Vi presenterer en metoden forbinder hele celle patch-klemme opptak og to-fotonet imaging å registrere Ca2 + transienter i neuronal dendrites i akutt hjernen skiver.
Kalsium (Ca2 +) bildebehandling er et kraftig verktøy for å undersøke spatiotemporal dynamikken i intracellulær Ca2 + signaler i neuronal dendrites. Ca2 + svingninger kan oppstå gjennom en rekke membran og intracellulær mekanismer og spille en avgjørende rolle i induksjon av synaptiske plastisitet og regulering av dendrittiske excitability. Derfor er evnen å fortegnelse typer Ca2 + signaler i dendrittiske grener verdifulle for grupper studere hvordan dendrites integrere informasjon. Bruk av to-fotonet mikroskopi har gjort slike studier betydelig lettere ved å løse problemene bildebehandling i levende vev, som lysspredning og photodamage. Videre gjennom kombinasjon av konvensjonelle elektrofysiologiske teknikker med to-Foton Ca2 + imaging, er det mulig å undersøke lokale Ca2 + svingninger i neuronal dendrites parallelt med opptak av synaptic aktivitet i Soma. Her beskriver vi hvordan du bruker denne metoden til å studere dynamikken i lokale Ca2 + transienter (cat) i dendrites av GABAergic hemmende interneurons. Metoden kan også brukes til å studere dendrittiske Ca2 + signalering i neuronal forskjellige i akutt hjernen skiver.
Bidrag av en Nevron nettverk aktivitet avhenger i stor grad av dynamikken i synaptic innganger den mottar. Tradisjonelt avhengig den dominerende metoden for å karakterisere synaptic aktivitet i neurons somatiske hele celle patch-klemme opptak av postsynaptic strøm fremkalt av elektrisk stimulering av axons av passasje. Imidlertid er bare aktivitet av proximally ligger synapser sannferdig rapportert i dette tilfellet1. I tillegg for å vurdere synapse-spesifikke mekanismene, har innspillinger fra par av neurons og dendrites på et bestemt sted blitt brukt mot synapser rundt og mekanismer for dendrittiske integrasjon, henholdsvis. Et stort gjennombrudd innen synaptic fysiologi ble oppnådd gjennom et ekteskap av optisk og elektrofysiologiske. To-fotonet eksitasjon laserskanning mikroskopi (2PLSM) i kombinasjon med Ca2 + bildebehandling og optogenetic verktøy kan avsløre enorm detaljer om dynamisk organiseringen av synaptic aktivitet på bestemte nevrale forbindelser i hjernen stykker i vitro og i vivo.
Flere viktige fordeler gjort 2PLSM skiller seg ut fra de konvensjonelle, ett-fotonet eksitasjon mikroskopi2: (1) et ikke-lineære naturen av to-fotonet eksitasjon til fluorescens genereres bare i fokal volumet, og alle slippes ut fotoner representerer nyttig signaler (ikke behov for pinhole); (2) lengre bølgelengder, brukes i 2PLSM, trenge spredning vevet mer effektivt; i tillegg er spredte fotoner også fortynne to-fotonet eksitasjon og bakgrunn fluorescens; (3) photodamage og Phototoksisitet er også begrenset til fokalplanet. Derfor til tross for den høye prisen av 2-fotonet systemer med konvensjonelle AC confocal mikroskop fortsatt 2PLSM en metoden for valg for høy oppløsning undersøkelse av neuronal struktur og funksjon i tykke levende vev.
Den første anvendelsen av 2PLSM i spredning vev var å image struktur og funksjon av dendrittiske spines3. 2PLSM i kombinasjon med Ca2 + bildebehandling har avslørt at spines funksjon som isolert biokjemiske avdelinger. Siden i mange neuronal typer det er en en korrespondanse mellom spines og personlige synapser4, ble to-Foton Ca2 + imaging snart en nyttig verktøyet rapportering aktiviteten til individuelle synapser i intakt vev5, 6,7,8. Videre ble 2PLSM-baserte Ca2 + imaging brukt til å overvåke enkelt kalsium kanaler og ikke-lineære samspillet mellom de indre og synaptic conductances, samt å vurdere tilstanden – og aktivitet-avhengige regulering av Ca2 + signalering i neuronal dendrites5,6,7,8,9,10,11.
Kalsium er en allestedsnærværende intracellulær andre messenger og sin subcellular spatiotemporal organisasjon bestemmer fysiologiske reaksjoner, fra endringer i synaptiske styrke reguleringen av ion kanaler, dendrite og ryggraden vekst, som celledød og overlevelse. Dendrittiske Ca2 + elevations oppstå via aktivering av flere veier. Handlingen potensialer (APs), backpropagating til dendrites, åpne spenning-gated kalsium kanaler12 og produsere relativt globale Ca2 + transienter (cat) i dendrites og spines13. Synaptiske overføring er forbundet med aktivering av postsynaptic Ca2 +-permeable reseptorer (NMDA, Ca2 +-permeable AMPA og kainate), utløser synaptic kattene6,14,15. Endelig kan supralinear Ca2 + hendelser genereres i dendrites under visse forhold11,12,13,16.
To-fotonet Ca2 + imaging i kombinasjon med patch-klemme elektrofysiologiske opptak bruker syntetiske Ca2 +-sensitive fluorescerende indikatorer, som vanligvis leveres gjennom oppdateringen elektroden under hele celle opptak . En standardmetode for kvantifisering av Ca2 + dynamics er basert på dobbelt indikator metoden17,18. Den bruker to fluorophores med godt adskilt utslipp spectra (f.eks, en kombinasjon av en rød Ca2 +-ufølsom fargestoff med grønne Ca2 + indikatorer, som Oregon Green BAPTA-1 eller Fluo-4) og har flere fordeler sammenlignet med den enkelt indikatoren metode. Først, en Ca2 +-ufølsom fargestoff brukes til å finne små strukturer rundt (dendrittiske grener og spines) der Ca2 + imaging utføres. Det andre beregnes forholdet mellom endringen i grønne og røde fluorescens (ΔG/R) som et mål på [Ca2 +], som er hovedsakelig ufølsom for endringer i planlagt fluorescens på grunn av svingninger i [Ca2 +]017 , 18. videre fluorescens endringer kan kalibreres i absolutt Ca2 + konsentrasjoner19.
En generell bekymring når du kjører to-fotonet Ca2 + tenkelig eksperimenter i akutt skiver er cell helse og stabilitet av bildeopptak fordi at høy laser brukes vanligvis. Ca2 + tenkelig eksperimenter er det også bekymring om forstyrrelsene og betydelig overvurdering av subcellular Ca2 + dynamics skyldes at Ca2 + indikatorer fungere som svært mobile eksogene Ca2 + buffere. Dermed valget av Ca2 + indikatoren og konsentrasjonen avhenger av hvilken neuronal, forventet amplituden av katter, og eksperimentelle spørsmålet.
Vi tilpasset metoden av to-fotonet Ca2 + imaging for undersøkelse av Ca2 + svingninger i dendrites GABAergic interneurons9,10,11,20,21 , 22. mens mesteparten av Ca2 + imaging studier ble gjort i viktigste nerveceller, hemmende interneurons presentere en rekke funksjonelle Ca2 + mekanismer som er forskjellige fra de i pyramideformet celler20 , 23 , 24. disse interneuron-spesifikke mekanismene (f.eks, Ca2 + permeable AMPA reseptorer) kan spille spesifikke roller i å regulere celle aktivitet. Mens dendrittiske Ca2 + signalering i interneurons er en fristende mål for videre etterforskning, presenterer to-Foton Ca2 + bildebehandling i dendrites av disse cellene flere utfordringer, fra tynnere diameter dendrites og mangel på spines til spesielt endogene Ca2 + bindende bæreevne. Som vår forskningsinteresser fokus på studiet av hippocampus interneurons, var følgende protokollen, mens gjelder for ulike neuronal befolkningsgrupper, tilpasset å håndtere disse utfordringene.
Denne protokollen ble utført med en kommersiell AC confocal to-fotonet mikroskop, som var utstyrt med to eksterne, ikke-descanned detektorer (NDDs), elektro-optiske modulator (EOM) og en Dodt skanning gradient kontrast (SGC), og installert på en optisk tabell. Mikroskopet ble kombinert med en Ti:Sapphire multiphoton laser modus-låst på 800 nm (> 3 W, 140 fs pulser, 80 Hz gjentakelseshastigheten). Bildebehandling systemet var utstyrt med en standard elektrofysiologi rigg, inkludert en perfusjonsmåling kammer med temperaturkontroll, en oversette plattform med to micromanipulators, en datastyrt microelectrode forsterker, en digitaliseringsenhet, en stimulering enheten, og programvare for oppkjøpet.
Metoden vist her demonstrerer hvordan kombinasjonen av to-fotonet Ca2 + bildebehandling og patch-klemme elektrofysiologi kan brukes for å studere dendrittiske Ca2 + signalering i neuronal dendrites i akutt hjernen skiver. Denne metoden tillater overvåking av både den lokale Ca2 + høyder fremkalt av elektrisk stimulering eller backpropagating AP dendrittiske segmenter og celle somatiske respons. Dette gjør det et utmerket verktøy for å studere hvordan ulike deler av dendrittiske tre…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av kanadiske institutter for helseforskning, naturvitenskap og Engineering Research council (NSERC Discovery Grant) og Savoy Foundation. OC ble støttet av en Ph.D. fellowship fra NSERC.
Animal Strain: Mouse CD1 | Charles River | 022 | |
Isoflurane | AbbVie Corporation | 0B506-099 | |
CGP 55845 hydrochloride | Abcam | ab120337 | |
Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | |
D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | |
Paraformaldehyde powder, 95% | Sigma-Aldrich | 158127 | |
Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
Potassium gluconate | Sigma-Aldrich | P1847 | |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S8875 | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
Trizma hydrochloride | Sigma-Aldrich | T3253 | |
Sodium phosphate dibasic dihydrate | Sigma-Aldrich | 71643 | |
Sodium phosphate monobasic monohydrate |
Sigma-Aldrich | S9638 | |
Biocytin | Sigma-Aldrich | B4261 | |
Alexa Fluor 594 Hydrazide | ThermoFisher Scientific | A10438 | |
SR95531 (Gabazine) | Abcam | ab120042 | |
Adenosine triphosphate (ATP)-Tris |
Sigma-Aldrich | A9062 | |
Guanosine (GTP)-Na+ |
Sigma-Aldrich | G8877 | |
Oregon Green BAPTA-1 |
ThermoFisher Scientific | O6812 | |
Phosphocreatine di(tris) salt |
Sigma-Aldrich | P1937 | |
Streptavidin-conjugated Alexa-546 |
ThermoFisher Scientific | S11225 | |
Patch Borosilicate Glass Capillaries |
World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
Theta Borosilicate Glass Capillaries |
Sutter Instrument | BT-150-10 | |
P-97 Flaming/Brown Micropipette puller |
Sutter Instrument | ||
TCS SP5 Confocal Multiphoton Microscope |
Leica Microsystems | ||
Chameleon Ultra II Ti:Sapphire multiphoton laser |
Coherent | ||
LAS AF Imaging Acquisition Software | Leica Microsystems | ||
Temperature Controller TC-324B |
Warner Instruments | ||
MultiClamp 700B Amplifier |
Molecular Devices | ||
Digidata 1440A Digitizer |
Molecular Devices | ||
Confocal Translator |
Siskiyou | ||
Micromanipulator |
Siskiyou | ||
pClamp Data Acquisition Software |
Molecular Devices | ||
A365 Constant Current Stimulus Isolator |
World Precision Instruments | ||
Vibraplane Optical Table |
Kinetic Systems |