Summary
このプロトコルでは、ホストの生理学的な条件の下でカンジダ菌のバイオ フィルム形成を視覚化するカスタマイズ可能な自動化されたマイクロ流体デバイスの使用について説明します。
Abstract
カンジダは、院内敗血症症例の約 15% を引き起こす人間の最も一般的な真菌病原体です。C. albicansの主な病原性属性は、そのバイオ フィルム フォームする能力、生物と非生物の表面に細胞の構造化されたコミュニティです。C. albicansのバイオ フィルムは、粘膜層などのホスト組織とカテーテル、ペース メーカー、入れ歯、人工関節などの医療機器を形成できます。物理と化学の摂動に強く、種子に貯水池播種性感染症として機能することができますので、バイオ フィルムは重要な臨床的課題を提起します。各種の in vitroアッセイは、 C. albicansのバイオ フィルム形成、マイクロタイター プレート アッセイ、乾燥重量測定、セル実行可能性の試金、共焦点走査型レーザー顕微鏡などの研究に利用されています。これらの試金のすべては、特定の時点でのバイオ フィルム形成の評価、単一エンドポイント アッセイです。ここでは、層流条件下で自動マイクロ流体デバイスを用いた実時間でのバイオ フィルムの形成を研究するためのプロトコルについて述べる。このメソッドは、血管カテーテルにおいて直面する問題など、ホストのそれらを模倣するカスタマイズ可能な条件を使用して、時間をかけて開発するバイオ、バイオ フィルム形成の観測できます。このプロトコルは、遺伝的変異のバイオ フィルムの欠陥だけでなく、バイオ フィルムにおけるリアルタイム抗菌剤の抑制効果を評価するために使用できます。
Introduction
しかし、それはまた、日和見主義の病原体、表面的な重症真菌感染症1,2を引き起こすことができる、カンジダは人間の微生物叢の共生メンバーです。C. albicansの主な病原性の特徴は弾力性のあるフォームにその能力と薬剤耐性のバイオ フィルム細胞のコミュニティ、表面に付着、細胞外マトリックス材料1,3で囲まれます。C. albicansのバイオ フィルムの構造高度、種類の細胞のいくつかの層を含む (ラウンド出芽酵母フォームのセル、オーバル偽セル、および尿細管の菌糸細胞)4。C. albicansのバイオ フィルムの開発で始まる画面で、これらの細胞の増殖が続く (シーディングにバイオ フィルム)、表面に丸い酵母型細胞の付着と未熟なバイオ フィルムの成熟に構造化し、完全に形成されたバイオ フィルム細胞外マトリックス材料4によって囲まれます。成熟したバイオ フィルムは主に、バイオ4に安定したアーキテクチャを提供する密な相互接続ネットワークを形成する細長い菌糸細胞で構成されます。バイオ フィルムのライフ サイクルでは、出芽酵母細胞成熟したバイオ フィルムから分散ぐるぐる播種性感染症を引き起こすまたは他サイト4,5で新しいバイオ フィルムをシードに体の他の地域への旅行があります。C. アルビカンスは生物の表面、粘膜面など、ホスト組織全体とカテーテル、ペース メーカー、入れ歯、人工関節などの非生物的表面にバイオ フィルムを形成できます。バイオ フィルムの反抗的な性質上、根絶することは困難、唯一の効果的な治療戦略は、多くの場合感染したデバイス4の除去。つまり、臨床現場で観察されたと同様の条件下でのバイオ フィルム形成を調査することが重要。
いくつか重要な生体内で動物のモデルC. albicansバイオ フィルム形成6,7,8; を研究するために使用しかし、これらの研究は高価、時間のかかることができます、系統と同時にテストすることができます抗菌剤の数によって制限されます。培養バイオ フィルムの試金、その一方で、抗真菌化合物および突然変異系統の高速、高スループットの評価を可能にする、はるかに費用対効果と運ばれるバイオ フィルム アッセイより倫理的な動物のモデル9、 10、11,12,13,14。ここで我々 が開発し、カスタマイズ可能なマイクロ流体デバイス14,15を使用して層流の下で一時的にバイオ フィルム形成を観察するように最適化の in vitroアッセイについて述べる。アッセイは、初期接着性のステップ、細胞の増殖、成熟バイオ フィルム細胞分散などのバイオ フィルム形成の各段階の可視化が可能です。試金はまたバイオ フィルムの開発中の細胞形態変化を視覚化するのに役立ちます。
マイクロタイター プレート、バイオ フィルム アッセイ培養、高スループット中は、制御フローの条件を許可しないため通常利用されています。伝統的な層流セル系バイオ フィルム形成の制御の流れの条件の継続的な評価を可能にするが、設定し、ダイナミック レンジ コントロールおよびスループットが制限する傾向があるに時間がかかることが多い。活用するマイクロ流体デバイス組み込み流室高スループット プレート (48 井戸を含む) を組み合わせることによりこれら制限を克服、高再現性、汎用性とカスタマイズ可能です。
ここでは、野生型C. albicansのバイオ フィルム形成を評価するために市販の自動マイクロ流体デバイスを使用するためのプロトコルについて述べるひずみ、バイオ フィルム、およびバイオ フィルムの発育に及ぼす知られている抗真菌剤バイオ フィルムを持っている以前報告された変異株 (bcr1Δ/Δ ・ Δ/Δ efg1 ) が 2 つの層の欠陥の in vitroとin vivoの16,17,18。記述のプロトコルは、バイオ フィルムのバイオ フィルム形成を阻害することで抗菌薬の有効性をテストするのには、ライブラリの突然変異体をスクリーニングによって通常バイオ フィルム開発に必要な遺伝子を識別するために使用できます。
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Protocol
1. 真菌の細胞培養の準備
注: 行為の細胞培養は、バイオ セーフティ キャビネット内で (すなわちフラスコ、細胞培養管、極低温のストック チューブを開く) を作業に。キャビネットの uv (紫外線) 殺菌ランプ、少なくとも 1 h 作業、および積極的にキャビネットでの作業中の UV ランプをオフにする前にオンにします。手袋・保護メガネ ・適切な保護具を着用し、ベンチや実験の開始前に 70% のエタノールでピペットの表面を消毒します。滅菌フィルターのヒントや基本的な無菌微生物学的テクニックに精通しているの使用をお勧めします。
- ストリークc.albicans系統 ( efg1 Δ/Δ、 bcr1 Δ/Δ、野生型) 酵母のエキス ペプトン ブドウ糖 (YPD) 中 (1% 酵母エキス、ペプトン 2%、2% ブドウ糖; pH 6.8) 寒天。48 h、次の標準的な微生物学的プラクティス1930 ° C で孵化させなさい。
- YPD 液体培地 (1% 酵母エキス、ペプトン 2%、2% ブドウ糖; pH 6.8) の 4 mL に接種し、30 ° C で 12-15 h、次の標準的な微生物学的実技のためのインキュベーターの振動標準の 225 rpm で振とうしながらインキュベート プレートから単一の隔離されたコロニーを選択します。価値19。
- 600 の光学濃度 (OD) を測定することによって文化のセルの密度を決定する nm キュベット (1 mL、パスは 1 cm)、次標準微生物学的実践19。
- 最終的な OD600 0.5, 2 x 107セル/ml、ロズウェル パーク記念研究所 (RPMI)-1640 媒体に相当に細胞培養を希釈 (165 mM 3-morpholinopropane-1-スルホン酸 (モップ)、L-グルタミンを含むナトリウムなし重炭酸、pH 7.0) またはスパイダー媒体 (1% 栄養流体培養基、1% マンニトール、0.4% K2HPO4、pH 7.2)。
注: 興味の菌株の特定の成長をサポートする代替メディアを使用できます。
注: 事前に遠くセル希釈をしないでください。ステップ 3.3 チャネル表示でシードされているセルの前に菌糸形成の開始を防止するために (後述) の後希釈液の調製を開始することをお勧めします。
2. マイクロ プレートのマイクロ チャネルの作製
注: マイクロ流体システムのユーザー マニュアルを参照して (材料の表参照) プレートと機器設定について。
- 37 ° C でインキュベーターでマイクロ流体実験、暖かい RPMI 1640 メディアまたはメディアがクモの 20 mL を実行する前に追加のメディア ボリュームは、2.8 の手順で計算に基づく必要あります。事前に地球温暖化のメディアは、実験中に空気の泡の形成を防ぎます。
- コント ローラー、2 つの電源装置、顕微鏡、カメラを含むマイクロ流体システムの電源し、システムに接続されているコンピューター。オープン システムを制御するソフトウェア (材料の表を参照)、コンピューターのプログラム メニューから。プログラムを開くと、2 つのウィンドウが表示されます。
- 使用中のプレートのバーコード番号を検索し、ソフトウェアでメッセージが表示されたら、番号を入力します。2 つの別のコンピューターの画面を使用すると、2 つの windows のソフトウェアを表示できます。1 つのウィンドウ (コントロール モジュール) 板のコントロールが含まれます、2 番目のウィンドウ (モンタージュ、イメージング モジュール) 顕微鏡とカメラのコントロールが含まれます。
- コント ローラーでヒーターの電源ボタンに切り替え、37 ° C 温度コント ローラーの矢印ボタンを使用するマイクロ流体システムの温度を設定します。
- きれいに滅菌水を使用して次のようにインタ フェース プレート (図 1)。プレートの底を滅菌水にスプレーし、レンズ ペーパーを使用して、汚れ・埃を除去します。空気が乾燥してきれいなレンズ ペーパー上インタ フェース プレートが下向きに置きます。70% イソプロパノールとレンズ ペーパーを使用してインタ フェース プレートの上部をきれいに。
注: インタ フェース プレートは、プレート細胞およびメディアを格納するマイクロ流体システムを接続します。液体が残っていないことすべての繊維や汚れを削除することを確認します。不適切なクリーニング低品質の画像と動画があります。 - フェース プレートにチューブから結露を削除します。
- 板面をレンズ ペーパーで休んで下のままに。コントロール モジュール ウィンドウは、プレートのマニュアル モードをクリックします。せん断制御メニュー] セクションで、列 1-4 および 5-8、流体の選択をクリックし、ドロップ ダウン メニューから 37 ° C を選択します。せん断制御セクションで定数フロー モードに設定、最大せん断を 2 ダイン/cm2に設定 (0.2 Pa) (図 2 a)。
- 入口井戸結露を削除するインタ フェース プレートのチューブを通して無菌の空気の流れを開始するをクリックします。5 分後、ウェル プレート コントロール セクション (図 2 a) の停止ボタンをクリックします。すべて凝縮が削除されていることを確認するためのインタ フェース プレートで管を観察します。水滴がまだ表示されている場合は、前述のように、別の 5 分に無菌の空気の流れを繰り返します。
注: インレット チューブ マイクロ流体システムに無菌の空気だけを導入できるように 0.22 ミクロン フィルターに添付されます。流れは、コントロール モジュール ウィンドウの画面上のイベント ログで監視できます。
- 顕微鏡ステージ上 48 ウェル 0 20 ダイン マイクロ プレートを配置します。
3カンジダバイオ フィルム形成マイクロ流体システム。
- バイオ フィルム形成を記録、入口の井戸 (プレート レイアウト、図 1を参照) に予め温めておいた RPMI 1640 媒体またはスパイダー媒体の 600 μ L を追加します。各実験条件の 2 つの複製があります。
- C. albicansのバイオ フィルム形成をテストするため野生型および変異株は実験板の入口の井戸に 600 μ L クモ媒体を追加します。
- 抗真菌薬 (または興味の他の化合物) の存在下でのバイオ フィルム形成をテストするには、2 つの井戸 (マイナス コントロール) に RPMI 1640 媒体の 600 μ L とアムホテリシン B (16 μ G/ml) 添加 RPMI 1640 媒体の 600 μ L を追加 (またはの選択の薬希望濃度) 他の 2 つの入口の井戸へ。
注: 12 h バイオ フィルム形成実験のため、入口の井戸に予め温めておいたメディアの 600 μ L を追加します。長い実験のためには、入口の井戸に追加メディア (50 μ L/h) を追加します。井戸 (1,500 μ L) の最大の量を超えないようにします。
- 48 よくマイクロ プレートの上にきれいにされたインタ フェース プレートがゆっくりと下ろします。相間のプレートにチューブが入口と出口の井戸の上に配置されるまで、インタ フェース プレートを左に少しスライドします。
注意: インタ フェース プレートにチューブから無菌の空気の流れ (によってコンピューター上のソフトウェアを使用して選択された方向) 入口または出口の井戸の液体をプッシュしますので、液体が流れる入口と出口間のチャネルを表示井戸カスタマイズされた方向と速度、ユーザーによって決定されます。
注: プライミング表示チャンネルから空気を除去し、チャンネルが目的のメディアに満ちていることを確認する必要です。
- C. アルビカンスをテストするため野生型および変異株はefg1 Δ/Δ 2 つのアウトレットの井戸にクモ メディアで、 bcr1 Δ/Δ 2 つのアウトレットの井戸にクモ メディアの 2 つのコンセント井戸クモ メディアで野生型 (SC5314) 細胞培養の 50 μ L を追加します。マイクロ プレートの上にバック フェース プレートを置き、蓋をロック (プレート レイアウト、図 1を参照)。
注: 3.1.1 の手順で説明するよう、すべての対応する入力井戸にはクモ メディアが含まれています。 - C. アルビカンスバイオ フィルム形成アムホテリシン B または興味の他の化合物の存在下でのテスト、4 アウトレットの井戸に RPMI 1640 培地で野生型 (SC5314) 細胞培養の 50 μ L を追加します。マイクロ プレートの上にバック フェース プレートを置き、蓋をロック (プレート レイアウト、図 1を参照)。
注: 3.1.2 の手順で説明するよう、すべての対応する入力井戸には RPMI 1640 メディア アムホテリシン B や他の化合物の興味の有無が含まれています。
注: セル入口井に向かってアウトレット井戸から移動します。セル入口井戸に達する前にフローが停止したことが不可欠です。これにより細胞培養の入口の井戸を汚しません得るか、実験の持続期間のための入口の井戸メディアまま滅菌こと。せん断力と必要な時間は、使用するメディアの粘度とセルのサイズに基づいています。
4 マイクロ流体実験の段階の位置を設定します。
注意: ステージ位置とプレート校正だけ実験を開始する前に設定する必要があります。このセットアップでは、実験中にイメージをキャプチャするための各表示チャンネルの位置を格納するコンピューターことができます。ステージ位置を設定した後、マイクロ プレートを邪魔されない必要があります。プレートを移動すると、ステージの位置は、試験開始前にリセットするでしょう。
- 可視化解析ソフトウェアを使用して、配置段階を設定する (資料の表を参照)。各チャネルの表示段階 (1-24) (図 1) であり、各ステージは表示チャンネル (図 1) に沿った異なる位置でイメージをキャプチャするための 3 つのサブ段階 (1-3)。イメージング モジュール ウィンドウ (図 2 b) MDA タブをクリックして '多次元買収' (MDA) モジュールを開きます。
- MDA モジュール (図 2 b) 左側メニューの 'ステージ' タブをクリックします。ステージでは、48 も 0 - 20 ダイン マイクロ プレート用マスター ステージ一覧を読み込みます。各チャネルの表示画像の獲得のための 3 つの段階が必要です。
- 「サンプル リロード調整」(SRA) を開き、' 絶対位置まで移動ステージ ' SRA] タブと、マップ タブ (図 2 b) をクリックして (地図表示) モジュール。SRA モジュールで十字線と画像のプレビューを参照してくださいに 'ライブ' ボタンを押します。
- ウェル プレートの位置、ジョイスティックを使用して、(物理的に皿の上にある) 矢印の先端ソフトウェアの十字線とチャンネル 4 の表示に隣接して配置。マップ メニュー '原点の設定' ボタン (図 2 b) キーを押します。現在の位置は、0 X、Y、および Z に今お読みください。
- SRA モジュール (図 2 b) 左側のメニュー欄を初期参照ポイントをクリックします。「読み込み設定」をクリックしてし 48 も 0 - 20 ダイン マイクロ プレート用ファイルを読み込みます。
- MDA モジュールの段階セクションをダブルクリック ' ステージ位置 22,2'。この位置を示す表示の真ん中 (サブ ステージ 2) チャネル番号 22。顕微鏡のステージを表示するが表示されます、チャネル 22 を表示して矢印マーカーに近接してのカメラのフォーカス。ウェル プレートの位置、ジョイスティックを使用して、(物理的に皿の上にある) 矢印の先端クロスヘアとチャンネル 22 の表示に隣接して配置。
- MDA モジュールで SRA モジュール (図 2 b) の ' の参照ポイントの更新 '] タブで、ポイント 2 の Y 位置に Y 座標をコピーします。
- SRA の '更新ステージ位置' タブで 'MDA ステージ一覧に [適用] をクリックして (図 2 b)。
注: これはすべてに更新されます特定のマイクロ プレート位置顕微鏡ステージ上に校正するプレート (1-24) のステージ位置を表示します。
5. セットアップ イメージの買収をマイクロ流体実験中にキャプチャします。
- イメージング モジュール ウィンドウで MDA モジュールを使用し、(図 2 b) の左側のメニューで「保存」タブをクリックしますします。実験とコンピューターで取得した画像を保存するフォルダーのファイル名を選択します。
- MDA モジュールの左側のメニューで「タイムラプス」タブをクリックしてし 145 総画像を取得するように設定タイムラプス画像を 5 分間に設定します。これは 1 つのイメージ 12 h バイオ フィルム開発実験のため 5 分毎になります。
注: 画像と画像の合計数との間の時間間隔は実験的要件に基づいて調整することができます。12 h 以上のイメージングしている場合、ステップ 3.1 で入口の井戸に井戸はドライ実行を確保するために追加のメディアを追加します。長い実験の入口の井戸に、(50 μ L/h) を必要に応じて追加のメディアを追加すること。 - MDA モジュール '波長'] タブ (図 2 b) の左側のメニューでをクリックし、1 として実験のための波長の数を設定します。50% 明視野、50% でキャプチャする波長を設定 12-20 ms、0.6 ゲインおよび 20 MHz デジタイザーの露光時間を持つカメラ。
注: 追加の波長使用できます、蛍光イメージングのための波長を含む (例えば、私たちが正常に可視化 mCherry とこのマイクロ流体デバイスを用いた GFP タグC. albicans系統)。実験的要件に基づいて買収のパラメーターを変更することも。例えば、第 2 波長を設定して「各 Timepoint でオート フォーカス」を選択、フォーカス、画像取得の機会を最大にする初心者のため第 3 波長と '各 Timepoint で自動露出' を選択することお勧めします。 - MDA モジュールの左側のメニューでステージ一覧タブを選択します。段階 1, 1-24,3 が表示されます。一つずつ各ステージをクリックし、ファインフォーカスの設定を使用して、手動で各ステージの表示チャネルの細胞に焦点を当てます。ビューのフィールドは、フォーカスでは、一度ステージ リストを更新し、各ステージの設定を保存するの横にある黒い矢印をクリックします。コンピューターは、これらの手動で定義された位置の設定、焦点距離の設定を使用して、すべての時点で画像が取得されます。任意の未使用の段階を '削除' 矢印を使用して一覧から削除します。
注: MDA モジュールとプログラムの段階として同じ意味で、チャンネルの表示を参照してください、ソフトウェアによって使用される同じ用語。
6. マイクロ流体実験の実行
- イメージング モジュール ウィンドウで MDA モジュールを使用してすべてのサブ ステージ (図 2 b) の付着細胞の前にフラッシュ画像をキャプチャを開始する ' 取得' を選択します。
注: イメージング モジュール ウィンドウとカメラ コントロール表示されますがキャプチャされる画像と地図、SRA、および MDA のモジュールは表示されなくなります。次のイメージ キャプチャ ・ サイクルが開始前に撮影した画像はキャプチャする画像の番号を示すために側と時間の経過にもタイマーを表示します。次のステップに進む前にキャプチャする画像の 1 つのラウンドを待ちます。
注: は、イメージング モジュール ウィンドウ画面に '一時停止' または 'マーク イベント' ボタンを使用しないでください。この時点から実験中に、2 番目のコンピューター画面 (図 2 a) コントロール モジュール ウィンドウ上だけでマウスを維持します。これは、イメージング モジュール ウィンドウを妨害を避けるために重要です。 - プレートのマニュアル モードにコントロール モジュール ウィンドウの滞在。せん断制御セクションで定数にフロー モードを設定し、最大せん断が 1 ダイン/cm2に設定 (0.1 Pa)。アウトレット井戸 O1、O7、O13、O19 入口から出口の井戸 (図 2 a) にメディアのフローを開始する非付着細胞を削除するをクリックします。ウェル プレート コントロール] セクションで [停止] ボタンをクリックして 5 分後。画像の第 2 ラウンドを取得できます。イメージを視覚化することができます、イメージング モジュール ウィンドウの 2 番目の画面で時間の経過を監視できます。
- せん断制御セクションで調整 0.5 ダイン/cm2に最大せん断流 (0.5 Pa) の最大数をクリックしてせん断列と 0.5 を入力するキーボードを使用して。キーボードの enter キーを押すし、コントロール モジュール] ウィンドウ (図 2 a) のイベント ログに流量の変化を確認します。実験を行わないで 12 時間暗闇の中で。
注: 光への暴露、運動/振動深刻な実験を通じて取得された画像の質を減らすことができます。マイクロ流体実験の最後に、イメージング モジュール ウィンドウは任意の画像は表示されませんし、SRA、マップ、および MDA のモジュールを表示に戻します。イメージング モジュール ソフトウェアは、画像を表示し、ビデオを組み立てる、バイオ フィルムを定量化する使用ことができます (後述) を形成します。
7. 結果を分析
- イメージング モジュール ウィンドウで「分析ツール」タブを選択し、、「レビュー多次元からデータをクリックして ' (RMD) ドロップ ダウン メニュー。RMD モジュール ' ベース ファイルを選択」をクリックします。' 多次元データ セット ユーティリティ」ウィンドウが開きます。
- 「ディレクトリ選択」ボタンをクリックし、手順 5.1 で実験を保存に使用したフォルダーを選択します。'データセット' リストで実験ファイル ログ (拡張子 .nd) を選択します。ログが読み込まれると、「見る」ボタンをクリックしてします。
- 左側の '波長' メニューのオプションをクリックして波長を選択し、ドロップ ダウン メニューから表示するステージ位置を選択します。画像の番号を右クリックして、モジュールの上部にある番号から読み込むイメージを選択します。選択すると、イメージを読み込む '画像をロード」ボタンをクリックします。一度に 1 つのイメージまたはすべてのイメージを表示できます。
- 時間の経過のビデオを作成するすべての画像を選択します。選択したイメージは、新しいウィンドウでビデオとして開かれます。イメージング モジュール ウィンドウで「ファイル」タブをクリックしてして、'ドロップ ダウン メニューから ' として保存。既定のファイル (TIFF/シリーズ) としては、結果のビデオを保存します。
- 開き、ImageJ ソフトウェアを使用して保存した動画ファイルをロードします。ImageJ、「ファイル」タブをクリックしてしとして保存] をクリックしますします。ドロップ ダウン メニューから「.avi」を選択し、、JPEG 変換を 10 フレーム/秒に設定されてを使用して .avi ファイルにファイルを変換します。
注: フレーム/秒を変えることによって、ビデオの再生速度を調整できます。 - バイオ フィルムを定量化するためには、7.2、7.3 と 7.4 の手順を繰り返します。
注: 実験中に得られた各画像の領域を' は同一と野生型株と変異株のバイオ フィルム形成の違いを評価するかの有効性を評価することに ' どちらられる面積の測定ができます、。バイオ フィルム形成テスト薬。
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Representative Results
ここで野生型を使用して記述されているマイクロ流体バイオ フィルム アッセイを行った 2 つのメディア条件 (RPMI 1640 とクモ メディア) C. albicans歪み、知られている抗真菌剤アムホテリシン B (16 μ G/ml) RPMI の存在下で野生型株バイオ フィルム形成 ( efg1 Δ/Δbcr1Δ/Δ ・ スパイダー メディアの欠陥を持っている 2 つの突然変異体系統が以前報告しました。
ビデオ 1 では、RPMI 1640 中規模およびバイオ フィルム形成に及ぼす抗真菌薬、アムホテリシン B、野生型バイオ フィルムの開発を示しています。野生型の条件の下でいくつかのセルは、チャネルに強く付着、セル形成時間の経過として菌糸と厚いバイオ フィルム間菌糸をインターカ レートで観察することができます酵母細胞。マイクロ流体実験の終わりには、野生型バイオ フィルムは完全に表示チャンネルを塗りつぶします。アムホテリシン B の存在しかし、バイオ フィルムを減らすことに大きく影響しています。具体的には、細胞の付着を低下し、アムホテリシン B の存在下で、状況を放置とは異なりいくつかのセルに画いてあるメディアのせん断流れと共に流れ去っていく。時間の進行、フォーム菌糸にセル失敗するとバイオ フィルム形成されていません。これらの違いは図 3、0 h、2 h、6 h、12 h で試金から 4 時間ポイントを描いたにも表示されます。
ビデオ 2 は野生型のバイオ フィルムの開発を示し、以前クモ メディアでバイオ フィルム欠損株 (bcr1 Δ/Δ ・ Δ/Δ efg1 ) で報告された 2。Bcr1 Δ/Δ とefg1 Δ/Δ の両方の系統を示す同質遺伝子の野生型株と比較して大幅に低下のバイオ フィルム形成。Efg1 Δ/Δ 株の付着細胞が菌糸を形成しない、結果として得られるバイオ フィルムは深刻な欠陥を見ました。Bcr1 Δ/Δ 株の事だけではバイオ フィルム形成はあるbcr1 Δ/Δ 株も明確な付着の欠陥は、細胞を見ることができる表示を見ました彼らに付着する失敗としてせん断流れの方向に漂流、チャンネルの表示。これらの違いは、図 4、0 h、2 h、6 h、12 h で試金から 4 時間ポイントを描いたにも表示されます。
図 1: この実験に用いられるマイクロ流体装置。パネルを示しますマイクロ器械使用、パネルBはインターフェイス板パネルCは単一の表示チャンネル (ステージ) と、実験中に、カメラで撮影された 3 つのサブ段階の概略を示して、パネルDは、出口と入口の井戸および表示ウィンドウの概略図と使用 48 ウェル マイクロ プレートの概略を示しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 制御システムのイメージング modulesoftware とマイクロ プレートの選択スクリーン ショットします。パネルAマイクロ プレート用のコントロールを含むコントロール モジュール、パネルBイメージング モジュール ウィンドウ、移動舞台」絶対位置まで 'を示しています (地図表示) モジュール、' 多次元買収' (MDA) モジュール「サンプル リロード調整」(SRA) モジュール。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: アムホテリシン B に暴露ではバイオ フィルム形成欠陥。RPMI 1640 メディア (列 1) とマイクロ流体システムの 12 h 後の遵守のための 37 ° C で 16 μ g/mL アムホテリシン B (列 2) 動的フロー (0.5 ダイン/cm2) の下で補った RPMI 1640 メディアにおけるバイオ フィルム形成の時間表を依存します。同質遺伝子野生型株 SN250 の代表的な 0 h (後の付着および初期洗浄)、2 h、6 h、12 h 画像 (上下から) が表示されます (列 1 および 2)。スケール バーは、各パネルで 20 μ m です。対応するバイオ フィルム形成のタイムラプス ビデオは、ビデオ 1で提供されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: BCR1またはEFG1の削除はバイオ フィルム形成の欠陥で結果します。マイクロ流体システムの 12 h 後遵守のためクモ メディア (列 1-3) 動的フロー (0.5 ダイン/cm2) 37 ° c の下でバイオ フィルム形成の依存の可視化の時間します。同質遺伝子野生型株 SN250 の代表的な 0 h (後の付着および初期洗浄)、2 h、6 h、12 h 画像 (上下から) が表示されます (列 1) bcr1の Δ/Δ efg1とひずみ (列 2)、Δ/Δ のひずみ (列 3)。スケール バーは、各パネルで 20 μ m です。対応するバイオ フィルム形成のタイムラプス ビデオは、ビデオ 2で提供されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
ビデオ 1:このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。
ビデオ 2:このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。
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Discussion
ここで説明したカスタマイズ可能なマイクロ流体バイオ フィルム アッセイでのバイオ フィルム形成の可視化は、固定レート層流および一定した温度に露出されたときに単一セルのレベルでリアルタイム。野生型および変異株のバイオ フィルムの研究開発に強力な手段を提供しています, 生理学的条件を模倣条件下でバイオ フィルムに対する抗菌剤治療の効果臨床設定で.異なり、ほとんどの in vitroバイオ フィルム アッセイ、このメソッドは、リアルタイムの開発バイオ フィルムの検討を形成。
このメソッドは、24 サンプルまでことができるバイオ フィルム形成を評価するために同時に実行高スループット方法で使用することができます。メソッドは、通常バイオ フィルム開発のために必要な遺伝子を識別するために突然変異体のライブラリの遺伝子スクリーニングを実施するも使用でき、化合物ライブラリー画面に関心の抗菌物質のバイオ フィルムに対する有効性を評価するために使用することができます。このマイクロ流体デバイスの将来のアプリケーションは、このような画面を含めることを期待しています。我々 は、しかし、特定の薬物治療の検査が形成されるバイオ フィルムの成長としてこのマイクロ流体デバイスを用いたバイオ フィルムの厚さによって制限されます、注意 > 16 h 表示チャネルを詰まらせる傾向にあります。したがって、薬物検査の実験が実行する必要があります < 16 h。
全体的にみて、このデバイスは、高いカスタマイズや、汎用性の高い、王国、流量、温度、培養時間、メディア間で微生物種を評価するために調整することができます。記載されているメソッドは、バイオ フィルムの形成、初期細胞接着性、成熟バイオ フィルム細胞分散などのさまざまな側面の番号についての情報を提供します。単一種のバイオ フィルム形成ここで結果を報告するだけ、このプロトコルはデュアルと混合種バイオ フィルムの形成を研究に適応できます。
2 つの手順は、このプロトコルを正常に実行するために重要です。まず、実験的な温度では、メディアを予熱でシステム内の気泡は避けなければなりません。1 つの一般的な誤りがない予熱されたメディア内のセルの希釈です。細胞は、入口の井戸に使用されている同じメディアで希釈する必要があります。第二に、井戸を注意深く監視する必要があります; 入口出口からの細胞の流れセル流れすぎる場合入口メディアが汚染になるし、実験は解釈結果を得られません。その一方で、セル表示されませんチャネルで実験中にそのセルが表示チャネルにすべての道を移動する許可されていない場合は白紙イメージに 。心に留めてその他重要なポイントとしてボリュームとマイクロ プレートのウェル間の動きは、列ごとに一緒にリンクされて、可能な限りメディアの一貫性を維持することが重要だ、(同じような粘度で細胞の密度と組成) と同様に、別のメディアと異なるセルのサイズ列の流量が異なるがある、各セルのサイズを (可能であれば)。顕微鏡; を使用してセルの逆流を監視、実験中にただし、(対物レンズ 10 倍を使用して) 1 つの時にだけ 2 つのチャネルを表示できます。したがって、細胞を使用して入口の井戸にコンセントからの流れに必要な時間を測定するための模擬実験を行うにお勧めは、メディアは、実際の実験で使用される予定します。
一般に、生体内で動物実験する前に利用するための in vitroアッセイとしてこのマイクロ流体バイオ フィルムの試金を使用お勧めします。アッセイは、まだの in vitroアッセイと結果は、適切な動物モデルで検証する必要があります。私たちの経験でこのマイクロ流体バイオ フィルム アッセイの結果は、最適予測値を持って他の in vitroアッセイと比較してバイオ フィルム体内の試金のため我々 は14を評価しています。
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Disclosures
クラリッサ ・ j ・ ノビレは阻害剤とC. albicansのバイオ フィルムの診断の開発会社 BioSynesis 社の創始者です。
Acknowledgments
我々 は、バイオ フィルムの試金の役に立つ議論のノビレ ラボのすべてのメンバーを感謝します。この調査は、健康 (NIH) のグラント R21 AI125801 (C.J.N.) に国立衛生研究所によってサポートされました。地下鉄は、メキシコとアメリカ合衆国 (UC mexus フライ) と国立ナシオナル デ サイエンス y Technologia (CONACYT) カリフォルニア大学の大学から博士課程フェローシップによって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioFlux 1000z | Fluxion | Automated microfluidic device for live cell analysis | |
| 48-well plate 0-20 dyne | Fluxion | 910-0047 | Microfluidic plate |
| Montage Software | Fluxion | Version 7.8.4.0 | Visualization analysis software |
| ImageJ Software | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Yeast Extract | Criterion | C7341 | |
| Bacto Peptone | BD Biosciences | 211677 | |
| Dextrose (D-Glucose) | Fisher Scientific | D163 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | P285-500 | |
| RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R6504 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M3183 | |
| Nutrient Broth | Criterion | C6471 | |
| Difco D-Mannitol | BD Biosciences | 217020 | |
| Agar | Criterion | C5001 | |
| Amphotericin B | Corning | 30-003-CF | |
| Sterile Inoculating Loops | VWR | 30002-094 | |
| Petri Dishes with Clear Lid | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Disposable Cuvettes | Fisher Scientific | 14-955-127 | |
| Lens Paper | VWR | 52846-001 | |
| Microplate and Cuvette Spectrophotometer | BioTek | EPOCH2TC | |
| Shaking Incubator | Eppendorf | M12820004 |
References
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