Nous présentons une méthode combinant les enregistrements de patch-clamp de la cellule entière et deux photons d’imagerie pour enregistrer des transitoires de Ca2 + en dendrites neuronales dans des tranches de cerveau aiguë.
Imagerie de calcium (Ca2 +) est un outil puissant pour étudier la dynamique spatio-temporelle de Ca2 + signaux intracellulaires dans les dendrites neuronales. Ca2 + fluctuations peuvent se produire à travers une variété de membrane et mécanismes intracellulaires et jouent un rôle crucial dans l’induction de la plasticité synaptique et la régulation de l’excitabilité dendritique. La capacité d’enregistrer différents types de signaux de Ca2 + en ramifications dendritiques est donc précieuse pour des groupes d’étudier comment dendrites intègrent l’information. L’avènement de la microscopie biphotonique a fait ces études beaucoup plus facile en résolvant les problèmes inhérents à l’imagerie dans les tissus vivants, tels que la diffusion de la lumière et le photovieillissement. En outre, grâce à la combinaison de techniques électrophysiologiques classiques avec deux photons Ca2 + imagerie, il est possible d’étudier Ca2 + fluctuations locales dans les dendrites neuronales en parallèle avec les enregistrements de l’activité synaptique Soma. Nous décrivons ici comment utiliser cette méthode pour étudier la dynamique des locaux Ca2 + transitoires (chats) dans les dendrites des interneurones inhibiteurs GABAergiques. La méthode peut être également appliquée à l’étude dendritiques Ca2 + signalisation dans différents types de neurones dans des tranches de cerveau aiguë.
La contribution d’un neurone à l’activité du réseau est en grande partie déterminée par la nature dynamique des entrées synaptiques qu’il reçoit. Traditionnellement, la principale méthode de caractérisation de l’activité synaptique dans les neurones s’est fondé sur les enregistrements de patch-clamp de la cellule entière somatique des courants postsynaptiques évoqués par stimulation électrique des axones de passage. Toutefois, la seule activité des synapses situées dans la partie proximale est véridiquement signalée dans ce cas1. En outre, afin d’évaluer les mécanismes spécifiques à synapse, enregistrements de paires de neurones et de dendrites à un endroit précis ont été utilisés pour cibler les synapses d’intérêt et les mécanismes d’intégration dendritique, respectivement. Une percée majeure dans le domaine de la physiologie synaptique a été atteint par un mariage des techniques optiques et électrophysiologiques. Excitation biphotonique microscopie à balayage laser (2PLSM) en combinaison avec les outils d’optogenetic et de Ca2 + imagerie peut révéler des détails extraordinaires de l’organisation dynamique de l’activité synaptique à connexions neuronales spécifiques dans des tranches de cerveau dans vitro et in vivo.
Plusieurs avantages principaux faits 2PLSM se démarquer de l’excitation classiques, un photon microscopy2: (1) en raison de la nature non linéaire d’excitation à deux photons, la fluorescence est générée uniquement dans le volume focal, et représentent tous les photons émis signaux utiles (pas besoin de trou d’épingle) ; (2) longueurs d’onde, utilisés en 2PLSM, pénètrent dans les tissus de diffusion plus efficacement ; en outre, les photons dispersés sont trop diluées pour produire l’excitation biphotonique et fluorescence de fond ; (3) le photovieillissement et phototoxicité sont également limités à plan focal. Par conséquent, malgré le coût élevé des systèmes 2 photons par rapport aux microscopes confocaux classiques, la 2PLSM reste une méthode de choix pour enquête à haute résolution de structure neuronale et la fonction dans les tissus vivants épais.
La première application de 2PLSM dans les tissus de diffusion a été à l’image de la structure et la fonction des épines dendritiques3. 2PLSM en combinaison avec Ca2 + imagerie a révélé cette fonction d’épines comme des compartiments isolés biochimiques. Puisque de nombreux types de neurones, il y a une correspondance biunivoque entre les épines et les synapses individuels4, deux photons Ca2 + imagerie bientôt est devenu un outil de reporting de l’activité des synapses individuelles en tissu intact5, 6,7,8. En outre, 2PLSM Ca2 + imagerie a été utilisée avec succès pour surveiller l’activité des canaux calciques unique et les interactions non linéaires entre les conductivités intrinsèques et synaptiques, ainsi que d’évaluer l’État et l’activité dépendante- régulation du Ca2 + signalisation neuronale dendrites5,6,7,8,9,10,11.
Le calcium est un omniprésent second messager intracellulaire, et son organisation spatio-temporelle subcellulaire détermine la direction de réactions physiologiques, de modifications de la force synaptique à la régulation des ions canaux, croissance dendritique et la colonne vertébrale, comme Bien que la mort cellulaire et la survie. Dendritiques Ca2 + élévations se produisent via l’activation de multiples voies. Potentiels d’action (PA), backpropagating pour les dendrites, ouvrir de canaux voltage-dépendants de calcium12 et produire des transitoires relativement globales Ca2 + (chats) dans les dendrites et les épines13. La transmission synaptique est associée à l’activation de postsynaptique Ca2 +-récepteurs perméables (NMDA, Ca2 +-perméable AMPA et kaïnate), déclenchement synaptique chats6,14,15. Enfin, SUPRALINÉAIRE Ca2 + événements peuvent être générés en dendrites sous certaines conditions11,12,13,16.
Deux photons Ca2 + imagerie en combinaison avec les enregistrements électrophysiologiques de patch clamp emploie synthétique Ca2 +-indicateurs fluorescents, qui sont généralement livrés par le biais de l’électrode de patch pendant les enregistrements de cellules entières . Une méthode standard pour la quantification de Ca2 + dynamique repose sur l’indicateur de double méthode17,18. Il utilise deux fluorophores avec des spectres d’émission bien séparées (par exemple, une combinaison d’un rouge Ca2 +-insensible colorant vert Ca2 + indicateurs, tels que l’Oregon vert BAPTA-1 ou Fluo-4) et présente plusieurs avantages par rapport à la méthode de l’indicateur unique. Tout d’abord, un Ca2 +-colorant insensible est utilisé pour localiser les petites structures d’intérêt (ramifications dendritiques et épines) où l’imagerie2 + Ca sera effectuée. Deuxièmement, le rapport entre la variation de la fluorescence verte et rouge (ΔG/R) est calculé en guise de [Ca2 +], qui est pratiquement insensible aux variations de fluorescence de base en raison de fluctuations [Ca2 +]017 , 18. en outre, les changements de fluorescence peuvent être calibrés en termes absolus, Ca2 + concentration19.
Une préoccupation générale lors de l’exécution de deux photons Ca2 + imageries expériences en tranches aiguës est la cellule santé et la stabilité de l’acquisition d’image en raison de la puissance du laser haute généralement utilisée. En outre, dans les2 + expériences d’imagerie, de Ca on se préoccupe de la perturbation et l’importante surestimation de subcellulaire Ca2 + dynamique dû au fait que servent d’indicateurs de Ca2 + très mobiles exogène Ca2 + mémoires tampons. Ainsi, le choix de l’indicateur de Ca2 + et sa concentration dépend du type neuronal, l’amplitude attendue des chats et la question expérimentale.
Nous avons adapté la méthode biphotonique Ca2 + imagerie pour recherche de Ca2 + fluctuations de dendrites de GABAergique interneurones9,10,11,20,21 , 22. alors que la majeure partie des premiers Ca2 + études d’imagerie ont été effectuées dans les principaux neurones, interneurones inhibiteurs présenter une grande variété de mécanismes2 + Ca fonctionnels qui sont distincts de ceux des cellules pyramidales20 , 23 , 24. ces mécanismes interneurone spécifiques (par exemple, Ca2 + perméables récepteurs AMPA) pourraient jouer un rôle spécifique dans la régulation de l’activité des cellules. Dendritiques Ca2 + signalisation dans des interneurones est une cible tentante pour complément d’enquête, deux photons Ca2 + imagerie dans les dendrites des cellules présente des difficultés supplémentaires, d’un diamètre plus mince des dendrites et manque d’épines pour une particulièrement élevé Ca2 + liaison capacité endogène. Comme nos recherches portent sur l’étude des interneurones hippocampe, le protocole suivant, alors qu’il y a lieu à différentes populations de neurones, a été adapté pour faire face à ces défis.
Ce protocole a été exécuté avec un microscope confocal de deux photons commercial, qui était équipé de deux détecteurs externes, non-descanned (NDDS™), modulateur électro-optique (MOE) et un Dodt balayage dégradé contraste (CGT) et installé sur une table optique. Le microscope a été couplé avec un laser Ti : Sapphire de multiphoton mode bloqué à 800 nm (> 3 W, 140 impulsions fs, 80 Hz fréquence de répétition). Le système d’imagerie était équipé d’une plate-forme d’électrophysiologie standard, y compris une chambre de perfusion avec contrôle de température, une plateforme de traduction avec deux micromanipulateurs, un amplificateur de la microélectrode contrôlé par ordinateur, un numériseur, une stimulation appareil et logiciel d’acquisition de données.
La méthode présentée ici montre comment la combinaison de deux photons Ca2 + imagerie et électrophysiologie patch clamp peut être utilisée pour l’étude dendritiques Ca2 + la signalisation dans les dendrites neuronales dans des tranches de cerveau aiguë. Cette méthode permet le suivi des deux locaux Ca2 + élévations évoquées par AP électrique de stimulation ou backpropagating segments dendritiques et somatique réponse de la cellule. Ce qui rend un excellent outil pour étu…
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu par le Conseil des instituts de recherche en santé, Sciences naturelles et en génie (subvention à la découverte du CRSNG) et la Fondation Savoy. OC a été soutenu par une bourse de doctorat du CRSNG.
Animal Strain: Mouse CD1 | Charles River | 022 | |
Isoflurane | AbbVie Corporation | 0B506-099 | |
CGP 55845 hydrochloride | Abcam | ab120337 | |
Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | |
D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | |
Paraformaldehyde powder, 95% | Sigma-Aldrich | 158127 | |
Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
Potassium gluconate | Sigma-Aldrich | P1847 | |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S8875 | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
Trizma hydrochloride | Sigma-Aldrich | T3253 | |
Sodium phosphate dibasic dihydrate | Sigma-Aldrich | 71643 | |
Sodium phosphate monobasic monohydrate |
Sigma-Aldrich | S9638 | |
Biocytin | Sigma-Aldrich | B4261 | |
Alexa Fluor 594 Hydrazide | ThermoFisher Scientific | A10438 | |
SR95531 (Gabazine) | Abcam | ab120042 | |
Adenosine triphosphate (ATP)-Tris |
Sigma-Aldrich | A9062 | |
Guanosine (GTP)-Na+ |
Sigma-Aldrich | G8877 | |
Oregon Green BAPTA-1 |
ThermoFisher Scientific | O6812 | |
Phosphocreatine di(tris) salt |
Sigma-Aldrich | P1937 | |
Streptavidin-conjugated Alexa-546 |
ThermoFisher Scientific | S11225 | |
Patch Borosilicate Glass Capillaries |
World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
Theta Borosilicate Glass Capillaries |
Sutter Instrument | BT-150-10 | |
P-97 Flaming/Brown Micropipette puller |
Sutter Instrument | ||
TCS SP5 Confocal Multiphoton Microscope |
Leica Microsystems | ||
Chameleon Ultra II Ti:Sapphire multiphoton laser |
Coherent | ||
LAS AF Imaging Acquisition Software | Leica Microsystems | ||
Temperature Controller TC-324B |
Warner Instruments | ||
MultiClamp 700B Amplifier |
Molecular Devices | ||
Digidata 1440A Digitizer |
Molecular Devices | ||
Confocal Translator |
Siskiyou | ||
Micromanipulator |
Siskiyou | ||
pClamp Data Acquisition Software |
Molecular Devices | ||
A365 Constant Current Stimulus Isolator |
World Precision Instruments | ||
Vibraplane Optical Table |
Kinetic Systems |