Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Tvådimensionell gelelektrofores tillsammans med masspektrometri metoder för en analys av mänskliga hypofysen adenom vävnad proteomet

Published: April 2, 2018 doi: 10.3791/56739
Automatic Translation
1,2,3,4, 1,2,3, 1,2,3
1Key Laboratory of Cancer Proteomics of Chinese Ministry of Health, Xiangya Hospital, Central South University, 2Hunan Engineering Laboratory for Structural Biology and Drug Design, Xiangya Hospital, Central South University, 3State Local Joint Engineering Laboratory for Anticancer Drugs, Xiangya Hospital, Central South University, 4The State Key Laboratory of Medical Genetics, Central South University

Summary

Här presenterar vi en tvådimensionell gelelektrofores (2DE) i kombination med masspektrometri (MS) för att separera och identifiera mänskliga hypofysen adenom vävnad proteomet, som presenterar ett bra och reproducerbara 2DE mönster. Många proteiner kan observeras i varje 2DE plats när analysera komplexa cancer proteomet med användning av hög känslighet MS.

Abstract

Mänskliga hypofysen adenom (PA) är en gemensam tumör som förekommer i mänskliga hypofysen i hypotalamus-hypofysen-targeted organsystem axel och kan klassificeras som antingen kliniskt funktionella eller icke-funktionella PA (FPA och NFPA). NFPA är svårt för tidigt skede diagnos och terapi på grund av knappt upphöja hormoner i blodet jämfört med FPA. Vårt långsiktiga mål är att använda proteomikmetoder för att upptäcka tillförlitliga biomarkörer för förtydligande av PA molekylära mekanismer och erkännande av effektiva diagnostiska, prognostiska markörer och terapeutiska mål. Effektiv tvådimensionell gelelektrofores (2DE) i kombination med masspektrometri (MS) metoder presenterades här för att analysera människors PA Proteom, inklusive beredning av prover, 2D gelelektrofores, protein visualisering, bildanalys, i-gel trypsin matsmältningen, peptid massa fingeravtryck (PMF) och tandem mass spectrometry (MS/MS). 2-dimensionella gelelektrofores desorption/jonisering masspektrometri med matrix-assisted laser PMF (2DE-MALDI MS PMF), 2DE-MALDI MS/MS och 2DE-liquid chromatography (LC) MS/MS förfaranden har tillämpats framgångsrikt i en analys av NFPA proteomet. Med användning av en hög känslighet masspektrometer identifierades många proteiner med 2DE-LC-MS/MS metod i varje 2D gel plats i en analys av komplexa PA vävnad att maximera täckningen av mänskliga PA proteomet.

Introduction

PA är en gemensam tumör som förekommer i mänskliga hypofysen i hypotalamus-hypofysen-targeted axis organsystem, som spelar viktiga roller i det mänskliga endokrina systemet. PA innehåller kliniskt funktionella och nonfunctional PAs (FPA och NFPA)1,2. NFPA är svår i tidigt skede diagnos och terapi på grund av endast lätt förhöjda hormonnivåer (t.ex., LH och FSH) i blodet jämfört med FPA, som har betydligt ökade nivåer av motsvarande hormoner i blodet3,4 ,5. Ett förtydligande av molekylära mekanismer och upptäckten av effektiva biomarkörer har viktiga kliniska betydelse i diagnos, behandling och prognos av NFPA. Vårt långsiktiga mål är att utveckla och använda proteomiska metoder för att studera NFPA för upptäckten av tillförlitliga biomarkörer att klargöra dess molekylära mekanismer och identifiera effektiva terapeutiska mål samt diagnostiska och prognostiska markörer. 2-DE tillsammans med MS-metoder har använts flitigt i vårt långsiktiga forskningsprogram angående mänskliga PA proteomet1,2,6,7, inklusive inrättandet av proteomet referens kartor3,8, analys av Differentiellt uttryckta proteinet profiler9,10,11,12,13, hormon varianter14 ,15, post-translationella modifieringar som fosforylering14 och tyrosin nitrering16,17,18, proteomiska variationen av invasiva förhållande till icke-invasiv NFPAs19och proteomiska heterogenitet NFPA subtyper13, vilket ledde till upptäckten av flera viktiga pathway nätverk (mitokondriell dysfunktion, cellcykeln dysreglering, oxidativ stress och MAPK signalering systemet abnormitet) som ändras i NFPA13,19,20.

2De separerar proteiner enligt deras isoelektrisk punkt (pI) (isoelektrisk fokusering, IEF) och molekylvikt (via sodium dodecyl sulfate polyakrylamid gelelektrofores, SDS-PAGE)1,2,3, 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23. Detta är en gemensam och klassiskt separation teknik inom proteomik, sedan införandet av begreppen den proteomet och proteomik i 199524. MS är den avgörande tekniken för att ta reda på identiteten på 2DE-separerad proteiner, inklusive strategier för PMF och MS/MS. Den mycket snabba utvecklingen av MS instrument, särskilt i aspekterna av upptäckt känslighet och upplösning, i kombination med förbättringen av LC system, avsevärt förbättrar identiteten på låg eller mycket låg överflöd proteiner i en proteomet att maximera den täckning av en proteomet. Det utmanar också våra traditionella koncept att endast en eller två proteiner finns i en plats i en analys av komplexa mänsklig vävnad proteomet 2D gel och ger en möjlighet att identifiera flera proteiner i en 2D gel plats i en analys av komplexa mänskliga vävnader proteomet och maximera täckningen av NFPA proteomet.

Här beskriver vi detaljerade protokoll av 2DE-MALDI MS PMF, 2DE-MALDI MS/MS och 2DE-LC-MS/MS som har framgångsrikt använts i analysen av mänskliga NFPA proteomet. Protokollen omfattar beredning av prover, första dimension (isoelektrisk fokusering, IEF), andra dimensionen (SDS-PAGE), visualisering av proteiner (silverfärgning och Coomassie blå färgning), bildanalys av 2D gel, i-gel trypsin matsmältningen, rening av tryptic peptider, PMF, MS/MS och databasen brännande3,8,25,26. Dessutom översätter detta protokoll enkelt för analys av andra mänsklig vävnad proteom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Detta protokoll följer riktlinjerna i Xiangya sjukhus medicinsk etik kommittén Central South University, Kina. En huvud mössa och handskar bör bäras hela experimentella förfarandet att undvika keratin kontaminering från hud och hår8.

1. preparation av prover

  1. Samla in PA vävnader (0,2 - 0,5 mg) från neurokirurgiska avdelningen. Genast frysa i flytande kväve, och sedan överföra till-80 ° C för lagring.
  2. Tillsätt 2 mL av 0,9% NaCl i avjoniserat destillerat vatten (ddH2O). Använd denna lösning att försiktigt tvätta blodet från vävnadsytan (3 x).
    Obs: ddH2O med konduktiviteten 18,2 MΩ cm används i hela protokollet. Några av tissuemight förloras när tvätta bort blodet från en vävnadsytan.
  3. Lägga till en volym (10 mL; 4 ° C) av lösningen innehållande 2 M ättiksyra och 0,1% (v/v) β-merkaptoetanol för varje 0,5 - 0,6 g vävnad, homogenisera (1 min, 13.000 rpm, 4 ° C, 10 x) med en vävnad Homogenisatorer, Sonikera Homogenatet för 20 s, lyophilize , och lagra på −80 ° C.
  4. Mäta proteinhalten i den frystorkade, homogeniserade prover med bicinchoninic syra (BCA) assay kit.
    Obs: BCA kvantifiering är inte en absolut kvantifiering och uppmätta resultatet kommer att ändras med olika tekniker och experimentella agenten. En fast koncentration prov standard ska användas för olika experiment. Därför kommer att slutliga lastning av proteiner för varje 2D gel fastställas med de silver-färgade eller Coomassie-betsad bra upplösning i de pre-designade experiment.
    1. Lägg ca 300 µg av frystorkade homogeniserade provet till en volym (282 µL) av protein-extrahera buffert (8 M urea och 4% käkar), följt av står för 2 h, sonicating i vattenbad för 5 min, roterande för 1 h, sonicating igen i vattenbad för 5 min , roterande igen för 1 h, och centrifugering vid 15 000 x g i 20 min.
    2. Förbereda BSA standardlösningar med koncentrationer som nämnts: 0, 25, 125, 250, 500, 750, 1 500, 2 000 µg/mL med kommersiella BSA standarden (2 mg/mL).
    3. Blanda BCA reagens A och B (a: b = 50: 1) som BCA fungerande lösning före användning.
    4. Tillsätt 0,1 mL av provet eller standardlösning till 2 mL av BCA fungerande lösning i ett mikrofugrör, följt av blandning och sedan inkubation vid 37 ° C i 30 min. Slutligen svalna i rumstemperatur i 10 min och åtgärd A562 nm OD värde.
    5. Beräkna den standard linjär linjen (A562 nm vs. BSA koncentration) att få en regressionsekvation för att beräkna proteinhalten som prov med ett562nm värde.
  5. Använd 150 µg av protein motsvarande frystorkade provet för silver färgning eller 500 µg av protein för Coomassie färgning, för en 18 cm immobiliserade pH gradient (IPG) strip pH 3-10 ickelinjära (NL).
    Obs: IPG torra remsan är 0,5 mm tjock och 3-mm bred, med olika längder inklusive 7, 11, 13, 18, och 24 cm och olika pH spänner inklusive pH 4-5, 4-7, 6-9 och 3-10 i antingen en linjär eller ickelinjära pH gradient. IPG bufferten används måste passa i strip27,28.
  6. 1.6.Add 250 µL utvinna buffert (7 M urea, 2 M tiourea, 4% (w/v) käkar, 100 mM DTT (Lägg till före användning), 0,5% v/v pharmalyte (Lägg till före användning), och ett spår av bromofenolblått).
  7. Förvara lösningen under 30 ° C, följt av vortexa för 5 min, sonicating för 5 min och roterande för 50 min.
  8. Tillsätt 110 µL rehydrering buffert (7 M urea, 2 M tiourea, 4% (w/v) käkar, 60 mM DTT (Lägg till före användning), 0,5% v/v IPG buffert (Lägg till före användning), och ett spår av bromofenolblått). Sonikera under 5 minuter. Rotera sedan provet för 50 min, virvel för 5 min och Centrifugera under 20 minuter vid 15 000 x g.
  9. Samla supernatanten (350 µL) som den protein prov lösning8.

2. tvådimensionell gelelektrofores

  1. IEF (första dimension): utför IEF på isoelektrisk fokusering systemet som beskrivs nedan.
    1. Tillsätt 350 µL av protein provlösningen i spåret av en 18 cm IPG remshållaren.
    2. Sätta en 18 cm IPG strip gel-och-ner på protein provlösningen (Undvik bubblor).
    3. Tillsätt 3-4 mL av mineralolja att täcka IPG remsan.
    4. Montera hållaren för IPG-remsa i den isoelektrisk fokusering anläggningen den spetsiga änden på baksidan (+) plattan och fyrkantiga änden på framsidan (−) plattan.
    5. Rehydrera övernattning (~ 18 h i rumstemperatur).
    6. Ange parametrarna IEF: maximalt nuvarande 30 µA per band, 20 ° C; 250 V, 1 h, 125 Vh, steg och håll; 1000 V, 1 h, 500 Vh, övertoning; 8 000 V, 1 h, 4.000 Vh, övertoning; 8 000 V, 4 h, 32.000 Vh, steg och håll; och 500 V, 0,5 h, 250 Vh, steg och håll. Låt den köra upp till en sammanlagd tid av 7,5 h och 36,875 Vh.
    7. Efter IEF, ta ut varje IPG remsa och ta bort den extra mineraloljan med en olöslig pappershandduk. Nu Linda remsan i ett ark av plastfolie och lagra vid −80 ° C.
      Obs: IPGstrip innehavaren bör rengöras med IPGstrip innehavaren rengöringsmedelslösning och destillerat vatten.
  2. SDS-PAGE (andra dimension): utföra SDS-PAGE i en vertikal Cell Electrophoresis System
    Obs: Varje SDS-PAGE gel storlek bör vara 255 x 190 x 1 mm.
    1. Använda en multi gel caster castar 12% sida att lösa geler. För gjutning 12% sida geler, utför följande steg.
      1. Tillsätt 270 mL ddH2O, 150 mL 1,5 M Tris-HCl (pH 8,8), 180 mL av 40% (w/v) akrylamid/bisacrylamide stamlösning (29: 1, 40% w/v akrylamid och 1,38% w/v N, N'-methylenebisacrylamide), 3 mL 10% ammonium persulfatoxidation och 150 µL av TEMED att göra gel lösning i en bägare. Blanda försiktigt och undvika bubblor.
      2. Häll gellösningen försiktigt i multicasting kammaren upp till förväntade gel höjden (19 cm).
      3. Lägg omedelbart till ca 3 mL ddH2O på varje lösa gel att täcka gelerna. Låt gelen polymerisera för ca 1 h.
    2. Förbereda 20 L av elektrofores buffert (25 mM Tris, 192 mM glycerin och 0,1% SDS). Fyll elektrofores separation enhet buffert tanken med denna buffert.
    3. Ta ut de fokuserade IPG remsorna från frysen och temperera remsorna för 10 min av gunga försiktigt i 4 mL minska jämvikt buffert (375 mM Tris-HCl (pH 8,8), 6 M urea, 2% (w/v) SDS, 20% (v/v) glycerol, 2% w/v DTT (Lägg till före användning) och ett spår av bromofenolblått).
    4. Låt jämvikta i 10 min genom att försiktigt skaka reducerad IPG remsorna i 4 mL alkylering jämvikt buffert (375 mM Tris-HCl (pH 8,8), 6 M urea, 2% (w/v) SDS, 20% (v/v) glycerol, 2,5% w/v iodoacetamide (Lägg till före användning), och ett spår av bromofenolblått).
    5. Demontera multicasting kammaren under gel jämvikt, och ta ut beredda att lösa gel kassetten. Skölj 3 x med ddH2O. ta bort överflödig ddH2O med en olöslig pappershandduk och sätta i en gel-stander.
    6. Skölj skakad IPG remsorna med elektrofores buffert och ta bort överflödig vätska på IPG strip ytan med olösliga pappershandduk.
    7. Sätta en IPG remsa på lösa SDS-PAGE gelen och låt IPG remsan plast sida kontakta längre glasskivan och den spetsiga ändan till vänster.
    8. Häll 3-4 mL varm 1% agaros i SDS elektrofores buffert (~ 80 ° C) snabbt att försegla IPG remsan på toppen av varje SDS-PAGE gel, och satte den övre sidan av IPG strip ner till toppen av den kortare glasplattan utan bubblor, och sedan polymerisera i 10 min.
    9. Sätt i monterade gel kassett vertikalt mellan plast packningar i vertikal elektrofores systemet. Placera toppen av gelen med IPG remsan intill katoden (−).
    10. Justera nivån av elektrofores buffert att fördjupa gel kassett.
    11. Ansluta och ställa in Power Supply/styrenheten i konstant spänning läge, och kör på 200 V för ca 370 min medan övervakning färgämnet.
    12. Efter löpning, ta ut gel kassetten från electrophoresis system, och ta försiktigt bort gelen från gel kassett, undvika Riva i gel, följt av färgning av 2DE-separerade proteinerna.
  3. Färgning av 2DE-separerade proteinerna
    1. Silverfärgning
      1. Försiktigt överför gelen med två händer i ett tråg innehållande 250 mL fixering lösning (50% metanol (v/v) och 5% (v/v) ättiksyra) och skaka försiktigt gelen i 20 min.
      2. Kassera lösningen och tillsätt 250 mL 50% (v/v) metanol i facket och skaka försiktigt i ca 10 min.
      3. Kassera metanol och tillsätt 250 mL ddH2O i facket. Skaka försiktigt i 10 min.
      4. Försiktigt skaka gelen för 1 min i 250 mL sensibilisering buffert som innehåller 0,02% (w/v) natriumtiosulfat och kasserar vätskan.
      5. Skaka försiktigt gelen i 250 mL ddH2O för 1 min (upprepa ännu en gång). Kassera vätskan efter varje steg.
      6. Skaka försiktigt gelen i 20 min i 250 mL silver reaktion lösning (0,1% (w/v) silvernitrat med 200 µL 37% (v/v) formaldehyd lagt till före användning).
      7. Skaka försiktigt gelen i 250 mL ddH2O för 1 min (upprepa ännu en gång). Kassera vätskan efter varje steg.
      8. Skaka gelen försiktigt i 250 mL utvecklingslösning (3% (w/v) natriumkarbonat med 100 µL 37% (v/v) formaldehyd läggs före användning) tills önskad intensitet av färgning erhålls (vanligen 1-3 min), sedan kasta vätskan.
      9. Försiktigt skaka gelen i 10 min i 250 mL stoppa lösning (5% (v/v) ättiksyra) och kassera vätskan.
      10. Försiktigt skaka för 5 min i 250 mL ddH2O och kasta bort vätskan.
      11. Gelet i 250 mL lagring lösning 8,8% glycerol vid 4 ° C.
    2. Coomassie brilliant blå färgning
      1. Förbereda Coomassie färgning lösning genom att lösa Coomassie brilliant blue G250 0,3 g ammoniumsulfat 25 g och fosforsyra 25 mL i ddH2O och upp till en total volym på 200 mL. Före användning, tillsätt metanol 50 mL.
      2. Tillsätt 250 mL Coomassie färgning lösning på gelen och skaka försiktigt i rumstemperatur tills tydlig protein fläckar (~ 2-4 h). Kassera vätskan.
      3. Tillsätt 250 mL ddH2O och skaka sakta i 5 min, sedan två gånger mer. Kassera vätskan.
      4. Tillsätt 250 mL avfärgning lösning (20% (v/v) etanol) och skaka långsamt tills bakgrundsfärgen blivit nästan färglös, och kassera vätskan.
      5. Ersätta med färsk destaining lösningen när gammalt en blir mörka och kasserar vätskan.
      6. Tillsätt 250 mL ddH2O och skaka sakta i 5 min. Kassera vätskan.
      7. Tillsätt 250 mL lagring lösning (8,8% glycerol) och hålla vid 4 ° C.
  4. Tvådimensionell gelelektrofores bildanalys
    1. Digitalisera de färgade gelerna med en flatbäddsskanner.
    2. Mata in bilden i 2D gel bild analys systemet.
    3. Identifiera och kvantifiera varje plats som använder en 2D gel bild analys programvara enligt tillverkarens protokollet.
    4. Matcha platserna mellan olika geler.

3. identifiering av 2DE-separerad proteiner med MS

  1. Beredning av tryptic peptid blandning
    Obs: Silikoniserad eller låg-lagring rör och pipettspetsar bör användas för att undvika förlust av proteiner eller peptider.
    1. Silver-gel avfärgning
      1. Punktskatt gelen fläckar i en 1,5 mL silikoniserad tube och tvätta i 500 µL ddH2O 6 gånger.
      2. Sätta den tvättade gel i en ny 1,5 mL silikoniserad tub och Finhacka den i många små bitar (0,5-1 mm3).
      3. Avfärga gel bitar i 20 µL av den destaining lösning som blandar en del av 30 mM Kaliumferricyanid och en del av 100 mM natriumtiosulfat (1:1) före användning för att låta brunaktig färg försvinna (vanligen 1-2 min). Kassera vätskan.
      4. Tvätta gel bitar med 20 µL av ddH2O 5 - 6 gånger så att den gula färgen försvinner. Kassera vätskan efter varje steg.
      5. Tillsätt 20 µL av 200 mM hjorthornssalt till gel lappar, och stanna i 20 min. Wash gel bitar med ddH2O (20 µL, 1 gång). Kassera vätskan.
      6. Torka gel bitar med 30 µL acetonitril minst två gånger för att låta gel bitar vända en ogenomskinlig vit och vakuum-centrifug torka i 30 min.
    2. Coomassie brilliant blue gel avfärgning
      1. Skuren gel ställen i en 1,5 mL silikoniserad tub och tvätta med 500 µL ddH2O minst 3 gånger.
      2. Sätta den tvättade gel i en ny 1,5 mL silikoniserat tub och finhacka det i flera bitar (0,5-1 mm3) med en pipett spets.
      3. Avfärga gelen i 50-100 µL avfärgning lösning (1:1 v/v mix 200 mM NH4HCO3 med acetonitril) beroende på volymen gel, inkubera vid 37 ° C i ett vattenbad. Upprepa och lägga till färska avfärgning lösning tills färgen försvinner (~ 1 h). Kassera vätskan efter varje steg.
      4. Tvätta gel bitar en gång med 20 µL av ddH2O.
      5. Torka gel bitarna i 100 µL acetonitril (minst två gånger) att låta gel bitar slå en ogenomskinlig vit.
      6. Vakuum torka i 30 min.
    3. I-gel trypsin matsmältningen av proteiner i torkade gel bitar
      1. Lös 20 µg (833 pmol) frystorkade trypsin pulver i 100 µL av 50 mM ättiksyra.
      2. Späd 20 µL av trypsin lösning (200 ng/µL) till 16 ng/µL med 230 µL av 50 mM hjorthornssalt.
      3. Tillsätt 20-30 µL (0,32-0,48 µg) av utspädda trypsin lösningen på varje tub som innehåller torkade gel bitar. Inkubera i 18-20 h i en 37 ° C i vattenbadet. Låt lösningen stå vid 4 ° C i 30 min.
      4. Centrifugera lösningen försiktigt i 10 s. Sonicate i ett vattenbad för 5-6 min vid 30 ° C och sedan Centrifugera vid 12 000 x g i 2 min.
      5. Samla in supernatanten innehållande tryptic peptid blandning till en silikoniserad 0,5 mL-rör.
    4. Rening av tryptic peptid blandning med C18 microcolumn.
      1. Tvätta varje C18 kolumn med acetonitril (10 µL, 5 gånger), och sedan med 50% acetonitril (10 µL, 5 gånger).
      2. Jämvikta med 0,1% trifluoro ättiksyra (TFA) (10 µL, 5 gånger).
      3. Pipettera provet upp och ner genom förberedda C18 kolonnen för 15 gånger.
      4. Tvätta provet 2 x med 10 µL 0,1% transfettsyror.
        Obs: Renat tryptic peptiderna behålls i kolumnen C18.
      5. Lägga till en volym (6 µL) lösning (85% v/v acetonitrile/0.1% v/v myrsyra) i en ren 0,5 mL silikoniserat tub, pipett här lösningen försiktigt och långsamt upp och ner genom peptid-C18 pärlor för 10 x att tvätta bond peptiderna i lösningen, lufttorka , och store (−20 ° C) för MS analys.
  2. MS analys
    1. MALDI-MS PMF analys
      1. Tillsätt 4 µL av 85% v/v acetonitrile/0.1% v/v TFA att upplösa renat tryptic peptid blandningen. Belastning 2 µL upplöst tryptic peptid blandningen på MALDI plåt och omedelbart lägga till 2 µL а-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) lösning som innehåller 10 g/L i 500 mL/L acetonitril 1 mL/L TFA, sedan lufttorka.
      2. Läsa in MALDI plattan med tryptic peptid blandningen i en MALDI-MS masspektrometer.
        Obs: Parametrarna för instrumentet ställs som reflektor läge med 20 kV accelererande spänning, positiv polaritet och 160 ns fördröjningstid extraktion. Varje MS spektrum fås med 200 laser skott med en rad m/z 1000 till 4000 efter extern kalibrering med standard peptiden massa.
      3. Använda en MS spektrum-bearbetning programvara för att bearbeta varje MS spektrum, inklusive baslinjekorrektion, brus tas bort (5%) och peak deisotoping.
      4. Korrekt massa listan från varje MS spektrum med avlägsnande av kontaminerande massorna från trypsin, matrix, keratins och andra okända föroreningar i parallellen blank-gel experiment.
      5. Ingång den korrigera massan lista in en PMF-baserade protein söka programvara för att identifiera proteiner i databasen Swiss-Prot protein med följande sökparametrar, inklusive PMF söktyp, mänskliga, trypsin med 1 maximal missade klyvning, fast carbamidomethyl cystein, variabel metionin oxidation, monoisotopic, peptid massan tolerans 50 ppm, peptid kostnad statligt (1 +), och signal-brus (S/N) 5.0.
      6. Identifiera proteiner med statistiskt signifikant protein noter, och där protein poäng =-10 × log(p), där p är sannolikheten att den observerade matchen är en slumpmässig händelse.
    2. MALDI-MS/MS-analys
      1. Tillsätt 4 µL av 50% v/v acetonitrile/0.1% v/v TFA att upplösa renat tryptic peptid blandningen. Varje renat tryptic peptid blandning (0,5 µL) var fläckvis på en MALDI-plattan med 384 brunnar, omedelbart fläckig 0,5 µL av mättade CHCA matrix i 50% acetonitrile/0.1% TFA på toppen av peptid provet och sedan torkas i luften.
      2. Låt den MALDI-TOF-TOF MS/MS hanteras automatiskt, använder 100 laser skott för att förvärva en MS1 spektrum, och ackumulera 6 upprepas MS1 spektra i en syntetisk MS1 spektrum.
      3. Ange 4 mest intensiva föregångare joner från varje syntetisk MS1 spektrum för MS/MS-analys. Använd 100 laser skott för varje föregångare ion att förvärva en MS/MS spektrum, och ackumuleras 4 upprepade MS/MS spectra i en syntetisk MS/MS spektrum.
      4. Använda syntetiska MS/MS data för att söka efter proteiner genom en MS/MS-baserad protein söka programvara med parametrar inklusive MS/MS Ion Sök, Swiss-Prot mänskliga databas, trypsin med högst 1 missade klyvning, fast carbamidomethyl (C), variabel Oxidation (M), monoisotopic massa värde, peptid massan tolerans ± 100 ppm och fragment massa tolerans ± 0,7 Da.
      5. Identifiera ett protein med en statistiskt signifikant sannolikhet utifrån Mowse Poäng och joner poäng = -10 x Log(P), där p är sannolikheten att den observerade matchen är en slumpmässig händelse.
    3. LC-ESI-MS/MS-analys
      1. Tillsätt 6 µL 5% v/v acetonitrile/0.1% v/v myrsyra att upplösa renat tryptic peptid blandningen.
      2. Använd ett högpresterande vätskekromatografi (HPLC) system tillsammans online med en elektrospray jonisering (ESI)-MS/MS mass spectrometer med en MS/MS data-förvärvade management programvara för att hantera hela operationen.
      3. Använd C18 fälla kolumn (300 µm i.d. × 5 mm längd), och omvänd-fas C18 kolonnen (75 µm i.d. x 15 cm längd) med en separation lutning på 98% lösningsmedel en (0,1% myrsyra) och 2% lösningsmedel B (0,1% myrsyra i 100% acetonitril) för 2 min , 2% till 40% lösningsmedel B för 45 min, 40% till 95% lösningsmedel B för 5 min och 95% vätska B till 10 min (totalt 65 min 300 nL/min).
      4. Ange positiva-Jon och data-beroende automatisk undersökning läge att förvärva MS och MS/MS-spektra och kollision-inducerad dissociation (CID) för ion fragmentering.
      5. Ange varje MS skanning till en massa rad m/z 350 – 1800 med en upplösning på 100.000 m/z 400. Utför sökningen för de 7 mer intensiva jonerna i MS scan.
      6. Använd MS/MS-baserad protein söka programvara jag att söka i databasen för identifiering av proteiner.
        1. Markera databasen som mänskliga protein.
        2. Välj trypsin med en missad klyvning webbplats tillåten.
        3. Ange peptid tolerans (±10 ppm), fragment ion tolerans (±0.8 Da), peptid kostnad (2 + 3 + och 4 +), fast carbamidomethylation på cystein och variabel oxidation på metionin.
        4. Ange false discovery priser (FDR) < 1%, och endast peptider med rank 1 accepteras.
        5. Identifiera protein med PSM≥1 (PSMs: det totala antalet identifierade peptid sekvenser (PSMs) för protein, inklusive de redundant identifieras) och minst två unika peptider per protein.
      7. Också använda MS/MS-baserad protein forskande programvara II för att söka i databasen för identifiering av proteiner.
        1. Konvertera raw MS-filen till en .mgf-fil.
        2. Valda databasen humant protein (uniprothuman_20161031.fasta som innehåller 70940 sekvenser och 23897047 rester).
        3. Välj trypsin matsmältningen med högst 2 missade Klyvningar.
        4. Sätta fast carbamidomethyl (C), variabel deamidated (NQ) och oxidation (M), föregångare ion mass tolerans 10 ppm, dotter ion mass toleransen 0,8 Da och monoisotopic topp.
        5. Identifiera proteiner med ett betydelse tröskelvärde på 0,05 och minst 2 unika peptider.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

1. 2DE-MALDI MS PMF: med experimentella proceduren ovan, sammanlagt 150 µg proteiner utvanns från FSH-uttryckta NFPA vävnader (kvinna, 50 år gammal, ACTH (-), GH (-), PRL (-), LH (-), FSH (+) och TSH (-)) och klädd med ett 18 cm IPG strip (pH 3-10 NL) och en storformat SDS-PAGE gel, sedan visualiseras med silverfärgning. Vi fick en reproducerbar och bra 2DE gel mönster av NFPA vävnad proteomet (figur 1), med en genomsnittlig positionella avvikelse 1.98 ± 0,75 mm i IEF riktning och 1,62 ± 0,68 mm i SDS-PAGE riktning, och med ett ungefärligt 1.200 protein fläckar upptäckts i 2DE gel kartan som distribuerades främst inom området för pH 4-8 och massa 15-150 kDa3. Totalt var 337 gel ställen censurerade och utsätts för gel avfärgning, trypsin matsmältningen, rening av tryptic peptider och MALDI-TOF-MS PMF analys. PMF data användes för protein identitet med maskot sökning mot humant protein-databasen. Totalt 192 överflödiga proteiner (som representerar 107 nonredundant proteiner) identifierades från 141 gel fläckar av 337 analyserade gel fläckar (141/337 = 42%), och inget protein identifierades i 196 ställen (196/337 = 58%) (Tabell 1). För de 141 fläckar, endast en protein per plats identifierades i 121 ställen, 2 proteiner per plats identifierades i 12 ställen (fläckar 31, 32, 33, 41, 42, 43, 44, 68, 75, 137, 148 och 224), identifierades 5 proteiner per plats i 3 ställen (ställen 19 22 och 23), 6 proteiner per plats identifierades i 3 ställen (fläckar 24, 91 och 93) och 7 proteiner per plats identifierades i 2 platser (fläckar 72 och 92).

2. 2DE-MALDI MS/MS och 2DE-LC-MS/MS: med hjälp av experimentell proceduren som beskrivs ovan, sammanlagt 500 µg av protein som utvinns ur en invasiv NFPA vävnad (hane, 22 år gammal, ACTH (-), hGH (-), PRL (++), LH (-) och FSH (-)) var klädd med en 18 cm IPG strip ( pH 3-10 NL) och en storformat SDS-PAGE gel, sedan visualiseras med Coomassie blå G250 färgning. Denna färgning gav ett reproducerbart och hög kvalitet 2DE gel mönster av invasiva NFPA vävnad proteomet (figur 2), med en genomsnittlig positionella avvikelse på 1,95 ± 0,85 mm i IEF riktning och 1,85 ± 0,79 mm i SDS-PAGE riktning, och med cirka 1.100 protein spotsdetected i 2DE gel kartan som distribuerades huvudsakligen inom spänna av pH 4-8 och massa 15-150 kDa29. De 10 platserna utvalda slumpmässigt och märkt figur 2 var exciderad och utsätts för gel avfärgning, trypsin matsmältningen, rening av tryptic peptider, följt av MALDI-MS/MS och LC-ESI-MS/MS analyser. Varje MS/MS datamängd användes för protein identitet med maskot sökning mot humant protein-databasen. För alla ställen, i genomsnitt 1 protein per plats identifierades med MALDI-TOF-TOF MS/MS-analys, medan många proteiner (genomsnitt 63 proteiner i en enda spot gel, genomsnitt 71 proteiner i en pool av 2 matchade platser och ett genomsnitt av 118 proteiner i en pool av 3 matc hed gel fläckar) i varje motsvarande plats identifierades med LC-ESI-MS/MS-analys (tabell 2). Här, måste man nämna att det LC-ESI-MS/MS-systemet har en mycket högre känslighet och upplösning i förhållande till systemets MALDI-MS/MS-analys. Dessa data visar tydligt att varje plats 2D gel innehåller många proteiner, inte bara en eller två proteiner i det komplexa mänskliga cancer vävnad proteomet.

Figure 1
Figur 1 : Silver färgade 2-DE mönster av en FSH-uttryckta NFPA proteomet analyseras med IPGstrip pH 3 - 10 NL och 12% gel koncentrationen av SDS-PAGE. Den röd-brun fläckar är silver-färgade proteinerna är orange bakgrund av silver-färgade gel. Märkt fläckarna analyserades med MALDI-TOF-MS PMF. Återgivits från Wang X, o.a. (2015) 3, med tillstånd från Wiley-VCH. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 : Coomassie blå målat 2-DE mönster av en NFPA proteomet analyseras med IPGstrip pH 3 - 10 NL och 12% gel koncentrationen av SDS-PAGE. Märkt fläckarna analyserades med MALDI-TOF-TOF MS/MS och LC-ESI-MS/MS. Fläckar 1 *, 2 *, 3 *, 5 *, och 16 * var matchade till de motsvarande platserna 1, 2, 3, 5 och 16, och sammanslogs från 2 matchade geler. Modifierad från Zhan X, o.a. (2018) 29, med tillstånd från Wiley-VCH. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Table 1
Tabell 1: Numret av proteiner som identifierades i varje 2DE gel plats med MALDI-TOF-MS PMF analys.

Table 2
Tabell 2: Antal proteiner som identifierades i varje 2DE gel plats med MS/MS-analys.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

2De, tillsammans med MS metoder inklusive 2DE-MS PMF och 2DE-MS/MS, har använts framgångsrikt i vårt långsiktiga program - användning av proteomik för att studera mänskliga NFPA proteomiska variationer och molekylära nätverk variationer för förtydligandet av molekylära mekanismer och upptäckten av effektiva biomarkörer för NFPAs. 2De-baserade jämförande proteomik med bra reproducerbarhet spelar en viktig roll i identifieringen av NFPA proteomiska variationer9,10,11,12,13, 19och 2DE tillsammans med metoden antikropp visar dess fördelar i upptäckten av en given posttranslationella modifieringen och varianter av ett visst protein, såsom detektion av tyrosin nitrering16,17 , 18 och GH varianter14,15.

2DE tillsammans med en MS metod anses dock en arbetskrävande teknik med svårigheter i analyser av låg överflöd proteiner, hydrofoba proteiner, extremt grundläggande eller sura proteiner och extremt låga eller höga massa proteiner2. Till exempel, extremt låg massa (< 10 kDa) eller hög-massa (> 150 kDa) proteiner, och extremt grundläggande (pI > 7,5 eller 8) eller sura (pI < 3,5 eller 4) proteiner inte lätt upptäcks av 2DE med ett 18 cm IPG remsor pH 3-10 NL3. Med den snabba utvecklingen av gel-fri separationsmetoder, inklusive tvådimensionell vätskekromatografi (2D-LC) tillsammans med stabil isotop märkning såsom iTRAQ och TMT i de senaste tio åren23, verkar det att 2-DE har successivt dragit tillbaka sin centrala status i proteomik forskning i analysen av det komplexa vävnad proteomet eftersom 2D-LC tillsammans med stabil isotop märkning och MS/MS-metoder effektivt övervinna nackdelarna med 2DE-baserade metoder.

Senaste studier funnit att, med hjälp av hög känslighet masspektrometri, såsom en LC-ESI-MS/MS (dess känslighet är i 1-10 amol sortimentet) i identifiering av 2DE-separerad proteiner, metoden 2-DE nya egenskaper upptäcktes som visar att en 2D gel plats innehåller många proteiner (tabell 2). Detta stred mot det traditionella begreppet bara en eller två proteiner per plats, vilket framgår av världen 2DPAGE databasen (World-2DPAGE portal: http://world-2dpage.expasy.org/portal). Detta visar tydligt att genomströmningen av 2-DE i identiteten hos proteiner i en komplexa mänskliga proteomet är mycket högre än man tidigare antagit, nämligen att det fanns endast en till två proteiner i en 2D gel plats. Detta techinique erbjuder löftet om användning för 2DE inom proteomik. En 2DE kan skilja över tusen till tio tusen ställen3,8,22 i analysen av det komplexa mänskliga proteomet, således 2DE är en mer detaljerad separation teknik till maximally förenkla komplexiteten i proteomet prov före LC-MS/MS analys i förhållande till 2D-LC systemet att första-dimensionell LC ofta genererar 18 till 30 fraktioner före LC-MS/MS-analys. 2DE i kombination med hög känslighet masspektrometri kan därför användas för att upprätta enorm information referens kartan för det komplexa mänskliga proteomet, särskilt för de låga eller extremt låg överflöd proteiner. Dessutom 2-DE i kombination med stabil isotop märkning (såsom iTRAQ, TMT och SILAC) och hög känslighet masspektrometri kan användas att kvantifiera storskaliga proteomiska variationer bland olika villkor. Dessutom 2DE tillsammans med stabil isotop märkning och hög känslighet masspektrometri har absoluta fördelar i storskaliga identifiering och kvantifiering av protein PTMs, protein varianter, protein artbildning och protein arter. Dessa fördelar måste 2DE återupplivas inom proteomik.

De nuvarande protokoll för analys av mänskliga PA vävnad proteomet beskrivs här översätts dessutom lätt för att studera andra mänskliga sjukdomar proteom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att det inte finns någon intressekonflikt.

Acknowledgments

Detta arbete stöds av National Natural Science Foundation av Kina (Grant nr 81572278 och 81272798 till XZ), anslag från Kina ”863” planera projektet (Grant No. 2014AA020610-1 till XZ), Xiangya sjukhus medlen för talang introduktion (till XZ) och Hunan Provinsiella naturvetenskap Foundation Kina (Grant No. 14JJ7008 till XZ). Författarna också erkänna det vetenskapliga bidraget av Dr Dominic M. Desiderio i University of Tennessee Health Science Center. X.Z. kontinuerligt utvecklat och använt 2DE-MS metoder för att analysera hypofysen adenom proteomet start från 2001, utformade konceptet för det nuvarande manuskriptet, skrev och reviderade manuskriptet, samordnas relevanta arbetet och var ansvarig för den ekonomiskt stöd och motsvarande arbete. Yl deltog i revision av manuskriptet. Y.H deltog i insamling av referenser och revision av manuskriptet. Alla författare godkänt det slutliga manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ettan IPGphor 3  GE Healthcare isoelectric focusing system.
Ettan DALTsix multigel caster Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA
Ettan DALT II System Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA The vertical electrophoresis system
Ettan IPGphor strip holder Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA
Ettan DALTsix multigel caster Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA Multigel caster
Voyager DE STR MALDI-TOF MS  ABI, Foster City,CA MALDI-MS PMF
MALDI-TOF-TOF Autoflex III, Bruker MALDI-MS/MS mass spectrometer
LTQ-OrbiTrap Velos Pro ETD Thermo Scientific, Waltham, MA, USA ESI-MS/MS mass spectrometer
EASY-nano LC system  Proxeon Biosystems, Odense, Denmark High performance liquid chromatography system
PepMap C18 trap column  300 μm i.d. × 5 mm length; Dionex Corp., Sunnyvale, CA, USA
RP C18 column 75 μm i.d., 15 cm length; Dionex Corp., Sunnyvale, CA, USA
KimWipe Kimvipe  Insoluble paper towel
Watter Made by PURELAB flex instrument
Polytron Model P710/35 homogenizer Brinkmann Instruments, Westbury, NY
PDQuest Bio-Rad,  Hercules, CA 2D gel image analysis software
SEQUEST  Thermo Proteome Discoverer 1.3 (version No. 1.3.0.339)
DataExplore (ver. 4.0.0.0) software MS spectrum-processing software
Mascot software PMF-based protein searching software  
Mascot software MS/MS-based protein searching software
Proteome Discoverer software v.1.3 beta Thermo Scientific
Xcalibur software v.2.1 MS/MS data-acquired management software 
Uniprot version 201410.1_HUMAN.fasta Human protein database
SEQUEST (version No. 1.3.0.339)  MS/MS-based protein searching software I
MASCOT (version 2.3.02)  MS/MS-based protein searching software II
C18 ZipTip microcolumn Millipore
PeptideMass Standard kit  Perspective Biosystems
Pierce BCA Protein Assay Kit  Thermo Fisher Scientific 23227
2-D Quant Kit GE Healthcare 80-6483-56
BIS-ACRYLAMIDE AMRESCO 0172
ACRYLAMIDE AMRESCO 0341
DTT Sigma-Aldrich D0632
Thiourea Sigma-Aldrich T8656
Urea VETEC V900119
SDS AMRESCO 0227
CHAPS AMRESCO 0465
TEMED AMRESCO M146
Ammonium Persulfate AMRESCO M133
Trypsin Promega, Madison, WI, USA V5111
IPG buffer pH 3-10, NL GE Healthcare 17-6000-87
Immobiline Dry Strip pH 3-10NL,18cm GE Healthcare 17-1235-01

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhan, X., Wang, X., Cheng, T. Human pituitary adenoma proteomics: new progresses and perspectives. Front. Endocrinol. 7 (54), (2016).
  2. Zhan, X., Desiderio, D. M. Comparative proteomics analysis of human pituitary adenomas: Current status and future perspectives. Mass Spectrom. Rev. 24 (6), 783-813 (2005).
  3. Wang, X., Guo, T., Peng, F., Long, Y., Mu, Y., Yang, H., Ye, N., Li, X., Zhan, X. Proteomic and functional profiles of a follicle-stimulating hormone-positive human nonfunctional pituitary adenoma. Electrophoresis. 36 (11-12), 1289-1304 (2015).
  4. Karppinen, A., Kivipelto, L., Vehkavaara, S., Ritvonen, E., Tikkanen, E., Kivisaari, R., Hernesniemi, J., Setälä, K., Schalin-Jäntti, C., Niemelä, M. Transition from microscopic to endoscopic transsphenoidal surgery for nonfunctional pituitary adenomas. World Neurosurg. 84 (1), 48-57 (2015).
  5. Liu, X., Ma, S., Dai, C., Cai, F., Yao, Y., Yang, Y., Feng, M., Deng, K., Li, G., Ma, W., Xin, B., Lian, W., Xiang, G., Zhang, B., Wang, R. Antiproliferative, antiinvasive, and proapoptotic activity of folate receptor α-targeted liposomal doxorubicin in nonfunctional pituitary adenoma cells. Endocrinol. 154 (4), 1414-1423 (2013).
  6. Zhan, X., Wang, X., Desiderio, D. M. Pituitary adenoma nitroproteomics: current status and perspectives. Oxid. Med. Cell. Longev. 2013, 580710 (2013).
  7. Zhan, X., Wang, X., Desiderio, D. M. Mass spectrometry analysis of nitrotyrosine-containing proteins. Mass Spectrom. Rev. 34 (4), 423-448 (2015).
  8. Zhan, X., Desiderio, D. M. A reference map of a pituitary adenoma proteome. Proteomics. 3 (5), 699-713 (2003).
  9. Desiderio, D. M., Zhan, X. A study of the human pituitary proteome: The characterization of differentially expressed proteins in an adenoma compared to a control. Cell. Mol. Biol. 49 (5), 689-712 (2003).
  10. Zhan, X., Desiderio, D. M. Heterogeneity analysis of the human pituitary proteome. Clin. Chem. 49 (10), 1740-1751 (2003).
  11. Zhan, X., Evans, C. O., Oyesiku, N. M., Desiderio, D. M. Proteomics and tanscriptomics analyses of secretagogin down-regulation in human non-functional pituitary adenomas. Pituitary. 6 (4), 189-202 (2003).
  12. Moreno, C. S., Evans, C. O., Zhan, X., Okor, M., Desiderio, D. M., Oyesiku, N. M. Novel molecular signaling in human clinically non-functional pituitary adenomas identified by gene expression profiling and proetomic analyses. Cancer Res. 65 (22), 10214-10222 (2005).
  13. Zhan, X., Wang, X., Long, Y., Desiderio, D. M. Heterogeneity analysis of the proteomes in clinically nonfunctional pituitary adenomas. BMC Med. Genomics. 7, (2014).
  14. Zhan, X., Giorgianni, F., Desiderio, D. M. Proteomics analysis of growth hormone isoforms in the human pituitary. Proteomics. 5 (5), 1228-1241 (2005).
  15. Kohler, M., Thomas, A., Püschel, K., Schänzer, W., Thevis, M. Identification of human pituitary growth hormone variants by mass spectrometry. J. Proteome Res. 8 (2), 1071-1076 (2009).
  16. Zhan, X., Desiderio, D. M. The human pituitary nitroproteome: detection of nitrotyrosyl-proteins with two-dimensional Western blotting, and amino acid sequence determination with mass spectrometry. Biochem. Biophys. Res. Commun. 325 (4), 1180-1186 (2004).
  17. Zhan, X., Desiderio, D. M. Nitroproteins from a human pituitary adenoma tissue discovered with a nitrotyrosine affinity column and tandem mass spectrometry. Anal. Biochem. 354 (2), 279-289 (2006).
  18. Zhan, X., Desiderio, D. M. Linear ion-trap mass spectrometric characterization of human pituitary nitrotyrosine-containing proteins. Int. J. Mass Spectrom. 259, 96-104 (2007).
  19. Zhan, X., Desiderio, D. M., Wang, X., Zhan, X., Guo, T., Li, M., Peng, F., Chen, X., Yang, H., Zhang, P., Li, X., Chen, Z. Identification of the proteomic variations of invasive relative to noninvasive nonfunctional pituitary adenomas. Electrophoresis. 35 (15), 2184-2194 (2014).
  20. Zhan, X., Desiderio, D. M. Signal pathway networks mined from human pituitary adenoma proteomics data. BMC Med. Genomics. 3, 13 (2010).
  21. O’Farrell, P. H. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J. Biol. Chem. 250 (10), 4007-4021 (1975).
  22. Klose, J., Kobalz, U. Two-dimensional electrophoresis of proteins: an updated protocol and implications for a functional analysis of the genome. Electrophoresis. 16 (6), 1034-1059 (1995).
  23. Zhan, X. Current status of two-dimensional gel electrophoresis and multi-dimensional liquid chromatography as proteomic separation techniques. Ann. Chromatogr. Sep. Tech. 1 (2), 1009 (2015).
  24. Wasinger, V. C., Cordwell, S. J., Cerpa-Poljak, A., Yan, J. X., Gooley, A. A., Wilkins, M. R., Duncan, M. W., Harris, R., Williams, K. L., Humphery-Smith, I. Progress with gene-product mapping of the Mollicutes: Mycoplasma genitalium. Electrophoresis. 16, 1090-1094 (1995).
  25. Zhan, X., Desiderio, D. M. Differences in the spatial and quantitative reproducibility between two second-dimensional gel electrophoresis. Electrophoresis. 24 (11), 1834-1846 (2003).
  26. Zhan, X., Desiderio, D. M. Spot volume vs. amount of protein loaded onto a gel. A detailed, statistical comparison of two gel electrophoresis systems. Electrophoresis. 24 (11), 1818-1833 (2003).
  27. Zhan, X. Two-dimensional electrophoresis. Experimental Protocols for Medical Molecular Biology in Chinese and English. Zheng, W. , Peking Union Medical College Press. Beijing. 93-108 (2005).
  28. Electrophoresis in Practice: A guide to Methods and Applications of DNA and Protein Separations. Westermeier, R. , VCH Wiley. Weinheim. (1997).
  29. Zhan, X., Yang, H., Peng, F., Li, J., Mu, Y., Long, Y., Cheng, T., Huang, Y., Li, Z., Lu, M., Li, N., Li, M., Liu, J., Jungblut, P. R. How many proteins can be identified in a 2DE gel spot within an analysis of a complex human cancer tissue proteome? Electrophoresis. , (2018).

Tags

Cancerforskning fråga 134 tvådimensionell gelelektrofores isoelektrisk fokusering akrylamid gelelektrofores silverfärgning Coomassie färgning bildanalys peptid massa fingeravtryck (PMF) Tandem Mass Spectrometry (MS/MS) hypofys Adenom proteomet
Tvådimensionell gelelektrofores tillsammans med masspektrometri metoder för en analys av mänskliga hypofysen adenom vävnad proteomet
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhan, X., Huang, Y., Long, Y.… More

Zhan, X., Huang, Y., Long, Y. Two-dimensional Gel Electrophoresis Coupled with Mass Spectrometry Methods for an Analysis of Human Pituitary Adenoma Tissue Proteome. J. Vis. Exp. (134), e56739, doi:10.3791/56739 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter