Vi presenterar en metod som kombinerar hela-cell patch-clamp inspelningar och två-photon imaging för att spela in Ca2 + transienter i nervcellernas dendriter i akut hjärnskada skivor.
Kalcium (Ca2 +) bildbehandling är ett kraftfullt verktyg för att undersöka spatiotemporal dynamiken i intracellulära Ca2 + signaler i nervcellernas dendriter. Ca2 + fluktuationer kan uppstå genom en mängd olika membran och intracellulära mekanismer och spelar en avgörande roll i induktion av synaptisk plasticitet och reglering av dendritiska retbarhet. Därför är möjligheten att spela in olika typer av Ca2 + signaler i dendritiska grenar värdefulla för grupper studerar hur dendriter integrera information. Tillkomsten av 2-foton mikroskopi har gjort sådana studier betydligt lättare genom att lösa problem som är förbundna med imaging i levande vävnad, såsom ljusspridning och åldrad hud. Genom kombination av konventionella elektrofysiologiska tekniker med två-photon Ca2 + imaging, är det dessutom möjligt att undersöka lokala Ca2 + fluktuationer i nervcellernas dendriter parallellt med inspelningar av synaptisk aktivitet i Soma. Här beskrivs hur man använder denna metod för att studera dynamiken i lokala Ca2 + transienter (katter) i dendriter av GABAergic hämmande interneuroner. Metoden kan tillämpas även på studera dendritiska Ca2 + signalering i olika neuronala typer i akut hjärnskada skivor.
Bidraget av en neuron till nätverksaktivitet bestäms till stor del av den dynamiska karaktären av de synaptic ingångarna som det mottar. Traditionellt, åberopade den dominerande metoden för att karaktärisera synaptisk aktivitet i nervceller somatiska hela-cell patch-clamp inspelningar av postsynaptiska strömmar frammanade genom elektrisk stimulering av axoner av passagen. Enda verksamhet som proximalt belägna synapserna rapporteras dock sanningsenligt i detta fall1. Dessutom, för att bedöma de synaps-specifika mekanismerna, har inspelningar från par av nervceller och dendriter på en viss plats använts att rikta synapserna sevärdheter och mekanismerna för dendritiska integration, respektive. Ett stort genombrott i fältet i synaptic fysiologi uppnåddes genom ett äktenskap mellan optisk och elektrofysiologiska tekniker. Två-foton excitation laserscanning mikroskopi (2PLSM) i kombination med Ca2 + imaging och optogenetic verktyg kan avslöja enorma Detaljer för den dynamiska organisationen av synaptisk aktivitet på specifika neuronala anslutningar i hjärnan skivor i vitro och in-vivo.
Flera viktiga fördelar gjorde 2PLSM sticker ut från den konventionella, one-photon excitation mikroskopi2: (1) på grund av en ickelinjär natur av två-photon excitation, fluorescensen skapas endast i focal volymen och alla avgivna fotonerna representerar användbara signaler (inget behov för pinhole); (2) längre våglängder, används i 2PLSM, penetrera scattering vävnaden mer effektivt; spridda fotoner är dessutom alltför utspädd att producera två-photon excitation och bakgrunden fluorescens; (3) photodamage och fototoxicitet är också begränsad till fokalplanet. Trots den höga kostnaden av 2-foton system jämfört med konventionella confocal Mikroskop förblir 2PLSM därför en metod för val av högupplösta utredning av neuronala struktur och funktion i tjock levande vävnad.
Den första tillämpningen av 2PLSM i scattering vävnad var att bild struktur och funktion av Dendritutskotten3. 2PLSM i kombination med Ca2 + imaging har avslöjat att spines funktion som isolerade biokemiska fack. Sedan i många neuronala typer finns det en one-to-one överensstämmelse mellan ryggar och enskilda synapserna4, blev två-photon Ca2 + imaging snart ett användbart verktyg för rapportering av enskilda synapserna i intakt vävnad5, 6,7,8. 2PLSM-baserade Ca2 + imaging har dessutom framgångsrikt använts för att övervaka aktiviteten hos enda kalciumkanaler och ickelinjära samspelet mellan de inneboende och synaptic conductances, samt att bedöma den statliga – och aktivitet-beroende reglering av Ca2 + signalering i nervcellernas dendriter5,6,7,8,9,10,11.
Kalcium är en allestädes närvarande intracellulära andra budbärare, och dess subcellulär spatiotemporal organisation bestämmer riktningen av fysiologiska reaktioner, från förändringar i synaptisk styrka till regleringen av ion kanaler, dendrite och ryggraden tillväxt, som samt celldöd och överlevnad. Dendritiska Ca2 + höjder uppstå via aktivering av flera vägar. Handlingspänningar (APs), backpropagating till dendriter, öppnar spänningskänsliga kalcium kanaler12 och producera relativt globala Ca2 + transienter (katter) i dendriter och ryggar13. Synaptisk transmission är associerad med aktivering av postsynaptiska Ca2 +-permeable receptorer (NMDA, Ca2 +-genomsläpplig AMPA och kainate), utlöser synaptic katter6,14,15. Slutligen kan supralinear Ca2 + händelser genereras i dendriter enligt vissa villkor11,12,13,16.
Två-foton Ca2 + imaging i kombination med patch-clamp elektrofysiologiska inspelningar sysselsätter syntetiska Ca2 +-känsliga fluorescerande indikatorer som levereras vanligtvis via lapp elektroden under hela-cell recordings . En schablonmässig metod för kvantifiering av Ca2 + dynamics är baserad på den dubbla indikator metod17,18. Den använder två fluorophores med väl separerade utsläpp spectra (t.ex., en kombination av en röd Ca2 +-okänsliga färgämne med grön Ca2 + indikatorer, såsom Oregon grön BAPTA-1 eller Fluo-4) och har flera fördelar jämfört med den enskild indikator metod. Första, en Ca2 +-okänsliga dye används för att leta upp små strukturer av intresse (dendritiska grenar och taggar) där Ca2 + avbildning kommer att utföras. Det andra beräknas förhållandet mellan förändringen i grön och röd fluorescens (ΔG/R) som ett mått på [Ca2 +], vilket är i stort sett okänsliga för förändringar i baslinjen fluorescens på grund av fluktuationer i [Ca2 +]017 , 18. Dessutom fluorescens förändringar kan kalibreras när det gäller absoluta Ca2 + koncentrationer19.
En allmän oro när kör två-photon Ca2 + imaging experiment i akut skivor är cell hälsa och stabilitet av förvärvet bild på grund av den höga lasereffekt som vanligtvis används. Dessutom finns Ca2 + imaging experiment, oro om störning och betydande överskattning av subcellulär Ca2 + dynamics på grund av att Ca2 + indikatorer fungera som lättrörliga exogena Ca2 + buffertar. Alltså, valet av Ca2 + indikatorn och dess koncentration beror på typ av neuronala, förväntade amplituden av katter och på experimentell frågan.
Vi anpassat metoden för två-photon Ca2 + imaging för utredning av Ca2 + fluktuationer i dendriter GABAergic interneuroner9,10,11,20,21 , 22. medan huvuddelen av tidig Ca2 + imaging studier var gjort i huvudsakliga nervceller, hämmande interneuroner Visa upp en stor mängd funktionella Ca2 + mekanismer som skiljer sig från dem i pyramidala celler20 , 23 , 24. dessa interneuron-specifika mekanismer (t.ex., Ca2 + genomsläpplig AMPA-receptorer) kan spela specifika roller i reglera cellernas aktivitet. Dendritiska Ca2 + signalering i interneuronen är ett lockande mål för vidare utredning, presenterar två-photon Ca2 + imaging i dendriter av dessa celler ytterligare utmaningar, från en tunnare diameter av dendriter och avsaknaden av taggar till en särskilt hög endogen Ca2 + bindande kapacitet. Som vårt forskningsintresse fokuserar på studier av hippocampus interneuroner, anpassades följande protokoll, medan gäller för olika neuronala populationer, till ta itu med dessa utmaningar.
Detta protokoll avrättades med en kommersiell confocal två-foton Mikroskop, som var utrustad med två externa, icke-descanned detektorer (NPF), Elektro-optiska modulator (EOM) och en Dodt skanning gradient kontrast (SGC), och installeras på en optisk tabell. Mikroskopet var förenat med en multiphoton TI: safirlaser läge-låst vid 800 nm (> 3 W, 140 fs pulser, 80 Hz repetition rate). Bildsystem var utrustad med en standard elektrofysiologi rigg, inklusive en perfusion kammare med en översättning plattform med två micromanipulators, en digitizer, en datorstyrd mikroelektrod förstärkare, temperaturkontroll, en stimulering enheten, och data förvärv programvara.
Den metod som visas här visar hur kombinationen av två-photon Ca2 + imaging och patch-clamp elektrofysiologi kan användas för att studera dendritiska Ca2 + signalering i nervcellernas dendriter i akut hjärnskada skivor. Denna metod tillåter övervakning av både den lokala Ca2 + förhöjda frammanade av elektrisk stimulering eller backpropagating AP i dendritiska segment och cellens somatiska svar. Detta gör det ett utmärkt verktyg att studera hur olika delar av trädet dendritisk…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds av kanadensiska institut för hälsa forskning, naturvetenskaplig och teknisk forskning rådet (NSERC Discovery Grant) och stiftelsen Savoy. OC stöddes av en Ph.D. stipendium från NSERC.
Animal Strain: Mouse CD1 | Charles River | 022 | |
Isoflurane | AbbVie Corporation | 0B506-099 | |
CGP 55845 hydrochloride | Abcam | ab120337 | |
Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | |
D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | |
Paraformaldehyde powder, 95% | Sigma-Aldrich | 158127 | |
Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
Potassium gluconate | Sigma-Aldrich | P1847 | |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S8875 | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
Trizma hydrochloride | Sigma-Aldrich | T3253 | |
Sodium phosphate dibasic dihydrate | Sigma-Aldrich | 71643 | |
Sodium phosphate monobasic monohydrate |
Sigma-Aldrich | S9638 | |
Biocytin | Sigma-Aldrich | B4261 | |
Alexa Fluor 594 Hydrazide | ThermoFisher Scientific | A10438 | |
SR95531 (Gabazine) | Abcam | ab120042 | |
Adenosine triphosphate (ATP)-Tris |
Sigma-Aldrich | A9062 | |
Guanosine (GTP)-Na+ |
Sigma-Aldrich | G8877 | |
Oregon Green BAPTA-1 |
ThermoFisher Scientific | O6812 | |
Phosphocreatine di(tris) salt |
Sigma-Aldrich | P1937 | |
Streptavidin-conjugated Alexa-546 |
ThermoFisher Scientific | S11225 | |
Patch Borosilicate Glass Capillaries |
World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
Theta Borosilicate Glass Capillaries |
Sutter Instrument | BT-150-10 | |
P-97 Flaming/Brown Micropipette puller |
Sutter Instrument | ||
TCS SP5 Confocal Multiphoton Microscope |
Leica Microsystems | ||
Chameleon Ultra II Ti:Sapphire multiphoton laser |
Coherent | ||
LAS AF Imaging Acquisition Software | Leica Microsystems | ||
Temperature Controller TC-324B |
Warner Instruments | ||
MultiClamp 700B Amplifier |
Molecular Devices | ||
Digidata 1440A Digitizer |
Molecular Devices | ||
Confocal Translator |
Siskiyou | ||
Micromanipulator |
Siskiyou | ||
pClamp Data Acquisition Software |
Molecular Devices | ||
A365 Constant Current Stimulus Isolator |
World Precision Instruments | ||
Vibraplane Optical Table |
Kinetic Systems |