Cancer Research

Eletroforese em Gel bidimensional juntamente com métodos de espectrometria de massa para uma análise do proteoma de tecido humano Adenoma de hipófise

Published: April 2, 2018 doi: 10.3791/56739

Xianquan Zhan^1,2,3,4, Yuda Huang^1,2,3, Ying Long^1,2,3

¹Key Laboratory of Cancer Proteomics of Chinese Ministry of Health, Xiangya Hospital, Central South University, ²Hunan Engineering Laboratory for Structural Biology and Drug Design, Xiangya Hospital, Central South University, ³State Local Joint Engineering Laboratory for Anticancer Drugs, Xiangya Hospital, Central South University, ⁴The State Key Laboratory of Medical Genetics, Central South University

Summary

Aqui, apresentamos uma eletroforese em gel bidimensional (2DE) acoplada com espectrometria de massa (MS) para separar e identificar adenoma de hipófise humana tecido proteome, que apresenta um padrão de 2DE bom e reprodutíveis. Muitas proteínas são observadas em cada ponto de 2DE quando analisando proteome complexo de câncer com o uso de MS de alta sensibilidade.

Abstract

Adenoma de hipófise humana (PA) é um tumor comum que ocorre na glândula pituitária humana nos sistemas de eixo hipotálamo-hipófise-alvo do órgão e pode ser classificado como PA clinicamente funcional ou não funcional (FPA e NFPA). NFPA é difícil para o diagnóstico precoce de palco e terapia devido ao mal, elevando hormônios no sangue em comparação com a FPA. O nosso objectivo a longo prazo é usar métodos de proteômica para descobrir biomarcadores confiáveis para o esclarecimento dos mecanismos moleculares de PA e reconhecimento de marcadores eficazes de diagnósticos, prognósticos e alvos terapêuticos. Eletroforese em gel bidimensional eficaz (2DE) juntamente com métodos de espectrometria de massa (MS) foram apresentados aqui para analisar humana proteomes PA, incluindo a preparação de amostras, análise de imagem, em-gel electroforese do gel 2D, visualização de proteína digestão do trypsin, impressão digital em massa de peptídeo (PMF) e em tandem (MS/MS) de espectrometria de massa. 2-dimensional gel de electroforese do laser assistida por matriz dessorção/ionização espectrometria de massa PMF (2DE MALDI MS PMF), 2DE MALDI MS/MS e os procedimentos de MS/MS cromatografia líquido-2DE (LC) foi aplicado com sucesso em uma análise do proteoma NFPA. Com o uso de um espectrômetro de massa de alta sensibilidade, muitas proteínas foram identificadas com o método de 2DE-LC-MS/MS em cada ponto em uma análise do tecido complexo de PA para maximizar a cobertura de proteome humano de PA de gel 2D.

Introduction

PA é um tumor comum que ocorre na glândula pituitária humana nos sistemas eixo hipotálamo-hipófise-alvo do órgão, que desempenham importantes funções no sistema endócrino humano. PA inclui funcionais e clinicamente PAs (FPA e NFPA)¹^,². NFPA é difícil no início fase de diagnóstico e terapia por causa dos níveis de hormônio apenas ligeiramente elevada (por exemplo, LH e FSH) no sangue em comparação com FPA, que aumentou significativamente os níveis de hormônios correspondentes no sangue³^,⁴ ^,⁵. O esclarecimento dos mecanismos moleculares e descoberta de biomarcadores eficazes tem significado clínico importante no diagnóstico, terapêutica e prognóstico da NFPA. O nosso objectivo a longo prazo é desenvolver e usar métodos de proteomic estudar NFPA para a descoberta de biomarcadores confiáveis para esclarecer seus mecanismos moleculares, e reconhecer alvos terapêuticos eficazes, bem como marcadores de diagnósticos e prognósticos. 2-DE juntamente com MS métodos têm sido utilizados extensivamente em nosso programa de investigação a longo prazo em matéria humana PA proteome¹^,²^,⁶^,⁷, incluindo o estabelecimento de referência proteome mapas de³^,⁸, análise de proteínas diferencialmente expressos perfis⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³, variantes de hormônio¹⁴ ^,¹⁵, modificações borne-translational como fosforilação¹⁴ e tirosina nitração¹⁶^,¹⁷^,¹⁸, a variação de proteomic de invasoras relativo a não-invasiva NFPAs¹⁹e a heterogeneidade de proteomic do NFPA subtipos¹³, que levou à descoberta de várias redes de importante via (disfunção mitocondrial, desregulação do ciclo celular, estresse oxidativo e MAPK sinalização anormalidade do sistema) que são alteradas em NFPA¹³^,¹⁹^,²⁰.

2DE separa as proteínas de acordo com seu ponto isoelétrico (pI) (isoeléctrica, IEF) e o peso molecular (através de sódio Dodecil sulfato poliacrilamida electroforese do gel, SDS-PAGE)¹^,²^,³^, ⁴ ^, ⁵ ^, ⁶ ^, ⁷ ^, ⁸ ^, ⁹ ^, ¹⁰ ^, ¹¹ ^, ¹² ^, ¹³ ^, ¹⁴ ^, ¹⁵ ^, ¹⁶ ^, ¹⁷ ^, ¹⁸ ^, ¹⁹ ^, ²⁰ ^, ²¹ ^, ²² ^, ²³. esta é uma técnica de separação comum e clássico no campo da proteômica, desde a introdução dos conceitos do proteoma e proteômica em 1995²⁴. MS é a técnica fundamental para descobrir a identidade de proteínas 2DE separada, incluindo estratégias PMF e MS/MS. O desenvolvimento muito rápido dos instrumentos de MS, especialmente nos aspectos de sensibilidade detecção e resolução, em combinação com a melhoria do sistema de LC, melhora consideravelmente a identidade das proteínas de baixa ou extremamente baixa abundância em um proteome para maximizar o cobertura de um proteome. Ele também desafia nossos conceitos tradicionais que apenas uma ou duas proteínas estão presentes em um gel 2D em uma análise do complexo tecido humano proteome local e oferece uma oportunidade para identificar várias proteínas em um ponto em uma análise do tecido humano complexo de gel 2D proteoma e maximizar a cobertura de proteome NFPA.

Aqui descrevemos protocolos detalhados de 2DE MALDI MS do DPP, 2DE MALDI MS/MS e 2DE-LC-MS/MS, que tem sido utilizada com sucesso na análise do proteoma humana de NFPA. Os protocolos incluem a preparação de amostras, primeiro dimensão (isoeléctrica, IEF), segunda dimensão (SDS-PAGE), visualização de proteínas (coloração prata e azul de Coomassie coloração), análise de gel 2D, digestão de tripsina em gel, da imagem purificação de peptídeos tryptic, PMF, MS/MS e banco de dados Cauterizante³^,⁸^,²⁵^,²⁶. Além disso, este protocolo traduz facilmente para a análise de outros proteomes de tecido humano.

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Protocol

O presente protocolo segue as diretrizes do Xiangya Hospital médica ética Comitê da Central South University, China. Um tampão principal e luvas devem ser usadas para todo o procedimento experimental evitar a contaminação de queratina do cabelo e pele⁸.

1. preparação das amostras

Colete tecidos PA (0,2 - 0,5 mg) do departamento de neurocirurgia. Congelar imediatamente em nitrogênio líquido e depois transferir a-80 ° C para armazenamento.
Adicionar 2 mL de 0,9% NaCl em água destilada deionizada (ddH₂O). Use esta solução levemente lavar o sangue da superfície de tecido (3x).
Nota: ddH₂O condutividade de 18,2 MΩ/cm é usado em todo o protocolo. Alguns do tissuemight ser perdidas quando lavando o sangue da superfície de um tecido.
Adicionar um volume (10 mL; 4 ° C) da solução contendo ácido acético de 2 M e 0,1% (v/v) β-Mercaptoetanol para cada 0,5 - 0,6 g de tecido, homogeneizar (1 min, 13.000 rpm, 4 ° C, 10 x) com um homogeneizador, proceda à sonicação o homogeneizado por 20 s, lyophilize e armazenar a −80 ° C.
Medir o teor de proteína do liofilizado, amostras homogeneizadas usando o ácido bicinchoninic (BCA) kit de ensaio.
Nota: Quantificação de BCA não é uma quantificação absoluta, e o resultado medido será alterado com um técnico diferente e o agente experimental. Um padrão de amostra de concentração fixa deve ser usado para experiências diferentes. Portanto, a quantidade de carga final de proteínas para cada gel 2D será determinada com a prata manchada ou manchadas de Coomassie bom-resolução de imagem nas experiências de pre-projetadas.
1. Adicionar cerca de 300 µ g de amostra homogeneizada liofilizada (282 µ l) de um volume de extração de proteínas buffer (ureia 8m e 4% de CHAPS), seguido por em pé por 2 h, sonicating em um banho de água durante 5 minutos, girando por 1h, sonicating novamente em banho-maria por 5 min , girar novamente por 1h e centrifugação a 15.000 x g por 20 min.
2. Preparar soluções-padrão BSA com concentrações como mencionado: 0, 25, 125, 250, 500, 750, 1.500, 2.000 µ g/mL com o padrão de BSA comercial (2 mg/mL).
3. Reagente de Mix BCA A e B (A:B = 50: 1) como solução de trabalho de BCA antes de usar.
4. Adicione 0,1 mL de amostra ou solução padrão de 2 mL de solução de trabalho de BCA em um tubo de microcentrífuga, seguido de mistura e então incubar a 37 ° C por 30 min. Finalmente esfriar em temperatura ambiente por 10 min e medida A_{562 nm} OD valor.
5. Calcular a linha linear padrão (A_{562 nm} vs. concentração de BSA) para obter uma equação de regressão para o cálculo da proteína de amostra conteúda com um valor de_562nm .
Use 150 µ g da amostra liofilizada equivalente da proteína para a coloração de prata, ou 500 µ g de proteína por Coomassie mancha, para um pH de faixa pH imobilizado 18cm gradiente (IPG) 3-10 não-linear (NL).
Nota: A faixa seca de IPG é 0.5-mm largura espessura e 3 mm, com comprimentos diferentes, incluindo 7, 11, 13, 18 e 24 cm e intervalos de pH diferentes incluindo pH 4-5, 4-7, 6-9 e 10-3 em qualquer um gradiente de pH linear ou não linear. O buffer IPG usado deve caber a faixa²⁷^,²⁸.
1.6.Add 250 µ l de tampão de extração (7m ureia, tioureia 2m, CHAPS de 4% (p/v), 100 mM DTT (adicionar antes da sua utilização), 0,5% v/v pharmalyte (adicionar antes da sua utilização) e um traço de azul de bromofenol).
Manter a solução abaixo de 30 ° C, seguido por num Vortex durante 5 min, sonicating por 5 min e girando por 50 min.
Adicionar 110 µ l de tampão de reidratação (7m ureia, tioureia 2m, CHAPS de 4% (p/v), 60 mM DTT (adicionar antes da sua utilização), buffer de IPG 0,5% v/v (adicionar antes da sua utilização) e um traço de azul de bromofenol). Proceda à sonicação por 5 min. Em seguida, gire a amostra por 50 min, vórtice por 5 min e centrifugar por 20 min a 15.000 x g.
Recolha o sobrenadante (350 µ l) como o de solução de amostra de proteína⁸.

2. eletroforese em Gel bidimensional

IEF (primeira dimensão): execute IEF sobre o sistema de focalização isoelétrico, conforme descrito abaixo.
1. Adicione 350 µ l da solução da amostra de proteína na abertura de um detentor de tira IPG de 18 cm.
2. Colocar um 18cm IPG tira gel-lado-para baixo para a solução de amostra de proteína (evitar bolhas).
3. Adicione 3-4 mL de óleo mineral para cobrir a faixa de IPG.
4. Monte o titular tira do IPG na expelir focalização isoelétrica a extremidade pontiaguda na extremidade quadrada na placa frontal (−) e placa traseira (+).
5. Reidratar durante a noite (~ 18 h à temperatura ambiente).
6. Definir os parâmetros do IEF: máximo atual 30 µA por tira, 20 ° C; 250 V, 1 h, 125 Vh, passo e segure; 1.000 V, gradiente de 1 h, 500 Vh, 8.000 V, gradiente de 1 h, 4.000 Vh, 8.000 V, 4 h, 32.000 Vh, passo e segure; e 500 V, 0,5 h, 250 Vh, passo e segure. Deixá-lo correr para um tempo total de 7,5 h e Vh 36.875.
7. Depois IEF, pegue cada tira IPG e remover o óleo mineral extra com uma toalha de papel insolúvel. Agora enrole a tira em uma folha de plástico e armazenar a −80 ° C.
  Nota: O titular de IPGstrip deve ser limpos com o suporte de IPGstrip solução de limpeza e água destilada.
SDS-PAGE (segunda dimensão): executar SDS-PAGE em um sistema de eletroforese Vertical célula
Nota: Cada tamanho do gel de SDS-PAGE deve ser 255 x 190 x 1 mm.
1. Usar um rodízio de gel multi para converter 12% página resolução de géis. Carcaça 12% gel de página, execute as seguintes etapas.
  1. 270 ml de DDQ₂O, 150 mL de 1.5 M Tris-HCl (pH 8,8), 180 mL de solução-mãe de acrilamida/bisacrylamide 40% (p/v) (29:1, 40% w/v acrilamida e 1,38% w/v N, N'-methylenebisacrylamide), 3 mL de persulfato de amónio de 10% e 150 µ l de TEMED tornar-se o gel solução em um béquer. Misture delicadamente e evitar bolhas.
  2. Despeje a solução de gel suavemente na câmara de multicast até à altura do esperado gel (19 cm).
  3. Imediatamente Adicione cerca de 3 mL ddH₂O em cada gel de resolução para cobrir os géis. Deixe o gel polimerizar-se por cerca de 1h.
2. Prepare 20 L de tampão de eletroforese (25 mM Tris, glicerina 192 mM e 0,1% SDS). Encha o tanque de reserva de unidade de separação de eletroforese com esse buffer.
3. Retire as tiras IPG focadas no freezer e equilibrar as tiras por 10 min, agite-o delicadamente em 4 mL de reduzir a reserva de equilíbrio (375 mM Tris-HCl (pH 8,8), ureia de 6 M, 2% (p/v) SDS, 20% (v/v) glicerol, 2% w/v DTT (adicionar antes do uso) e um traço de azul de bromofenol).
4. Equilibrar durante 10 minutos, agite-o delicadamente as tiras IPG reduzidas em 4 mL de tampão de equilíbrio alquilação (375 mM Tris-HCl (pH 8,8), ureia de 6 M, 2% (p/v) SDS, 20% (v/v) glicerol, iodoacetamide 2,5% p/v (adicionar antes da sua utilização) e um traço de azul de bromofenol).
5. Durante o gel de equilíbrio, desmontar a câmara de difusão seletiva e retire a fita de gel de resolução preparada. Lavar 3x com DDQ₂O. Remove excesso ddH₂O com uma toalha de papel insolúvel e colocar em um gel de stander.
6. Enxagúe as tiras de IPG equilibradas com tampão de eletroforese e remover o excesso de líquido na superfície de tira IPG com a toalha de papel insolúvel.
7. Coloque uma tira IPG do gel de SDS-PAGE a resolução e deixa a lateral de plástico da tira IPG entre em contato com a placa de vidro mais longa e a ponta para a esquerda.
8. Despeje 3-4 mL de agarose a 1% em tampão de eletroforese SDS (~ 80 ° C) rapidamente para a IPG tira do selo quente no topo de cada gel de SDS-PAGE e colocar o lado superior da faixa de IPG até o topo da placa de vidro mais curto, sem bolhas e então polimerizar por 10 min.
9. Insira a fita de gel de montado verticalmente entre juntas de plástico no sistema de eletroforese vertical. Coloque a parte superior do gel com o IPG strip e ao lado do cátodo (−).
10. Ajuste o nível do tampão de eletroforese de imergir a fita de gel.
11. Conectar-se e definir a unidade de alimentação/controle de energia em modo de tensão constante e executar a 200 V para cerca de 370 min enquanto monitora o corante.
12. Após a execução, retire a fita de gel do sistema de eletroforese e remova cuidadosamente o gel o gel de cassete, evitando rasgar o gel, seguido pela coloração de proteínas 2DE separada.
Coloração de proteínas 2DE separada
1. Coloração prata
  1. Transferir suavemente o gel com as duas mãos em uma bandeja contendo 250 mL de solução de fixação (metanol 50% (v/v) e 5% (v/v) de ácido acético) e agite suavemente o gel por 20 min.
  2. Descartar a solução e adicionar 250 mL de metanol a 50% (v/v) na bandeja e agite por 10 min.
  3. Descartar o metanol e adicione 250 mL de DDQ₂O na bandeja. Agitar suavemente durante 10 min.
  4. Homogeneizar o gel por 1 min em 250 mL de solução tampão de sensibilização com tiossulfato de sódio 0,02% (p/v) e descarte o líquido.
  5. Agite suavemente o gel em 250 mL de DDQ₂O por 1 min (repetir mais uma vez). Descarte o líquido depois de cada passo.
  6. Agite suavemente o gel por 20 min em solução de reação de 250 mL de prata (nitrato de prata 0,1% (p/v) com formol de 37% (v/v) 200 µ l adicionado antes do uso).
  7. Agite suavemente o gel em 250 mL de DDQ₂O por 1 min (repetir mais uma vez). Descarte o líquido depois de cada passo.
  8. Agitar o gel suavemente em 250 mL de solução de desenvolvimento (3% (p/v) de carbonato de sódio com formol de 37% (v/v) 100 µ l adicionado antes do uso) até obter a intensidade desejada de coloração (geralmente 1-3 min), em seguida, descartar o líquido.
  9. Homogeneizar o gel por 10 min em 250 mL de solução (ácido acético a 5% (v/v)) a parar e descarte o líquido.
  10. Homogeneizar por 5 min em 250 mL de DDQ₂O e descarte o líquido.
  11. Manter o gel em 250 mL de armazenar a solução de glicerol de 8,8%, a 4 ° C.
2. Coloração azul brilhante de Coomassie
  1. Preparar a coloração solução dissolvendo Coomassie brilhante de Coomassie blue G250 0,3 g, sulfato de amônio 25 g e ácido fosfórico 25 mL em ddH₂O e até um volume total de 200 mL. Antes da utilização, adicionar metanol 50 mL.
  2. Adicionar 250 mL de Coomassie manchando a solução para o gel e agite suavemente à temperatura ambiente até clear aparecer manchas de proteínas (~ 2-4 h). Descarte o líquido.
  3. Adicionar 250 mL de DDQ₂O e agitar lentamente durante 5 min, então duas vezes mais. Descarte o líquido.
  4. Adicionar 250 mL de solução de descoloração (20% (v/v) de etanol) e agitar lentamente até que a cor de fundo tornam-se quase incolor e descarte o líquido.
  5. Substitua a solução de descoloração fresca quando o velho um está ficando escuro e descarte o líquido.
  6. Adicionar 250 mL de DDQ₂O e agitar lentamente durante 5 min. descarte o líquido.
  7. Adicionar 250 mL de solução (8,8% glicerol) de armazenar e manter a 4 ° C.
Análise de imagem de electroforese do gel bidimensional
1. Digitalize os géis corados com um scanner de mesa.
2. Entrada da imagem para o sistema de análise de imagem 2D coagule.
3. Detectar e quantificar cada ponto usando um software de análise de imagem 2D gel de acordo com o protocolo do fabricante.
4. Coincidir com os pontos entre diferentes géis.

3. identificação das proteínas 2DE separada com MS

Preparação da mistura de tryptic do peptide
Nota: Siliconizado ou baixa retenção de tubos e pontas de pipeta devem ser usadas para evitar qualquer perda de proteínas ou peptídeos.
1. Prata-gel descoloração
  1. Excisar o gel manchas em um 1,5 mL siliconizado do tubo e lavagem em 500 µ l ddH₂O 6 vezes.
  2. Coloque o gel lavado em um novo tubo de 1,5 mL siliconizado e piquem-em muitos pedaços pequenos (0,5-1 mm³).
  3. Destain os pedaços de gel em 20 µ l da solução de descoloração que mistura uma parte de ferricianeto de potássio de 30 mM e uma parte de 100 mM de tiossulfato de sódio (1:1) antes da sua utilização para deixar a cor acastanhada desaparecerem (geralmente 1-2 min). Descarte o líquido.
  4. Lave os pedaços de gel com 20 µ l de DDQ₂O 5 - 6 vezes para deixar a cor amarela desaparecer. Descarte o líquido depois de cada passo.
  5. Adicionar 20 µ l de bicarbonato de amónio de 200 mM para os pedaços de gel e permanecer por 20 min. Lave os pedaços de gel com O ddH₂(20 µ l, 1 hora). Descarte o líquido.
  6. Desidrate os pedaços de gel com acetonitrilo 30 µ l de pelo menos duas vezes para deixar os pedaços de gel de virar um branco opaco e vácuo-centrífuga seco por 30 min.
2. Descoloração de gel azul brilhante de Coomassie
  1. Cortar um tubo de 1,5 mL siliconizado gel manchas e lave com 500 µ l ddH₂O pelo menos 3 vezes.
  2. Coloque o gel lavado em um novo tubo siliconizado de 1,5 mL e piquem-o em vários pedaços (0,5-1 mm³) com uma ponta da pipeta.
  3. Destain o gel em 50-100 µ l descoloração solução (1:1 v/v mistura 200mm NH₄HCO₃ com acetonitrilo) dependendo do volume de gel, incubar a 37 ° C em banho-maria. Repetir e adicionar solução fresca de descoloração até que a cor desaparece (~ 1 h). Descarte o líquido depois de cada passo.
  4. Lave os pedaços de gel de uma vez com 20 µ l de DDQ₂O.
  5. Desidrata-se os pedaços de gel em 100 µ l acetonitrilo (pelo menos duas vezes) para deixar os pedaços de gel de transformar um opaco branco.
  6. Vácuo seco por 30 min.
3. Em-gel tripsina digestão das proteínas em gel seco peças
  1. Dissolva 20 µ g (833 pmol) de pó liofilizado tripsina em 100 µ l de ácido acético de 50 mM.
  2. Dilua 20 µ l de solução de tripsina (200 ng / µ l) a 16 ng / µ l com 230 µ l de bicarbonato de amónio de 50 mM.
  3. Adicionar 20-30 µ l (0.32-0.48 µ g) da solução de tripsina diluídos a cada tubo contendo pedaços de gel de secas. Incube por 18-20 h em um 37 ° C em banho-maria. Deixe a solução a 4 ° C por 30 min.
  4. Centrifugar a solução suavemente durante 10 s. Sonicate em um banho de água durante 5-6 min a 30 ° C e em seguida centrifugar a 12.000 x g por 2 min.
  5. Recolha o sobrenadante contendo o peptídeo tryptic mistura em um tubo de 0,5 mL siliconizado.
4. Purificação da mistura de tryptic peptídeo com microcolumn C18.
  1. Lave cada coluna C18 com acetonitrilo (10 µ l, 5 vezes) e depois com 50% acetonitrila (10 µ l, 5 vezes).
  2. Equilibrar com 0,1% ácido acético de trifluoro (TFA) (10 µ l, 5 vezes).
  3. Pipete o exemplo acima e para baixo através da coluna C18 preparada por 15 vezes.
  4. Lavar a amostra 2 x com 10 µ l 0,1% TFA.
    Nota: Os peptídeos tryptic purificados são retidos na coluna C18.
  5. Adicionar um volume (6 µ l) de solução (85% v/v acetonitrile/0.1% fórmico ácido v/v) em um tubo siliconizado limpo 0,5 mL, pipetar esta solução suavemente e lentamente acima e para baixo através do peptide-C18 grânulos para 10x lavar os peptídeos de vínculo na solução, secar ao ar livre e loja (−20 ° C) para análise de MS.
Análise de MS
1. Análise de PMF MALDI-MS
  1. Adicione 4 µ l de 85% v/v acetonitrile/0.1% v/v TFA para dissolver a mistura de peptídeo tryptic purificada. Carga 2 µ l dissolvido peptídeo tryptic mistura em um prato MALDI e imediatamente adicionar 2 µ l de solução de ácido а-cyano-4-hidroxicinâmicos (CHCA) que contém 10 g/L em acetonitrila 500 mL/L 1 mL/L TFA, depois deixe secar naturalmente.
  2. Carrega a placa MALDI com mistura de tryptic peptídeo em um espectrômetro de massa MALDI-MS.
    Nota: Os parâmetros do instrumento são definidos como modo de refletor com 20 kV tensão, polaridade positiva e tempo de extração de atraso ns 160 a acelerar. Cada espectro de MS é adquirido com 200 tiros de laser com uma variedade de m/z 1.000 a 4.000 após calibração externa com o padrão do peptide mass.
  3. Use um software de processamento de espectro de MS para processar cada espectro de MS, incluindo correção de linha de base, remoção de ruído (5%) e deisotoping de pico.
  4. Corrigi a lista de massa de cada espectro de MS com a remoção de contaminantes massas de tripsina, matriz, queratina e outros contaminantes desconhecidos no paralelo de experimentos em branco-gel.
  5. Entrada a massa corrigida listar em uma proteína baseada em PMF procurando software para identificar proteínas no banco de proteína de Swiss-Prot com os seguintes parâmetros de pesquisa, incluindo o tipo de pesquisa do DPP, humano, clivagem de tripsina com máximo de 1 falta, fixada carbamidomethyl, cisteína, metionina variável oxidação, monoisotópico, tolerância de massa do peptide 50 ppm, carga do peptide do estado (1 +) e sinal para ruído (S/N) 5.0.
  6. Identificar proteínas com golo de proteína estatisticamente significativo, e onde a proteína pontuação =-10 × log(p), onde p é a probabilidade de que a correspondência observada é um evento aleatório.
2. Análise de MALDI-MS/MS
  1. Adicione 4 µ l de 50% v/v acetonitrile/0.1% v/v TFA para dissolver a mistura de peptídeo tryptic purificada. Cada mistura purificada tryptic peptídeo (0,5 µ l) foi manchada em uma 384 MALDI-placa, imediatamente vista 0,5 µ l de matriz CHCA saturada em 50% acetonitrile/0.1% TFA na parte superior da amostra de peptídeo e depois de seco no ar.
  2. Deixe a MALDI-TOF-TOF MS/MS para ser gerenciada automaticamente, usando 100 tiros de laser para adquirir um espectro MS1, e acumular 6 repetido MS1 espectros em um espectro de MS1 sintético.
  3. Conjunto 4 íons de precursor mais intensa de cada espectro MS1 sintético para análise de MS/MS. Uso do laser de 100 tiros para cada íon precursor adquirir um espectro de MS/MS e acumular 4 repetido espectros de MS/MS em um espectro de MS/MS sintético.
  4. Use os dados sintéticos de MS/MS para procurar proteínas através de uma proteína baseada em MS/MS Pesquisar softwares com parâmetros incluindo MS/MS Ion Search, Swiss-Prot humano de banco de dados, tripsina com um máximo de 1 clivagem perdida, carbamidomethyl fixo (C), variável Oxidação (M), valor de massa monoisotópico, peptídeo massa tolerância ± 100 ppm e o fragmento massa tolerância ± 0,7 Da.
  5. Identificar uma proteína com uma probabilidade estatisticamente significativa, com base na pontuação de Mowse e pontuação de íons = -10 x Log(P), onde p é a probabilidade de que a correspondência observada é um evento aleatório.
3. Análise de LC-ESI-MS/MS
  1. Adicione 6 µ l de ácido fórmico 5% v/v acetonitrile/0.1% v/v para dissolver a mistura de peptídeo tryptic purificada.
  2. Utilização de um sistema de cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) on-line juntamente com uma ionização electrospray (ESI)-MS/MS massa espectrômetro com um software de gerenciamento de dados adquiridos de MS/MS para gerenciar toda a operação.
  3. Use a coluna de armadilha C18 (300 µm identificação × 5 mm de comprimento) e a coluna de fase reversa C18 (75 µm identificação x 15 cm de comprimento) com um gradiente de separação em 98% solvente um (0,1% de ácido fórmico) e a 2% solvente B (0,1% ácido fórmico em 100% acetonitrila) por 2 min , 2% a 40% de solvente B para 95% solvente B durante 10 minutos (um total de 65 min em 300 nL/min), 40% a 95% solvente B por 5 min e 45 min.
  4. Definir modo de iões positivos e modo dependente de dados de pesquisa automática para adquirir espectros de MS e MS/MS e definir a dissociação induzida por colisão (CID) para a fragmentação do íon.
  5. Defina cada verificação de MS a um intervalo de massa de m/z 350-1.800 com uma resolução de 100.000 m/z 400. Execute a varredura para os 7 íons mais intensa no MS scan.
  6. Proteína baseada em uso MS/MS Pesquisar softwares que para pesquisar o banco de dados para identificação de proteínas.
    1. Selecione o banco de proteína humana.
    2. Selecione a tripsina com uma clivagem perdidas permitida.
    3. Defina a tolerância de peptídeo (± 10 ppm), fragmento de tolerância do íon (±0.8 Da), carbamidomethylation de carga (2 + 3 + e 4 +), fixa peptídeo em cisteína e oxidação variável em metionina.
    4. Definir taxas de falsa da descoberta (FDR) < 1% e apenas peptídeos com rank 1 são aceitos.
    5. Identificar a proteína com PSM≥1 (PSMs: O número total de sequências de peptídeo identificados (PSMs) para a proteína, incluindo aqueles identificados de forma redundante) e pelo menos dois peptídeos exclusivos por proteína.
  7. Também, use MS/MS-software com base em proteína busca II para pesquisar o banco de dados para identificação de proteínas.
    1. Converta o arquivo raw da MS para um arquivo de .mgf.
    2. Selecionado o banco de dados da proteína humana (uniprothuman_20161031.fasta que contém 70940 sequências e 23897047 resíduos).
    3. Selecione a digestão do trypsin, com um máximo de 2 decotes perdidas.
    4. Conjunto fixada carbamidomethyl (C), a variável desamidados (NQ) e a oxidação (M), a tolerância da massa 10 ppm, tolerância da massa 0,8 do íon filha do íon precursor Da e o pico de monoisotópico.
    5. Identifica proteínas com um limiar de significância de 0,05 e pelo menos 2 peptídeos exclusivos.

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Representative Results

1. 2DE MALDI MS PMF: com o procedimento experimental descrito acima, um total de 150 µ g de proteínas foram extraídos de tecidos NFPA FSH-expresso (fêmea; 50 anos de idade, ACTH (-), GH (-), PRL (-), LH (-), FSH (+) e TSH (-)) e se vestiu com um 18 cm Faixa de IPG (pH 3-10 NL) e um gel de SDS-PAGE de grande formato, depois visualizadas com coloração de prata. Obtivemos um 2DE reproduzíveis e bom gel de padrão de NFPA proteome de tecido (Figura 1), com um desvio médio posicional de 1,98 ± 0,75 mm na direção do IEF e 1,62 ± 0,68 mm na direção de SDS-PAGE e com uma manchas de proteína aproximadamente 1.200 detectado no mapa de gel 2DE que distribuíram-se principalmente na zona de pH 4-8 e 15-150 massa kDa³. No total, 337 pontos de gel foram extirpados e submetidos a descoloração do gel, digestão do trypsin, purificação de tryptic peptídeos e análise de PMF MALDI-TOF-MS. Dados PMF foi usados para identidade de proteína com busca de mascote contra banco de proteína humana. Um total de 192 proteínas redundantes (representando 107 proteínas não redundante) foram identificados de 141 gel manchas fora 337 pontos analisados gel (141/337 = 42%), e nenhuma proteína foi identificada em 196 pontos (196/337 = 58%) (Tabela 1). Para aqueles 141 pontos, apenas uma proteína por local foi identificada em 121 pontos, 2 proteínas por local foram identificadas em 12 pontos (pontos 31, 32, 33, 41, 42, 43, 44, 68, 75, 137, 148 e 224), 5 proteínas por local foram identificadas em 3 pontos (pontos 19 22 e 23), 6 proteínas por local foram identificadas em 3 pontos (pontos 24, 91 e 93) e 7 proteínas por local foram identificadas em 2 pontos (pontos 72 e 92).

2. 2DE MALDI MS/MS e 2DE-LC-MS/MS: usando o procedimento experimental descrito acima, um total de 500 µ g de proteínas extraídas de um tecido NFPA invasivo (masculino, 22 anos de idade, ACTH (-), hGH (-), PRL (+ +), (-) de LH e FSH (-)) achava-se vestida com um 18cm IPG strip ( pH 3-10 NL) e um gel de SDS-PAGE de grande formato, depois visualizadas com coloração Coomassie Blue G250. Esta coloração gerou um padrão de gel 2DE reprodutíveis e de alta qualidade do proteome de tecido invasiva NFPA (Figura 2), com um desvio médio posicional de 1,95 ± 0,85 mm na direção do IEF e 1,85 ± 0,79 mm na direção de SDS-PAGE e com aproximadamente proteína de 1.100 spotsdetected o mapa em gel 2DE que distribuíram-se principalmente dentro do intervalo de pH 4-8 e massa 15-150 kDa²⁹. Os 10 pontos selecionados aleatoriamente e rotulado na Figura 2 foram gel excisado e submetido a descoloração, digestão do trypsin, purificação de tryptic peptídeos, seguido por MALDI-MS/MS e LC-ESI-MS/MS análises. Cada conjunto de dados de MS/MS foi usado para identidade de proteína com busca de mascote contra banco de proteína humana. Para todos os pontos, uma média de 1 proteína por local foi identificada com análise de MALDI-TOF-TOF MS/MS, Considerando que muitas proteínas (uma média de 63 proteínas em um único ponto de gel, uma média de 71 proteínas em uma piscina de 2 pontos combinados e uma média de 118 proteínas em uma piscina de 3 j Hed gel pontos) em cada ponto correspondente foram identificados com análise de LC-ESI-MS/MS (tabela 2). Aqui, um deve mencionar que o sistema de LC-ESI-MS/MS tem uma muito maior sensibilidade e resolução relativo ao sistema de análise de MALDI-MS/MS. Estes dados demonstram claramente que cada ponto de gel 2D contém muitas proteínas, proteínas não apenas um ou dois no câncer humano complexo tecido proteome.

Figura 1 : Prata manchada 2-DE padrão de um proteome FSH-expresso NFPA analisado com pH IPGstrip 3 - 10 NL e 12% concentração de gel de SDS-PAGE. As manchas vermelho-marrom são as proteínas de prata manchada, a laranja é o fundo do gel prata manchada. As manchas rotuladas foram analisadas com PMF MALDI-TOF-MS. Reproduzido do Wang X, et al (2015) ³, com a permissão de Wiley-VCH. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2 : Azul de Coomassie manchado 2-DE padrão de um proteome NFPA analisado com pH IPGstrip 3 - 10 NL e 12% concentração de gel de SDS-PAGE. As manchas rotuladas foram analisadas com MALDI-TOF-TOF MS/MS e LC-ESI-MS/MS. Pontos 1 *, 2 *, 3 *, 5 * e 16 * foram coincidem com os correspondentes pontos 1, 2, 3, 5 e 16 e pool de 2 géis correspondentes. Modificado de Zhan X, et al (2018) ²⁹, com a permissão de Wiley-VCH. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Table 1
Tabela 1: o número de proteínas que foram identificadas em cada 2DE gel spot com análise de PMF MALDI-TOF-MS.

Table 2
Tabela 2: O número de proteínas que foram identificados em cada ponto de gel 2DE com análise de MS/MS.

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Discussion

2DE, juntamente com métodos MS incluindo 2DE-MS PMF e 2DE-MS/MS, tem sido utilizado com sucesso em nosso programa de longo prazo - o uso da proteômica para estudar variações de proteomic humanas NFPA e variações de rede molecular para a elucidação dos mecanismos moleculares e descoberta de biomarcadores eficazes para NFPAs. Baseado em 2DE proteômica comparativa com boa reprodutibilidade desempenha um papel importante na identificação de NFPA proteomic variações⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³^, ¹⁹e 2DE juntamente com o método de anticorpo demonstra suas vantagens na detecção de uma determinado modificação pós-traducional e variantes de uma determinada proteína, como detecção de tirosina nitração¹⁶^,¹⁷ ^, ¹⁸ e GH variantes¹⁴^,¹⁵.

No entanto, 2DE juntamente com um método de MS é considerado uma técnica de trabalho intensiva com dificuldades nas análises de baixa abundância proteínas, proteínas hidrofóbicas, extremamente básicas ou ácidas de proteínas e de proteínas em massa extremamente baixa ou alta². Por exemplo, massa extremamente baixa (< 10 kDa) ou massa alta (> 150 kDa) proteínas e extremamente básico (pI > 7,5 ou 8) ou ácida (pI < 3,5 ou 4) proteínas não são facilmente detectadas por 2DE com uma 18-cm IPG strip de pH 3-10 NL³. Com o rápido desenvolvimento de métodos de livre de gel de separação, incluindo cromatografia líquida bidimensional (2D-LC) juntamente com o isótopo estável rotulando como iTRAQ e TMT nos últimos dez anos²³, parece que DE 2-retirou-se gradualmente de sua status de central em proteômica pesquisa na análise do proteoma tecido complexo porque 2D-LC juntamente com isótopo estável rotulagem e MS/MS métodos efetivamente superar as desvantagens dos métodos baseados em 2DE.

Estudos recentes encontraram que, com o uso de espectrometria de massa de alta sensibilidade, tais como uma LC-ESI-MS/MS (sua sensibilidade está no intervalo de 1-10 amol) na identificação de proteínas 2DE separados, foram descobertas as novas características do método 2-DE que mostrar que um 2D gel local contém muitas proteínas (tabela 2). Isto correu contrária ao conceito tradicional de apenas uma ou duas proteínas por ponto, como é evidenciado pelo Banco Mundial de 2DPAGE (portal do mundo-2DPAGE: http://world-2dpage.expasy.org/portal). Isto demonstra claramente que a taxa de transferência de 2-DE na identidade de proteínas em um complexo proteome humano é muito maior do que um suposto anteriormente, ou seja que havia apenas uma ou duas proteínas em um ponto de gel 2D. Este techinique oferece a promessa de uso para 2DE no campo da proteômica. Um 2DE pode separar mais de mil para dez mil pontos³^,⁸^,²² na análise do complexo proteome humano, assim, 2DE é uma técnica de separação mais detalhada màxima simplificar a complexidade do proteoma amostras antes da análise da LC-MS/MS, relativo ao sistema de 2D-LC, que o primeiro-dimensional LC comumente gera frações de 18 a 30 antes da análise de LC-MS/MS. Portanto, 2DE em combinação com a espectrometria de massa de alta sensibilidade pode ser usado para estabelecer o mapa de referência de informação tremenda para o complexo proteome humano, especialmente para aqueles de baixa ou extremamente baixa de proteínas de abundância. Além disso, em combinação com o isótopo estável de 2-DE rotulagem (tais como iTRAQ, TMT e SILAC) e espectrometria de massa de alta sensibilidade podem ser usados para quantificar proteomic em grande escala de variações entre diferentes condições. Além disso, 2DE juntamente com isótopo estável rotulagem e espectrometria de massa de alta sensibilidade tem vantagens absolutas em grande escala detecção e quantificação da proteína PTMs, variantes da proteína, proteína especiação e espécie de proteína. Essas vantagens terão 2DE revitalizado no campo da proteômica.

Além disso, os protocolos de presentes para a análise do proteoma de tecido humana PA descrita aqui são facilmente traduzidos para estudar outras doenças humanas proteomes.

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Disclosures

Os autores declaram que não há conflito de interesses.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado pela Fundação Nacional de ciências naturais da China (Grant n. º 81572278 e 81272798 para XZ), as bolsas da China "863" plano de projeto (Grant No. 2014AA020610-1 a XZ), os fundos do Hospital de Xiangya para talento Introduçãoà (XZ) e a Hunan Fundação provincial de ciências naturais da China (14JJ7008 No. Grant para XZ). Os autores também reconhecem a contribuição científica do Dr. Dominic M. Desiderio em centro de Ciências de saúde Universidade do Tennessee. X.Z. continuamente desenvolvido e usado métodos 2DE-MS para analisar proteome adenoma de hipófise a partir de 2001, concebeu o conceito para o presente manuscrito, escreveu e revisto o manuscrito, coordenou o trabalho pertinente e foi responsável para a apoio financeiro e trabalho correspondente. Y.L. participou na revisão do manuscrito. YH participou na coleção de referências e revisão do manuscrito. Todos os autores aprovaram o manuscrito final.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ettan IPGphor 3	GE Healthcare		isoelectric focusing system.
Ettan DALTsix multigel caster	Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA
Ettan DALT II System	Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA		The vertical electrophoresis system
Ettan IPGphor strip holder	Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA
Ettan DALTsix multigel caster	Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA		Multigel caster
Voyager DE STR MALDI-TOF MS	ABI, Foster City,CA		MALDI-MS PMF
MALDI-TOF-TOF	Autoflex III, Bruker		MALDI-MS/MS mass spectrometer
LTQ-OrbiTrap Velos Pro ETD	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA		ESI-MS/MS mass spectrometer
EASY-nano LC system	Proxeon Biosystems, Odense, Denmark		High performance liquid chromatography system
PepMap C18 trap column	300 μm i.d. × 5 mm length; Dionex Corp., Sunnyvale, CA, USA
RP C18 column	75 μm i.d., 15 cm length; Dionex Corp., Sunnyvale, CA, USA
KimWipe	Kimvipe		Insoluble paper towel
Watter	Made by PURELAB flex instrument
Polytron Model P710/35 homogenizer	Brinkmann Instruments, Westbury, NY
PDQuest	Bio-Rad, Hercules, CA		2D gel image analysis software
SEQUEST	Thermo Proteome Discoverer 1.3 (version No. 1.3.0.339)
DataExplore (ver. 4.0.0.0) software			MS spectrum-processing software
Mascot software			PMF-based protein searching software
Mascot software			MS/MS-based protein searching software
Proteome Discoverer software v.1.3 beta	Thermo Scientific
Xcalibur software v.2.1			MS/MS data-acquired management software
Uniprot version 201410.1_HUMAN.fasta			Human protein database
SEQUEST (version No. 1.3.0.339)			MS/MS-based protein searching software I
MASCOT (version 2.3.02)			MS/MS-based protein searching software II
C18 ZipTip microcolumn	Millipore
PeptideMass Standard kit	Perspective Biosystems
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	23227
2-D Quant Kit	GE Healthcare	80-6483-56
BIS-ACRYLAMIDE	AMRESCO	0172
ACRYLAMIDE	AMRESCO	0341
DTT	Sigma-Aldrich	D0632
Thiourea	Sigma-Aldrich	T8656
Urea	VETEC	V900119
SDS	AMRESCO	0227
CHAPS	AMRESCO	0465
TEMED	AMRESCO	M146
Ammonium Persulfate	AMRESCO	M133
Trypsin	Promega, Madison, WI, USA	V5111
IPG buffer pH 3-10, NL	GE Healthcare	17-6000-87
Immobiline Dry Strip pH 3-10NL,18cm	GE Healthcare	17-1235-01

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Cancer Research

Eletroforese em Gel bidimensional juntamente com métodos de espectrometria de massa para uma análise do proteoma de tecido humano Adenoma de hipófise

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

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