Apresentamos um método combinando dois fotões de imagem para gravar transientes de Ca2 + em dendritos neuronais em fatias cerebral aguda e gravações de células inteiras remendo-braçadeira.
Imagem de cálcio (Ca2 +) é uma poderosa ferramenta para investigar a dinâmica spatiotemporal de Ca2 + sinais intracelulares em dendritos neuronais. Flutuações de CA2 + podem ocorrer através de uma variedade de mecanismos intracelulares e membrana e desempenham um papel crucial na indução de plasticidade sináptica e regulação da excitabilidade dendrítica. Portanto, a capacidade de gravar diferentes tipos de Ca2 + sinais em ramificações dendríticas é valiosa para grupos estudando como dendrites integram informações. O advento da microscopia de dois fotões tenha facilitado tais estudos significativamente, resolvendo os problemas inerentes à imagem latente no tecido vivo, tais como a dispersão da luz e Fotodano. Além disso, através da combinação de técnicas eletrofisiológicas convencionais com dois fotões Ca2 + imagem, é possível investigar o local Ca2 + flutuações nos dendritos neuronais em paralelo com as gravações de atividade sináptica em soma. Aqui, descrevemos como usar esse método para estudar a dinâmica do locais transientes de Ca2 + (gatos) em dendritos de interneurônios inibitórios gabaérgica. O método pode ser aplicado também ao estudo dendríticas Ca2 + sinalização em diferentes tipos neuronais em fatias cerebral aguda.
A contribuição de um neurônio para atividade da rede é largamente determinada pela natureza dinâmica das entradas sinápticas que recebe. Tradicionalmente, o método predominante de caracterizar a atividade sináptica nos neurônios baseou-se em gravações somática célula inteira remendo-braçadeira de correntes pós-sinápticas evocadas pela estimulação elétrica de axônios de passagem. No entanto, única atividade de sinapses proximalmente localizadas com sinceridade é relatada neste caso1. Além disso, para avaliar os mecanismos específicos de sinapse, gravações de pares de neurônios e de dendrites num local específico têm sido utilizadas para atingir as sinapses de interesse e os mecanismos de integração dendrítica, respectivamente. Um grande avanço no campo da fisiologia sináptica foi alcançado através de um casamento de técnicas ópticas e eletrofisiológicos. Laser de excitação de dois fotões microscopia (2PLSM) em combinação com a imagem latente de Ca2 + e optogenetic ferramentas pode revelar detalhes tremenda da organização dinâmica da atividade sináptica em conexões neuronais específicas em fatias de cérebro em Vitro e na vivo.
Diversas vantagens feitas 2PLSM destacam-se a excitação convencional, um fóton microscopia2: (1) devido a uma natureza não-linear de dois fotões de excitação, a fluorescência é gerada apenas no volume focal, e todos os fótons emitidos representam sinais úteis (sem necessidade de pinhole); (2) comprimentos de onda, usados em 2PLSM, penetram o tecido de dispersão mais eficientemente; Além disso, dispersos fótons são demasiado diluídos para produzir a excitação de dois fotões e fluorescência de fundo; (3) Fotodano e fototoxicidade também são limitados ao plano focal. Portanto, apesar do alto custo dos sistemas 2-fóton em comparação com microscópios confocal convencionais, o 2PLSM continua a ser um método de escolha para investigação de alta resolução da estrutura neuronal e função em tecidos grossos.
A primeira aplicação de 2PLSM em tecido de dispersão foi a imagem da estrutura e função das espinhas dendríticas3. 2PLSM em combinação com Ca2 + imagem latente revelou essa função de espinhos como compartimentos isolados de bioquímicos. Uma vez que em muitos tipos de neurônios, há uma correspondência exacta entre espinhos e sinapses individuais4, dois fotões Ca2 + imagem logo tornou-se uma ferramenta útil, relatando a atividade de sinapses individuais em tecido intacto5, 6,7,8. Além disso, baseada em 2PLSM Ca2 + imagem foi usada com sucesso para monitorar a atividade de canais de cálcio único e as interações não-lineares entre os conductances intrínsecos e sinápticas, bem como para avaliar o estado e atividade-dependente Regulamento de Ca2 + sinalização neuronal dendrites5,6,7,8,9,10,11.
O cálcio é um onipresente segundo mensageiro intracelular, e sua organização spatiotemporal subcellular determina a direção de reações fisiológicas, alterações na força sináptica para a regulação do íon de canais, crescimento dos dentritos e espinha, como bem como morte celular e sobrevivência. Dendríticas Ca2 + elevações ocorrem através da ativação de várias vias. Potenciais de ação (APs), backpropagating para os dendritos, abrir canais de cálcio dependentes de voltagem12 e produzir relativamente globais transientes de Ca2 + (gatos) em dendritos e espinhos13. Transmissão sináptica é associada com a ativação de pós-sináptica Ca2 +-permeáveis receptores (NMDA, Ca2 +-permeável Leandro e agonista), desencadeando sináptica gatos6,14,15. Finalmente, supralinear Ca2 + eventos podem ser gerados em dendritos sob certas condições,11,12,13,16.
Emprega dois fotões Ca2 + imagem em combinação com gravações eletrofisiológicos remendo-braçadeira sintético Ca2 +-sensíveis indicadores fluorescentes, que normalmente são entregues através do eletrodo de remendo durante as gravações de células inteiras . Um método padrão para a quantificação da dinâmica de Ca2 + baseia-se o método de duplo indicador17,18. Ele usa dois fluorophores com espectros de emissão bem separados (por exemplo, uma combinação de um vermelho Ca2 +-tintura insensível com verde Ca2 + indicadores, tais como o Oregon Green BAPTA-1 ou Fluo-4) e tem várias vantagens quando comparado com o método do indicador único. Primeiro, uma Ca2 +-tintura insensível é usado para localizar pequenas estruturas de interesse (ramificações dendríticas e espinhos) onde Ca2 + imagem latente será executada. Em segundo lugar, a relação entre a mudança na fluorescência verde e vermelha (ΔG/R) é calculada como uma medida de [Ca2 +], que é em grande parte insensível às mudanças na fluorescência de base devido a flutuações no [Ca2 +]017 , 18. Além disso, as alterações de fluorescência podem ser calibradas em termos de absoluta Ca2 + concentrações.19.
Uma preocupação geral quando executando dois fotões Ca2 + imagem experimentos em fatias agudas é celular saúde e estabilidade da aquisição imagem devido ao poder do laser alta normalmente usado. Adicionalmente, em Ca2 + imagem as experiências, há preocupação com a perturbação e substancial superestimação da subcellular Ca2 + dinâmica devido ao fato de que indicadores de Ca2 + atuam como altamente móvel exógena Ca2 + buffers. Assim, a escolha do indicador de Ca2 + e sua concentração depende do tipo neuronal, a amplitude prevista de gatos e a questão experimental.
Adaptamos o método de dois fotões Ca2 + imagem para investigação de Ca2 + flutuações de dendrites de gabaérgica interneurônios9,10,11,20,21 , 22. enquanto a maior parte do Ca2 + imagem estudos iniciais foram feitos em neurônios principais, interneurônios inibitórios mostrar uma grande variedade de funcional Ca2 + mecanismos que são distintos daqueles em células piramidais20 , 23 , 24. estes mecanismos específicos de interneurônio (por exemplo, Ca2 + permeável Leandro receptores) podem desempenhar funções específicas na regulação da atividade das células. Enquanto dendríticas Ca2 + sinalização em interneurônios é um alvo tentador para maiores investigações, dois fotões Ca2 + imagem em dendritos dessas células apresenta desafios adicionais, de um diâmetro mais fino de dendrites e falta de espinhos para uma particularmente elevado Ca2 + ligação capacidade endógena. Como nossa pesquisa interessa foco no estudo dos interneurônios hippocampal, o seguinte protocolo, embora aplicáveis a diferentes populações neuronais, foi adaptado para lidar com esses desafios.
Este protocolo foi executado com um microscópio confocal comercial dois fotões, que foi equipado com dois detectores externos, não-descanned (NDDs), electro-ópticos modulador (Moe) e um Dodt digitalização contraste gradiente (SGC) e instalado em uma mesa de óptica. O microscópio foi acoplado com uma Ti:Sapphire do laser do multiphoton modo bloqueado a 800 nm (> 3 W, 140 pulsos fs, taxa de repetência de 80 Hz). O sistema da imagem latente foi equipado com uma plataforma padrão de eletrofisiologia, incluindo uma câmara de perfusão com controle de temperatura, uma plataforma de tradução com dois Micromanipuladores, um amplificador de microeletrodos controlado por computador, um digitador, um estímulo unidade e software de aquisição de dados.
O método mostrado aqui demonstra como a combinação de dois fotões Ca2 + imagem e Eletrofisiologia do remendo-braçadeira pode ser usada para estudar dendríticas Ca2 + sinalização nos dendritos neuronais em fatias cerebral aguda. Esse método permite o monitoramento de ambos as locais Ca2 + elevações evocadas pela AP elétrica de estimulação ou backpropagating em segmentos dendríticas e resposta somática da célula. Isso torna uma excelente ferramenta para estudar como várias…
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi apoiado pelo Conselho de institutos canadenses de pesquisa em saúde, ciências naturais e pesquisa de engenharia (NSERC Discovery Grant) e a Fundação de Savoy. OC foi apoiado por uma bolsa de doutorado do NSERC.
Animal Strain: Mouse CD1 | Charles River | 022 | |
Isoflurane | AbbVie Corporation | 0B506-099 | |
CGP 55845 hydrochloride | Abcam | ab120337 | |
Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | |
D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | |
Paraformaldehyde powder, 95% | Sigma-Aldrich | 158127 | |
Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
Potassium gluconate | Sigma-Aldrich | P1847 | |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S8875 | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
Trizma hydrochloride | Sigma-Aldrich | T3253 | |
Sodium phosphate dibasic dihydrate | Sigma-Aldrich | 71643 | |
Sodium phosphate monobasic monohydrate |
Sigma-Aldrich | S9638 | |
Biocytin | Sigma-Aldrich | B4261 | |
Alexa Fluor 594 Hydrazide | ThermoFisher Scientific | A10438 | |
SR95531 (Gabazine) | Abcam | ab120042 | |
Adenosine triphosphate (ATP)-Tris |
Sigma-Aldrich | A9062 | |
Guanosine (GTP)-Na+ |
Sigma-Aldrich | G8877 | |
Oregon Green BAPTA-1 |
ThermoFisher Scientific | O6812 | |
Phosphocreatine di(tris) salt |
Sigma-Aldrich | P1937 | |
Streptavidin-conjugated Alexa-546 |
ThermoFisher Scientific | S11225 | |
Patch Borosilicate Glass Capillaries |
World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
Theta Borosilicate Glass Capillaries |
Sutter Instrument | BT-150-10 | |
P-97 Flaming/Brown Micropipette puller |
Sutter Instrument | ||
TCS SP5 Confocal Multiphoton Microscope |
Leica Microsystems | ||
Chameleon Ultra II Ti:Sapphire multiphoton laser |
Coherent | ||
LAS AF Imaging Acquisition Software | Leica Microsystems | ||
Temperature Controller TC-324B |
Warner Instruments | ||
MultiClamp 700B Amplifier |
Molecular Devices | ||
Digidata 1440A Digitizer |
Molecular Devices | ||
Confocal Translator |
Siskiyou | ||
Micromanipulator |
Siskiyou | ||
pClamp Data Acquisition Software |
Molecular Devices | ||
A365 Constant Current Stimulus Isolator |
World Precision Instruments | ||
Vibraplane Optical Table |
Kinetic Systems |