Summary
Vi presenterar en metod som kombinerar hela-cell patch-clamp inspelningar och två-photon imaging för att spela in Ca2 + transienter i nervcellernas dendriter i akut hjärnskada skivor.
Abstract
Kalcium (Ca2 +) bildbehandling är ett kraftfullt verktyg för att undersöka spatiotemporal dynamiken i intracellulära Ca2 + signaler i nervcellernas dendriter. Ca2 + fluktuationer kan uppstå genom en mängd olika membran och intracellulära mekanismer och spelar en avgörande roll i induktion av synaptisk plasticitet och reglering av dendritiska retbarhet. Därför är möjligheten att spela in olika typer av Ca2 + signaler i dendritiska grenar värdefulla för grupper studerar hur dendriter integrera information. Tillkomsten av 2-foton mikroskopi har gjort sådana studier betydligt lättare genom att lösa problem som är förbundna med imaging i levande vävnad, såsom ljusspridning och åldrad hud. Genom kombination av konventionella elektrofysiologiska tekniker med två-photon Ca2 + imaging, är det dessutom möjligt att undersöka lokala Ca2 + fluktuationer i nervcellernas dendriter parallellt med inspelningar av synaptisk aktivitet i Soma. Här beskrivs hur man använder denna metod för att studera dynamiken i lokala Ca2 + transienter (katter) i dendriter av GABAergic hämmande interneuroner. Metoden kan tillämpas även på studera dendritiska Ca2 + signalering i olika neuronala typer i akut hjärnskada skivor.
Introduction
Bidraget av en neuron till nätverksaktivitet bestäms till stor del av den dynamiska karaktären av de synaptic ingångarna som det mottar. Traditionellt, åberopade den dominerande metoden för att karaktärisera synaptisk aktivitet i nervceller somatiska hela-cell patch-clamp inspelningar av postsynaptiska strömmar frammanade genom elektrisk stimulering av axoner av passagen. Enda verksamhet som proximalt belägna synapserna rapporteras dock sanningsenligt i detta fall1. Dessutom, för att bedöma de synaps-specifika mekanismerna, har inspelningar från par av nervceller och dendriter på en viss plats använts att rikta synapserna sevärdheter och mekanismerna för dendritiska integration, respektive. Ett stort genombrott i fältet i synaptic fysiologi uppnåddes genom ett äktenskap mellan optisk och elektrofysiologiska tekniker. Två-foton excitation laserscanning mikroskopi (2PLSM) i kombination med Ca2 + imaging och optogenetic verktyg kan avslöja enorma Detaljer för den dynamiska organisationen av synaptisk aktivitet på specifika neuronala anslutningar i hjärnan skivor i vitro och in-vivo.
Flera viktiga fördelar gjorde 2PLSM sticker ut från den konventionella, one-photon excitation mikroskopi2: (1) på grund av en ickelinjär natur av två-photon excitation, fluorescensen skapas endast i focal volymen och alla avgivna fotonerna representerar användbara signaler (inget behov för pinhole); (2) längre våglängder, används i 2PLSM, penetrera scattering vävnaden mer effektivt; spridda fotoner är dessutom alltför utspädd att producera två-photon excitation och bakgrunden fluorescens; (3) photodamage och fototoxicitet är också begränsad till fokalplanet. Trots den höga kostnaden av 2-foton system jämfört med konventionella confocal Mikroskop förblir 2PLSM därför en metod för val av högupplösta utredning av neuronala struktur och funktion i tjock levande vävnad.
Den första tillämpningen av 2PLSM i scattering vävnad var att bild struktur och funktion av Dendritutskotten3. 2PLSM i kombination med Ca2 + imaging har avslöjat att spines funktion som isolerade biokemiska fack. Sedan i många neuronala typer finns det en one-to-one överensstämmelse mellan ryggar och enskilda synapserna4, blev två-photon Ca2 + imaging snart ett användbart verktyg för rapportering av enskilda synapserna i intakt vävnad5, 6,7,8. 2PLSM-baserade Ca2 + imaging har dessutom framgångsrikt använts för att övervaka aktiviteten hos enda kalciumkanaler och ickelinjära samspelet mellan de inneboende och synaptic conductances, samt att bedöma den statliga - och aktivitet-beroende reglering av Ca2 + signalering i nervcellernas dendriter5,6,7,8,9,10,11.
Kalcium är en allestädes närvarande intracellulära andra budbärare, och dess subcellulär spatiotemporal organisation bestämmer riktningen av fysiologiska reaktioner, från förändringar i synaptisk styrka till regleringen av ion kanaler, dendrite och ryggraden tillväxt, som samt celldöd och överlevnad. Dendritiska Ca2 + höjder uppstå via aktivering av flera vägar. Handlingspänningar (APs), backpropagating till dendriter, öppnar spänningskänsliga kalcium kanaler12 och producera relativt globala Ca2 + transienter (katter) i dendriter och ryggar13. Synaptisk transmission är associerad med aktivering av postsynaptiska Ca2 +-permeable receptorer (NMDA, Ca2 +-genomsläpplig AMPA och kainate), utlöser synaptic katter6,14,15. Slutligen kan supralinear Ca2 + händelser genereras i dendriter enligt vissa villkor11,12,13,16.
Två-foton Ca2 + imaging i kombination med patch-clamp elektrofysiologiska inspelningar sysselsätter syntetiska Ca2 +-känsliga fluorescerande indikatorer som levereras vanligtvis via lapp elektroden under hela-cell recordings . En schablonmässig metod för kvantifiering av Ca2 + dynamics är baserad på den dubbla indikator metod17,18. Den använder två fluorophores med väl separerade utsläpp spectra (t.ex., en kombination av en röd Ca2 +-okänsliga färgämne med grön Ca2 + indikatorer, såsom Oregon grön BAPTA-1 eller Fluo-4) och har flera fördelar jämfört med den enskild indikator metod. Första, en Ca2 +-okänsliga dye används för att leta upp små strukturer av intresse (dendritiska grenar och taggar) där Ca2 + avbildning kommer att utföras. Det andra beräknas förhållandet mellan förändringen i grön och röd fluorescens (ΔG/R) som ett mått på [Ca2 +], vilket är i stort sett okänsliga för förändringar i baslinjen fluorescens på grund av fluktuationer i [Ca2 +]017 , 18. Dessutom fluorescens förändringar kan kalibreras när det gäller absoluta Ca2 + koncentrationer19.
En allmän oro när kör två-photon Ca2 + imaging experiment i akut skivor är cell hälsa och stabilitet av förvärvet bild på grund av den höga lasereffekt som vanligtvis används. Dessutom finns Ca2 + imaging experiment, oro om störning och betydande överskattning av subcellulär Ca2 + dynamics på grund av att Ca2 + indikatorer fungera som lättrörliga exogena Ca2 + buffertar. Alltså, valet av Ca2 + indikatorn och dess koncentration beror på typ av neuronala, förväntade amplituden av katter och på experimentell frågan.
Vi anpassat metoden för två-photon Ca2 + imaging för utredning av Ca2 + fluktuationer i dendriter GABAergic interneuroner9,10,11,20,21 , 22. medan huvuddelen av tidig Ca2 + imaging studier var gjort i huvudsakliga nervceller, hämmande interneuroner Visa upp en stor mängd funktionella Ca2 + mekanismer som skiljer sig från dem i pyramidala celler20 , 23 , 24. dessa interneuron-specifika mekanismer (t.ex., Ca2 + genomsläpplig AMPA-receptorer) kan spela specifika roller i reglera cellernas aktivitet. Dendritiska Ca2 + signalering i interneuronen är ett lockande mål för vidare utredning, presenterar två-photon Ca2 + imaging i dendriter av dessa celler ytterligare utmaningar, från en tunnare diameter av dendriter och avsaknaden av taggar till en särskilt hög endogen Ca2 + bindande kapacitet. Som vårt forskningsintresse fokuserar på studier av hippocampus interneuroner, anpassades följande protokoll, medan gäller för olika neuronala populationer, till ta itu med dessa utmaningar.
Detta protokoll avrättades med en kommersiell confocal två-foton Mikroskop, som var utrustad med två externa, icke-descanned detektorer (NPF), Elektro-optiska modulator (EOM) och en Dodt skanning gradient kontrast (SGC), och installeras på en optisk tabell. Mikroskopet var förenat med en multiphoton TI: safirlaser läge-låst vid 800 nm (> 3 W, 140 fs pulser, 80 Hz repetition rate). Bildsystem var utrustad med en standard elektrofysiologi rigg, inklusive en perfusion kammare med en översättning plattform med två micromanipulators, en digitizer, en datorstyrd mikroelektrod förstärkare, temperaturkontroll, en stimulering enheten, och data förvärv programvara.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experimenten utfördes enligt riktlinjerna som djurskydd djur skydd kommittén av Université Lavaldomen och kanadensiska rådets på djur vård.
1. inledande förberedelser (tillval: förbereda 1 dag i förväg)
- Förbered tre typer av konstgjorda cerebrospinalvätska (ACSF) lösning (Normal, sackaros och återställningslösningar, 1 L varje, se tabell 1). Justera osmolalitet av lösningar till 300 ± 10 mOsm25 och cool ACSF-sackaros ner till en nära-fryspunkt (0-4 ° C).
Obs: Användningen av en låg salthalt skärande lösning (ACSF-sackaros) hjälper bevara livskraften hos nervceller i de ytliga lagrarna av akut skivor26. - Förbereda 0,75 mL patch-lösning innehållande en röd fluorophore (t.ex., Alexa-594) och en grön syntetisk kalcium indikator (t.ex., Oregon grön BAPTA-1; se tabell 1). Inkluderar biocytin (se tabell 1) i patch-lösningen om post hoc morfologisk identifiering av inspelade celler krävs.
- Justera osmolalitet på lösningen på 280 ± 5 mOsm och pH 7,35 ± 0,5. Förvara lösningen i kylskåp eller på is på alla gånger.
Obs: Val av kalcium indikatorn bör bygga på dess dynamiska omfång och arten av de undersökta Ca2 + händelserna. - Med hjälp av en mikropipett avdragare, förbereda patch pipetter från borosilikatglas kapillärer (se Tabell för material) med en ≈ 2 µm spets (pipett motstånd av 3-5 MΩ) och stimulering pipetter från Borsilikat theta-glas kapillärer (se tabellen Material) med 2-5 µm spets.
Obs: Avdragare inställningarna att göra pipetter av en viss diameter och form kommer att bestämmas av avdragare glödtråd typ och ramp testresultaten för en viss typ av glas.
2. Hippocampus Slice förberedelse
- Söva musen (P13-20; belastningen och sex av musen bestäms av experimentella frågan behandlas) med 1 mL av isofluran placeras på en pappershandduk inom en inandning narkos kammare. När djuret är djupt sövda, vilket framgår av brist på rörelse och långsam andning, ta bort den från narkos kammaren och halshugga med en giljotin.
- Exponera skallen genom att skära i huden med en liten sax från baksidan av skallen till näsan. Använd ett litet par av mini ben rongeurs för att göra ett hål på bregma nivå. Sedan använda saxen för att göra ett caudal-till-rostralt snitt längs sagittal suturen. Med rongeurs greppa baksidan av varje skalle lock och lyft uppåt och utåt för att ta bort skallen som täcker varje halvklotet.
- När hjärnan är helt exponerad, underskred synnerverna med en liten spatel. Ta bort hjärnan från skallen och sätta det i en petriskål som innehåller kontinuerligt syresatt, kall ACSF-sackaros (se tabell 1 för sackaros koncentration).
- Om vävnad från äldre möss krävs, utföra en intrakardiellt perfusion med en spruta (25G) fylld med 20 mL iskallt ACSF-sackaros innan hjärnan utvinning för att få bra kvalitet skivor.
- Förbereda Hippocampus skivor från den extraherade djurens hjärnan.
- Låt hjärnan kylan för cirka 2 min. Placera filter papper på en is-packade petriskål, överföra hjärnan på filter papper. Dissekera de två hjärnhalvorna.
- Limma de dissekerade hjärnhalvorna (orientering bestäms av experimentella målet att erhålla koronala, övergripande eller horisontella skivor) på en vibratome tabell och fördjupa det i vibratome facket fylld med iskall syresatt ACSF-sackaros. Gör 300 µm tjocka skivor vid en temperatur av ca 1 ° C med hjälp av en vibratome svalare eller utsläppande isen runt vibratome facket.
- Använda en platt pensel, ackumuleras skivor som innehåller hippocampus (upp till 6 skivor per halvklotet) i ett bad innehållande syresatt ACSF-Recovery värms upp till 37 ° C.
- Lämna skivor i ACSF-Recovery badet för minst 45 min.
3. hela-cell Patch-clamp Recordings
- Inrätta ett Hippocampus segment i ett bad placerad under målet (förstoring: 40 x, numerisk bländare: 0,8) av laserskanning två-foton Mikroskop. Kontinuerligt BEGJUTA badet med syresatt ACSF-Normal uppvärmd till 30-32 ° C i en takt av 2,5-3 mL/min.
- Använda IR differentiell störningar kontrast (IR-DIC) eller Dodt-SGC mikroskopi för att hitta en cell av intresse med hjälp av dess storlek, form och position.
Obs: Beroende på befolkningens riktade neuron, en transgen musmodell kan användas för att enkelt hitta celler av intresse. Detta steg kan i detta fall ersättas med användning av en fluorescerande ljuskälla. - Fyll en stimulering pipett med en ACSF-Normal lösning innehållande röda fluorophore (t.ex., Alexa-594).
- Ange stimulering pipetten (ansluten till en elektrisk stimulering enhet) ovanpå segmentet så att spetsen är i samma region som cellen av intresse.
- Efter fyllning patch pipetten med patch lösning och kopplar den till ett huvud skede, Ställ över segmentet så att dess spets är direkt ovanför cellen av intresse.
- Passar en spruta in i en tre-vägs Avstängningskranen och Anslut den till lapp-pipetten genom plast röret. Injicera konstant övertryck i patch pipetten (≈ 0,1 mL) med hjälp av sprutan. Hålla Avstängningskranen i ”nära” position.
- Aktivera modulen förstärkare programvara och växla till spänning-klämman genom att klicka på knappen ”VC”. Öppna elektrofysiologi data förvärv programvaran (t.ex., clampex) för förvärv av elektrofysiologiska signaler och klicka på ikonen ”membran Test” att kontinuerligt skicka ut en fyrkantig spänning puls (5 mV, 10 ms), som är nödvändigt att övervaka det förändringar i pipett motståndet.
- Lägre patch pipetten tills det är ovanpå riktade cellen. Vid att göra kontakt med cellmembranet, ta bort trycket genom att vrida Avstängningskranen i ”öppet” läge.
Obs: Kontakt med cellmembranet upptäcks när en liten ökning i pipett motståndet (≈ 0,2 MΩ) ses och en liten inbuktning på cellen orsakas av övertryck. - Applicera ett lätt undertryck till patch pipetten med hjälp av en tom spruta in Avstängningskranen tills pipett motståndet som tillhandahålls av programvaran når 1 GΩ. I fönstret 'Membran Test' av programvaran data förvärv klämma cellen vid -60 mV.
- Fortsätta att tillämpa negativa trycket tills cellen öppnas och hela-cell konfigurationen uppnås. Påvisande av denna cell staten bygger på plötslig förändring i pipett motståndet (från 1 GΩ till 70-500 MΩ beroende på interneuron) och uppkomsten av stora kapacitiv transienter i fönstret 'Membran Test'.
4. två-photon Ca2 + Imaging
- Om intresserad av excitatoriska postsynaptiska svaren, lägga den GABAA receptor blockerare gabazine (10 µM) och den GABAB -receptorblockerare CGP55845 (2 µM) i ACSF badet.
- I förstärkaren programvarumodul, inställd ström-clamp patch konfigurationen genom att klicka på knappen ”CC” och registrera cellens bränning mönster i svar på somatiska injektioner av depolariserande ström (0.8-1.0 nA, 1 s). Vänta i minst 30 min för cellen att fyllas med indikatorerna som patch lösningen i.
Obs: Cellens bränning mönster och aktiva egenskaper kan användas för att identifiera cellens subtyp; e.g., snabb-tillsatta celler. Det är viktigt för koncentrationen i indikator att stabilisera genom diffusion innan du börjar spela in katter (se tabell 2 för felsökning). - AP-framkallat katter
- Med förvärvet bildbehandlingsprogram, starta bilder. Leta upp en dendrite sevärdheter med av röd fluorescens. För att säkerställa en synlig svar, Välj först en proximal dendrite (≤ 50 µm) som AP backpropagation effektivitet försämras väsentligt med avstånd i GABAergic interneuroner22.
- Verktyget ' rektangulärt ' i förvärvet bildbehandlingsprogram, zooma in på den berörda regionen och växla till den ”xt” (linescan) läge. Placera skanna över den dendritiska grenen av intresse. Med laser intensitet kontrollanterna i programvaran förvärvet, ställa in två-photon laser på en minimal effektnivå där baslinjen grön fluorescens är bara något synligt, att undvika fototoxicitet.
- I den elektrofysiologi data förvärv programvaran 'Protokoll' fönster och bild förvärv, skapa en inspelning rättegång önskad varaktighet som innehåller en somatisk nuvarande injektion av önskad amplituden.
- Använda programvaran bild förvärv, klicka på knappen ”starta rekord” och förvärva fluorescensen kontinuerligt för 1-2 s. Upprepa bild förvärv 3 - 10 gånger. Vänta minst 30 s mellan enda skanningar att undvika photodamage. Om att förvärva linescans på flera punkter längs en dendrite, ta dem i slumpmässig ordning att undvika ordning effekter.
- Synaptically-framkallat katter
- Leta upp en dendrite sevärdheter med av röd fluorescens.
- Ställ in stimulering pipetten på ytan av segmentet ovan dendrite sevärdheter. Sakta ned stimulering pipetten på plats, minimera rörelse för att undvika att störa hela-cell konfigurationen. Placera pipetten på 10-15 µm från dendrite.
- För att visualisera placeringen av synaptic microdomains i aspiny dendriter, förvärv bildbehandlingsprogram växla till den 'xt' (linescan) läge och placera linjen längs grenen dendritiska sevärdheter.
- I 'Protokoll' fönster (av elektrofysiologi data förvärv programvara) och förvärvet bildbehandlingsprogram, skapa en inspelning rättegång som utlöser stimulering enheten efter rättegång.
- Via programvaran förvärvet Klicka på knappen ”starta posten” Skanna längs dendrite kontinuerligt för 1-2 s. Upprepa förvärv 3 - 5 gånger, vänta 30 s mellan skanningar att förebygga åldrad hud.
Obs: Scan längd kan justeras beroende på evenemangets evoked kinetik, men bör minimeras för att förhindra photodamage (se tabell 2 för felsökning). - Upprepa steg 4.5.5 under olika förhållanden (t.ex., olika intensitet/längd av stimulering, införandet av en farmakologisk blocker, etc.) beroende på den specifika frågan behandlas.
- Stoppa förvärvet när cellen visar tecken på försämrad hälsa: depolarisation nedan -45 mV, ökning av baslinjen Ca2 + nivå, morfologiska försämring av dendriter (t.ex., blebbing, fragmentering, se tabell 2 för felsökning).
- Du få preliminär information om cellens morfologi och föra ett register över placeringen av stimulering pipetten, förvärva en Z -stack i cellen i den röda kanalen. Använda programvaran förvärvet i 'xyz' läge, Ställ in den övre och nedre stack gränsvärden till bild hela cellen med alla processer som ingår. Ställa in storleken' steg' på 1 µm och initiera stack förvärvet med knappen ”Start post”.
- När Z-stack förvärv är klar, Använd alternativet ”Max projektion” i programvaran att överlagra alla focal planer i stacken och kontrollera kvaliteten på förvärvet. Sedan långsamt dra tillbaka patch pipetten ur segmentet.
- För att fixa biten för post hoc morfologisk identifiering, snabbt ta bort segmentet från badet med en platt pensel, och placera den mellan två filtrerpapper, i en ACSF-fyllda petriskål. Ersätta ACSF med en 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) lösning och lämna skålen i 4 ° C rum eller kylskåp över natten.
5. immunhistokemi för Post Hoc morfologisk identifiering av inspelade celler
Obs: Efter 1 natt fixering i PFA, slice kan lagras i fosfatbuffert (PB) med natriumazid (0,5%) för upp till 1 månad.
- Sätta på segmentet i Tris-buffrad koksaltlösning (TBS) med Triton x-100 (0,3%) och utföra 4 tvättar (5-10 min varje).
- Sätta på segmentet i TBS-Triton 0,3% med 10% normalt get serum (NGS) för 1 h.
- Sätta på segmentet i TBS-Triton 0,3% med 1% natten NGS och en streptividin-konjugerad fluorophore (t.ex., Alexa Fluor 546-konjugerad streptividin, 1: 200) för inkubation.
- Tvätta 4 gånger (5-10 min) i TBS.
- Montera skivor på objektglas och bilden med confocal Mikroskop. För att ha en komplett cell rekonstruktion, förvärva en Z-stack (steg storlek: 1 µm) använder ett 20 x mål. För imaging en Alexa-546-konjugerad etikett, ange användning 543 nm laser och en 515-560 nm upptäckt filter.
6. analys av katter
- Extrahera fluorescens värden från regionerna av intresse (ROIs) i linescan bilder från de röda och gröna kanalerna och genomsnittliga värdena för de flera repetitioner för varje villkor att minska buller.
Obs: När linescan förvärv utförs längs dendrite, är det möjligt att extrahera data från flera ROIs, som kan motsvara dendritiska microdomains (2-5 µm), och därigenom studien av de Ca2 + signal uppdelning. - För varje ROI, express förändringarna i Ca2 + amplitud som:
Obs: Här G är fluorescens värdet från den gröna kanalen; G0 är fluorescens utgångsvärdet från den gröna kanalen under perioden före stimulering. R är fluorescens värdet från den röda kanal18. Två-foton magnetisering är starkt lokaliserad och genererar inte en betydande bakgrund, krävs inte subtraktion av bakgrunden fluorescens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med hjälp av protokollet som presenteras här, fick vi katter frammanade genom somatiska nuvarande injektion och elektrisk stimulering i dendriter av oriens/alveus interneuroner i området CA1 i hippocampus. Efter lapp en neuron, identifieras baserat på dess form och ställning, förvärvade vi linescans över en proximal dendrite på flera punkter givit avstånd från soma (figur 1A). Vi observerat en minskning av amplituden av katter som induceras av backpropagating APs som avståndet från den soma ökade (vägledande av minskad AP amplitud eller en distansera-anhörig minskning kalcium kanal distribution, figur 1B). Efter immunohistokemi (med streptividin-konjugerad Alexa Fluor 546), kunde vi hämta biocytin märkning av cellen och identifiera inspelade neuron som en bistratified cell med ett axon som ockuperar stratum oriens och stratum radiatum (figur 1 C). I andra försöket, stimulering pipett fördes till en distala dendritiska webbplats. Skanning längs dendrite, var vi sedan kunna bedöma amplituden av de postsynaptiska Ca2 + signalerna i en given dendritiska gren (figur 2A–C) svar på elektrisk stimulering av axoner av passagen. Postsynaptiska katterna skilde sig mellan angränsande dendritiska microdomains (segment 1 till 6. Figur 2D), som kan vara associerade med en spridning på Ca2 + signal från zonen av inledande och/eller olika postsynaptiska mekanismer som är involverade.
Figur 1: Representativa exempel på AP-framkallat Ca2 + transienter. (A) maximalt projektion av en två-photon Z-stack (13 µm) av en lappat interneuron fylld med Alexa-594 (20 µM). Vita linjer beteckna plats och längden på linescans. (B) spår visar katterna framkallas på platser som visas i A. Top spår visar kort AP tåget genereras genom somatiska nuvarande injektion under inspelningen rättegång. Tidsskalan är samma på alla spår visas. (C) maximalt projektion av en confocal Z-stack visar biocytin märkning av cellen. O/A: Oriens/Alveus; PYR: Stratum Pyramidale; RAD: Stratum Radiatum. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Postsynaptiska Ca2 + transienter framkallat av en explosion av elektrisk stimulering (3 stimuli vid 100 Hz). (A) maximalt projektion av en två-photon Z-stack (148 µm) visar en lappat interneuron fylld med Alexa-594. Vita pilar peka på platsen av axonal terminaler inom pyramidal lagret, vilket tyder på interneuron är en korg cell. (B) enda fokalplan illustrerar den dendritiska gren där stimulering elektroden var placerad. Streckad linje visar platsen för den linescan visas i (C1 och C2). (C) bilder som illustrerar resultatet av en linescan i rött (1; Alexa-594; 20 µM) och grönt (2; Oregon grön Bapta-5N; 300 µM) kanaler. Bilderna var kastas i papperskorgen i mindre segment att analysera spridningen av svaret över 30 µm. (D) spår visar att Ca2 + transienter (katter) framkallas inom segmenten visas i C2. Översta spåret visar spänning svaret på elektrisk stimulering registreras på somatiska nivå under imaging rättegången. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Lösning | Komponent | Koncentration (mM) |
| ACSF-Normal | NaCl | 124 |
| KCl | 2.5 | |
| NaH2PO4 | 1,25 | |
| MgSO4 | 2 | |
| NaHCO3 | 26 | |
| Glukos | 10 | |
| CaCl2 | 2 | |
| ACSF-återhämtning | NaCl | 124 |
| KCl | 2.5 | |
| NaH2PO4 | 1,25 | |
| MgSO4 | 3 | |
| NaHCO3 | 26 | |
| Glukos | 10 | |
| CaCl2 | 1 | |
| ACSF-sackaros | KCl | 2 |
| NaH2PO4 | 1,25 | |
| MgSO4 | 7 | |
| NaHCO3 | 26 | |
| Glukos | 10 | |
| Sackaros | 219 | |
| CaCl2 | 1 | |
| K+-baserat Patch lösning | K+- glukonat | 130 |
| HEPES | 10 | |
| MgCl2 | 2 | |
| Phosphocreatin di (tris) salt | 10 | |
| ATP-Tris | 2 | |
| GTP-Tris | 0,2 | |
| Biocytin | 72 | |
| Alexa-594 | 0,02 | |
| Oregon Green-BAPTA-1 | 0,2 |
Tabell 1: lösning recept. Föreningar och koncentrationer för lösningar som används under protokollet.
| Problemet | Lösning |
| Det går inte att lappa friska neuron | Kontrollera för tecken på att skivor är ohälsosamt: krympta eller svullna celler, synliga atomkärnor, etc. I så fall kassera skivor. Kontrollera också patch-pipett motståndet och patch-lösningens osmolalitet; Byt ut dem om värdena inte är i lämplig intervall. |
| Fluorescens signalen från dendriter är låg | Vänta längre för cellen att fylla. Om ett hinder är att hålla patch-lösningen från sprida in i cellen, prova att applicera en liten mängd av undertrycket i patch-pipetten. |
| Elektrisk stimulering inte frammana en Ca2 + svar | Kontrollera förekomsten av en artefakt i elektrofysiologiska inspelningen. Om frånvarande, kontrollera för en kort-kortslutningen/stimulerande tekniskt fel på enheten. I förekommande fall, höjer stimulering intensiteten eller flytta stimulering pipetten närmare till dendrite. Det ska noteras att avståndet mellan stimulering elektroden och dendrite inte bör överskrida 8 um för att förhindra direkta depolarisation av dendriter när man studerar synaptic svaren. |
| Evoked Ca2 + signalen är alltför hög/mättat fett av Ca2 + indikator | Minska lasereffekt. Om problemet kvarstår i flera celler, använda en annan Ca2 + indikator, med en lägre Ca2 + affinitet. |
| Baslinjen Ca2 + signal ökar successivt under experimentet | Vänta längre mellan enskilda skanningar. Om baslinjen fortfarande ökar, sluta förvärvet. det indikerar att cellens hälsa sannolikt minskar. |
| Amplituden av signalen minskar Ca2 + under genomsökningar | Minska lasereffekt eller zooma ut (i tillämpliga fall). |
| Dendrite fragmentering (”blebbing”) efter skanning | Minska lasereffekten eller zooma ut. Om blebbing är begränsad till den riktade dendrite, välja en annan dendrite och minska lasereffekt / zooma ut. Om flera dendriter är blebbing, stoppa förvärv. |
| Fluorescens signaler ”drifting” ur raden scan efter sveper | Minska rörelsen i segmentet genom att minska hastigheten på ACSF perfusion. Innan lapp, se säker på att segmentet är starkt fast på plats av ett netto. |
Tabell 2: Felsökning tabell. Lösningar på vanliga problem som kan uppstå under en Ca2 + imaging experiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den metod som visas här visar hur kombinationen av två-photon Ca2 + imaging och patch-clamp elektrofysiologi kan användas för att studera dendritiska Ca2 + signalering i nervcellernas dendriter i akut hjärnskada skivor. Denna metod tillåter övervakning av både den lokala Ca2 + förhöjda frammanade av elektrisk stimulering eller backpropagating AP i dendritiska segment och cellens somatiska svar. Detta gör det ett utmärkt verktyg att studera hur olika delar av trädet dendritiska integrera ingångar och kommunicera med soma. Men med tanke på längden på experimentet, särskild uppmärksamhet behöver ägnas cell hälsa genom att begränsa användningen av lasereffekt för imaging för att undvika photodamage av dendriter. Detta kan även uppnås genom minskar zoomnivå, minskar varaktigheten av scan och öka skanningshastigheten under bild förvärv. Imaging interneuron dendriter introducerar ytterligare utmaningar. Som dendriter av dessa celler har inga ryggar, rekommenderas skanning längs dendrite att underlätta lokalisering av postsynaptiska Ca2 + microdomains. Dessutom är ges en hög endogen Ca2 + bindande kapacitet, Ca2 + förhöjda interneuron dendriter mindre och långsammare än de som genereras i dendriter pyramidala celler. Detta kräver att förvärva flera linescan bilder för genomsnitt samt en tillräckligt lång varaktighet på enskilda linescans för att beskriva Ca2 + signal kinetik på lämpligt sätt.
Lokala elektrisk stimulering använder bipolär theta-glaselektrod representerar ett användbart verktyg för karakterisering av dendritiska postsynaptiska Ca2 + microdomains. Det kan emellertid fortfarande aktivera olika ”en passant” axoner ligger i en viss region. Antalet ingångar som aktiveras i detta fall är okänd och bara beräknas med hjälp av ytterligare datorverktyg. Två-foton glutamat uncaging27, vilket möjliggör samtidig stimulering av flera enskilda synapserna, representerar ett bra alternativ för framkalla lokala dendritiska Ca2 + svaren. Denna metod används ofta för studie av huvudsakliga celler, som har tydligt definierade excitatoriska postsynaptiska strukturer (Taggar), men är inte väl lämpade för studier av interneuroner, som totalt har en låg ryggraden täthet. Uncaging glutamat längs den interneuron dendrite som den tillämpas på huvudsakliga celler oundvikligen skulle aktivera flera extrasynaptic mekanismer av Ca2 + signalering9,10, vilket gör det svårt att tolka den observationer.
I det senaste decenniet erbjöd framsteg inom optisk teknik förbättrad temporal upplösning för två-photon Ca2 + avbildning. En av de mest lovande är direktåtkomst mikroskopi (RAMP) genom acousto-optic avvisare (utanordnarnas)28,29. Till skillnad från konventionella raster skanning, skannar RAMP utvalda punkter av intresse på hög frekvens, som är aktiverat som den snabba hastigheten i tröghet-fri utanordnarnas. Den är idealisk för samtidiga studier av flera dendritiska grenar, eftersom det inte är begränsat till punkter som anges i en linjär mönster. Den högre temporal upplösning som erbjuds av utanordnarnas kan dock onödigt när imaging Ca2 + händelser varar hundratals millisekunder inom samma fokal plan. Dessutom kan platsen för skanning punkter inom samma struktur av intresse vara svåra att kontrollera på grund av mikro-drivor i slice preparat är associerad med en hög perfusion, vilket är nödvändigt för bra skiva kvalitet. Därför är hög temporal upplösning (500-700 Hz) linescan-baserade förvärvsmetoden presenteras i denna artikel fortfarande att föredra när imaging Ca2 + signaler i enskilda dendritiska grenar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingen konkurrerande ekonomiska intressen eller andra intressekonflikter.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av kanadensiska institut för hälsa forskning, naturvetenskaplig och teknisk forskning rådet (NSERC Discovery Grant) och stiftelsen Savoy. OC stöddes av en Ph.D. stipendium från NSERC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal Strain: Mouse CD1 | Charles River | 022 | |
| Isoflurane | AbbVie Corporation | 0B506-099 | |
| CGP 55845 hydrochloride | Abcam | ab120337 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Paraformaldehyde powder, 95% | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Potassium gluconate | Sigma-Aldrich | P1847 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S8875 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma-Aldrich | T3253 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate | Sigma-Aldrich | 71643 | |
Sodium phosphate monobasic monohydrate |
Sigma-Aldrich | S9638 | |
| Biocytin | Sigma-Aldrich | B4261 | |
| Alexa Fluor 594 Hydrazide | ThermoFisher Scientific | A10438 | |
| SR95531 (Gabazine) | Abcam | ab120042 | |
Adenosine triphosphate (ATP)-Tris |
Sigma-Aldrich | A9062 | |
Guanosine (GTP)-Na+ |
Sigma-Aldrich | G8877 | |
Oregon Green BAPTA-1 |
ThermoFisher Scientific | O6812 | |
Phosphocreatine di(tris) salt |
Sigma-Aldrich | P1937 | |
Streptavidin-conjugated Alexa-546 |
ThermoFisher Scientific | S11225 | |
Patch Borosilicate Glass Capillaries |
World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
Theta Borosilicate Glass Capillaries |
Sutter Instrument | BT-150-10 | |
P-97 Flaming/Brown Micropipette puller |
Sutter Instrument | ||
TCS SP5 Confocal Multiphoton Microscope |
Leica Microsystems | ||
Chameleon Ultra II Ti:Sapphire multiphoton laser |
Coherent | ||
| LAS AF Imaging Acquisition Software | Leica Microsystems | ||
Temperature Controller TC-324B |
Warner Instruments | ||
MultiClamp 700B Amplifier |
Molecular Devices | ||
Digidata 1440A Digitizer |
Molecular Devices | ||
Confocal Translator |
Siskiyou | ||
Micromanipulator |
Siskiyou | ||
pClamp Data Acquisition Software |
Molecular Devices | ||
A365 Constant Current Stimulus Isolator |
World Precision Instruments | ||
Vibraplane Optical Table |
Kinetic Systems |
References
- Williams, S. R., Mitchell, S. J. Direct measurement of somatic voltage clamp errors in central neurons. Nat Neurosci. 7, 790-798 (2008).
- Denk, W., Svoboda, K. Photon upmanship: why multiphoton imaging is more than a gimmick. Neuron. 18, 351-357 (1997).
- Yuste, R., Denk, W. Dendritic spines as basic functional units of neuronal integration. Nature. 375, 682-684 (1995).
- Nimchinsky, E. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. Structure and Function of Dendritic Spines. Annu Rev Physiol. 64, 313-353 (2002).
- Sabatini, B. L., Svoboda, K. Analysis of calcium channels in single spines using optical fluctuation analysis. Nature. 408, 589-593 (2000).
- Mainen, Z. F., Malinow, R., Svoboda, K. Synaptic calcium transients in single spines indicate that NMDA receptors are not saturated. Nature. 399, 151-155 (1999).
- Yasuda, R., Sabatini, B. L., Svoboda, K. Plasticity of calcium channels in dendritic spines. Nat Neurosci. 6, 948-955 (2003).
- Carter, A. G., Sabatini, B. L. State-dependent calcium signaling in dendritic spines of striatal medium spiny neurons. Neuron. 44, 483-493 (2004).
- Topolnik, L., Congar, P., Lacaille, J. C. Differential regulation of metabotropicglutamate receptor- and AMPA receptor-mediated dendritic Ca2+ signals by presynaptic and postsynaptic activity in hippocampal interneurons. J Neurosci. 25, 990-1001 (2005).
- Topolnik, L., Chamberland, S., Pelletier, J. G., Ran, I., Lacaille, J. C. Activity-dependent compartmentalized regulation of dendritic Ca2+ signaling in hippocampal interneurons. J Neurosci. 29, 4658-4663 (2009).
- Camiré, O., Topolnik, L. Dendritic calcium nonlinearities switch the direction of synaptic plasticity in fast-spiking interneurons. J Neurosci. 34, 3864-3877 (2014).
- Jaffe, D. B., Johnston, D., Lasser-Ross, N., Lisman, J. E., Miyakawa, H., Ross, W. N. Thespread of Na+ spikes determines the pattern of dendritic Ca2+ entry into hippocampal neurons. Nature. 357, 244-246 (1992).
- Nakamura, T., Barbara, J. G., Nakamura, K., Ross, W. N. Synergistic release of Ca2+ from IP3-sensitive stores evoked by synaptic activation of mGluRs paired with backpropagating action potentials. Neuron. 24, 727-737 (1999).
- Kovalchuk, Y., Eilers, J., Lisman, J., Konnerth, A. NMDA receptor-mediated subthreshold Ca(2+) signals in spines of hippocampal neurons. J Neurosci. 20, 1791-1799 (2000).
- Goldberg, J. H., Yuste, R., Tamas, G. Ca2+ imaging of mouse neocortical interneurone dendrites: contribution of Ca2+-permeable AMPA and NMDA receptors to subthreshold Ca2+ dynamics. J Physiol. 551, 67-78 (2003).
- Goldberg, J. H., Lacefield, C. O., Yuste, R. Global dendritic calcium spikes in mouselayer 5 low threshold spiking interneurones: implications for control of pyramidal cell bursting. J Physiol. 558, 465-478 (2004).
- Oertner, T. G. Functional imaging of single synapses in brain slices. Exp Physiol. 87, 733-736 (2002).
- Yasuda, R., et al. Imaging calcium concentration dynamics in small neuronal compartments. Sci STKE. 219, pl5 (2004).
- Maravall, M., Mainen, Z. F., Sabatini, B. L., Svoboda, K. Estimating intracellular calcium concentrations and buffering without wavelength rationing. Biophys J. 78, 2655-2667 (2000).
- Camiré, O., Topolnik, L. Functional compartmentalization and regulation of postsynaptic CaTs in inhibitory interneurons. Cell Calcium. 52, 339-346 (2012).
- Guet-McCreight, A., Camiré, O., Topolnik, L., Skinner, F. K. Using a semi-automated strategy to develop multi-compartment models that predict biophysical properties of interneuron-specific 3 (IS3) cells in hippocampus. eNeuro. 3, 1-26 (2016).
- Evstratova, A., Chamberland, S., Topolnik, L. Cell type-specific and activity-dependent dynamics of action potential-evoked Ca2+ signals in dendrites of hippocampal inhibitory interneurons. J Physiol. 589, 1957-1977 (2011).
- Topolnik, L. Dendritic calcium mechanisms and long-term potentiation in cortical inhibitory interneurons. Eur J Neurosci. 35, 496-506 (2012).
- Camiré, O., Lacaille, J. C., Topolnik, L. Dendritic Signaling in Inhibitory Interneurons: Local Tuning via Group I Metabotropic Glutamate Receptors. Front Physiol. 3, 259 (2012).
- Bourque, C. W. Central mechanisms of osmosensation and systemic osmoregulation. Nat RevNeurosci. 9, 519-531 (2008).
- Aghajanian, G. K., Rasmussen, K. Intracellular studies in the facial nucleus illustrating a simple new method for obtaining viable motoneurons in adult rat brain slices. Synapse. 3, 331-338 (1989).
- Pettit, D. L., Wang, S. S., Gee, K. R., Augustine, G. J. Chemical two-photon uncaging: anovel approach to mapping glutamate receptors. Neuron. 19, 465-471 (1997).
- Salomé, R., et al. Ultrafast random-access scanning in two-photon microscopy usingacousto-optic deflectors. J Neurosci Methods. 154, 161-174 (2006).
- Lechleiter, J. D., Lin, D. T., Sieneart, I. Multi-photon laser scanning microscopy using an acoustic optical deflector. Biophys J. 83, 2292-2299 (2002).
