Summary
ويصف هذا البروتوكول استخدام جهاز موائع جزيئية الآلي للتخصيص لتصور تشكيل بيوفيلم في المبيضات البيض تحت ظروف فسيولوجية المضيف.
Abstract
المبيضات البيض هي الأكثر شيوعاً الممرض الفطرية للبشر، مما تسبب في حوالي 15% حالات الانتان المكتسبة في المستشفى. هو سمة فوعة رئيسية من المبيضة لها القدرة على شكل الأغشية الحيوية، والمجتمعات تنظيماً للخلايا التي تعلق على السطوح الحيوية وغير الحيوية. يمكن أن تشكل الأغشية الحيوية المبيضة على أنسجة المضيف، مثل الطبقات المخاطية، والأجهزة الطبية، مثل القسطرة ومنظم نبضات القلب، وأطقم الأسنان والأطراف الصناعية المشتركة. الأغشية الحيوية تطرح تحديات سريرية هامة لأنها شديدة المقاومة للاضطرابات الفيزيائية والكيميائية، ويمكن أن تعمل كخزانات للبذور نشر العدوى. وقد استخدمت مختلف في المختبر فحوصات لدراسة تكوين بيوفيلم المبيضة ، مثل microtiter لوحة فحوصات وقياسات الوزن الجاف وفحوصات سلامة الخلية ومجهرية ليزر المسح [كنفوكل]. كل من هذه الاختبارات فحوصات نقطة نهاية واحدة، حيث يتم تقييم تشكيل بيوفيلم في نقطة زمنية محددة. وهنا يصف لنا بروتوكولا لدراسة تشكيل بيوفيلم في الوقت الحقيقي باستخدام جهاز موائع جزيئية الآلي تحت ظروف التدفق الصفحي. يسمح هذا الأسلوب للمراقبة لتشكيل بيوفيلم بيوفيلم يتطور مع مرور الوقت، استخدام الشروط القابلة للتخصيص التي تحاكي تلك المضيفة، مثل تلك التي ووجهت في القسطرة والأوعية الدموية. يمكن استخدام هذا البروتوكول لتقييم عيوب بيوفيلم طفرات وراثية وكذلك الآثار المثبطة لمضادات الجراثيم في التنمية بيوفيلم في الوقت الحقيقي.
Introduction
المبيضات البيض عضو commensal الحجمية البشرية، إلا وهو أيضا الممرضات انتهازية، القادرة على التسبب بالأمراض الفطرية السطحية وحادة1،2. سمة فوعة رئيسية من المبيضة هو قدرته على نموذج مرن والأغشية الحيوية مقاومة للعقاقير، مجتمعات خلايا انضمت إلى سطح والمغلقة في مواد1،مصفوفة خارج الخلية3. الأغشية الحيوية المبيضة عالية منظم، الذي يحتوي على عدة طبقات من أنواع متعددة من الخلايا (جولة الناشئين الخميرة على شكل الخلايا والخلايا بسيودوهيفال البيضاوي وخلايا أصله أنبوبي)4. المبيضة بيوفيلم التنمية يبدأ مع التمسك بخلايا الخميرة جولة-نموذج سطح (البذر في بيوفيلم)، تليها انتشار هذه الخلايا على السطح، وثم هيكل نضوج بيوفيلم غير ناضجة في بيوفيلم تشكيل تماما محاط ب المواد المصفوفة خارج الخلية4. بيوفيلم ناضجة الغالب تتألف من خلايا أصله ممدود التي تشكل شبكات كثيفة ومترابطة، وتوفير الاستقرار المعمارية إلى بيوفيلم4. طوال دورة الحياة بيوفيلم، جولة الناشئين الخميرة الخلايا تفريق من بيوفيلم ناضجة، ويجوز السفر إلى مناطق أخرى من الجسم لتسبب التهابات نشرها أو البذور الأغشية الحيوية الجديدة في،من4مواقع أخرى5. يمكن أن تشكل المبيضة الأغشية الحيوية على السطوح الحيوية، مثل الأسطح المخاطية وفي جميع أنحاء أنسجة المضيف، وعلى الأسطح غير الأحيائية، مثل القسطرة ومنظم نبضات القلب، وأطقم الأسنان والمفاصل الاصطناعية. بسبب خصائص المعاندة للأغشية الحيوية، أنها صعبة للغاية للقضاء على، وفي كثير من الحالات أن استراتيجية العلاج الفعال الوحيد إزالة الأجهزة المصابة4. وبالتالي من الأهمية بمكان للتحقيق في تشكيل بيوفيلم تحت ظروف مماثلة لتلك التي لوحظت في إعدادات السريرية.
وهناك عدة حاسمة في فيفو النماذج الحيوانية المستخدمة لدراسة المبيضة بيوفيلم تشكيل6،،من78؛ بيد أن هذه الدراسات يمكن أن تكون مكلفة وتستغرق وقتاً طويلاً، وتقتصر على عدد من سلالات ومضادات الجراثيم التي يمكن اختبارها في وقت معين. في المختبر بيوفيلم فحوصات، من ناحية أخرى، تسمح للتقييم السريع والفائق للمركبات المضادة للفطور وسلالات متحولة، وهي أكثر فعالية من حيث التكلفة والأخلاقية من فحوصات بيوفيلم التي تقوم بها في الحيوان نماذج9، 10،،من1112،،من1314. هنا يصف لنا في المختبر مقايسة التي وضعت والأمثل لمراقبة تشكيل بيوفيلم وقتيا تحت الاندفاق الصفحي استخدام موائع جزيئية لتخصيص جهاز14،15. يسمح الفحص للتصور من كل مرحلة من مراحل تكوين بيوفيلم، بما في ذلك الخطوة الأولى التقيد وتكاثر الخلايا، ونضوج بيوفيلم، وتشتت الخلية. المقايسة مفيد أيضا لتصور التغييرات مورفولوجيا الخلية في جميع أنحاء تطوير بيوفيلم.
لوحات ميكروتيتير، والتي تستخدم عادة في المختبر فحوصات بيوفيلم، بينما إنتاجية عالية، لا تسمح لظروف التدفق التي تسيطر عليها. تسمح أنظمة الخلية الاندفاق الصفحي التقليدية للتقييم المستمر لتشكيل بيوفيلم في ظروف التدفق التي تسيطر عليها، ولكن هذه غالباً ما تستغرق وقتاً طويلاً لإعداد وتميل إلى التحكم الديناميكي وإنتاجية محدودة. الجهاز موائع جزيئية المستخدمة هنا يتغلب على هذه القيود من خلال الجمع بين لوحات الإنتاجية العالية (التي تحتوي على آبار 48) مع دائرة الاندفاق الصفحي مدمج واستنساخه عاليا وتنوعاً، وقابلة للتخصيص.
وهنا، يمكننا وصف بروتوكول لاستخدام جهاز موائع جزيئية الآلي المتاحة تجارياً لتقييم تكوين بيوفيلم البرية من نوع المبيضة سلالة، آثار عامل مضاد فطري معروف على تطوير بيوفيلم، وبيوفيلم تشكيل في سلالات متحولة اثنين (bcr1Δ/Δ و efg1 Δ/Δ) التي تم الإبلاغ عنها سابقا أن يكون بيوفيلم العيوب في المختبر و في فيفو16،،من1718. يمكن استخدامها في وصف بروتوكول اختبار فعالية مضادات الجراثيم في تثبيط تكوين بيوفيلم في جميع أنحاء تطوير بيوفيلم، وتحديد الجينات المطلوبة للتنمية بيوفيلم العادي بفحص مكتبات متحولة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد ثقافة الخلية الفطرية
ملاحظة: السلوك خلية ثقافة العمل (أي فتح أنابيب الأسهم المبردة وخلية ثقافة أنابيب وقوارير) داخل مجلس الوزراء السلامة الأحيائية. بدوره على الأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية) مصباح مبيد للجراثيم على الأقل 1 ح لمجلس الوزراء قبل العمل، وإيقاف تشغيل مصباح الأشعة فوق البنفسجية بينما كان يعمل بنشاط في مجلس الوزراء. ارتداء القفازات، ونظارات السلامة، ومعدات الوقاية الشخصية المناسبة، وإزالة التلوث على السطح من على مقاعد البدلاء والماصات مع الإيثانول 70% قبل البدء التجربة. يوصي باستخدام معقم تصفية نصائح والإلمام بالتقنيات الميكروبيولوجية الأساسية العقيم.
- استخراج الانتصارات المبيضة السلالات البرية من نوع ( bcr1 Δ/Δ، و efg1 Δ/Δ) في الخميرة ببتون سكر العنب (YPD) متوسطة (استخراج الخميرة 1%، ببتون 2%، 2% جلوكوز؛ الرقم الهيدروجيني 6.8) لوحات أجار. احتضان عند 30 درجة مئوية ل 48 ح، الممارسات القياسية الميكروبيولوجية التالية19.
- حدد مستعمرة معزولة مفردة من اللوحة تطعيم إلى 4 مل من YPD السائلة المتوسطة (استخراج الخميرة 1%، ببتون 2%، 2% جلوكوز؛ الرقم الهيدروجيني 6.8) واحتضان عند 30 درجة مئوية مع الهز 225 لفة في الدقيقة في معيار تهز الحاضنة ح 12-15، اللجنة الميكروبيولوجية القياسية التالية تيسيس19.
- تحديد كثافة الخلية للثقافة عن طريق قياس الكثافة البصرية (OD) 600 نانومتر في ومبومو (1 مل، طول المسار 1 سم)، المعايير التالية الميكروبيولوجية الممارسات19.
- تمييع ثقافة الخلية ل التطوير التنظيمي نهائي600 0.5، أي ما يعادل 2 × 107 خلايا/مل، في المتوسط روزويل بارك التذكاري المعهد (ربمي)-1640 (التي تحتوي على 165 ملم حمض 3-مورفولينوبروباني-1-سولفونيك (والمماسح)، ل الجلوتامين، ودون الصوديوم بيكربونات، درجة الحموضة 7.0) أو العنكبوت المتوسطة (1% مرق المغذيات، المانيتول 1%، 0.4% ك2مكتب البراءات الهنغاري4، والرقم الهيدروجيني 7.2).
ملاحظة: يمكن استخدام وسائط بديلة لدعم نمو سلالات فائدة المحددة.
ملاحظة: لا تجعل تخفيف الخلية بعيداً جداً في وقت مبكر. من المستحسن أن تبدأ تخفيف بعد الخطوة 3.3 (الموصوفة أدناه) بغية منع الشروع في تشكيل خيوط فطرية قبل الخلايا التي تبذر في قناة العرض.
2-إعداد قنوات موائع جزيئية لصفيحة موائع جزيئية
ملاحظة: الرجوع إلى دليل المستخدم لنظام موائع جزيئية (انظر الجدول للمواد) للمعلومات بشأن إعداد صك ولوحات.
- قبل تشغيل هذه التجربة موائع جزيئية، الحارة 20 مل ربمي-1640 وسائل الإعلام أو وسائل الإعلام العنكبوت في حاضنة في 37 درجة مئوية. حجم وسائط إضافية قد تكون مطلوبة استناداً إلى العمليات الحسابية في الخطوة 2.8. وسائل الإعلام قبل الاحترار يمنع تكوين فقاعات الهواء أثناء التجربة.
- قم بتشغيل نظام ميكروفلويديكس التي تتضمن وحدة تحكم ووحدات الإمداد بالطاقة اثنين، والمجهر، والكاميرا والكمبيوتر موصول إلى النظام. افتح البرنامج الذي يتحكم في النظام (انظر الجدول للمواد) من قائمة البرامج على الكمبيوتر. سوف تظهر اثنين من النوافذ بمجرد فتح البرنامج.
- حدد موقع رقم الكود الشريطي لصفيحة في استخدام وإدخال رقم عند مطالبتك بواسطة البرنامج. استخدام اثنين من شاشات كمبيوتر منفصل لعرض البرنامج على windows اثنين. نافذة واحدة (وحدة التحكم) يحتوي على عناصر تحكم اللوحة والإطار الثاني (المونتاج، وحدة التصوير) يحتوي على عناصر التحكم للمجهر والكاميرا.
- التبديل على زر الطاقة مسخن على وحدة تحكم وتعيين ميكروفلويديكس نظام درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية باستخدام أزرار الأسهم على وحدة التحكم بدرجة الحرارة.
- تنظيف لوحة واجهة استخدام الماء المعقم كالتالي (الشكل 1). رش الجزء السفلي من اللوحة مع الماء المعقم واستخدام ورقة العدسة لإزالة التراب/الغبار. ضع واجهة لوحة الوجه لأسفل على ورقة العدسة نظيفة للهواء الجاف. تنظيف الجزء العلوي من لوحة واجهة استخدام ورق الايزوبروبانول وعدسة 70%.
ملاحظة: يربط لوحة واجهة نظام موائع جزيئية للوحة التي سوف تحتوي على خلايا ووسائط الإعلام. ضمان أن يبقى لا سائل، وأن تتم إزالة كافة الألياف والأوساخ. تنظيف غير ملائمة قد يؤدي انخفاض جودة الصور وأشرطة الفيديو. - إزالة التكثيف من الأنابيب على لوحة واجهة.
- اترك الوجه لوحة أسفل يستريح على الورق العدسة. في عنصر التحكم انقر فوق إطار الوحدة النمطية في الوضع اليدوي اللوحة. في المقطع قائمة التحكم القص، انقر فوق التحديد السائل لأعمدة 1-4 و 5-8، وحدد 37 درجة مئوية من القائمة المنسدلة. في المقطع التحكم القص، تعيين وضع تدفق ثابت وضبط الإمالة ماكس 2 داين/سم2 (0.2 السلطة الفلسطينية) (الشكل 2 أ).
- انقر فوق في الآبار مدخل لبدء تدفق الهواء العقيمة من خلال أنابيب لوحة واجهة لإزالة التكثيف. بعد 5 دقائق، انقر فوق الزر "إيقاف" في المقطع عنصر تحكم لوحة جيدا (الشكل 2A). مراقبة هذه الأنابيب في لوحة واجهة للتأكد من أنه تم إزالة جميع التكثيف. إذا كان لا يزال قطرات مرئية، كرر تدفق الهواء العقيمة، كما ذكر أعلاه، لمدة 5 دقائق أخرى.
ملاحظة: يتم إرفاق أنابيب مدخل 0.22 ميكرون المرشحات لضمان الهواء العقيم فقط هو عرض للنظام ميكروفلويديكس. ويمكن رصد التدفق سجل الأحداث على الشاشة في إطار وحدة التحكم.
- ضع لوحة موائع جزيئية داين 0-20 48-جيدا في مرحلة المجهر.
3-"تشكيل بيوفيلم" المبيضات البيض في نظام موائع جزيئية
- لتسجيل تشكيل بيوفيلم، إضافة 600 ميليلتر من قبل حرارة RPMI 1640 المتوسطة أو المتوسطة العنكبوت إلى مدخل الآبار (انظر الشكل 1 لتخطيط اللوحة). وقد replicates اثنين لكل حالة تجريبية.
- لاختبار تكوين بيوفيلم المبيضة إضافة السلالات البرية من نوع ومتحولة، 600 ميليلتر العنكبوت المتوسطة إلى الآبار مدخل للوحة التجربة.
- لاختبار تكوين بيوفيلم حضور الأدوية المضادة للفطور (أو غيرها من المركبات ذات الأهمية)، إضافة 600 ميليلتر ربمي-1640 المتوسطة وبئرين (المراقبة السلبية) و 600 ميليلتر في المتوسط RPMI 1640 تستكمل مع الامفوتريسين ب (16 ميكروغرام/مل) (أو العقار المفضل في المطلوب تركيز) لبئرين مدخل الأخرى.
ملاحظة: لتجربة تشكيل بيوفيلم ح 12، إضافة 600 ميليلتر لوسائل الإعلام قبل المعالجون إلى الآبار مدخل. لتجارب أطول إضافة وسائط إضافية (50 ميليلتر/h) إلى مدخل الآبار. لا يتجاوز حجم الحد الأقصى من البئر (1,500 ميليلتر).
- انخفاض ببطء لوحة واجهة تنظيفها على رأس لوحة 48 موائع جزيئية جيدا. الشريحة لوحة واجهة قليلاً إلى اليسار حتى يتم وضع أنابيب على لوحة الطور البيني على رأس الآبار مدخل ومخرج.
ملاحظة: سوف يدفع تدفق الهواء العقيمة من الأنابيب في لوحة واجهة السائل في الآبار مدخل أو مخرج (حسب الاتجاه المحدد باستخدام البرمجيات على جهاز الكمبيوتر)، حيث أن تدفق السائل من خلال قناة العرض بين مدخل ومخرج الآبار في اتجاه مخصصة وسرعة يمليها المستخدم.
ملاحظة: مطلوب فتيلة إزالة الهواء من قنوات العرض والتأكد من أن القنوات تمتلئ الوسائط المطلوبة.
- لاختبار المبيضة إضافة السلالات البرية من نوع ومتحولة، 50 ميليلتر من البرية من نوع (SC5314) خلية ثقافة في وسائل الإعلام العنكبوت بئرين منفذاً و bcr1 Δ/Δ في وسائل الإعلام العنكبوت إلى منفذ بئرين efg1 Δ/Δ في وسائل الإعلام العنكبوت لبئرين منفذاً. ضع لوحة الواجهة مرة أخرى على لوحة موائع جزيئية وقفل الغطاء (انظر الشكل 1 لتخطيط اللوحة).
ملاحظة: كما هو موضح في الخطوة 3.1.1، تحتوي على جميع الآبار الإدخال المطابق العنكبوت وسائط الإعلام. - لاختبار تكوين بيوفيلم المبيضة حضور الامفوتريسين B أو غيرها مجمع الفائدة، إضافة 50 ميليلتر من البرية من نوع (SC5314) خلية الثقافة في المتوسط RPMI 1640 إلى أربعة مأخذ الآبار. ضع لوحة الواجهة مرة أخرى على لوحة موائع جزيئية وقفل الغطاء (انظر الشكل 1 لتخطيط اللوحة).
ملاحظة: كما هو موضح في الخطوة 3.1.2، تحتوي على جميع الآبار الإدخال المطابق ربمي-1640 وسائل الإعلام وبدون الامفوتريسين B أو مجمع الأخرى ذات الاهتمام.
ملاحظة: يتم نقل الخلايا من آبار مأخذ تجاه مدخل الآبار؛ فمن الضروري أن يتم وقف التدفق قبل الخلايا تصل إلى الآبار مدخل. وهذا يضمن أن لا الحصول على الآبار مدخل ملوثة في خلية ثقافة وأن وسائط الإعلام في الآبار مدخل تظل عقيمة طوال فترة التجربة. يستند بقوة القص والوقت اللازم لزوجة الوسائط المستخدمة وحجم الخلايا.
4-إعداد مواقف المرحلة للتجربة موائع جزيئية
ملاحظة: يجب تعيين مواقف المرحلة ولوحة المعايرة فقط قبل البدء التجربة. يسمح هذا الإعداد الكمبيوتر لتخزين ومواقف كل قناة العرض لالتقاط الصور أثناء التجربة. وينبغي عدم الانزعاج لوحة موائع جزيئية بعد إعداد مواقف المرحلة. إذا تم نقل اللوحة، سيتعين على مواقف مرحلة إعادة تعيين قبل البدء التجربة.
- استخدام برنامج تحليل التصور (انظر الجدول للمواد) لتعيين المرحلة المواقف؛ كل قناة العرض مرحلة (1-24) (الشكل 1) وكل مرحلة من مراحل ثلاث مراحل فرعية (1-3) لالتقاط الصور في مواقع مختلفة على طول القناة المشاهدة (الشكل 1). في إطار وحدة التصوير، افتح الوحدة النمطية '"اكتساب الأبعاد"' (نجمة داود الحمراء) بواسطة النقر فوق علامة التبويب جمعية نجمة داود الحمراء (الشكل 2).
- في نجمة داود الحمراء الوحدة النمطية انقر فوق علامة التبويب 'مرحلة' في القائمة الموجودة على الجانب الأيمن (الشكل 2). في المقطع المرحلة، تحميل قائمة المرحلة الرئيسية للوحة موائع جزيئية داين 20 جيد 0-48. ينبغي أن يكون لكل قناة عرض ثلاث مراحل للحصول على الصور.
- فتح 'تحديث نموذج التكيف' (SRA) و 'مرحلة الانتقال إلى"الموضع المطلق"' وحدات (خريطة) بالنقر فوق علامة التبويب حساب الاحتياطي الخاص وعلامة التبويب مخطط (الشكل 2). في الوحدة النمطية لحساب الاحتياطي الخاص، اضغط على زر 'لايف' لمشاهدة معاينة صورة مع الشعيرات المتصالبة.
- استخدام الجويستيك، ضع لوحة جيدا أن غيض السهم (جسديا الموجود على اللوحة) المتاخمة لعرض القناة 4 بمحاذاة مع مرمى على البرمجيات. في القائمة مخطط، اضغط على الزر '"تعيين الأصل"' (الشكل 2). يجب الآن قراءة الموقف الحالي 0 في X و Y و Z.
- في الوحدة النمطية SRA، انقر فوق المقطع 'النقاط المرجعية الأولى' في القائمة اليسرى (الشكل 2). انقر على '"تحميل إعدادات"' وتحميل الملف الخاص بلوحة موائع جزيئية داين 20 جيد 0-48.
- في المقطع المرحلة من الوحدة النمطية MDA، انقر نقراً مزدوجاً فوق 'موقف المرحلة 22,2'. يشير هذا الموقف إلى الوسط (المرحلة الفرعية 2) للعرض رقم 22 القناة. وهذا سيجلب المجهر عرض المرحلة وتركيز الكاميرا في مقربة علامة السهم بعرض القناة 22. استخدام الجويستيك، ضع لوحة جيدا أن غيض السهم (جسديا الموجود على اللوحة) المتاخمة لعرض القناة 22 بمحاذاة مع مرمى.
- نسخ الإحداثيات Y في الوحدة النمطية لجمعية نجمة داود الحمراء في موقف ص 2 نقطة في علامة التبويب 'تحديث النقاط المرجعية' الوحدة النمطية SRA (الشكل 2).
- في علامة التبويب '"تحديث مرحلة المواقف"' SRA، انقر فوق 'تطبيق"جمعية نجمة داود الحمراء المرحلة القائمة"' (الشكل 2).
ملاحظة: سيتم تحديث كافة عرض مواقف المرحلة في اللوحة (1-24) معايرة لموقف لوحة موائع جزيئية محددة على الساحة المجهر.
5-إعداد المقتنيات للصورة التقاط خلال التجربة موائع جزيئية
- في إطار وحدة التصوير، استخدام الوحدة النمطية لجمعية نجمة داود الحمراء وانقر فوق علامة التبويب "حفظ" في القائمة اليسرى (الشكل 2). حدد اسم الملف للتجربة ومجلد لتخزين الصور المكتسبة على جهاز الكمبيوتر.
- في الوحدة النمطية لجمعية نجمة داود الحمراء، انقر فوق علامة التبويب 'Timelapse' في القائمة اليسرى، وتعيين للحصول على صور إجمالي 145؛ تعيين timelapse بين الصور لمدة 5 دقائق. وهذا سيؤدي إلى الصورة 1 كل 5 دقائق لتجربة تنمية بيوفيلم ح 12.
ملاحظة: الفاصل الزمني بين الصور والعدد الإجمالي للصور يمكن تعديلها استناداً إلى متطلبات التجريبية. إذا كان التصوير لمدة أطول من 12 ح، إضافة وسائط إضافية إلى الآبار مدخل في الخطوة 3، 1 لضمان أن لا يتم تشغيل الآبار الجافة. لتجارب أطول إضافة وسائط إضافية، حسب الحاجة (50 ميليلتر/h) إلى مدخل الآبار. - في الوحدة النمطية لجمعية نجمة داود الحمراء، انقر فوق علامة التبويب 'موجات' في القائمة اليسرى (الشكل 2)، وتعيين العدد من الطول الموجي للتجربة ك 1. تعيين الطول الموجي للقبض على 50% برايتفيلد و 50% الكاميرا مع وقت تعرض من 12-20 مللي ثانية وكسب 0.6 ومرقم 20 ميغاهرتز.
ملاحظة: أطوال موجية إضافية يمكن استخدامها، بما في ذلك الأطوال الموجية لتصوير الأسفار (على سبيل المثال، أننا قد نجحت تصور متشيري وسلالات بروتينات فلورية خضراء معلم المبيضة باستخدام هذا الجهاز موائع جزيئية). ويمكن أيضا تغيير المعلمات لاقتناء استناداً إلى متطلبات التجريبية. على سبيل المثال، إعداد طول موجه ثانية وتحديد 'ضبط تلقائي للصورة في كل تيميبوينت' وينصح طول موجه ثالثة وتحديد 'Autoexposure في كل تيميبوينت' للمبتدئين لتحقيق أقصى قدر من فرص الحصول على الصورة التي في التركيز. - في الوحدة النمطية لجمعية نجمة داود الحمراء، حدد المرحلة قائمة علامات التبويب في القائمة اليسرى. مراحل 1.1--سيتم عرض 24.3. واحداً تلو الآخر، انقر فوق في كل مرحلة، واستخدام إعدادات التركيز جيد التركيز يدوياً على الخلايا الموجودة في القناة عرض لكل مرحلة. مرة واحدة مجال الرؤية في التركيز، انقر فوق السهم الأسود الموجود بجوار القائمة المرحلة تحديث وحفظ الإعدادات لكل مرحلة. سوف تستخدم الكمبيوتر هذه الإعدادات يدوياً تحديد الموقف وإعدادات الاتصال للحصول على الصور عند كل نقطة في الوقت. قم بإزالة أي المراحل غير المستخدمة من القائمة باستخدام السهم 'إزالة'.
ملاحظة: وحدة جمعية نجمة داود الحمراء والبرنامج الرجوع إلى عرض القنوات كمراحل التبادل، وهو نفس المصطلحات المستخدمة بواسطة البرنامج.
6-تشغيل التجربة موائع جزيئية
- في إطار وحدة التصوير، استخدام الوحدة النمطية لجمعية نجمة داود الحمراء، حدد 'الحصول على' لبدء التقاط الصور قبل تدفق الخلايا التقيد بها لجميع المراحل الفرعية (الشكل 2).
ملاحظة: إطار الوحدة النمطية التصوير وأجهزة التحكم في الكاميرا الآن إظهار الصور التي يتم التقاطها من يجري ووحدة خريطة، SRA، وجمعية نجمة داود الحمراء لن تكون مرئية. سوف تظهر الصور التي تم التقاطها أيضا جهاز ضبط وقت على الجانب، للإشارة إلى عدد الصور التي يتم التقاطها والفاصل الزمني قبل أن تبدأ دورة التقاط الصورة التالية. الانتظار لجولة واحدة من الصور لالتقاطها قبل المتابعة إلى الخطوة التالية.
ملاحظة: لا تستخدم الأزرار 'وقفه' أو 'الحدث علامة' على الشاشة نافذة وحدة التصوير. من هذه النقطة خلال التجربة، الاحتفاظ بالماوس فقط في إطار وحدة التحكم على شاشة الكمبيوتر الثاني (الشكل 2A). هذا أمر مهم لتجنب الإخلال بإطار الوحدة النمطية التصوير. - في البقاء نافذة وحدة التحكم في وضع دليل اللوحة. في المقطع التحكم القص، تعيين وضع تدفق ثابت وضبط الإمالة ماكس 1 داين/سم2 (0.1 السلطة الفلسطينية). انقر فوق منفذ الآبار O1، O7، O13 و O19 لبدء تدفق الوسائط من مدخل إلى مأخذ الآبار (الشكل 2A) لإزالة الخلايا غير التقيد. بعد 5 دقائق انقر فوق الزر "إيقاف" في المقطع عنصر تحكم لوحة جيدا. تسمح بإجراء جولة ثانية من الصور الحصول عليها. يمكن تصور الصور ويمكن رصدها مرور الزمن على الشاشة الثانية في إطار الوحدة النمطية التصوير.
- في المقطع التحكم القص، ضبط تدفق القص كحد أقصى إلى 0.5 داين/سم2 (0.5 السلطة الفلسطينية) عن طريق النقر على الرقم الموجود في أقصى الحدود القص والأعمدة باستخدام لوحة المفاتيح لإدخال 0.5. اضغط المفتاح enter على لوحة المفاتيح، وتأكيد التغيير في معدل التدفق في سجل الأحداث في إطار وحدة التحكم (الشكل 2A). اترك التجربة دون عائق في الظلام ح 12.
ملاحظة: التعرض للضوء والحركة/الاهتزازات يمكن شدة يقلل من جودة الصور المكتسبة طوال التجربة. في نهاية التجربة موائع جزيئية، لن يتم عرض أي صور إطار الوحدة النمطية التصوير وتعود إلى عرض وحدات حساب الاحتياطي الخاص، وخريطة، وجمعية نجمة داود الحمراء. يمكن استخدام برامج وحدة التصوير لعرض الصور، وتجميع أشرطة الفيديو، والتحديد الكمي الأغشية الحيوية شكلت (الموصوفة أدناه).
7-تحليل النتائج
- في إطار وحدة التصوير، قم بتحديد علامة التبويب '"أدوات تحليل"' وانقر فوق '"استعراض الأبعاد بيانات"' (رمد) من الإسقاط إلى أسفل القائمة. في الوحدة النمطية رمد، انقر فوق '"حدد ملف قاعدة"'. سيؤدي هذا إلى فتح نافذة '"الأبعاد المرافق مجموعة البيانات"'.
- انقر فوق الزر '"تحديد دليل"' واختر المجلد الذي تم استخدامه لحفظ التجربة في الخطوة 5، 1. في قائمة 'مجموعات البيانات'، حدد سجل التجربة للملف (الامتداد.nd). حالما يتم تحميل السجل، انقر فوق الزر 'عرض'.
- تحديد الطول الموجي بالنقر فوق الخيارات الموجودة في القائمة 'موجات' الأيمن واختر موقف المرحلة عرض من قائمة المنسدلة. اختر الصورة لتحميل من الأرقام على رأس الوحدة النمطية بالنقر بالزر الأيمن رقم الصورة. وبمجرد اختيار، انقر فوق الزر 'تحميل صورة (ق)' لتحميل الصور. يمكنك عرض كافة الصور أو صورة واحدة في وقت واحد.
- حدد جميع الصور جعل الفاصل الزمني الفيديو. سيتم فتح الصور المحددة على شريط فيديو في نافذة جديدة. انقر فوق علامة التبويب 'ملف' في إطار الوحدة النمطية التصوير واختر 'حفظ' من القائمة المنسدلة. حفظ الفيديو الناتج كملف افتراضي (TIFF/ميتاسيريس).
- فتح وتحميل ملف الفيديو المحفوظة باستخدام البرمجيات إيماجيج. في إيماجيج، انقر فوق علامة التبويب 'ملف' وانقر فوق 'حفظ'. اختر 'أفي' من القائمة المنسدلة، وتحويل الملف إلى ملف.avi باستخدام JPEG التحويل تعيين إلى 10 إطارات/ثانية.
ملاحظة: يمكن تعديل سرعة الفيديو بتبديل الإطارات/s. - للتحديد الكمي للأغشية الحيوية، كرر الخطوات 7.2 و 7.3 و 7.4.
ملاحظة: 'المنطقة' لكل الصور التي تم الحصول عليها من خلال التجربة غير متطابقة وهكذا يمكن استخدام قياس '"منطقة ثريشولديد"' تقييم الاختلافات بين السلالات البرية من نوع وسلالات متحولة في تشكيل بيوفيلم أو تقييم الفعالية اختبار المخدرات في تشكيل بيوفيلم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
أجرينا المقايسة بيوفيلم موائع جزيئية الموصوفة هنا باستخدام نوع البرية سلالة المبيضة ظروف اثنين من وسائل الإعلام (media ربمي-1640 والعنكبوت)، وسلالة البرية من نوع حضور العقاقير المضادة للفطور المعروفة الامفوتريسين ب (16 ميكروغرام/مل) في ربمي، وسبق أن أبلغت سلالات متحولة اثنين لها عيوب في تكوين بيوفيلم (bcr1Δ/Δ و efg1 Δ/Δ) في وسائل الإعلام العنكبوت.
فيديو 1 يبين تطور بيوفيلم البرية من نوع في المتوسط RPMI 1640 وآثار العقاقير المضادة للفطور، الامفوتريسين ب، على تشكيل بيوفيلم. تحت الظروف البرية من نوع، عدة خلايا التمسك بشدة بالقناة والخلايا تشكل خيوط فطرية مع مرور الوقت وبيوفيلم سميكة يمكن ملاحظتها مع إينتيركالاتينج خيوط فطرية وخلايا الخميرة. نهاية التجربة موائع جزيئية، يملأ بيوفيلم البرية من نوع تماما قناة العرض. ومع ذلك، قد وجود الامفوتريسين ب، له تأثير واضح على الحد بيوفيلم. على وجه التحديد، على انضمام الخلايا يتناقص، وخلافا للشروط غير المعالجة، حضور الامفوتريسين B، يمكن رؤية العديد من الخلايا المتدفقة بعيداً مع تدفق القص لوسائط الإعلام. لم يتم تشكيل كتقدم الوقت وتفشل الخلايا على شكل خيوط فطرية وبيوفيلم. كما تظهر هذه الاختلافات في الشكل 3، الذي يصور الوقت 4-نقاط الفحص في ح 0، ح 2، ح 6، وح 12.
فيديو 2 يبين تطور بيوفيلم البرية من نوع واثنين سبق الإبلاغ عنها طفرات معيبة بيوفيلم (bcr1 Δ/Δ و efg1 Δ/Δ) في وسائل الإعلام العنكبوت. إظهار كلا سلالات Δ/Δ Δ/Δ و efg1 bcr1 تشكيل بيوفيلم انخفاض حاد بالمقارنة مع سلالة البرية من نوع اسوي. لسلالة Δ/Δ efg1 ، لاحظنا أن الخلايا التقيد بها لا تشكل خيوط فطرية وبيوفيلم الناتجة عن شدة معيبة. لسلالة Δ/Δ bcr1 ، لاحظنا أن ليس فقط هو سلالة Δ/Δ bcr1 المعيبة في تشكيل بيوفيلم، ولكن أيضا يعرض عيب التزام واضح، حيث يمكن رؤية خلايا الانجراف في اتجاه تدفق القص كما أنها لا تلتزم عرض القناة. كما تظهر هذه الاختلافات في الشكل 4، الذي يصور 4 نقاط زمنية من التحليل في ح 0، ح 2، ح 6، وح 12.
رقم 1: موائع جزيئية الأداة المستخدمة في هذه التجربة- تظهر لوحة أ موائع جزيئية الوسيلة المستخدمة، لوحة ب يظهر لوحة واجهة، تظهر لوحة ج ملخص تخطيطي قناة عرض واحد (المرحلة) والمراحل الفرعية الثلاث الملتقطة بواسطة الكاميرا أثناء التجربة، و تظهر لوحة د ملخص تخطيطي من لوحة موائع جزيئية 48-كذلك تستخدم مع تخطيطي لآبار مخرج ومدخل ونافذة عرض. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: حدد لقطات من التصوير مودوليسوفتواري وموائع جزيئية لوحة التحكم في النظام- تظهر لوحة "وحدة التحكم"، التي تحتوي على عناصر تحكم للوحة موائع جزيئية، وتظهر لوحة ب إطار الوحدة النمطية التصوير، '"نقل المرحلة"إلى"الموضع المطلق"' وحدة نمطية (خريطة)، الوحدة النمطية '"اكتساب الأبعاد"' (نجمة داود الحمراء)، ووحدة '"تحديث نموذج التكيف"' (SRA). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: يؤدي التعرض إلى الامفوتريسين بعيوب تشكيل بيوفيلم- الوقت التصور يعتمد تكوين بيوفيلم في وسائل الإعلام RPMI 1640 (العمود 1)، و RPMI 1640 تستكمل مع 16 ميكروغرام/مل الامفوتريسين ب (عمود 2) تحت التدفق الديناميكي (0.5 داين/سم2) عند 37 درجة مئوية للانضمام بعد ح 12 في نظام موائع جزيئية. ح 0 الممثل (يغسل ما بعد الانضمام والأولية)، ح 2، ح 6، وصور ح 12 (من أعلى إلى أسفل) وترد لسلالة البرية من نوع اسوي SN250 (الأعمدة 1 و 2). هي أشرطة مقياس ميكرومتر 20 في كل فريق. يتم توفير أشرطة الفيديو في مرور الوقت المقابلة لتشكيل بيوفيلم في الفيديو 1. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: يؤدي حذف BCR1 أو EFG1 بيوفيلم تشكيل العيوب. الوقت التصور يعتمد تكوين بيوفيلم في العنكبوت وسائط الإعلام (أعمدة 1-3) تحت التدفق الديناميكي (0.5 داين/سم2) عند 37 درجة مئوية للانضمام بعد ح 12 في نظام موائع جزيئية. ح 0 الممثل (يغسل ما بعد الانضمام والأولية)، ح 2، ح 6، وصور ح 12 (من أعلى إلى أسفل) وترد لسلالة البرية من نوع اسوي SN250 Δ/Δ bcr1(العمود 1)، سلالة (العمود 2)، و efg1 سلالة Δ/Δ (العمود 3). هي أشرطة مقياس ميكرومتر 20 في كل فريق. أشرطة الفيديو في مرور الوقت المقابلة لتشكيل بيوفيلم ترد في الفيديو 2. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الفيديو 1: اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
الفيديو 2: اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
والرزن بيوفيلم موائع جزيئية للتخصيص الموضحة هنا يسمح لتصور تشكيل بيوفيلم في الوقت الحقيقي على مستوى خلية واحدة عندما تتعرض إلى معدل ثابت الاندفاق الصفحي ودرجة حرارة ثابتة. ويوفر وسيلة قوية لدراسة تطوير الأغشية الحيوية في السلالات البرية من نوع ومتحولة، ولوحظت آثار المعالجات عامل مضادات الميكروبات في الأغشية الحيوية في ظل الظروف التي تحاكي الظروف الفسيولوجية في إعدادات السريرية. وخلافا لمعظم في المختبر بيوفيلم فحوصات، يسمح هذا الأسلوب لفحص بيوفيلم النامي في الوقت الحقيقي كما أنها تشكل.
يمكن استخدام هذا الأسلوب في طريقة الفائق، حيث تصل إلى 24 عينة يمكن تشغيلها في وقت واحد لتقييم تكوين بيوفيلم. الأسلوب يمكن استخدامها أيضا لإجراء الشاشات الوراثية المكتبات متحولة إلى تحديد الجينات المطلوبة للتنمية بيوفيلم العادية، ويمكن استخدامها لتقييم الفعالية ضد الأغشية الحيوية لمركبات مضادات الميكروبات من الفائدة في شاشات مكتبة مجمع. ونحن نتوقع أن التطبيقات المستقبلية لهذا الجهاز موائع جزيئية وسوف تشمل هذه الشاشات. ومع ذلك، نلاحظ أن بعض اختبار المخدرات العلاج سيكون محدودا بسمك بيوفيلم تشكيل باستخدام هذا الجهاز موائع جزيئية كالأغشية الحيوية نمت ل > ح 16 تميل إلى أن تسد قناة العرض. وهكذا، سوف تحتاج اختبار تجارب المخدرات الذي سيتم تنفيذه ل < ح 16.
وعموما، هذا الجهاز قابلة للتخصيص للغاية وتنوعاً، ويمكن تعديلها لتقييم مختلف أنواع الجراثيم عبر الممالك ومعدلات التدفق، ودرجات الحرارة، ومرات حضانة ووسائل الإعلام. الأسلوب الموصوفة يوفر معلومات حول عدد من الجوانب المختلفة لتشكيل بيوفيلم، بما في ذلك التقيد الخلية الأولى ونضوج بيوفيلم وتشتت الخلية. على الرغم من أننا فقط تقرير النتائج لتشكيل بيوفيلم نوع واحد هنا، هذا البروتوكول يمكن تكييفها وفقا لدراسة تشكيل بيوفيلم المزدوج--مختلطة--الأنواع وأيضا.
خطوتين أمرا حاسما لنجاح تنفيذ هذا البروتوكول. أولاً، يجب تجنب فقاعات الهواء في النظام بالتدفئة وسائل الإعلام في درجة حرارة التجريبية. زلة مشترك واحد هو تمييع الخلايا في وسائل الإعلام التي كانت لا يسخن. وينبغي أن تضعف الخلايا في نفس الوسائط الذي يتم استخدامه للآبار مدخل. الثانية، وتدفق الخلايا من منفذ إلى مدخل الآبار يجب أن تراقب بعناية؛ إذا كان تدفق الخلايا بعيداً جداً، سوف تصبح ملوثة وسائط الإعلام مدخل والتجربة لن تسفر عن نتائج التفسير. من ناحية أخرى، إذا كانت الخلايا غير مسموح بنقل وصولاً إلى قناة العرض، ثم لا الخلايا ستكون مرئية في القناة خلال التجربة، مما يؤدي إلى صور فارغة. هي النقاط الرئيسية الإضافية أن نأخذ في الاعتبار أن حجم وحركة بين الآبار في لوحة موائع جزيئية مرتبطة معا لكل عمود، ومن الأهمية بمكان للحفاظ على التناسق وسائل الإعلام قدر الإمكان (مع اللزوجة مماثلة، خلية الكثافة، و تكوين) وكذلك الحجم الخلايا (إذا أمكن)، كما سيكون وسائل الإعلام المختلفة وخلية مختلفة الأحجام معدلات تدفق مختلفة في العمود. أثناء التجربة، يرصد الدفق الخلايا باستخدام مجهر؛ ومع ذلك، يمكن عرض قناتين فقط في وقت واحد (باستخدام هدفا X 10). وهكذا، فإنه ينصح بشدة إجراء تجربة وهمية لقياس الوقت اللازم لتدفق من منفذ إلى مدخل الآبار باستخدام الخلايا ووسائل الإعلام يعتزم استخدامها في التجربة الفعلية.
وعموما، نحن نوصي بشدة استخدام هذا الإنزيم بيوفيلم موائع جزيئية كفحص في المختبر تستغل من قبل في فيفو التجارب الحيوانية. المقايسة، ومع ذلك، لا يزال فحص في المختبر ، وأن النتائج تحتاج إلى التحقق من صحتها في نماذج حيوانية ذات الصلة. في تجاربنا، كانت نتائج هذا الفحص بيوفيلم موائع جزيئية أفضل القيمة التنبؤية لفحوصات بيوفيلم في فيفو مقارنة مع غيرها في المختبر فحوصات قمنا بتقييم14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
كلاريسا J. Nobile مؤسس بيوسينيسيس، شركة، وهي شركة تطوير مثبطات والتشخيص للأغشية الحيوية المبيضة .
Acknowledgments
ونشكر جميع أعضاء المختبر Nobile لإجراء مناقشات مفيدة في فحوصات بيوفيلم. وأيد هذا الدراسة المعاهد الوطنية للصحة (المعاهد الوطنية للصحة) منحة R21 AI125801 (C.J.N.). وأيد D.L.R. على زمالة دكتوراه من جامعة "معهد كاليفورنيا" للمكسيك والولايات المتحدة (UC-مكسيوس) y Consejo ناسيونال دي العلوم تكنولوجيا (المجلس الوطني).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioFlux 1000z | Fluxion | Automated microfluidic device for live cell analysis | |
| 48-well plate 0-20 dyne | Fluxion | 910-0047 | Microfluidic plate |
| Montage Software | Fluxion | Version 7.8.4.0 | Visualization analysis software |
| ImageJ Software | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Yeast Extract | Criterion | C7341 | |
| Bacto Peptone | BD Biosciences | 211677 | |
| Dextrose (D-Glucose) | Fisher Scientific | D163 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | P285-500 | |
| RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R6504 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M3183 | |
| Nutrient Broth | Criterion | C6471 | |
| Difco D-Mannitol | BD Biosciences | 217020 | |
| Agar | Criterion | C5001 | |
| Amphotericin B | Corning | 30-003-CF | |
| Sterile Inoculating Loops | VWR | 30002-094 | |
| Petri Dishes with Clear Lid | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Disposable Cuvettes | Fisher Scientific | 14-955-127 | |
| Lens Paper | VWR | 52846-001 | |
| Microplate and Cuvette Spectrophotometer | BioTek | EPOCH2TC | |
| Shaking Incubator | Eppendorf | M12820004 |
References
- Nobile, C. J., Johnson, A. D. Candida albicans Biofilms and Human Disease. Annu Rev Microbiol. 69, 71-92 (2015).
- Kojic, E. M., Darouiche, R. O. Candida infections of medical devices. Clin Microbiol Rev. 17 (2), 255-267 (2004).
- Fox, E. P., Nobile, C. J. Candida albicans: Symptoms, Causes and Treatment Options. Dietrich, L. A., Friedmann, T. S. , Nova Science Publishers. 1-24 (2013).
- Gulati, M., Nobile, C. J. Candida albicans biofilms: development, regulation, and molecular mechanisms. Microbes Infect. 18 (5), 310-321 (2016).
- Uppuluri, P., et al. Dispersion as an important step in the Candida albicans biofilm developmental cycle. PLoS Pathog. 6 (3), e1000828 (2010).
- Andes, D., et al. Development and characterization of an in vivo central venous catheter Candida albicans biofilm model. Infect Immun. 72 (10), 6023-6031 (2004).
- Nett, J. E., Marchillo, K., Spiegel, C. A., Andes, D. R. Development and validation of an in vivo Candida albicans biofilm denture model. Infect Immun. 78 (9), 3650-3659 (2010).
- Nett, J. E., et al. Rat indwelling urinary catheter model of Candida albicans biofilm infection. Infect Immun. 82 (12), 4931-4940 (2014).
- Krom, B. P., Willems, H. M. In Vitro Models for Candida Biofilm Development. Methods Mol Biol. 1356, 95-105 (2016).
- Hawser, S. P., Douglas, L. J. Biofilm formation by Candida species on the surface of catheter materials in vitro. Infect Immun. 62 (3), 915-921 (1994).
- Ramage, G., Vande Walle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Standardized method for in vitro antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms. Antimicrob Agents Chemother. 45 (9), 2475-2479 (2001).
- Nett, J. E., Cain, M. T., Crawford, K., Andes, D. R. Optimizing a Candida biofilm microtiter plate model for measurement of antifungal susceptibility by tetrazolium salt assay. J Clin Microbiol. 49 (4), 1426-1433 (2011).
- Krom, B. P., Cohen, J. B., McElhaney Feser, G. E., Cihlar, R. L. Optimized candidal biofilm microtiter assay. J Microbiol Methods. 68 (2), 421-423 (2007).
- Lohse, M. B., et al. Assessment and Optimizations of Candida albicans In Vitro Biofilm Assays. Antimicrob Agents Chemother. 61 (5), (2017).
- Winter, M. B., et al. Global Identification of Biofilm-Specific Proteolysis in Candida albicans. mBio. 7 (5), (2016).
- Nobile, C. J., et al. A recently evolved transcriptional network controls biofilm development in Candida albicans. Cell. 148 (1-2), 126-138 (2012).
- Fox, E. P., et al. An expanded regulatory network temporally controls Candida albicans biofilm formation. Mol Microbiol. 96 (6), 1226-1239 (2015).
- Nobile, C. J., Mitchell, A. P. Regulation of cell-surface genes and biofilm formation by the C. albicans transcription factor Bcr1p. Curr Biol. 15 (12), 1150-1155 (2005).
- Baker, K. At the bench: A laboratory navigator. 27, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2005).
