Summary
פרוטוקול זה מתאר את השימוש מכשיר microfluidic אוטומטית להתאמה אישית כדי להמחיש ביופילמים ב קנדידה אלביקנס בתנאים פיזיולוגיים המארח.
Abstract
קנדידה אלביקנס היא המחלה פטרייתי הנפוץ ביותר של בני האדם, גורם כ 15% של המקרים רכשה החולים אלח דם. תכונה התקפה אלימה העיקריים של ג אלביקנס הוא היכולת ליצור biofilms שלה, קהילות מובנית של תאים מחוברת משטחים ביוטיים והאביוטיים. Biofilms ג אלביקנס יכולים ליצור רקמות מארח, כגון שכבות הרירית, ועוד מכשירים רפואיים, כגון קטטרים, קוצבי, שיניים תותבות, תותבות משותפת. Biofilms מהוות אתגרים משמעותיים קלינית כי הם עמידים מאוד בפני לפליטת פיזיקליות, כימיות, ויש לפעול כפי מאגרים זרע המופץ זיהומים. מבחני במבחנה שונים כבר נעזרו ללמוד אלביקנס ג ביופילמים, כגון מבחני צלחת microtiter, מדידות משקל יבש, מבחני הכדאיות תא קונפוקלית לייזר סריקה. כל מבחני אלה הם מבחני מובילים בודד, היכן שקובעת ביופילמים בנקודת זמן מסוימת. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול ללמוד ביופילמים בזמן אמת באמצעות מכשיר microfluidic אוטומטית תחת תנאי זרימה שכבתית. שיטה זו מאפשרת התבוננות ביופילמים כפי biofilm מתפתחת עם הזמן, שימוש להתאמה אישית בתנאים המחקים את אלה של המחשב המארח, כגון אלה המצויים קטטרים לכלי הדם. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי להעריך את הליקויים biofilm של מוטציות גנטיות וכן אפקטים המעכבת של סוכני מיקרוביאלית על פיתוח biofilm בזמן אמת.
Introduction
קנדידה אלביקנס הוא חבר commensal microbiota האנושית, אולם זה גם פתוגן הזדמנותית, מסוגל לגרום זיהומים פטרייתיים שטחית וחמור1,2. תכונה התקפה אלימה העיקריים של ג אלביקנס היא יכולתה להעביר טופס גמיש, biofilms עמידים בפני התרופה, קהילות של תאים דבקה משטח המוקף בסוגריים גשמי1,מטריצה חוץ-תאית3. ג אלביקנס biofilms בנויות מאוד, המכיל מספר שכבות של סוגי תאים מרובים (סיבוב ניצני שמרים-טופס תאים, התאים pseudohyphal אובל ותאים hyphal צינורי)4. פיתוח biofilm אלביקנס ג מתחיל עם הדבקות של תאי שמרים עגולה-טופס משטח (זריעה של biofilm), ואחריו ההתפשטות של תאים אלה על פני השטח ולאחר מכן ההבשלה של biofilm ילדותי מבנה לתוך biofilm מלא שנוצר המוקפת מטריצה חוץ-תאית גשמי4. בוגרת biofilm מורכב בעיקר מוארך התאים hyphal היוצרים רשתות צפופות ולא מחוברים, מספקת את היציבות אדריכלי עד biofilm4. לאורך כל מחזור חיי biofilm, עגול ניצני שמרים תאים לפזר מן biofilm בוגרת, עשוי לטייל באזורים אחרים של הגוף כדי לגרום לזיהומים המופץ או זרע biofilms חדש על אתרים אחרים,4,5. ג אלביקנס יכולים ליצור biofilms על משטחים ביוטיים, כגון משטחים הרירית וברחבי רקמות הפונדקאי, ועל משטחים והאביוטיים, כגון קטטרים, קוצבי, שיניים תותבות, המפרקים תותבת. בשל מאפייני biofilms הסרבן, הם קשים מאוד לשרש, במקרים רבים אסטרטגיית טיפול יעיל רק הסרה של התקן נגוע4. לכן חשוב לחקור ביופילמים בתנאים דומים לאלה הנהוגות הגדרות קליניים.
ישנם כמה קריטי ויוו חייתיים המשמשות ללימוד אלביקנס ג biofilm היווצרות6,7,8; עם זאת, מחקרים אלה יכול להיות יקר, זמן רב, מוגבלים על ידי מספר זנים, סוכני מיקרוביאלית יכול להיבדק בזמן נתון. במבחנה biofilm מבחני, מצד שני, לאפשר ההערכה המהירה, תפוקה גבוהה של תרכובות פטריות מוטציה זנים, והם הרבה יותר חסכונית, אתי מבחני biofilm נשא שם חיה מודלים9, 10,11,12,13,14. כאן נתאר assay במבחנה אנו פיתח, אופטימיזציה להתבונן ביופילמים חנותם תחת זרימה שכבתית באמצעות14,התקן15microfluidic להתאמה אישית. וזמינותו מאפשר החזיית בכל שלב של ביופילמים, כולל את שלב הדבקות ראשונית, התפשטות תאים, ההבשלה biofilm תא פיזור. וזמינותו שימושי גם לדמיין תא מורפולוגיה שינויים במהלך התפתחות ממבנה biofilm.
לוחות Microtiter, אשר בדרך כלל מנוצלים עבור במבחנה biofilm מבחני, בעוד תפוקה גבוהה, אינם מאפשרים תנאים זרימה מבוקרת. מסורתי, תא מנדפים תאפשר להערכה מתמשכת של ביופילמים בתנאי זרימה מבוקרת, אך אלה הם לעתים קרובות זמן רב כדי להגדיר, נוטים מוגבל טווח דינמי שליטה והתפוקה. המכשיר microfluidic מנוצל כאן מתגבר על מגבלות אלה על-ידי שילוב לוחות תפוקה גבוהה (מכיל 48 וולס) עם תא זרימה שכבתית מובנה, היא מאוד לשחזור, תכליתי, הניתנים להתאמה אישית.
כאן, אנו מתארים את פרוטוקול לשימוש של מכשיר microfluidic אוטומטיים זמינים מסחרית כדי להעריך ביופילמים של פראי-סוג אלביקנס ג להתאמץ, את ההשפעות של סוכן פטריות ידוע על הפיתוח של biofilm ו biofilm -צורה שני זנים מוטציה (Δbcr1/Δ וδ efg1/Δ) אשר היו בעבר דווח כי biofilm פגמים במבחנה , ויוו16,17,18. הפרוטוקול המתואר ניתן לבדוק את היעילות של סוכני מיקרוביאלית עיכוב ביופילמים במהלך התפתחות ממבנה biofilm, וכדי לזהות גנים הדרושים לפיתוח biofilm רגילה על-ידי הקרנת ספריות מוטציה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנה התרבות התא פטרייתי
הערה: תרבית תאים התנהגות עבודה (כלומר פתיחה קריוגני מניות, תא תרבות צינורות, שפופרות מבחנות) בתוך ארון אבטחה. הפעל את אולטרה סגול (UV) קוטל חידקים המנורה לפחות 1 h הקבינט לפני העבודה, כבה מנורת UV תוך פועלת נמרצות הארון. ללבוש כפפות בטיחות משקפיים, ציוד מגן אישי המתאים, decontaminate פני השטח של הספסל, פיפטות עם 70% אתנול לפני תחילת הניסוי. השימוש טיפים מסנן סטרילי והיכרות עם טכניקות בסיסיות מיקרוביולוגית aseptic מומלץ.
- פס אלביקנס ג זנים (פראי-סוג, bcr1 Δ/Δ וδ efg1/Δ) על שמרים לחלץ בינוני דקסטרוז (YPD) peptone (תמצית שמרים 1%, peptone 2%, 2% גלוקוז; pH 6.8) פלטות אגר. דגירה ב 30 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות, מיקרוביולוגית הבאים תקן ומתרגלת19.
- בחר מושבה מבודדת אחת מהצלחת לחסן לתוך 4 מ של YPD נוזלי בינוני (תמצית שמרים 1%, peptone 2%, 2% גלוקוז; pH 6.8), דגירה ב 30 מעלות צלזיוס ברעידות ב rpm 225 תקן רועד חממה במשך 12-15 h, כמעט בכל תחום סטנדרטי מיקרוביולוגית הבאים tices19.
- לקבוע את צפיפות התאים של התרבות על ידי מדידת צפיפות אופטית (OD)-600 nm, cuvette (1 מ"ל, 1 ס מ אורך נתיב), מיקרוביולוגית הבאים תקן ומתרגלת19.
- לדלל את התרבות התא יתר סופית600 של 0.5, שקול ל- 2 x 107 תאים/mL, רוזוול פארק אנדרטת המכון (RPMI)-1640 בינוני (המכיל חומצה 3-morpholinopropane-1-sulfonic 165 מ מ (MOPS),-גלוטמין, ללא נתרן ביקרבונט, pH 7.0) או עכביש בינונית (נזיד מזין 1%, 1% מניטול, 0.4% K-2-HPO-4, pH 7.2).
הערה: המדיה חלופי יכול לשמש כדי לתמוך הגידול הספציפי של זנים מעניינים.
הערה: אל תבצע תא דילולים רחוק מדי מראש. מומלץ להתחיל דילולים לאחר שלב 3.3 (המתוארות להלן) כדי למנוע אתחול של היווצרות hyphae לפני התאים להיות נזרע בערוץ הצפייה.
2. הכנת Microfluidic ערוצי הבסיס Microfluidic
הערה: עיין במדריך למשתמש של מערכת microfluidic (ראה טבלה של חומרים) לקבלת מידע על צלחות, כלי ההתקנה.
- לפני הפעלת הניסוי microfluidic, חם 20 מ של RPMI-1640 מדיה או מדיה עכביש בתוך אינקובטור ב 37 º C. אחסון מדיה נוספים עשוי להידרש המבוסס על חישובים בשלב 2.8. מדיה מראש התחממות כדור הארץ מונע היווצרות בועות אוויר במהלך הניסוי.
- להפעיל את המערכת מיקרופלואידיקה אשר כוללת המצלמה המיקרוסקופ, היחידות אספקת כוח שני, הבקר, מחשב המחובר למערכת. לפתוח את התוכנה ששולטים המערכת (ראה טבלה של חומרים) מתוך התפריט תוכנית במחשב. שני חלונות הם יופיעו לאחר פתיחת התוכנית.
- לאתר את מספר הברקוד של הצלחת בשימוש ולהזין את מספר כאשר תתבקש על-ידי התוכנה. השתמש שני מסכי מחשב נפרד כדי להציג את התוכנה על החלונות שני. חלון אחד (מודול בקרת) מכיל את הפקדים על הצלחת ומכיל החלון השני (מצרף, מודול ההדמיה) את הפקדים כדי להפוך את המיקרוסקופ המצלמה.
- לעבור על כפתור כוח דוד בבקר ולהגדיר מיקרופלואידיקה הטמפרטורה של המערכת 37 ° C באמצעות לחצני החצים של בקר טמפרטורה.
- לנקות את הצלחת ממשק (איור 1) שימוש במים סטריליים כדלקמן. לרסס בתחתית הצלחת עם מים סטרילי והשתמש העדשה נייר כדי להסיר אבק/לכלוך. הנח את ממשק צלחת עם הפנים כלפי מטה על העדשה נקייה נייר כדי אוויר יבש. לנקות את החלק העליון של הלוח ממשק משתמש אלכוהול איזופרופיל 70% ונייר עדשות.
הערה: הצלחת ממשק מקשר את מערכת microfluidic לצלחת שיכיל את התאים ואת התקשורת. ודא כי אין נוזל נשאר כל סיבים ולכלוך יוסרו. לקוי עלול לגרום קטעי וידאו ותמונות באיכות נמוכה. - הסר את התעבות של הצינורות בצלחת ממשק.
- להשאיר צלחת הפנים למטה נח על הנייר העדשה. בפקד החלון מודול לחץ על מצב ידני על הצלחת. במקטע גזירה תפריט הבקרה, לחץ על בחירת נוזל עבור עמודות 1-4 ו- 5-8 ובחר 37 ° C מתוך התפריט הנפתח. במקטע בקרת ' הטיה ', הגדר את מצב זרימה קבוע ולהגדיר את ההטיה מקסימום דיין 2/cm2 (0.2 הרשות הפלסטינית) (איור 2 א).
- לחץ על הבארות כניסת להתחיל את זרימת האוויר סטרילי דרך הצינורות צלחת ממשק כדי להסיר עיבוי. לאחר 5 דקות, לחץ על הלחצן ' עצור ' במקטע בקרת לוח טוב (איור 2 א). להתבונן הצינורות בצלחת ממשק כדי לוודא כי כל עיבוי הוסר. אם טיפות עדיין גלויים, חזור על זרימת אוויר סטרילי, כאמור לעיל, עבור עוד 5 דקות.
הערה: כניסת הצינורות מחוברים מסננים מיקרוניים 0.22 כדי להבטיח רק סטרילי אוויר היא הציגה את מערכת מיקרופלואידיקה. ניתן לנטר את זרימת מאת יומן האירועים על המסך החלון מודול הבקרה.
- מקם את הצלחת microfluidic 48-ובכן 0-20 דיין על הבמה מיקרוסקופ.
3. קנדידה אלביקנס ביופילמים במערכת Microfluidic
- כדי להקליט ביופילמים, להוסיף 600 µL בינוני RPMI-1640 מראש ומחוממת או בינוני עכביש הבארות כניסת (ראה איור 1 לפריסה צלחת). יש משכפל שני עבור כל תנאי הניסוי.
- בדיקה ביופילמים של אלביקנס ג זנים פראי-סוג של מוטציה, להוסיף 600 µL עכביש בינוני כניסת בארות של צלחת הניסוי.
- בדיקה ביופילמים בנוכחות תרופות נגד פטריות (או תרכובות אחרות עניין), להוסיף 600 µL של RPMI-1640 בינוני כדי שתי בארות (בקרה שלילית) ו- 600 µL בינוני RPMI-1640 בתוספת המפוטריצין (16 µg/mL) (או סם בחירתך-רצוי ריכוז) כדי שתי בארות כניסת אחרים.
הערה: עבור ניסוי היווצרות biofilm 12 שעות, להוסיף µL 600 של מדיה מראש ומחוממת הבארות מפרץ צר. לניסויים עוד להוסיף מדיה נוספים (µL 50/h) הבארות מפרץ צר. לא יעלה על הנפח המרבי של הבאר (1,500 µL).
- הורידו לאט את הצלחת ממשק נקי על גבי לוח 48 microfluidic טוב. החלק את הצלחת ממשק מעט שמאלה עד הצינורות בצלחת לאטמוספרה הממוקמים על גבי הבארות כניסת ו עודפים.
הערה: זרימה של אוויר סטרילי מן הצינורות בצלחת ממשק ידחוף את הנוזל בתוך הבארות כניסת או עודפים (תלוי בכיוון שנבחר באמצעות התוכנה במחשב), כך הנוזל זורם דרך ערוץ צפייה בין כניסת עודפים בארות מותאם אישית כיוון ומהירות מוכתב על-ידי המשתמש.
הערה: לקרקע נדרש להסיר אוויר ערוצי הצפייה ולהבטיח כי הערוצים מלאים התקשורת הרצוי.
- בדיקה אלביקנס ג זנים פראי-סוג של מוטציה, להוסיף 50 µL של תרבית תאים (SC5314) פראי-סוג בתקשורת עכביש שתי בארות outlet, Δ bcr1/Δ בתקשורת עכביש כדי שתי בארות עודפים של efg1 Δ/Δ בתקשורת עכביש כדי שתי בארות עודפים. למקם את הצלחת ממשק בחזרה לצלחת microfluidic, לנעול את המכסה (ראה איור 1 לפריסה צלחת).
הערה: כפי שמתואר בשלב 3.1.1, כל בארות קלט המתאימה להכיל מדיה עכביש. - בדיקה אלביקנס ג ביופילמים בנוכחות B שהוא גוסס או מתחם אחרת עניין, להוסיף 50 µL של תרבית תאים (SC5314) פראי-סוג RPMI-1640 בינוני מארבע בארות עודפים. למקם את הצלחת ממשק בחזרה לצלחת microfluidic, לנעול את המכסה (ראה איור 1 לפריסה צלחת).
הערה: כפי שמתואר בשלב 3.1.2, כל בארות קלט המתאימה להכיל מדיה RPMI-1640 עם ובלי B שהוא גוסס או מתחם אחרת עניין.
הערה: התאים מועברים מן הבארות עודפים לקראת הבארות כניסת; זה חיוני כי הזרם מופסק לפני התאים מגיעים הבארות מפרץ צר. פעולה זו מבטיחה כי הבארות כניסת לא להזדהם עם תרבית תאים, כי אמצעי התקשורת הבארות כניסת נותר סטרילי משך זמן הניסוי. הטיית הכוח ואת הזמן הדרוש מבוסס על צמיגות של מדיה המשמשת והגודל של התאים.
4. הגדרת את העמדות הבמה לניסוי. Microfluidic
הערה: הבמה עמדות וכיול הצלחת להגדיר בדיוק לפני תחילת הניסוי. תוכנית התקנה זו מאפשרת למחשב לאחסן את העמדות של כל ערוץ צפייה עבור לכידת התמונות במהלך הניסוי. ואסור להפריע את הצלחת microfluidic לאחר הגדרת את העמדות הבמה. אם הצלחת מועבר, העמדות שלב תצטרך לאפס לפני תחילת הניסוי.
- השתמש בתוכנת ניתוח של ויזואליזציה (ראה טבלה של חומרים) כדי להגדיר את הבמה עמדות; כל ערוץ צפייה הינו שלב (1-24) (איור 1D) ויש בכל שלב שלושה תת שלבים (1-3) עבור לכידת התמונה לעבר עמדות שונות לאורך הערוץ צפייה (איור 1C). בחלון מודול ההדמיה, פתח את ' Multi-dimensional' (מד א) המודול על ידי לחיצה על הכרטיסיה מד א (איור 2B).
- מד א מודול לחץ על הכרטיסיה 'הבמה' בתפריט בצד שמאל (איור 2B). במקטע שלב, לטעון את רשימת שלב בסיס לצלחת microfluidic 48 טוב 0 - 20 דיין. כל ערוץ צפייה צריך שלושה שלבים עבור רכישת התמונה.
- לפתוח את 'מדגם רענן התאמת' (ההזמנות) ואת 'שלב לעבור למיקום המוחלט' מודולים (מפה) על-ידי לחיצה על הכרטיסיה ההזמנות ועל הכרטיסיה מפה (איור 2B). במודול ההזמנות, לחץ על לחצן 'Live' כדי לראות מקדימה של תמונה עם הכוונת.
- באמצעות ג ' ויסטיק, מקם את הצלחת טוב כזה בקצה החץ (ממוקם פיזית על הצלחת) יישור סמוכים להצגת ערוץ 4 עם העדשה על התוכנה. בתפריט ' מפה ', לחץ על לחצן 'הגדר מקור' (איור 2B). המיקום הנוכחי צריך לקרוא עכשיו בתוך 0 X, Y ו- Z.
- במודול ההזמנות, לחץ על המקטע 'נקודות התייחסות ראשונית' בתפריט השמאלי (איור 2B). לחץ על 'טען קביעות', לטעון את הקובץ לצלחת microfluidic 48 טוב 0 - 20 דיין.
- בחלק שלב של המודול מד א, לחץ פעמיים על ' מיקום הבמה 22,2'. עמדה זו עולה באמצע (תת שלב 2) הצפייה ערוץ מספר 22. זה יביא המיקרוסקופ במלונות הבמה וסגור המוקד מצלמה ב מהקרבה סמן החץ על-ידי הצגת ערוץ 22. באמצעות ג ' ויסטיק, מקם את הצלחת טוב כזה בקצה החץ (ממוקם פיזית על הצלחת) יישור סמוכים להצגת ערוץ 22 עם העדשה.
- העתק קואורדינטת Y במודול מד א למצב Y של נקודה 2 בכרטיסיה 'נקודות התייחסות עדכון' של מודול ההזמנות (איור 2B).
- בכרטיסיה 'עדכון הבמה עמדות' ההזמנות, לחץ על 'החל על רשימה הבמה מד א' (איור 2B).
הערה: זה לעדכן את כל הצגת עמדות הבמה בצלחת (1-24) כדי להיות מכויל למיקום צלחת microfluidic ספציפית על הבמה מיקרוסקופ.
5. הגדרת רכישות עבור התמונה ללכוד במהלך הניסוי Microfluidic
- בחלון מודול ההדמיה, להשתמש במודול מד א ולחץ על הכרטיסיה 'שמירה' בתפריט השמאלי (איור 2B). בחר את שם הקובץ עבור הניסוי ואת התיקיה כדי לאחסן תמונות רכשה את המחשב.
- במודול מד א, לחץ על הכרטיסייה 'Timelapse' בתפריט השמאלי ולהגדיר אותו לרכוש תמונות סה כ 145; הגדר את timelapse בין תמונות ל 5 דקות. התוצאה תהיה 1 תמונה כל 5 דקות עבור ניסוי פיתוח biofilm 12 שעות.
הערה: מרווח הזמן בין התמונות לבין המספר הכולל של תמונות יכול להיות מותאם בהתבסס על דרישות ניסיוני. אם הדמיה יותר מ 12 שעות, להוסיף מדיה נוספים הבארות כניסת בשלב 3.1 על מנת להבטיח הבארות לא להתייבש. לניסויים עוד להוסיף מדיה נוספים, לפי הצורך (µL 50/h) הבארות מפרץ צר. - במודול מד א, לחץ על הכרטיסייה 'אורכי גל' בתפריט השמאלי (איור 2B) ולהגדיר את מספר הגל לניסוי כ- 1. קבע את אורך הגל כדי ללכוד ב 50% Brightfield ו-50% מצלמה עם מועד החשיפה של 12-20 ms, רווח 0.6 ב- 20mhz digitizer.
הערה: אורכי גל נוספים ניתן להשתמש, כולל אורכי גל לדימות קרינה פלואורסצנטית (לדוגמה, אנחנו בהצלחה רוחי mCherry וללחצים GFP מתויג אלביקנס ג שימוש במכשיר זה microfluidic). בנוסף ניתן לשנות את הפרמטרים של רכישת בהתבסס על דרישות ניסיוני. לדוגמה, הגדרת אורך גל השני ובחירת 'פוקוס אוטומטי על כל Timepoint' "Autoexposure על כל Timepoint" של הגל השלישי ובחירה מומלץ למתחילים למצות הזדמנויות רכישה תמונות כי הם בפוקוס. - המודול מד א, בחר את הכרטיסיות רשימה הבמה בתפריט השמאלי. שלבים – 1, 1 24,3 יוצג. אחד אחד, לחץ על כל שלב, ולהשתמש בהגדרות המיקוד בסדר להתמקד באופן ידני התאים בערוץ צפייה עבור כל שלב. לאחר שדה הראייה בפוקוס, לחץ על החץ השחור לצד הרשימה הבמה כדי לעדכן ושמור את ההגדרות עבור כל שלב. שהמחשב ישתמש אלה עמדה באופן ידני על-ידי הגדרות והגדרות מוקד לרכוש תמונות בכל נקודת זמן. הסר במות שאינם בשימוש מתוך הרשימה באמצעות החץ 'הסר'.
הערה: מודול מד א ואת התוכנית להתייחס לצפייה ערוצים כמו שלבים לסירוגין, ומשמש באותה הטרמינולוגיה על ידי התוכנה.
6. עורכים את הניסוי Microfluidic
- בחלון מודול ההדמיה, בעזרת המודול מד א, בחרו 'ייבוא' כדי להתחיל בלכידת תמונות מראש סומק של תאים מודבקת על כל תתי שלבים (איור 2B).
הערה: את החלון מודול ההדמיה והפקדים מצלמה עכשיו יציג תמונות נמצאים בשבי, המודול מפה, ההזמנות, מד א כבר לא יהיה גלוי. התמונות שנתפסו גם יראה טיימר על הצד, כדי לציין את מספר תמונות שצולמו, את זמן לשגות לפני המחזור הבא של לכידת תמונה יתחיל. המתן סיבוב אחד של תמונות כדי להיות בשבי לפני שתמשיך לשלב הבא.
הערה: אין להשתמש בלחצנים 'השהה' או "מארק אירוע" על המסך חלון מודול ההדמיה. מנקודה זו ואילך במהלך הניסוי, לשמור על העכבר רק על החלון מודול הבקרה על מסך המחשב השני (איור 2 א). זה חשוב שלא להפריע למטופלים את החלון מודול ההדמיה. - ב בקרה מודול חלון השהייה על מצב ידני על הצלחת. במקטע בקרת ' הטיה ', הגדר את מצב זרימה קבוע ולהגדיר את ההטיה מקסימום דיין 1/cm2 (0.1 הרשות הפלסטינית). לחץ על בארות עודפים O1, O7, O13, O19 להתחיל את זרימת המדיה של כניסת עודפים וולס (איור 2 א) כדי להסיר תאים שאינם דבקה. לאחר 5 דקות לחץ על הלחצן ' עצור ' במקטע בקרת לוח טוב. לאפשר סיבוב שני של תמונות כדי לרכוש. תמונות, ניתן לאבחן ו ניתן לנטר את זמן לשגות במסך השני של החלון מודול ההדמיה.
- במקטע בקרת ' הטיה ', להתאים את זרימת מקסימום הטיה דיין 0.5/cm2 (0.5 הרשות) על ידי לחיצה על המספר המירבי להטיה עמודה, שימוש בלוח המקשים כדי להזין 0.5. הקש על מקש enter במקלדת, לאשר את השינוי קצב הזרימה ביומן האירועים של החלון מודול הבקרה (איור 2 א). להשאיר את הניסוי ללא הפרעה בחושך במשך 12 שעות.
הערה: חשיפה לאור ורעידות/תנועה יכול קשות לצמצם את איכות התמונות רכשה לאורך כל הניסוי. בסוף הניסוי microfluidic, החלון מודול ההדמיה לא יציג תמונות, יחזרו מציג את המודולים ההזמנות, מפה, מד א. התוכנה מודול ההדמיה יכול לשמש כדי להציג את התמונות, להרכיב את קטעי וידאו, לכמת biofilms נוצר (כמפורט להלן).
7. ניתוח התוצאות
- בחלון מודול ההדמיה, בחר את הכרטיסיה 'כלי ניתוח' ולחץ על 'סקירה Multi-dimensional נתונים' (RMD) מהמסירה למטה בתפריט. במודול RMD, לחץ על 'בחר קובץ בסיס'. פעולה זו תפתח חלון 'כלי שירות של ערכת הנתונים Multi-dimensional'.
- לחץ על לחצן 'בחר ספריית האתר' ובחר את התיקיה ששימש לשמור את הניסוי בשלב 5.1. ברשימה 'ערכות נתונים', בחר את הניסוי קובץ יומן הרישום (סיומת. .nd). ברגע נטען את יומן הרישום, לחץ על הלחצן 'תצוגה'.
- בחר את אורך הגל על ידי לחיצה על האפשרויות בתפריט השמאלי 'אורכי גל' ובחר מיקום הבמה להציג מהתפריט הנפתח. בחר את התמונה שיש לטעון מ המספרים על המודול בלחיצה ימנית על מספר תמונות. ברגע שנבחר, לחץ על לחצן 'טען כתמונות' כדי לטעון את התמונות. באפשרותך להציג תמונה אחת או כל התמונות בבת אחת.
- בחר את כל התמונות כדי להפוך את זמן לשגות וידאו. התמונות הנבחרות יפתח כווידאו בחלון חדש. לחץ על הכרטיסיה 'קובץ' ב חלון מודול ההדמיה ובחרו 'שמור בשם' מהתפריט הנפתח. שמירת וידאו שהתקבל כקובץ ברירת המחדל (TIFF/MetaSeries).
- פתח, לטעון את קובץ הווידאו שנשמר באמצעות תוכנת ImageJ. ב- ImageJ, לחץ על הכרטיסיה 'קובץ' ולחץ על 'שמור'. בחרו '.avi' מהתפריט הנפתח, להמיר את הקובץ כקובץ avi באמצעות ההמרה JPEG מוגדר 10 מסגרות לשנייה.
הערה: ניתן להתאים את המהירות של הווידאו על ידי שינוי של המסגרות לשנייה. - כדי לכמת biofilms, חזור על שלבים 7.2 7.3, 7.4.
הערה: 'אזור' עבור כל תמונה שהתקבל במהלך הניסוי הוא זהה, ולכן המדידה 'אזור Thresholded' יכול לשמש כדי להעריך את ההבדלים ביופילמים בין זנים פראי-סוג וללחצים מוטציה או להעריך את היעילות של התרופה שנבדקה על ביופילמים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ביצענו microfluidic biofilm וזמינותו המתוארים כאן על ידי שימוש פראי-סוג של מתח אלביקנס ג בתנאים מדיה שני (RPMI-1640, עכביש מדיה), המתח פראי-סוג בנוכחות הסם פטריות ידוע שהוא גוסס B (16 µg/mL)-RPMI, שני זנים מוטציה בעבר דווח כי פגמים במבנה biofilm (Δbcr1/Δ וδ efg1/Δ) בתקשורת עכביש.
וידאו 1 מציג את התפתחות ממבנה biofilm פראי-סוג RPMI-1640 בינונית, את ההשפעות של התרופה נגד פטריות, המפוטריצין, על ביופילמים. בתנאים פראי-סוג, תאים אחדים לדבוק בחריפות הערוץ, התאים יוצרים hyphae לאורך זמן, והן ממבנה biofilm עבה יכול להיות שנצפו עם intercalating hyphae תאים שמרים. לקראת סוף הניסוי microfluidic, biofilm פראי-סוג ממלא לגמרי את הערוץ הצפייה. הנוכחות של המפוטריצין, עם זאת, יש השפעה מובהקת על הפחתת biofilm. באופן ספציפי, הדבקות של תאים נחלש, בניגוד לתנאים לא מטופל, בנוכחות B שהוא גוסס, תאים אחדים ניתן לראות ונעלם עם הזרם הטיה של המדיה. ככל שהזמן מתקדם, את התאים אינם טופס hyphae, ממבנה biofilm לא נוצר. הבדלים אלה מוצגים גם באיור 3, המתאר 4 בזמן נקודות מ וזמינותו ב 0 h, 2 h, 6 h ו 12 שעות.
וידאו 2 מראה על התפתחות ממבנה biofilm פראי-סוג, שתי מוטציות תקינה biofilm (Δ bcr1/Δ וδ efg1/Δ) דיווח בעבר בתקשורת עכביש. שני זנים Δ/Δ bcr1 Δ/Δ ו- efg1 מציגים ביופילמים קשות מופחתת בהשוואה המתח פראי-סוג isogenic. לזן Δ/Δ של efg1 ', הבחנו כי התאים מודבקת לא בצורת hyphae, biofilm וכתוצאה מכך פגומה קשות. לזן Δ/Δ של bcr1 ', הבחנו כי לא רק מוצג המתח Δ/Δ bcr1 פגומים ביופילמים, אבל זה גם הדבקות ברורה פגם, שבו ניתן לראות תאים נסחף בכיוון הזרימה הטיה כפי הם נכשלים לדבוק צפייה בערוץ. הבדלים אלה מוצגים גם באיור 4, המתאר ארבע נקודות זמן וזמינותו ב 0 h, 2 h, 6 h ו 12 שעות.
איור 1: מכשיר Microfluidic בניסוי זה. פאנל A מראה המכשיר microfluidic בשימוש, פאנל B מציג הצלחת ממשק, לוח ג מראה קו מיתאר סכמטי של ערוץ צפייה יחיד (שלב), שלושה שלבים ותת שנתפסו על ידי המצלמה במהלך הניסוי, ואת החלונית ' D מציגה קו מיתאר סכמטי של צלחת 48-הבאר microfluidic בשימוש עם שרטוט של עודפים, כניסת בארות, חלון צפייה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: מערכת בקרת בחירה צילומי מסך של הדמיה צלחת modulesoftware ו- microfluidic. פאנל A מציג את מודול הבקרה, המכיל את הפקדים על הלוח microfluidic, ומציג לוח B החלון מודול ההדמיה, 'להעביר הבמה כדי מיקום מוחלט' מודול (מפה), המודול 'רכישה Multi-dimensional' (מד א), המודול 'מדגם רענן התאמת' (ההזמנות). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: חשיפה המפוטריצין מתבטא biofilm היווצרות פגמים. הזמן תלוי ויזואליזציה של ביופילמים RPMI-1640 מדיה (עמודה 1), RPMI-1640 מדיה בתוספת 16 µg/mL המפוטריצין (עמודה 2) תחת זרימה דינאמי (דיין 0.5/cm2) ב 37 מעלות צלזיוס ב"זכות שאחרי 12 שעות במערכת microfluidic. נציג 0 h (פוסט הדבקות, הראשונית לשטוף), 2 h, 6-אייץ ' ותמונות 12 שעות (מלמעלה למטה) מוצגים לזן פראי-סוג של isogenic SN250 (עמודים 1 ו- 2). סרגלי קנה מידה הם 20 מיקרומטר של כל לוח. הזמן המתאים? לשגות קטעי וידאו של ביופילמים ניתנים 1 וידאו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: מחיקה של BCR1 או EFG1 תוצאות biofilm היווצרות פגמים. הזמן תלוי ויזואליזציה של ביופילמים בתקשורת עכביש (עמודות 1-3) תחת דינמי זורם (דיין 0.5/cm2) 37 ° C ב"זכות שאחרי 12 שעות במערכת microfluidic. נציג 0 h (פוסט הדבקות, הראשונית לשטוף), 2 h, 6-אייץ ' ותמונות 12 שעות (מלמעלה למטה) מוצגים לזן פראי-סוג של isogenic SN250 (עמודה 1), bcr1Δ/Δ זן (עמודה 2), efg1 Δ/Δ זן (עמודה 3). סרגלי קנה מידה הם 20 מיקרומטר של כל לוח. הזמן המתאים? לשגות קטעי וידאו של ביופילמים ניתנים סרטון 2. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
וידאו 1: אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
וידאו 2: אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Microfluidic להתאמה אישית biofilm וזמינותו המתוארים כאן מאפשר החזיית ביופילמים ב בזמן אמת ברמה תא בודד כאשר הם נחשפים זרימה שכבתית בריבית קבועה עם טמפרטורה קבועה. הוא מספק אמצעי רב עוצמה כדי ללמוד על התפתחות biofilms בפראי-סוג של מוטציה זנים, ההשפעות של הסוכן מיקרוביאלית טיפולים על biofilms בתנאים המחקים בתנאים פיזיולוגיים שנצפתה הגדרות קליניים. שלא כמו רוב במבחנה biofilm מבחני, שיטה זו מאפשרת בחינת ממבנה biofilm המתפתח בזמן אמת כמו צורות.
בשיטה זו ניתן להשתמש באופן תפוקה גבוהה, בו עד 24 דוגמאות ניתן להפעיל בו זמנית כדי להעריך ביופילמים. השיטה יכול לשמש גם לנהל את מסכי גנטי של ספריות מוטציה לזיהוי גנים הדרושים לפיתוח biofilm נורמלי והוא יכול לשמש כדי להעריך את ולייעל נגד biofilms של תרכובות מיקרוביאלית עניין בספריית מתחם מסכי. אנו צופים כי יישומים עתידיים של התקן microfluidic זה יכלול מסכי כזה. יש לציין, עם זאת, כי בדיקות טיפול סמים מסוימים תוגבל על ידי עובי biofilm הנוצרת באמצעות מכשיר microfluidic זה כמו biofilms גדל עבור > 16 h נוטים הסותמים את הערוץ הצפייה. לכן, בדיקות ניסויים סמים יהיה צורך לבצע עבור < 16 h.
בסך הכל, המכשיר הזה הוא מאוד להתאמה אישית, רב-תכליתי, יכול להיות מותאם כדי להעריך מינים חיידקים שונים ברחבי הממלכות, המחירים זרימה, טמפרטורות, דגירה פעמים ומדיה. השיטה המתוארת מספק מידע על מספר היבטים שונים של ביופילמים, לרבות הדבקות ראשונית תא, ההבשלה biofilm תא פיזור. אמנם אנחנו רק לדווח על תוצאות חד-מינים ביופילמים כאן, פרוטוקול זה יכול גם להיות מותאם ללמוד כפול-מעורב-מינים ביופילמים.
שני צעדים הם קריטיים כדי לבצע בהצלחה פרוטוקול זה. ראשית, יש להימנע בועות אוויר בתוך המערכת על ידי חימום התקשורת בטמפרטורה ניסיוני. טעות נפוצה אחת היא הדילול של תאים בתקשורת זה לא היה טרופה. צריך להיות מדולל תאים בתקשורת באותה נמצא בשימוש עבור הבארות כניסת. רגע, הזרימה של תאים משקע כניסת בארות חייב להיות במעקב בקפידה; אם התאים לזרום רחוק מדי, התקשורת כניסת להיות מזוהמים, הניסוי לא תניב תוצאות interpretable. מצד שני, אם התאים לא מורשים לעבור כל הדרך לתוך התעלה צפייה, ואז לא התאים יהיו גלויים בערוץ במהלך הניסוי, מוביל לתמונות ריק. נקודות מפתח נוספים שכדאי לזכור הן עוצמת הקול והתנועה בין בארות בצלחת microfluidic קשורים יחד עבור כל עמודה, וזה חשוב לשמור על עקביות מדיה רב ככל האפשר (עם צמיגות דומה, תא צפיפות, ו קומפוזיציה) באופן דומה בגודל התאים (במידת האפשר), כמו מדיה שונים ובגדלים שונים תא תהיה זרימה שונים המחירים בעמודה. במהלך הניסוי, זרם אחורי של התאים מתבצע פיקוח באמצעות מיקרוסקופ; עם זאת, ניתן לצפות רק שני ערוצים בבת אחת (באמצעות מטרה X 10). לכן, מומלץ מאוד לבצע ניסוי מדומה כדי למדוד את הזמן הנדרש כדי לזרום משקע בארות כניסת באמצעות התאים, מדיה שתוכנן לשמש לניסוי בפועל.
באופן כללי, מומלץ מאוד שימוש assay biofilm זה microfluidic כמו assay במבחנה כדי להיות מנוצל לפני ויוו הניסויים בחיות. וזמינותו, עם זאת, הוא עדיין assay במבחנה , תוצאות, תצטרך לאמת הרלוונטיים במודלים של בעלי חיים. בחוויות, היו התוצאות של זה וזמינותו biofilm microfluidic את הערך החזוי בצורה הטובה ביותר עבור ויוו biofilm מבחני לעומת שאר מבחני במבחנה אנחנו שהערכת14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
קלריסה ג'יי Nobile הוא מייסד BioSynesis, inc., חברה פיתוח מעכבי ואבחון של biofilms אלביקנס ג .
Acknowledgments
אנו מודים לכל חברי המעבדה Nobile לדיונים מועיל על מבחני biofilm. מחקר זה נתמך על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) מענק R21 AI125801 (C.J.N.). D.L.R. נתמכה על ידי מלגת דוקטורט מאוניברסיטת קליפורניה המכון מקסיקו, ארצות הברית (UC-MEXUS) ו y Consejo נאסיונאל דה Ciencia Technologia (CONACYT).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioFlux 1000z | Fluxion | Automated microfluidic device for live cell analysis | |
| 48-well plate 0-20 dyne | Fluxion | 910-0047 | Microfluidic plate |
| Montage Software | Fluxion | Version 7.8.4.0 | Visualization analysis software |
| ImageJ Software | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Yeast Extract | Criterion | C7341 | |
| Bacto Peptone | BD Biosciences | 211677 | |
| Dextrose (D-Glucose) | Fisher Scientific | D163 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | P285-500 | |
| RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R6504 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M3183 | |
| Nutrient Broth | Criterion | C6471 | |
| Difco D-Mannitol | BD Biosciences | 217020 | |
| Agar | Criterion | C5001 | |
| Amphotericin B | Corning | 30-003-CF | |
| Sterile Inoculating Loops | VWR | 30002-094 | |
| Petri Dishes with Clear Lid | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Disposable Cuvettes | Fisher Scientific | 14-955-127 | |
| Lens Paper | VWR | 52846-001 | |
| Microplate and Cuvette Spectrophotometer | BioTek | EPOCH2TC | |
| Shaking Incubator | Eppendorf | M12820004 |
References
- Nobile, C. J., Johnson, A. D. Candida albicans Biofilms and Human Disease. Annu Rev Microbiol. 69, 71-92 (2015).
- Kojic, E. M., Darouiche, R. O.
- Fox, E. P., Nobile, C. J. Candida albicans: Symptoms, Causes and Treatment Options. Dietrich, L. A., Friedmann, T. S. , Nova Science Publishers. 1-24 (2013).
- Gulati, M., Nobile, C. J. Candida albicans biofilms: development, regulation, and molecular mechanisms. Microbes Infect. 18 (5), 310-321 (2016).
- Uppuluri, P., et al. Dispersion as an important step in the Candida albicans biofilm developmental cycle. PLoS Pathog. 6 (3), e1000828 (2010).
- Andes, D., et al. Development and characterization of an in vivo central venous catheter Candida albicans biofilm model. Infect Immun. 72 (10), 6023-6031 (2004).
- Nett, J. E., Marchillo, K., Spiegel, C. A., Andes, D. R. Development and validation of an in vivo Candida albicans biofilm denture model. Infect Immun. 78 (9), 3650-3659 (2010).
- Nett, J. E., et al. Rat indwelling urinary catheter model of Candida albicans biofilm infection. Infect Immun. 82 (12), 4931-4940 (2014).
- Krom, B. P., Willems, H. M. In Vitro Models for Candida Biofilm Development. Methods Mol Biol. 1356, 95-105 (2016).
- Hawser, S. P., Douglas, L. J. Biofilm formation by Candida species on the surface of catheter materials in vitro. Infect Immun. 62 (3), 915-921 (1994).
- Ramage, G., Vande Walle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Standardized method for in vitro antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms. Antimicrob Agents Chemother. 45 (9), 2475-2479 (2001).
- Nett, J. E., Cain, M. T., Crawford, K., Andes, D. R. Optimizing a Candida biofilm microtiter plate model for measurement of antifungal susceptibility by tetrazolium salt assay. J Clin Microbiol. 49 (4), 1426-1433 (2011).
- Krom, B. P., Cohen, J. B., McElhaney Feser, G. E., Cihlar, R. L. Optimized candidal biofilm microtiter assay. J Microbiol Methods. 68 (2), 421-423 (2007).
- Lohse, M. B., et al. Assessment and Optimizations of Candida albicans In Vitro Biofilm Assays. Antimicrob Agents Chemother. 61 (5), (2017).
- Winter, M. B., et al. Global Identification of Biofilm-Specific Proteolysis in Candida albicans. mBio. 7 (5), (2016).
- Nobile, C. J., et al. A recently evolved transcriptional network controls biofilm development in Candida albicans. Cell. 148 (1-2), 126-138 (2012).
- Fox, E. P., et al. An expanded regulatory network temporally controls Candida albicans biofilm formation. Mol Microbiol. 96 (6), 1226-1239 (2015).
- Nobile, C. J., Mitchell, A. P. Regulation of cell-surface genes and biofilm formation by the C. albicans transcription factor Bcr1p. Curr Biol. 15 (12), 1150-1155 (2005).
- Baker, K. At the bench: A laboratory navigator. 27, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2005).
