर्म 1% agarose के 3-4 मिलीलीटर डालो जल्दी से प्रत्येक एसडीएस-पृष्ठ जेल के शीर्ष पर IPG पट्टी सील करने के लिए, और ऊपर की ओर IPG पट्टी के नीचे छोटे कांच की थाली के शीर्ष करने के लिए बुलबुले के बिना डाल दिया, और फिर polymerize 10 मिनट के लिए ।
    9. इकट्ठे जेल कैसेट कार्यक्षेत्र ट्रो प्रणाली में प्लास्टिक गैसकेट के बीच खड़ी डालें । कैथोड (−) के बगल में IPG पट्टी के साथ जेल के ऊपर रखो ।
    10. जेल कैसेट विसर्जित करने के लिए ट्रो बफर के स्तर को समायोजित करें ।
    11. कनेक्ट और स्थिर वोल्टेज मोड में बिजली की आपूर्ति/नियंत्रण इकाई सेट, और डाई की निगरानी करते हुए के बारे में 370 मिनट के लिए 200 वी में चलाते हैं ।
    12. चलाने के बाद, बाहर ट्रो प्रणाली से जेल कैसेट ले, और धीरे जेल कैसेट से जेल हटाने, जेल फाड़ से बचने, 2DE के दाग से अलग प्रोटीन के बाद ।
  3. 2DE के दाग-अलग प्रोटीन
    1. चांदी धुंधला
      1. धीरे जेल निर्धारण समाधान (50% मेथनॉल (वी/वी) और 5% (v/v) एसिटिक एसिड) के 250 मिलीलीटर युक्त एक ट्रे में दो हाथों से स्थानांतरित, और धीरे से 20 मिनट के लिए जेल हिला ।
      2. समाधान त्यागें और ट्रे में 50% (v/v) मेथनॉल के 250 मिलीलीटर जोड़ें और धीरे से 10 मिनट के लिए हिला ।
      3. मेथनॉल त्यागें और ट्रे में ddH2के 250 मिलीलीटर जोड़ें । 10 मिनट के लिए धीरे से हिला ।
      4. धीरे से संवेदीकरण बफर के 250 मिलीलीटर में 1 मिनट के लिए जेल हिला 0.02% (डब्ल्यू/वी) सोडियम thiosulfate युक्त, और तरल त्यागें ।
      5. धीरे 1 मिनट के लिए ddH2O के 250 मिलीलीटर में जेल हिला (एक और समय दोहराएं) । प्रत्येक चरण के बाद लिक्विड को छोड़ें.
      6. धीरे से 250 मिलीलीटर चांदी प्रतिक्रिया समाधान में 20 मिनट के लिए जेल हिला (0.1% (डब्ल्यू/वी) 200 µ l 37% (v/v) formaldehyde के साथ रजत नाइट्रेट का उपयोग करने से पहले जोड़ा) ।
      7. धीरे 1 मिनट के लिए ddH2O के 250 मिलीलीटर में जेल हिला (एक और समय दोहराएं) । प्रत्येक चरण के बाद लिक्विड को छोड़ें.
      8. हिला जेल धीरे 250 मिलीलीटर विकास समाधान में (3% (डब्ल्यू/वी) सोडियम कार्बोनेट 100 µ l 37% के साथ (v/formaldehyde पहले का उपयोग करने के लिए जोड़ा) जब तक दाग की वांछित तीव्रता प्राप्त (सामांयतः 1-3 मिनट) है, तो तरल त्यागें ।
      9. धीरे से 250 मिलीलीटर में 10 मिनट के लिए जेल हिला समाधान रोक (5% (v/v) एसिटिक एसिड) और तरल त्यागें ।
      10. धीरे ddH2O के 250 मिलीलीटर में 5 मिनट के लिए शेक और तरल त्यागें ।
      11. 250 मिलीलीटर में जेल रखें 4 डिग्री सेल्सियस पर 8.8% ग्लिसरॉल के समाधान भंडारण ।
    2. Coomassie खूब नीला दाग
      1. Coomassie शानदार नीले G250 0.3 g, अमोनियम सल्फेट 25 ग्राम, और फास्फोरस एसिड 25 ddH2हे में और 200 मिलीलीटर की कुल मात्रा तक को भंग करके समाधान Coomassie तैयार करें । उपयोग करने से पहले, मेथनॉल 50 मिलीलीटर जोड़ें ।
      2. जेल के लिए Coomassie धुंधला समाधान के 250 मिलीलीटर जोड़ें और धीरे से कमरे के तापमान पर हिला जब तक स्पष्ट प्रोटीन धब्बे (~ 2-4 एच) दिखाई देते हैं । तरल त्यागें ।
      3. ddH के 250 मिलीलीटर जोड़ें2O और धीरे से 5 मिनट के लिए हिला, तो दो बार और अधिक । तरल त्यागें ।
      4. भंग समाधान (20% (v/v) इथेनॉल के 250 मिलीलीटर जोड़ें) और धीरे हिला जब तक पृष्ठभूमि का रंग लगभग बेरंग हो, और तरल त्यागें ।
      5. ताजा दाग समाधान के साथ बदलें जब पुराने एक अंधेरा हो रही है, और तरल त्यागें ।
      6. ddH2O की 250 मिलीलीटर जोड़ें और 5 मिनट के लिए धीरे से हिलाएं । तरल त्यागें ।
      7. समाधान भंडारण के 250 मिलीलीटर जोड़ें (8.8% ग्लिसरॉल) और 4 डिग्री सेल्सियस पर रहते हैं ।
  4. दो आयामी जेल ट्रो छवि विश्लेषण
    1. एक flatbed स्कैनर के साथ दाग जैल डिजिटलीकरण ।
    2. इनपुट 2d जेल छवि विश्लेषण प्रणाली में छवि ।
    3. का पता लगाने और प्रत्येक जगह एक 2d जेल छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार का उपयोग कर लगाता है ।
    4. अलग जैल के बीच स्पॉट मैच ।

3. एमएस के साथ 2DE-अलग प्रोटीन की पहचान

  1. tryptic पेप्टाइड मिश्रण की तैयारी
    नोट: सिलिकॉन या कम प्रतिधारण ट्यूबों और पिपेट सुझावों के लिए प्रोटीन या पेप्टाइड्स के किसी भी नुकसान से बचने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए ।
    1. रजत-जेल का दाग
      1. एक 1.5 मिलीलीटर सिलिकॉन में जेल स्पॉट एक्साइज, और 500 µ एल ddH में धो लें2O 6 बार ।
      2. एक नया 1.5 मिलीलीटर सिलिकॉन ट्यूब में धोया जेल रखो, और यह कई छोटे टुकड़ों में कीमा (0.5-1 मिमी3) ।
      3. दाग है कि 30 मिमी पोटेशियम ferricyanide का एक हिस्सा घोला जा सकता है और 100 मिमी सोडियम thiosulfate (1:1) के एक भाग को भूरा रंग गायब होने के लिए उपयोग करने से पहले (आमतौर पर 1-2 मिनट) धुंधलाना समाधान के 20 µ एल में जेल टुकड़े दाग । तरल त्यागें ।
      4. जेल के टुकड़ों को ddH के 20 µ l के साथ धो कर2O 5-6 बार पीला रंग गायब होने दें । प्रत्येक चरण के बाद लिक्विड को छोड़ें.
      5. जेल टुकड़े करने के लिए 200 मिमी अमोनियम बिकारबोनिट के 20 µ एल जोड़ें, और 20 मिनट के लिए रहने के लिए ddH के साथ जेल टुकड़े धो लें2O (20 µ l, 1 समय) । तरल त्यागें ।
      6. निर्जलीकरण 30 µ एल acetonitrile के साथ जेल टुकड़े करने के लिए दो बार जेल टुकड़े एक अपारदर्शी सफेद बारी है, और निर्वात-30 मिनट के लिए सूखी केंद्रापसारक ।
    2. Coomassie शानदार ब्लू जेल धुंधला
      1. एक 1.5 मिलीलीटर सिलिकॉन ट्यूब में कटौती जेल स्पॉट और 500 µ l ddH2O के साथ कम से धो 3 बार ।
      2. एक नया 1.5 मिलीलीटर सिलिकॉन में धोया जेल रखो, और यह कई टुकड़ों में कीमा (0.5-1 mm3) एक पिपेट टिप के साथ ।
      3. जेल में दाग-कैलरी µ l धुंधला समाधान (1:1 v/v मिश्रण 200 mM NH4HCO3 विथ acetonitrile) जेल की मात्रा पर निर्भर करता है, एक पानी के स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस पर मशीन । दोहराएं और रंग गायब हो जाता है जब तक नए सिरे से धुंधला समाधान जोड़ें (~ 1 h) । प्रत्येक चरण के बाद लिक्विड को छोड़ें.
      4. ddH2O के 20 µ l के साथ एक बार जेल के टुकड़े धो लें ।
      5. निर्जलीकरण जेल टुकड़े एक अपारदर्शी सफेद बारी करने के लिए 100 µ l acetonitrile में (कम से कम दो बार) ।
      6. 30 मिनट के लिए वैक्यूम सूखी ।
    3. जेल में trypsin सूखे जेल के टुकड़ों में प्रोटीन का पाचन
      1. भंग 20 µ जी (833 pmol) के 100 µ l में lyophilized trypsin पाउडर का 50 एमएम एसिटिक एसिड होता है ।
      2. trypsin समाधान के 20 µ एल पतला (200 एनजी/µ एल) के लिए 16 एनजी/µ l के साथ 230 µ एल के 50 मिमी अमोनियम बिकारबोनिट.
      3. सूखे जेल टुकड़े युक्त प्रत्येक ट्यूब के लिए पतला trypsin समाधान के 20-30 µ एल (0.32-0.48 µ जी) जोड़ें । पानी के स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस में 18-20 ज के लिए मशीन । 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर समाधान खड़े हो जाओ ।
      4. 30 डिग्री सेल्सियस पर 5-6 मिनट के लिए एक पानी के स्नान में 10 एस Sonicate के लिए धीरे समाधान केंद्रापसारक और फिर 2 मिनट के लिए 12,000 x जी में केंद्रापसारक ।
      5. एक 0.5 मिलीलीटर सिलिकॉन ट्यूब में tryptic पेप्टाइड मिश्रण युक्त supernatant लीजिए ।
    4. C18 microcolumn के साथ tryptic पेप्टाइड मिश्रण का शुद्धिकरण.
      1. प्रत्येक C18 कॉलम को acetonitrile के साथ धोएं (10 µ l, 5 बार), और फिर 50% acetonitrile (10 µ l, 5 बार) के साथ ।
      2. 0.1% trifluoro एसिटिक अम्ल (TFA) (10 µ l, 5 बार) के साथ Equilibrate ।
      3. पिपेट नमूना तैयार C18 कॉलम के माध्यम से 15 बार के लिए ऊपर और नीचे ।
      4. 10 µ एल 0.1% TFA के साथ नमूना 2x धो लो ।
        नोट: शुद्ध tryptic पेप्टाइड्स C18 स्तंभ में बनाए रखे जाते हैं ।
      5. (6 µ l) समाधान का कोई खंड जोड़ें (85% v/v acetonitrile/0.1% v/v प्रपत्र अंल) एक साफ 0.5 मिलीलीटर सिलिकॉन में ट्यूब, पिपेट इस समाधान धीरे और धीरे ऊपर और नीचे के माध्यम से पेप्टाइड-C18 मोतियों के लिए 10x के समाधान में बांड पेप्टाइड्स धोने के लिए, हवा सूखी , और एमएस विश्लेषण के लिए स्टोर (− 20 डिग्री सेल्सियस) ।
  2. एमएस विश्लेषण
    1. मालदी-MS PMF विश्लेषण
      1. शुद्ध tryptic पेप्टाइड मिश्रण को भंग करने के लिए 85% v/v acetonitrile/0.1% v/v TFA के 4 µ l जोड़ें । लोड 2 µ एल एक मालदी प्लेट पर tryptic पेप्टाइड मिश्रण भंग और तुरंत а के 2 µ एल जोड़ने-cyano-4-hydroxycinnamic एसिड (CHCA) समाधान है कि 500 मिलीलीटर में 10 ग्राम/l शामिल हैं/l acetonitrile 1 मिलीलीटर/l TFA, फिर हवा-सूखा.
      2. एक मालदी-MS मास स्पेक्ट्रोमीटर में tryptic पेप्टाइड मिश्रण के साथ मालदी प्लेट लोड ।
        नोट: साधन मापदंडों 20 केवी तेजी वोल्टेज, सकारात्मक ध्रुवीकरण, और 160 एनएस देरी निष्कर्षण समय के साथ रिफ्लेक्टर मोड के रूप में सेट कर रहे हैं । प्रत्येक एमएस स्पेक्ट्रम मानक पेप्टाइड मास के साथ बाहरी अंशांकन के बाद एम/जेड 1,000 से 4,000 की एक सीमा के साथ 200 लेजर शॉट्स के साथ अधिग्रहण कर लिया है ।
      3. एक एमएस स्पेक्ट्रम प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें आधारभूत सुधार, शोर हटाने (5%), और पीक deisotoping सहित प्रत्येक एमएस स्पेक्ट्रम, प्रक्रिया ।
      4. trypsin, मैट्रिक्स, keratins से दूषित जनता को हटाने के साथ प्रत्येक एमएस स्पेक्ट्रम से जन सूची सही, और खाली जेल प्रयोगों के समानांतर में अन्य अज्ञात दूषित पदार्थों.
      5. एक PMF में सही जन सूची इनपुट आधारित प्रोटीन खोज सॉफ्टवेयर स्विस में प्रोटीन की पहचान करने के लिए Prot प्रोटीन डाटाबेस के साथ निंनलिखित खोज मानकों के साथ, PMF खोज प्रकार, मानव सहित, trypsin 1 अधिकतम याद दरार के साथ, फिक्स्ड carbamidomethyl cysteine, चर methionine ऑक्सीकरण, monoisotopic, पेप्टाइड जन सहिष्णुता 50 पीपीएम, पेप्टाइड प्रभारी राज्य (1 +), और शोर करने के लिए संकेत (S/
      6. सांख्यिकीय महत्वपूर्ण प्रोटीन स्कोर के साथ प्रोटीन की पहचान, और जहां प्रोटीन स्कोर =-10 × प्रवेश करें (पी), जहां p संभावना है कि मनाया मैच एक यादृच्छिक घटना है ।
    2. मालदी-ms/एमएस विश्लेषण
      1. शुद्ध tryptic पेप्टाइड मिश्रण को भंग करने के लिए 50% v/v acetonitrile/0.1% v/v TFA के 4 µ l जोड़ें । प्रत्येक शुद्ध tryptic पेप्टाइड मिश्रण (0.5 µ एल) एक 384-अच्छी तरह से मालदी प्लेट पर देखा गया था, तुरंत पेप्टाइड नमूने के शीर्ष पर 50% CHCA में संतृप्त acetonitrile मैट्रिक्स के 0.5 µ l देखा, और फिर हवा में सूख गया ।
      2. चलो मालदी-तोफ-तोफ ms/ms स्वचालित रूप से प्रबंधित किया जा करने के लिए, एक MS1 स्पेक्ट्रम प्राप्त करने के लिए 100 लेज़र शॉट्स का उपयोग कर, और एक सिंथेटिक MS1 स्पेक्ट्रम में 6 दोहराया MS1 स्पेक्ट्रा जमते ।
      3. एमएस/एमएस विश्लेषण के लिए प्रत्येक सिंथेटिक MS1 स्पेक्ट्रम से 4 सबसे तीव्र अग्रदूत आयनों सेट. एक एमएस/एमएस स्पेक्ट्रम प्राप्त करने के लिए प्रत्येक अग्रदूत आयन के लिए 100 लेजर शॉट्स का प्रयोग करें, और एक सिंथेटिक एमएस में 4 बार एमएस/ms स्पेक्ट्रा जमा/
      4. एमएस/ms आयन खोज, स्विस-Prot मानव डाटाबेस, 1 की एक अधिकतम के साथ trypsin के साथ सॉफ्टवेयर खोज के माध्यम से प्रोटीन के लिए खोज करने के लिए सिंथेटिक एमएस/ms डेटा का प्रयोग करें/ms Ion research, फिक्स्ड carbamidomethyl (सी), चर ऑक्सीकरण (एम), monoisotopic जन मूल्य, पेप्टाइड जन सहिष्णुता ± 100 पीपीएम, और टुकड़ा जन सहिष्णुता ± 0.7 डा.
      5. Mowse स्कोर के आधार पर एक सांख्यिकीय महत्वपूर्ण संभावना के साथ एक प्रोटीन की पहचान करें, और आयनों स्कोर =-10 एक्स लॉग (पी), जहां p संभावना है कि मनाया मैच एक यादृच्छिक घटना है ।
    3. LC-ईएसआई-ms/
      1. 6 µ l को 5% v/v acetonitrile/0.1% v/v former अम्ल को शुद्ध tryptic पेप्टाइड मिश्रण को भंग करने के लिए जोड़ें ।
      2. एक उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (HPLC) एक electrospray ionization के साथ ऑनलाइन युग्मित प्रणाली का प्रयोग करें (ईएसआई)-एमएस/ms जन स्पेक्ट्रोमीटर के साथ एक एमएस/
      3. C18 ट्रैप कॉलम का प्रयोग करें (300 µm आईडी × 5 मिमी लंबाई), और रिवर्स चरण C18 कॉलम (75 µm आईडी x 15 सेमी लंबाई) पर एक जुदाई ढाल के साथ 98% विलायक एक (0.1% फार्मिक एसिड) और 2% विलायक बी (100% acetonitrile में 0.1% फार्मिक एसिड) 2 मिनट के लिए , 2% से 40% विलायक बी के लिए 45 मिनट, 40% के लिए 95% विलायक बी के लिए 5 मिनट, और 95% विलायक बी 10 मिनट के लिए (300 nL पर 65 मिनट की कुल/
      4. सेट सकारात्मक आयन मोड और डेटा पर निर्भर स्वत: सर्वेक्षण मोड एमएस और एमएस/ms स्पेक्ट्रा प्राप्त करने के लिए, और सेट टक्कर प्रेरित पृथक्करण (सीआईडी) आयन विखंडन के लिए ।
      5. एम के एक बड़े पैमाने पर रेंज के लिए एक एमएस स्कैन सेट/जेड 350-1800 पर 100,000 के एक संकल्प के साथ एम/ एमएस स्कैन में 7 सबसे तीव्र आयनों के लिए स्कैन करते हैं ।
      6. उपयोग एमएस/ms-आधारित प्रोटीन खोज सॉफ्टवेयर मैं प्रोटीन की पहचान के लिए डेटाबेस खोज करने के लिए ।
        1. मानव प्रोटीन डाटाबेस का चयन करें ।
        2. एक याद दरार साइट की अनुमति के साथ trypsin का चयन करें ।
        3. सेट पेप्टाइड सहनशीलता (± 10 पीपीएम), टुकड़ा आयन सहिष्णुता (± 0.8 दा), पेप्टाइड चार्ज (2 +, 3 +, और 4 +), cysteine पर फिक्स्ड carbamidomethylation, और methionine पर चर ऑक्सीकरण ।
        4. गलत खोज दर (एफडीआर) < 1% सेट करें, और केवल रैंक 1 के साथ पेप्टाइड्स को स्वीकार किया जाता है ।
        5. PSM ≥ 1 के साथ प्रोटीन की पहचान करें (PSMs: प्रोटीन के लिए पहचाने गए पेप्टाइड अनुक्रम (PSMs) की कुल संख्या, जिनमें अनावश्यक रूप से पहचान की जाती है) और प्रोटीन के अनुसार कम से दो अद्वितीय पेप्टाइड.
      7. इसके अलावा, प्रोटीन की पहचान के लिए डेटाबेस खोज करने के लिए एमएस/ms-आधारित प्रोटीन खोज सॉफ्टवेयर द्वितीय का उपयोग करें ।
        1. रॉ MS फ़ाइल को एक. mgf फ़ाइल में कनवर्ट करें ।
        2. मानव प्रोटीन डाटाबेस (uniprothuman_20161031. फसता जो ७०९४० दृश्यों और २३८९७०४७ अवशेषों शामिल है) का चयन किया ।
        3. 2 याद दरारें की एक अधिकतम के साथ trypsin पाचन का चयन करें ।
        4. निर्धारित carbamidomethyl (सी), चर deamidated (NQ) और ऑक्सीकरण (एम), अग्रदूत आयन जन सहिष्णुता 10 पीपीएम, बेटी आयन जन सहनशीलता 0.8 दा, और monoisotopic चोटी सेट करें ।
        5. एक महत्व सीमा के साथ 0.05 और कम से कम 2 अद्वितीय पेप्टाइड्स प्रोटीन की पहचान करें ।

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Representative Results

1. 2DE-मालदी MS PMF: प्रयोगात्मक प्रक्रिया के ऊपर वर्णित के साथ, 150 µ ग्राम प्रोटीन की कुल FSH-व्यक्त NFPA ऊतकों (महिला से निकाले गए थे; 50 साल की उम्र, ACTH (-), GH (-), PRL (-), LH (-), FSH (+), और टीएसएच (-)) और एक 18 सेमी के साथ सरणी IPG पट्टी (पीएच 3-10 NL) और एक बड़े प्रारूप एसडीएस-पृष्ठ जेल, तो चांदी धुंधला के साथ visualized । हम NFPA ऊतक proteome के एक reproducible और अच्छा 2DE जेल पैटर्न प्राप्त (चित्रा 1), आईईएफ दिशा में १.९८ ± 0.75 मिमी की एक औसत स्थान विचलन और एसडीएस पृष्ठ की दिशा में १.६२ ± ०.६८ मिमी के साथ, और एक लगभग 1,200 प्रोटीन स्पॉट के साथ 2DE जेल के नक्शे में पाया गया कि मुख्य रूप से पीएच 4-8 और मास 15-150 केडीए3के क्षेत्र के भीतर वितरित किया गया । कुल में, 337 जेल स्पॉट और एक्साइज जेल धुंधलाना, trypsin पाचन, tryptic पेप्टाइड्स की शुद्धि, और मालदी-तोफ-MS PMF विश्लेषण के अधीन थे । PMF डेटा मानव प्रोटीन डाटाबेस के खिलाफ शुभंकर खोज के साथ प्रोटीन पहचान के लिए इस्तेमाल किया गया था । कुल 192 अनावश्यक प्रोटीन (107 निरर्थक प्रोटीन का प्रतिनिधित्व) से 141 जेल स्पॉट से पहचाने गए 337 विश्लेषण जेल स्पॉट (141/337 = 42%), और 196 स्थानों में कोई प्रोटीन की पहचान की थी (196/337 = 58%) (तालिका 1) । उन 141 स्थानों के लिए, प्रति स्थान केवल एक प्रोटीन की पहचान की थी 121 स्थानों में, प्रति स्थान 2 प्रोटीन की पहचान की गई 12 स्थानों में (स्पॉट 31, 32, 33, 41, 42, 43, 44, 68, 75, 137, 148, और 224), 5 प्रोटीन प्रति स्पॉट 3 स्थानों में पहचान की गई (स्पॉट 19 , 22, और 23), प्रति स्थान 6 प्रोटीन 3 स्थानों में पहचान की गई (स्पॉट 24, 91, और 93), और प्रति स्थान 7 प्रोटीन 2 स्थानों में पहचान की गई (72 स्पॉट, और 92) ।

2.2DE-मालदी ms/ms और 2DE-LC-ms/ms: प्रयोगात्मक प्रक्रिया का उपयोग कर ऊपर वर्णित, एक इनवेसिव NFPA ऊतक (पुरुष, 22 साल पुराना है, ACTH (-), hGH (-), PRL (+ +), LH (-), और FSH (-)) से निकाले गए प्रोटीन के 500 µ जी की कुल एक 18 सेमी IPG पट्टी के साथ सरणी था ( पीएच 3-10 NL) और एक बड़े प्रारूप एसडीएस-पृष्ठ जेल, तो Coomassie नीले G250 धुंधला के साथ visualized । यह दाग इनवेसिव NFPA ऊतक proteome (चित्रा 2) के एक reproducible और उच्च गुणवत्ता 2DE जेल पैटर्न उपज, आईईएफ दिशा में 1.95 ± ०.८५ मिमी और एसडीएस पृष्ठ की दिशा में 1.85 ± ०.७९ मिमी के एक औसत स्थान विचलन के साथ, और लगभग 2DE जेल के नक्शे में 1,100 प्रोटीन spotsdetected जो कि मुख्य रूप से पीएच 4-8 और मास 15-150 केडीए29की सीमा के भीतर वितरित किए गए थे । 10 स्पॉट बेतरतीब ढंग से चयनित और लेबल में चित्रा 2 थे और आबकारी जेल के अधीन थे, trypsin पाचन, tryptic पेप्टाइड्स के शुद्धिकरण, मालदी द्वारा पीछा-एमएस/ms और नियंत्रण रेखा-ईएसआई-ms/ प्रत्येक ms/ms dataset प्रोटीन पहचान के लिए शुभंकर खोज के साथ मानव प्रोटीन डेटाबेस के विरुद्ध उपयोग किया गया था । सभी स्थानों के लिए, प्रति स्थान 1 प्रोटीन की एक औसत मालदी के साथ की पहचान की थी-तोफ-तोफ ms/जबकि कई प्रोटीन (एक एक जेल मौके में 63 प्रोटीन का एक औसत, एक पूल में 71 प्रोटीन की एक औसत 2 मिलान स्पॉट, और 3 matc के एक पूल में 118 प्रोटीन की एक औसत hed जेल स्पॉट) प्रत्येक इसी मौके में नियंत्रण रेखा के साथ की पहचान की गई-ईएसआई-ms/ms विश्लेषण (तालिका 2) । यहां, एक उल्लेख है कि नियंत्रण रेखा-ईएसआई एमएस/एमएस प्रणाली एक बहुत अधिक संवेदनशीलता और मालदी के सापेक्ष समाधान-ms/ यह डेटा स्पष्ट रूप से दर्शाता है कि प्रत्येक 2d जेल स्पॉट कई प्रोटीन, नहीं सिर्फ एक या दो जटिल मानव कैंसर ऊतक proteome में प्रोटीन होता है ।

Figure 1
चित्र 1 : चांदी सना हुआ 2-DE एक FSH के पैटर्न-व्यक्त NFPA proteome IPGstrip पीएच 3 के साथ विश्लेषण किया - 10 NL और एसडीएस के 12% जेल एकाग्रता-पृष्ठ। लाल-भूरे रंग के धब्बे चांदी के दाग वाले प्रोटीन होते हैं, नारंगी चांदी से सना हुआ जेल की पृष्ठभूमि होती है । मालदी-तोफ-MS PMF के साथ लेबल किए गए धब्बे का विश्लेषण किया गया । वांग एक्स, एट अल से reproduced । (2015) 3, विले-VCH से अनुमति के साथ । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 : Coomassie नीले दाग 2-एक NFPA proteome के DE पैटर्न IPGstrip पीएच 3 के साथ विश्लेषण किया- 10 NL और एसडीएस के 12% जेल एकाग्रता-पृष्ठ। लेबल धब्बे मालदी के साथ विश्लेषण-तोफ-तोफ एमएस/ms और नियंत्रण रेखा-ईएसआई-ms/ धब्बे 1 *, 2 *, 3 *, 5 *, और 16 * इसी धब्बे 1, 2, 3, 5, और 16 से मिलान किया गया, और 2 मिलान जैल से परित । Zhan एक्स, एट अल से संशोधित । (2018) 29, विले-VCH से अनुमति के साथ । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Table 1
तालिका 1: मालदी-तोफ-MS PMF विश्लेषण के साथ प्रत्येक 2DE जेल स्पॉट में पहचाने गए प्रोटीन की संख्या ।

Table 2
तालिका 2: प्रोटीन की संख्या है कि एमएस के साथ प्रत्येक 2DE जेल स्पॉट में पहचान की गई/

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Discussion

2DE, 2DE सहित एमएस तरीकों के साथ युग्मित-ms PMF और 2DE-ms/एमएस, सफलतापूर्वक हमारी लंबी अवधि के कार्यक्रम में इस्तेमाल किया गया है-प्रोटियोमिक् के उपयोग के लिए मानव NFPA proteomic रूपांतरों और आणविक तंत्र के elucidation के लिए आणविक नेटवर्क रूपांतरों का अध्ययन करने के लिए और NFPAs के लिए प्रभावी करने वाले मार्क्स की खोज । 2DE आधारित तुलनात्मक प्रोटियोमिक् अच्छे reproducibility के साथ NFPA proteomic की पहचान में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है9,10,11,12,13, 19, और एंटीबॉडी विधि के साथ युग्मित 2DE एक दिए गए पद का पता लगाने में अपने लाभ को दर्शाता है-शोधों संशोधन और एक दिया प्रोटीन के वेरिएंट, जैसे tyrosine nitration का पता लगाने के लिए16,17 , 18 और GH वेरिएंट14,15.

हालांकि, एक एमएस विधि के साथ युग्मित 2DE कम बहुतायत प्रोटीन के विश्लेषण में कठिनाइयों के साथ एक श्रम गहन तकनीक माना जाता है, hydrophobic प्रोटीन, अत्यंत बुनियादी या अंलीय प्रोटीन, और बहुत कम या उच्च जन प्रोटीन2। उदाहरण के लिए, अत्यंत निम्न-मास (< 10 केडीए) या उच्च-मास (> 150 केडीए) प्रोटीन, और अत्यंत बुनियादी (pi > 7.5 या 8) या अंलीय (pi < 3.5 या 4) प्रोटीन आसानी से 2DE द्वारा pH 3-10 NL3के एक 18-सेमी IPG स्ट्रिप के साथ नहीं पाए जाते हैं । जेल के तेजी से विकास के साथ मुक्त जुदाई तरीकों, दो आयामी तरल क्रोमैटोग्राफी सहित (2d-नियंत्रण रेखा) स्थिर आइसोटोप के साथ युग्मित ऐसे iTRAQ और टीएमटी के रूप में पिछले दस वर्षों में23, ऐसा लगता है कि 2-DE धीरे से वापस ले लिया है अपनी जटिल ऊतक proteome के विश्लेषण में प्रोटियोमिक् अनुसंधान में केंद्रीय स्थिति क्योंकि 2d-नियंत्रण स्थिर आइसोटोप के साथ मिलकर लेबलिंग और एमएस/एमएस तरीकों प्रभावी ढंग से 2DE-आधारित तरीकों की कमियां दूर ।

हाल के अध्ययनों से पता चला है कि, उच्च संवेदनशीलता जन स्पेक्ट्रोमेट्री के उपयोग के साथ, ऐसे एक नियंत्रण रेखा के रूप में-ईएसआई-ms/ms (इसकी संवेदनशीलता 1-10 अमोल श्रेणी में है) 2DE-अलग प्रोटीन की पहचान में, 2-डे विधि की नई विशेषताओं की खोज की गई जो शो कि एक 2d जेल स्पॉट कई प्रोटीन (तालिका 2) शामिल हैं । यह केवल एक या दो जगह प्रति प्रोटीन के पारंपरिक अवधारणा के लिए काउंटर भाग गया, के रूप में विश्व 2DPAGE डाटाबेस (विश्व 2DPAGE पोर्टल: http://world-2dpage.expasy.org/portal) द्वारा सबूत है । यह स्पष्ट रूप से दर्शाता है कि 2 के एक जटिल मानव proteome में प्रोटीन की पहचान में DE का प्रवाह बहुत अधिक से अधिक एक पहले ग्रहण, अर्थात् है कि वहां केवल एक 2 डी जेल स्पॉट में दो प्रोटीन थे । यह techinique प्रोटियोमिक् के क्षेत्र में 2DE के लिए उपयोग का वादा करता है । एक 2DE एक हजार से अधिक अलग कर सकते है १०००० स्पॉट3,8,22 जटिल मानव proteome के विश्लेषण में, इस प्रकार 2DE एक अधिक विस्तृत जुदाई तकनीक को अधिक से अधिक proteome की जटिलता को सरल बनाने के लिए है lc-ms/एमएस विश्लेषण से पहले के नमूनों 2d-नियंत्रण रेखा प्रणाली है कि पहली आयामी नियंत्रण रेखा से पहले आमतौर पर 18 से 30 भागों को उत्पंन करता है-ms/ इसलिए, उच्च संवेदनशीलता जन स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ संयोजन में 2DE जटिल मानव proteome के लिए जबरदस्त जानकारी संदर्भ नक्शा स्थापित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, विशेष रूप से उन कम या बहुत कम बहुतायत प्रोटीन के लिए । इसके अलावा, 2-DE स्थिर आइसोटोप लेबलिंग के साथ संयोजन में (जैसे iTRAQ, टीएमटी, और SILAC के रूप में) और उच्च संवेदनशीलता जन स्पेक्ट्रोमेट्री विभिन्न स्थितियों के बीच बड़े पैमाने पर proteomic रूपांतरों को बढ़ाता है करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके अलावा, 2DE स्थिर आइसोटोप लेबलिंग और उच्च संवेदनशीलता के साथ युग्मित जन स्पेक्ट्रोमेट्री बड़े पैमाने पर पता लगाने और प्रोटीन PTMs, प्रोटीन वेरिएंट, प्रोटीन speciation, और प्रोटीन प्रजातियों में से ठहराव में निरपेक्ष लाभ है । इन फायदों के प्रोटियोमिक् के क्षेत्र में 2DE पुनर्जीवन होगा ।

इसके अलावा, मानव PA ऊतक proteome के विश्लेषण के लिए वर्तमान प्रोटोकॉल यहां वर्णित आसानी से अंय मानव रोग proteomes अध्ययन अनुवाद कर रहे हैं ।

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Disclosures

लेखक यह घोषणा करते हैं कि हितों का कोई टकराव नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम चीन की राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (ग्रांट no. ८१५७२२७८ और ८१२७२७९८ टू XZ) द्वारा समर्थित किया गया, चीन से अनुदान "863" योजना परियोजना (ग्रांट no. 2014AA020610-1 से XZ), प्रतिभा परिचय के लिए Xiangya अस्पताल कोष (XZ), और हुनान चीन के प्रांतीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (ग्रांट No. 14JJ7008 टू XZ) । लेखक भी यूनिवर्सिटी ऑफ टेनेसी हेल्थ साइंस सेंटर में डॉ डोमिनिक एम Desiderio के वैज्ञानिक योगदान को स्वीकार करते हैं । X.Z. लगातार विकसित और इस्तेमाल किया 2DE-एमएस तरीके पिट्यूटरी ग्रंथ्यर्बुद proteome का विश्लेषण करने के लिए 2001 से शुरू, वर्तमान पांडुलिपि के लिए अवधारणा की कल्पना, लिखा और पांडुलिपि संशोधित, उचित काम समंवित, और के लिए जिंमेदार था वित्तीय सहायता और इसी काम करते हैं । Y.L. ने पांडुलिपि के पुनरीक्षण में भाग लिया । Y. H संदर्भ के संग्रह में भाग लिया, और पांडुलिपि के संशोधन । सभी लेखकों ने अंतिम पांडुलिपि को मंजूरी दी ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ettan IPGphor 3  GE Healthcare isoelectric focusing system.
Ettan DALTsix multigel caster Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA
Ettan DALT II System Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA The vertical electrophoresis system
Ettan IPGphor strip holder Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA
Ettan DALTsix multigel caster Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA Multigel caster
Voyager DE STR MALDI-TOF MS  ABI, Foster City,CA MALDI-MS PMF
MALDI-TOF-TOF Autoflex III, Bruker MALDI-MS/MS mass spectrometer
LTQ-OrbiTrap Velos Pro ETD Thermo Scientific, Waltham, MA, USA ESI-MS/MS mass spectrometer
EASY-nano LC system  Proxeon Biosystems, Odense, Denmark High performance liquid chromatography system
PepMap C18 trap column  300 μm i.d. × 5 mm length; Dionex Corp., Sunnyvale, CA, USA
RP C18 column 75 μm i.d., 15 cm length; Dionex Corp., Sunnyvale, CA, USA
KimWipe Kimvipe  Insoluble paper towel
Watter Made by PURELAB flex instrument
Polytron Model P710/35 homogenizer Brinkmann Instruments, Westbury, NY
PDQuest Bio-Rad,  Hercules, CA 2D gel image analysis software
SEQUEST  Thermo Proteome Discoverer 1.3 (version No. 1.3.0.339)
DataExplore (ver. 4.0.0.0) software MS spectrum-processing software
Mascot software PMF-based protein searching software  
Mascot software MS/MS-based protein searching software
Proteome Discoverer software v.1.3 beta Thermo Scientific
Xcalibur software v.2.1 MS/MS data-acquired management software 
Uniprot version 201410.1_HUMAN.fasta Human protein database
SEQUEST (version No. 1.3.0.339)  MS/MS-based protein searching software I
MASCOT (version 2.3.02)  MS/MS-based protein searching software II
C18 ZipTip microcolumn Millipore
PeptideMass Standard kit  Perspective Biosystems
Pierce BCA Protein Assay Kit  Thermo Fisher Scientific 23227
2-D Quant Kit GE Healthcare 80-6483-56
BIS-ACRYLAMIDE AMRESCO 0172
ACRYLAMIDE AMRESCO 0341
DTT Sigma-Aldrich D0632
Thiourea Sigma-Aldrich T8656
Urea VETEC V900119
SDS AMRESCO 0227
CHAPS AMRESCO 0465
TEMED AMRESCO M146
Ammonium Persulfate AMRESCO M133
Trypsin Promega, Madison, WI, USA V5111
IPG buffer pH 3-10, NL GE Healthcare 17-6000-87
Immobiline Dry Strip pH 3-10NL,18cm GE Healthcare 17-1235-01

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References

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  2. Zhan, X., Desiderio, D. M. Comparative proteomics analysis of human pituitary adenomas: Current status and future perspectives. Mass Spectrom. Rev. 24 (6), 783-813 (2005).
  3. Wang, X., Guo, T., Peng, F., Long, Y., Mu, Y., Yang, H., Ye, N., Li, X., Zhan, X. Proteomic and functional profiles of a follicle-stimulating hormone-positive human nonfunctional pituitary adenoma. Electrophoresis. 36 (11-12), 1289-1304 (2015).
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