Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Visualisering av Biofilm formasjon i Candida albicans bruker en automatisert Microfluidic enhet

Published: December 14, 2017 doi: 10.3791/56743
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Molecular and Cell Biology, School of Natural Sciences, University of California, Merced

Summary

Denne protokollen beskriver bruken av en tilpassbar automatisert microfluidic enhet å visualisere biofilm formasjon i Candida albicans under vert fysiologiske forhold.

Abstract

Candida albicans er den vanligste fungal patogen av mennesker, forårsaker ca 15% av sykehus-ervervet sepsis. En stor virulens attributt for C. albicans er dens evne til å skjemaet biofilm, strukturert samfunn av celler knyttet til biotiske og abiotiske flater. C. albicans biofilm kan danne vert vev, som slimhinnene lag, og medisinske enheter, for eksempel katetre, pacemaker, proteser og felles proteser. Biofilm utgjøre betydelige klinisk utfordringer fordi de er svært motstandsdyktig mot fysiske og kjemiske forstyrrelser, og kan fungere som reservoarer til frø spres infeksjoner. Ulike i vitro analyser har vært benyttet for å studere C. albicans biofilm formasjonen, som være ferdig innen plate analyser, tørr vekt mål, celle levedyktighet analyser og AC confocal skanning laser mikroskopi. Alle disse analyser er enkelt end-point analyser, der biofilm formasjon er vurdert på et bestemt tidspunkt. Her beskriver vi en protokoll for å studere biofilm formasjon i sanntid ved hjelp av en automatisert microfluidic enhet under laminær strømningsforhold. Denne metoden gjør observasjon av biofilm formasjon som biofilm utvikler seg over tid, passelig betingelser som etterligner de av verten, som de i vaskulær katetre. Denne protokollen kan brukes til å vurdere biofilm defekter genetisk mutanter samt hemmende effekten av antimikrobielle midler på biofilm utvikling i sanntid.

Introduction

Candida albicans er commensal med den menneskelige bakterieflora, men det er også en opportunistisk patogen, kan forårsake overfladiske og alvorlig fungal infeksjoner1,2. En stor virulens egenskap av C. albicans er evnen til å danne spenstig og resistente biofilm, samfunn av celler overholdt en overflate og omsluttet av en ekstracellulær matrix materiale1,3. C. albicans biofilm er svært strukturert, som inneholder flere lag flere celletyper (runde spirende gjær-skjemaet celler, ovale pseudohyphal celler og rørformede hyphal celler)4. C. albicans biofilm utvikling begynner med tilslutning celleområde runde gjær-skjemaet til en overflate (såing av biofilm), etterfulgt av spredning av disse cellene på overflaten, og deretter modning av den umodne biofilm strukturen i en fullt dannet biofilm som er omgitt av ekstracellulær matrix materiale4. Den modne biofilm består hovedsakelig av langstrakte hyphal celler som tett og sammenkoblede nettverk, å gi arkitektoniske stabilitet til biofilm4. Gjennom hele livssyklusen biofilm rundt spirende gjær spre fra de eldre biofilm og kan reise til andre deler av kroppen for å føre spres infeksjoner eller frø nye biofilm på andre nettsteder4,5. C. albicans kan danner biofilm biotiske overflater, for eksempel mucosal overflater og hele vert vev, og abiotiske flater, for eksempel katetre, pacemaker, proteser og protese ledd. På grunn av gjenstridige egenskapene til biofilm, de er svært vanskelig å utrydde, og i mange tilfeller det bare effektiv behandling strategien er fjerning av infisert enheten4. Det er derfor avgjørende å undersøke biofilm formasjon under forhold som ligner de i klinisk innstillinger.

Det er flere kritiske i vivo dyr modeller brukes til å studere C. albicans biofilm formasjon6,7,8; men disse studiene kan være kostbart, tidkrevende, og er begrenset av antall stammer og antimikrobielle midler som kan testes på et gitt tidspunkt. In vitro biofilm analyser, derimot, tillater rask, høy gjennomstrømming vurdering av soppdrepende forbindelser og mutant stammer, og er mye mer kostnadseffektiv og etisk enn biofilm analyser båret ut i dyr modeller9, 10,11,12,13,14. Her beskriver vi i vitro analysen som vi utviklet og optimalisert for å observere biofilm formasjon timelig under laminær strømning bruker en passelig microfluidic enheten14,15. Analysen gir effekten av hvert trinn i biofilm formasjon, inkludert overholdelse av første trinn, celle spredning, biofilm modning og celle spredning. Analysen er også nyttig å visualisere cellen morfologi endringer i utviklingen av en biofilm.

Være ferdig innen platene som benyttes vanligvis for i vitro biofilm analyser, mens høy gjennomstrømning, tillater ikke for kontrollert strømningsforhold. Tradisjonelle laminær strømning celle systemer tillater kontinuerlig vurdering av biofilm formasjon i kontrollerte strømningsforhold, men disse er ofte tidkrevende å definere og pleier å ha begrenset dynamisk rekkevidde-kontroll og gjennomstrømning. Microfluidic enheten brukes her overvinner disse begrensningene ved å kombinere høy gjennomstrømning plater (inneholder 48 brønner) med en innebygd laminær strømning kammer og er svært reproduserbare, allsidig og kan tilpasses.

Her beskriver vi en protokoll for bruk av en kommersielt tilgjengelig automatiserte microfluidic enhet å vurdere biofilm dannelsen av en vill-type C. albicans belastning, effekten av en kjent soppdrepende middel på utviklingen av biofilm og biofilm formasjon i to mutant stammer (bcr1Δ/Δ og efg1 Δ/Δ) som tidligere ble rapportert å ha biofilm defekter i vitro og vivo16,17,18. Beskrevet protokollen kan brukes til å teste effekten av antimikrobielle midler i hemme biofilm formasjon hele utviklingen av en biofilm, og identifisere tilblivelse kreves for vanlig biofilm utvikling av screening mutant biblioteker.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. fungal celle kultur forberedelse

Merk: Oppførsel cellekultur fungerer (dvs. Åpne kryogene lager rør, celle kultur rør og flasker) i en biosafety kabinett. Slå på regjeringens ultrafiolett (UV) bakteriedrepende lampe minst 1 h før arbeidet, og slå av UV-lampen mens arbeider aktivt i kabinettet. Slitasje hansker, vernebriller og riktig personlig verneutstyr, og dekontaminere overflaten av benken og Pipetter med 70% etanol før starten av eksperimentet. Bruk av steril filter tips og kjennskap til grunnleggende aseptiske mikrobiologisk teknikker anbefales.

  1. Strek C. albicans stammer (vill-type, bcr1 Δ/Δ og efg1 Δ/Δ) på gjær ekstra pepton druesukker (YPD) medium (1% gjærekstrakt, 2% pepton, 2% glukose, pH 6.8) agar plater. Ruge på 30 ° C i 48 timer, følgende standard mikrobiologisk praksis19.
  2. Velg en enkelt isolert koloni fra platen å vaksinere i 4 mL YPD flytende medium (1% gjærekstrakt, 2% pepton, 2% glukose, pH 6.8) og ruge på 30 ° C med skjelvende på 225 rpm i standard risting inkubator for 12-15 h, følgende standard mikrobiologisk prac Tices19.
  3. Bestemme cellen tettheten av kulturen ved å måle optisk tetthet (OD) på 600 nm i søppel (1 mL, 1 cm banelengde), følgende standard mikrobiologisk praksis19.
  4. Fortynne cellekultur en siste OD600 på 0,5, tilsvarende 2 x 107 celler/mL, i Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medium (inneholder 165 mM 3-morpholinopropane-1-sulfonic acid (MOPPER), L-Glutamine, og uten natrium bikarbonat, pH 7.0) eller edderkopp medium (1% næringsrik buljong, 1% mannitol, 0,4% K2HPO4, pH 7.2).
    Merk: Alternative medier kan brukes til å støtte bestemte veksten av stammer av interesse.
    Merk: Ikke gjør celle fortynninger langt på forhånd. Det anbefales å begynne fortynninger etter trinn 3.3 (beskrevet nedenfor) for å hindre oppstart av hyfer formasjon før celler blir sådd i visning kanalen.

2. forberedelse av Microfluidic kanaler av Microfluidic Plate

Merk: Se bruksanvisningen microfluidic system (se tabell av materialer) for informasjon om platene og instrument oppsett.

  1. Før du kjører microfluidic eksperimentet, varme 20 mL av RPMI-1640 media eller edderkopp media i en inkubator på 37 ° C. Flere medier volumet kan være nødvendig basert på beregninger i trinn 2.8. Pre oppvarming media hindrer dannelsen av luftbobler under eksperimentet.
  2. Slå på microfluidics system som omfatter kontrolleren, de to strømforsyningsenheter, mikroskopet, kameraet, og datamaskinen koblet til systemet. Åpne programvaren som styrer systemet (se tabell av materialer) fra program-menyen på datamaskinen. To vinduer vises når programmet er åpnet.
  3. Finn strekkode antall platen i bruk og angi nummeret når programvaren. Bruk to separat dataskjermer vise programvaren på to Vinduer. Ett vindu (kontroll modul) inneholder kontroller for plate og det andre vinduet (Montage, tenkelig modul) inneholder kontroller for mikroskop og kameraet.
  4. Slå på ovn strøm-knappen på kontrolleren og sett microfluidics temperatur 37 ° C ved hjelp av piltastene på temperatur kontrolleren.
  5. Rengjør grensesnitt platen (figur 1) bruker sterilt vann som følger. Spray bunnen av platen med sterilt vann og bruk linsen papir for å fjerne skitt/støv. Hvile grensesnitt plate ansiktet ned på rent objektiv papir å lufttørke. Rengjør toppen av grensesnittet platen bruker 70% isopropanol og linsen.
    Merk: Grensesnitt platen kobler microfluidic systemet av platen som inneholder cellene og media. Kontroller at ingen væske forblir og at alle fiber og skitt er fjernet. Upassende rensning kan resultere i lav kvalitet bilder og videoer.
  6. Fjern kondens fra rørene på grensesnittet tallerkenen.
    1. La platen ansiktet ned hviler på linsen papiret. Kontroll modul-vinduet klikker manuell modus for plate. Klikk på flytende markeringen for kolonner 1-4 og 5-8 i delen skjær kontroll-menyen, og velg 37 ° C fra det miste-ned menyen. Skjær kontroll delen Angi flyt modus med konstant og angi maks skjær 2 Dyn/cm2 (0,2 Pa) (figur 2A).
    2. Klikk på innløpet brønnene starte sterilt luftstrømmen gjennom grensesnittet plate rør for å fjerne kondensvann. Etter 5 min, klikk på stoppknappen i inndelingen for godt plate kontroll (figur 2A). Observere rør i grensesnittet plate å bekrefte at alle kondens er fjernet. Hvis dråper er fortsatt synlig, gjenta flyten av steril luft, som nevnt ovenfor, for en annen 5 min.
      Merk: Innløp rørene er knyttet til 0.22 mikron filtre for å sikre bare steril luft er introdusert til microfluidics systemet. Strømmen kan overvåkes av hendelsesloggen på skjermen i modulvinduet.
  7. Plass 48-og 0-20 Dyn microfluidic platen på mikroskopet scenen.

3. candida albicans Biofilm formasjonen i Microfluidic systemet

  1. For å registrere biofilm formasjon, legge til 600 µL av forvarmes RPMI-1640 middels eller edderkopp medium innløp brønnene (se figur 1 plate oppsett). Har to gjentak for hver eksperimentelle betingelse.
    1. For testing biofilm dannelsen av C. albicans vill-type og mutant stammer, legge til 600 µL Spider medium innløp brønner av eksperimentet plate.
    2. For å teste biofilm formasjonen i nærvær av antifungal medisiner (eller andre forbindelser rundt), legge til 600 µL RPMI-1640 middels to brønner (negativ kontroll) og 600 µL av RPMI-1640 medium med amfotericin B (16 µg/mL) (eller legemiddel på ønsket konsentrasjon) til to andre innløp brønner.
      Merk: For en 12t biofilm formasjon eksperiment, kan du legge til 600 µL forvarmes medier innløp fordelt. Legge til flere medier (50 µL/h) innløp fordelt lengre eksperimenter. Ikke overstige det maksimale volumet i brønnen (1500 µL).
  2. Sakte senke renset grensesnitt platen på 48 godt microfluidic platen. Skyv platen grensesnittet litt til venstre til rør på interphase plate er plassert på toppen av brønnene innløp og utløp.
Aktivere grensesnittet platen fra venstre til høyre for å låse grensesnitt platen i posisjon, eksperimentet er lufttett spaken.
Merk: Sterile luftstrømmen fra rør i grensesnittet platen vil presse væske i innganger og utganger brønnene (avhengig av hvilken retning med programvaren på datamaskinen), slik at væsken flyter gjennom visning kanalen mellom innløp og utløp brønner i tilpassede retningen og hastigheten diktert av brukeren.
  • Skjær kontroll delen Angi flyt modus med konstant og angi maks skjær 1 Dyn/cm2 (0,1 Pa). Klikk på innløpet brønner med media å begynne flyten av media fra innløpet stikkontakt brønner (figur 2A) Prime kanalen. Etter 5 min klikker på stoppknappen i delen godt plate kontroll. Fjern grensesnitt platen og observere microfluidic plate brønnene. Etter grunning kanalene, skal bare en liten dråpe media vises i brønnene som utløp. Hvis rullegardinlisten ikke er synlig, prime kanalene i 2 min intervaller til den lille dråpen medier i stikkontakt brønnene er synlig.
    Merk: Grunning er nødvendig å fjerne luft fra visning kanaler og sikre at kanalene er fylt med de ønskede mediene.
  • Fjern grensesnitt platen fra microfluidic plate og sett den til side på et sterilt underlag. Legge til 50 µL av cellekultur (beskrevet i trinn 1,5) til hver stikkontakt godt.
    1. For testing C. albicans legge vill-type og mutant stammer, 50 µL av vill-type (SC5314) cellekultur i Spider media to uttak brønner, bcr1 Δ/Δ i Spider media to uttak brønner og efg1 Δ/Δ i Spider media to uttak brønner. Plasser grensesnitt platen tilbake på microfluidic plate og låse lokket (se figur 1 plate oppsett).
      Merk: Som beskrevet i trinn 3.1.1, inneholder alle tilsvarende input brønner Spider medier.
    2. For å teste C. albicans biofilm formasjonen i nærvær av amfotericin B eller andre sammensatte interesse, legge til 50 µL av vill-type (SC5314) cellekultur i RPMI-1640 medium fire stikkontakt brønner. Plasser grensesnitt platen tilbake på microfluidic plate og låse lokket (se figur 1 plate oppsett).
      Merk: Som beskrevet i trinn 3.1.2, inneholder alle tilsvarende input brønner RPMI-1640 medier med og uten amfotericin B eller andre sammensatte interesse.
  • Skjær kontroll delen Angi flyt modus med konstant og angi maks skjær 2 Dyn/cm2 (0,2 Pa). Klikk på uttak brønner med celler å begynne flyten av media fra innløpet stikkontakt brønner (figur 2A) å begynne såing av C. albicans. Etter 3 s Klikk stoppknappen i kontrollen godt plate delen for å hindre celler å input brønnene.
    Merk: Cellene flyttes fra uttaket brønnene mot innløp brønnene; Det er viktig at flyten stoppes før cellene når innløp brønnene. Dette sikrer at innløp brønnene ikke bli forurenset med cellekultur og at mediene i innløpet brønnene forblir sterilt for varigheten av eksperimentet. Skjær kraft og tiden som trengs er basert på viskositeten av mediene som brukes og størrelsen på cellene.
  • At cellene å holdes med ingen flyt (0 Dyn/cm2) i 10-20 min i visning kanalen for første celle overholdelse. I denne 10-20 min tilslutning trinn, konfigurere datamaskinen til å fange de scenen posisjonene og begynne å anskaffe pre flush bilder (beskrevet i detalj i punkt 4-6).

    • 4. definere scenen stillingene for Microfluidic eksperimentet

    Merk: Den scenen posisjoner og plate kalibrering bør settes like før eksperimentet. Dette oppsettet kan datamaskinen til å lagre plasseringen av hver visning kanal for å ta bilder under eksperimentet. Microfluidic platen skulle ikke bli forstyrret etter å sette opp scenen stillingene. Hvis platen er flyttet, må scenen stillingene tilbakestilles før starten av eksperimentet.

    1. Bruke visualisering analyseprogramvare (se tabell av materialer) å sette scenen posisjoner; hvert trinn har tre sub-scener (1-3) for avbildningsopptak forskjellige posisjoner langs visning kanalen (figur 1 c) hver visning kanal er en scene (1-24) (figur 1 d). Åpne modulen 'Multi-dimensional Acquisition' (MDA) ved å klikke kategorien MDA (figur 2B) i tenkelig modul-vinduet.
    2. I MDA modul Klikk på kategorien "Stage" i menyen til venstre (figur 2B). I delen scenen laste listen master scenen for 48 godt 0 - 20 Dyn microfluidic plate. Hver visning kanal bør ha tre stadier for bildeopptak.
    3. Åpne 'Eksempel Reload Adjustment' (SRA) og flytte scenen for å absolutt posisjon (kart) moduler ved å klikke kategorien SRA og kart (figur 2B). Trykk på "Live"-knappen for å se en forhåndsvisning av bildet med trådkorset i modulen SRA.
    4. Med styrespaken, plassere godt platen slik at spissen av pilen (fysisk finnes på platen) ved ser kanalen 4 justert med trådkorset på programvare. I Kartmenyen, trykk på "Angi opprinnelse" (figur 2B). Gjeldende posisjon skal nå lese 0 i X, Y og Z.
    5. Klikk på delen "Første referansepunkter" i menyen til venstre (figur 2B) i modulen SRA. Klikk på 'Laste innstillinger' og laste filen for 48 godt 0 - 20 Dyn microfluidic plate.
    6. På scenen delen av modulen MDA, dobbeltklikk på "scenen posisjon 22,2'. Denne stillingen angir midt (sub trinn 2) visning kanalnummer 22. Dette vil bringe mikroskopet viser scenen og kameraet fokus i nærhet til pil merket av ser kanalen 22. Med styrespaken, plassere godt platen slik at spissen av pilen (fysisk finnes på platen) ved ser kanalen 22 justert med trådkorset.
    7. Kopier Y-koordinaten modulen MDA til Y plasseringen av punkt 2 i kategorien 'Oppdateringen referansepunkter' modulen SRA (figur 2B).
    8. Klikk på "Apply MDA scenen listen" i kategorien "Oppdateringen scenen posisjoner" av SRA (figur 2B).
      Merk: Dette vil oppdatere alle viser scenen posisjoner i platen (1-24) kalibreres til bestemte microfluidic plate posisjon på mikroskopet scenen.
    Platen er nå klar for bildeopptak og vil bruke kalibrert scenen plasseringene flytte inn bilder fra tre posisjoner i alle 24 vise kanaler.

    5. sette opp oppkjøp for Image fange under Microfluidic eksperimentet

    1. I modulvinduet tenkelig bruker modulen MDA og klikk på 'Lagre' kategorien i menyen til venstre (figur 2B). Velg filnavnet for eksperimentet og mappen å lagre ervervet bildene på datamaskinen.
    2. I modulen MDA Klikk på kategorien "Timelapse" i venstremenyen og sette den å erverve 145 totale bilder; Angi timelapse mellom bilder på 5 min. Dette vil resultere i 1 bilde hvert 5 min for en 12t biofilm utvikling eksperiment.
      Merk: Tidsintervallet mellom bilder og antall bilder kan bli justert basert på eksperimentell krav. Hvis imaging lenger enn 12 h, legge til flere medier innløp fordelt på trinn 3.1 for å sikre at brønnene ikke kjører tørr. For lengre eksperimenter legge flere medier, som nødvendig (50 µL/h) innløp fordelt.
    3. I modulen MDA Klikk på kategorien "bølgelengder" i menyen til venstre (figur 2B) og angi antall bølgelengde for eksperimentet som 1. Angi bølgelengden å fange ved 50% Brightfield og 50% kamera med en eksponeringstid på 12-20 ms, 0,6 gevinst og 20 MHz digitaliseringsenhet.
      Merk: Flere bølgelengder kan brukes, inkludert bølgelengder for fluorescens imaging (for eksempel vi har vellykket visualisert mCherry og GFP merket C. albicans stammer bruke microfluidic enheten). Parameterne for oppkjøpet kan også endres basert på eksperimentell krav. For eksempel sette opp en andre bølgelengde og velge 'Autofokus på hver Timepoint' og en tredje bølgelengde og velge 'Autoexposure på hver Timepoint' anbefales for nybegynnere å maksimere bilde oppkjøpet muligheter som er i fokus.
    4. Velg kategoriene scenen listen i venstremenyen i modulen MDA. Stadier 1,1-vil 24,3 vises. Ett klikk på hvert trinn, og bruk finskruen innstillingene manuelt fokusere på cellene i visning kanalen for hvert trinn. Når synsfelt er i fokus, klikk den svarte pilen ved siden av listen trinn å oppdatere og lagre innstillingene for hver enkelt etappe. Datamaskinen bruker disse defineres manuelt innstilling og fokal innstillingene hente bilder på hvert tidspunkt. Fjern eventuelle ubrukte stadier fra listen ved å bruke 'Fjern' pilen.
      Merk: Modulen MDA og programmet se vise kanaler som stadier om hverandre, og samme terminologi brukes av programvaren.

    6. kjøre Microfluidic eksperimentet

    1. I modulvinduet tenkelig bruk modulen MDA velge tilegne seg for å begynne å ta pre flush skjermbilder av overholdt celler for alle sub-scener (figur 2B).
      Merk: Bildebehandling modulvinduet og kameraet kontrollene vil nå vise bilder som er erobret og kart, SRA og MDA modulen vil ikke vises. Bildene tatt viser også en tidtaker på siden, angi hvor bildet blir fanget og tidsforløp før neste bilde fange syklusen begynner. Vent på en runde av bilder skal være tatt før du fortsetter med neste trinn.
      Merk: Ikke Bruk knappene "Pause" eller "Merke hendelse" på skjermbildet for bildebehandling modul-vinduet. Fra dette punktet under eksperimentet, kan du holde musen bare på modulvinduet på andre skjermen (figur 2A). Dette er viktig å unngå å forstyrre tenkelig modul-vinduet.
    2. I kontroll modul vinduet oppholdet på manuell modus for plate. Skjær kontroll delen Angi flyt modus med konstant og angi maks skjær 1 Dyn/cm2 (0,1 Pa). Klikk på uttak brønner O1, O7, O13 og O19 å begynne flyten av media fra innløpet stikkontakt brønner (figur 2A) å fjerne ikke-overholdt celler. Etter 5 min klikker på stoppknappen i delen godt plate kontroll. Tillate en ny runde med bilder anskaffes. Bilder kan visualiseres og tidsforløp kan overvåkes i det andre skjermbildet i tenkelig modul-vinduet.
    3. Skjær kontroll delen justere max skjær til 0,5 Dyn/cm2 (0,5 Pa) ved å klikke på tallet i max skjær kolonnen og bruke tastaturet til å angi 0,5. Trykk ENTER på tastaturet og bekrefte endringen i infusjonshastigheten i hendelsesloggen i kontroll modul-vinduet (figur 2A). La eksperimentet uforstyrret i mørket 12 h.
      Merk: Eksponering for lys og bevegelse/vibrasjoner kan sterkt redusere kvaliteten på bilder ervervet gjennom hele eksperimentet. På slutten av microfluidic eksperimentet, tenkelig modul-vinduet vises ikke bilder og går tilbake til viser SRA, kart og MDA modulene. Den modulen programvaren kan brukes til å vise bildene, samle videoer og kvantifisere biofilm dannet (beskrevet nedenfor).

    7. analysere resultatene

    1. I tenkelig modulvinduet, Velg kategorien "Verktøy" og klikk "Gjennomgang Multi-dimensional Data" (RMD) fra miste ned meny. Klikk på "Velg Base fil" i modulen RMD. Dette åpner vinduet 'Multi-dimensional datasett Utilities'.
    2. Klikk på knappen "Velg katalog" og velg mappen som ble brukt til å lagre eksperimentet i trinn 5.1. I listen 'Datasett' Velg eksperiment filen loggen (nd forlengelse). Når loggen er lastet, klikk på knappen "Vis".
    3. Velg bølgelengden ved å klikke på alternativene i menyen til venstre 'Bølgelengder' og velg scenen posisjon vise fra en miste-ned meny. Velg bildet for å laste fra tallene på modulen ved å høyreklikke hvor bildet. Når valgt, klikk på knappen "Last bilde(r)" laste bilder. Du kan vise ett bilde eller alle bildene samtidig.
    4. Velg alle bildene til å lage en video. De valgte bildene åpnes som en video i et nytt vindu. Klikk på kategorien 'fil' i tenkelig modul-vinduet og velg 'Lagre som' fra det miste-ned menyen. Lagre den resulterende videoen som standardfilen (TIFF/MetaSeries).
    5. Åpne og laste inn lagrede videofilen ImageJ programmvre. I ImageJ, klikk på 'fil'-kategorien og klikk på 'Lagre som'. Velg "AVI" fra det miste-ned menyen og konvertere filen til en AVI-fil med JPEG konverteringen satt til 10 bilder/s.
      Merk: Hastigheten på videoen kan justeres ved å endre rammer/s.
    6. For å kvantifisere biofilm, gjentar du trinn 7.2 7.3 og 7.4.
    Velg det siste bildet (nummer 144) og klikk "Last bilde(r)" for å laste bildet. Bildet åpnes i et nytt vindu. Klikk på knappen 'terskelen bilde' og velg "Inclusive" terskelen. Flytt markøren til biofilm cellene er farget rød, og regioner med ingen celler er ikke farget.
  • Klikk på knappen 'Åpne Logg' logge målinger (knappen vil vise 'Åpne Logg' bare først, når en logg er aktiv knappen vil bli omdøpt til "F9: loggdata '). Vinduet 'Åpen Data Logg' Velg "Dynamisk datautveksling" og klikk "ok."
  • I tenkelig modul-vinduet, Velg kategorien 'Verktøy' og klikk 'Vis regionen statistikk'. Dette åpner et nytt vindu som viser målinger fra bildet. Velg "Hele bildet" i "Mål" alternativene og klikk "F9: loggdata." En excel-fil med alle mål vises. Finn verdiene for 'Området' og 'Thresholded området' og dele sistnevnte av den tidligere å oppnå en numerisk verdi for området okkupert av biofilm.
    Merk: 'Området' for hvert bilde fikk under forsøket er identisk og dermed ' Thresholded områdemålenheten ' kan brukes til å evaluere forskjellene i biofilm formasjonen vill-type stammer og mutant stammer eller evaluere effektiviteten av den testet stoffet på biofilm formasjon.

    • Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Vi utførte microfluidic biofilm analysen beskrevet her bruker en vill-type C. albicans belastning under to medier forhold (RPMI-1640 og edderkopp media), vill-type belastningen i nærvær av kjente soppdrepende stoffet amfotericin B (16 µg/mL) i RPMI, og to mutant stammer tidligere rapportert for å ha feil i biofilm formasjonen (bcr1Δ/Δ og efg1 Δ/Δ) i Spider medier.

    Video 1 viser utviklingen av en vill-type biofilm i RPMI-1640 medium og effekten av soppdrepende stoffet, amfotericin B, på biofilm formasjon. Under vill-type forhold, flere celler overholder sterkt kanalen, cellene danner hyfer som tiden går, og en tykk biofilm kan observeres med intercalating hyfer og gjær celler. Mot slutten av microfluidic eksperimentet fyller vill-type biofilm helt visning kanalen. Tilstedeværelsen av amfotericin B, men har en uttalt effekt på å redusere biofilm. Spesielt etterlevelse av celler er redusert, og i motsetning til ubehandlet forhold, i nærvær av amfotericin B, flere celler kan bli sett flyter bort med skjær flyten av media. Som tiden går, de cellene ikke skjemaet hyfer og en biofilm er ikke utformet. Disse forskjellene er også vist i Figur 3som viser 4 tid-poeng fra analysen på 0 h, 2 timer, 6 h og 12 h.

    Video 2 viser utviklingen av en vill-type biofilm og to tidligere rapporterte biofilm-defekt mutanter (bcr1 Δ/Δ og efg1 Δ/Δ) i Spider medier. Begge bcr1 Δ/Δ og efg1 Δ/Δ stammer Vis sterkt redusert biofilm formasjon sammenlignet isogenic vill-type belastningen. For efg1 Δ/Δ belastningen observerte vi at adhered cellene ikke form hyfer og den resulterende biofilm er alvorlig defekt. For bcr1 Δ/Δ belastningen, observerte vi at ikke bare er bcr1 Δ/Δ belastningen defekt i biofilm formasjon, men det også viser en klar tilslutning lyte, hvor cellene kan sees drivende i retning av skjær som de unnlater å overholde den viser kanalen. Disse forskjellene er også vist i Figur 4, som viser 4 tidspunkt fra analysen på 0 h, 2 timer, 6 h og 12 h.

    Figure 1
    Figur 1: Microfluidic instrument som brukes i dette eksperimentet. Panelet A viser microfluidic apparatet brukes, panelet B viser grensesnitt platen, panelet C viser en skjematisk oversikt over en enkelt visning kanal (scenen) og tre sub-scener tatt av kameraet under eksperimentet, og panelet D viser en skjematisk oversikt over 48-vel microfluidic platen med en skjematisk på uttak og vik og visningsvinduet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figure 2
    Figur 2: Velg skjermbilder Imaging modulesoftware og microfluidic plate kontrollsystem. Panelet A viser modulen kontrollen som inneholder kontroller for microfluidic plate, og panelet B tenkelig modulvinduet, 'Flytt scenen absolutt posisjon' (kart) modul, modulen 'Multi-dimensional Acquisition' (MDA) og modulen 'Eksempel Reload Adjustment' (SRA). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figure 3
    Figur 3: eksponering for amfotericin B resulterer i biofilm formasjon defekter. Tid avhengig visualisering av biofilm formasjon i RPMI-1640 medier (kolonne 1) og RPMI-1640 media supplert med 16 µg/mL amfotericin B (kolonne 2) under dynamisk flyt (0,5 Dyn/cm2) på 37 ° C for 12 h etter overholdelse i microfluidic systemet. Representant 0t (etter etterlevelse og første vask), 2 timer, 6 h og 12t bilder (topp til bunn) vises for isogenic vill-type belastningen SN250 (kolonner 1 og 2). Skala barer er 20 µm i hvert panel. Tilsvarende tid forfalle videoer av biofilm formasjon er gitt i Video 1. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figure 4
    Figur 4: Sletting av BCR1 eller EFG1 resulterer i biofilm formasjon defekter. Tid avhengig visualisering av biofilm formasjon i Spider media (kolonner 1-3) under dynamisk flyt (0,5 Dyn/cm2) på 37 ° C for 12 h etter etterlevelse i microfluidic systemet. Representant 0t (etter etterlevelse og første vask), 2 timer, 6 h og 12t bilder (topp til bunn) vises for isogenic vill-type belastningen SN250 (kolonne 1), bcr1Δ/Δ belastning (kolonne 2), og efg1 Δ/Δ belastning (kolonne 3). Skala barer er 20 µm i hvert panel. Tilsvarende tid forfalle videoer av biofilm formasjon er gitt i Video 2. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Video 1: Klikk her for å laste ned denne filen.

    Video 2: Klikk her for å laste ned denne filen.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Passelig microfluidic biofilm analysen beskrevet her gir visualisering av biofilm formasjon i sanntid på en enkelt cellenivå når de utsettes for en fast rente laminær strømning og konstant temperatur. Det gir en kraftig måte å studere utviklingen av biofilm i vill-type og mutant stammer, og effekten av antimikrobiell agent behandlinger biofilm under forhold som etterligner fysiologiske forhold observert i klinisk innstillinger. I motsetning til de fleste i vitro biofilm analyser, gir denne metoden undersøkelse av en utvikling biofilm i sanntid som danner.

    Denne metoden kan brukes på en høy gjennomstrømming måte, der opptil 24 eksempler kan være kjøre samtidig for å vurdere biofilm formasjon. Metoden kan også brukes til å utføre genetiske skjermer av mutant biblioteker for å identifisere tilblivelse kreves for vanlig biofilm utvikling og kan brukes til å vurdere effectivity mot biofilm antimikrobielle forbindelser interesse sammensatt bibliotek skjermer. Vi forventer at fremtidige anvendelser av microfluidic enheten vil inkludere slike skjermer. Vi imidlertid oppmerksom på at visse narkotika behandling testing vil være begrenset av tykkelsen på biofilm bruker microfluidic enheten som biofilm vokst for > 16 h pleier å tette visning kanalen. Dermed narkotikatesting eksperimenter må utføres for < 16 timer.

    Samlet denne enheten er svært passelig og allsidig, og kan justeres for å vurdere ulike mikrobielle arter over kongedømmer, flyt priser, temperaturer, inkubasjon ganger og media. Metoden beskrevet gir informasjon om en rekke ulike aspekter av biofilm formasjon, inkludert første celle etterlevelse, biofilm modning og celle spredning. Selv om vi bare rapporterer resultatene for single-arter biofilm formasjonen her, kan denne protokollen også være tilpasset å studere dobbel - og mixed-arter biofilm formasjonen.

    To trinn er avgjørende for å kunne utføre denne protokollen. Først må luftbobler i systemet unngås ved forvarming media ved eksperimentelle temperatur. En vanlig misstep er fortynning av celler i media som ikke var forvarmet. Bør fortynnet celler i de samme mediene som brukes for innløp brønnene. Sekund, flyten av celler fra uttaket til innløp brønner må nøye overvåket; Hvis cellene strømme langt, vik media vil bli forurenset og eksperimentet vil ikke gi interpretable resultater. På den annen side, hvis cellene ikke er tillatt å flytte helt til visning kanalen, så ingen celler blir synlig i kanalen under eksperimentet, fører til tom bilder. Flere viktige punkter å huske på er at volumet og bevegelse mellom brønner i microfluidic platen er koblet sammen for hver kolonne, og det er viktig å beholde så mye media konsekvensen som mulig (med lignende viskositet, celle tetthet, og sammensetning) og samme størrelse celler (hvis mulig), som andre medier og ulike celle størrelser vil ha forskjellige strømningshastigheter i kolonnen. Under eksperimentet overvåkes tilbakestrømming av cellene ved hjelp av et mikroskop; men kan bare to kanaler vises samtidig (med en 10 X-målet). Dermed er det sterkt anbefalt å utføre en uekte eksperiment for å måle tiden det tar å flyte fra uttaket innløp brønner med cellene og media planlegges å bli brukt i det aktuelle eksperimentet.

    Generelt anbefaler vi bruk av denne microfluidic biofilm analysen som i vitro analysen som skal benyttes før i vivo dyr testing. Analysen, er imidlertid fortsatt i vitro analysen, og resultatene må valideres i relevante dyremodeller. I våre erfaringer, resultatene av denne microfluidic biofilm analysen har hatt den beste logiske verdien for i vivo biofilm analyser sammenlignet med andre i vitro analyser vi har vurdert14.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Clarissa J. Nobile er grunnlegger av BioSynesis, Inc., et selskap som utvikler hemmere og diagnostisering av C. albicans biofilm.

    Acknowledgments

    Vi takker alle medlemmer av Nobile laboratoriet nyttig diskusjoner på biofilm analyser. Denne studien ble støttet av National Institutes of Health (NIH) grant R21 AI125801 (til C.J.N.). D.L.R. ble støttet av et universitet fellesskap fra University of California Institute for Mexico og USA (UC-MEXUS) og Consejo Nacional de Ciencia y Technologia (CONACYT).

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    BioFlux 1000z Fluxion Automated microfluidic device for live cell analysis
    48-well plate 0-20 dyne Fluxion 910-0047 Microfluidic plate
    Montage Software Fluxion Version 7.8.4.0 Visualization analysis software
    ImageJ Software NIH https://imagej.nih.gov/ij/
    Yeast Extract Criterion C7341
    Bacto Peptone BD Biosciences 211677
    Dextrose (D-Glucose) Fisher Scientific D163
    Potassium Phosphate Monobasic Fisher Scientific P285-500
    RPMI-1640 Sigma-Aldrich R6504
    MOPS Sigma-Aldrich M3183
    Nutrient Broth Criterion C6471
    Difco D-Mannitol BD Biosciences 217020
    Agar Criterion C5001
    Amphotericin B Corning 30-003-CF
    Sterile Inoculating Loops VWR 30002-094
    Petri Dishes with Clear Lid Fisher Scientific FB0875712
    Disposable Cuvettes Fisher Scientific 14-955-127
    Lens Paper VWR 52846-001
    Microplate and Cuvette Spectrophotometer BioTek EPOCH2TC
    Shaking Incubator Eppendorf M12820004

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Nobile, C. J., Johnson, A. D. Candida albicans Biofilms and Human Disease. Annu Rev Microbiol. 69, 71-92 (2015).
    2. Kojic, E. M., Darouiche, R. O. Candida infections of medical devices. Clin Microbiol Rev. 17 (2), 255-267 (2004).
    3. Fox, E. P., Nobile, C. J. Candida albicans: Symptoms, Causes and Treatment Options. Dietrich, L. A., Friedmann, T. S. , Nova Science Publishers. 1-24 (2013).
    4. Gulati, M., Nobile, C. J. Candida albicans biofilms: development, regulation, and molecular mechanisms. Microbes Infect. 18 (5), 310-321 (2016).
    5. Uppuluri, P., et al. Dispersion as an important step in the Candida albicans biofilm developmental cycle. PLoS Pathog. 6 (3), e1000828 (2010).
    6. Andes, D., et al. Development and characterization of an in vivo central venous catheter Candida albicans biofilm model. Infect Immun. 72 (10), 6023-6031 (2004).
    7. Nett, J. E., Marchillo, K., Spiegel, C. A., Andes, D. R. Development and validation of an in vivo Candida albicans biofilm denture model. Infect Immun. 78 (9), 3650-3659 (2010).
    8. Nett, J. E., et al. Rat indwelling urinary catheter model of Candida albicans biofilm infection. Infect Immun. 82 (12), 4931-4940 (2014).
    9. Krom, B. P., Willems, H. M. In Vitro Models for Candida Biofilm Development. Methods Mol Biol. 1356, 95-105 (2016).
    10. Hawser, S. P., Douglas, L. J. Biofilm formation by Candida species on the surface of catheter materials in vitro. Infect Immun. 62 (3), 915-921 (1994).
    11. Ramage, G., Vande Walle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Standardized method for in vitro antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms. Antimicrob Agents Chemother. 45 (9), 2475-2479 (2001).
    12. Nett, J. E., Cain, M. T., Crawford, K., Andes, D. R. Optimizing a Candida biofilm microtiter plate model for measurement of antifungal susceptibility by tetrazolium salt assay. J Clin Microbiol. 49 (4), 1426-1433 (2011).
    13. Krom, B. P., Cohen, J. B., McElhaney Feser, G. E., Cihlar, R. L. Optimized candidal biofilm microtiter assay. J Microbiol Methods. 68 (2), 421-423 (2007).
    14. Lohse, M. B., et al. Assessment and Optimizations of Candida albicans In Vitro Biofilm Assays. Antimicrob Agents Chemother. 61 (5), (2017).
    15. Winter, M. B., et al. Global Identification of Biofilm-Specific Proteolysis in Candida albicans. mBio. 7 (5), (2016).
    16. Nobile, C. J., et al. A recently evolved transcriptional network controls biofilm development in Candida albicans. Cell. 148 (1-2), 126-138 (2012).
    17. Fox, E. P., et al. An expanded regulatory network temporally controls Candida albicans biofilm formation. Mol Microbiol. 96 (6), 1226-1239 (2015).
    18. Nobile, C. J., Mitchell, A. P. Regulation of cell-surface genes and biofilm formation by the C. albicans transcription factor Bcr1p. Curr Biol. 15 (12), 1150-1155 (2005).
    19. Baker, K. At the bench: A laboratory navigator. 27, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2005).

    Tags

    Infeksjonssykdommer problemet 130 Biofilm Candida albicans visualisering microfluidic enhet i vitro biofilm analyser biofilm metoder biofilm protokoller biofilm skjermer laminær strømning
    Visualisering av Biofilm formasjon i <em>Candida albicans</em> bruker en automatisert Microfluidic enhet
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Gulati, M., Ennis, C. L., Rodriguez, … More

    Gulati, M., Ennis, C. L., Rodriguez, D. L., Nobile, C. J. Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device. J. Vis. Exp. (130), e56743, doi:10.3791/56743 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter