Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

استخدام Fluorescence في الموقع التهجين (الأسماك) لرصد حالة التماسك الذراع في بروميتافاسي والطوريه وأنا بويضات المورفولوجية

Published: December 6, 2017 doi: 10.3791/56802
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biological Sciences, Dartmouth College

Summary

هذه المخطوطة تعرض طريقة مفصلة لتوليد X-تحقيقات ذراع الكروموسوم والمنفذ fluorescence في الموقع التهجين (الأسماك) فحص حالة الأخت التماسك تشروماتيد في بروميتافاسي والطوريه اعتقلت المورفولوجية بويضات. هذا البروتوكول مناسبة لتحديد ما إذا كان الذراع هو التماسك سليمة أو تعطل في الأنماط الجينية المختلفة.

Abstract

في البشر، وأخطاء العزل الصبغي في بويضات مسؤولة عن معظم حالات الإجهاض والتشوهات الخلقية. وعلاوة على ذلك، كسن المرأة، يعرف خطر الحمل جنين أنيوبلويد تزداد بشكل مفاجىء وهذه الظاهرة تأثير عمر الأمهات. شرط واحد للعزل الصبغي دقيقة أثناء الشعب هو هو الحفاظ على أخت التماسك تشروماتيد خلال فترة ممتدة من الطور الأول تجربة بويضات. وتوحي الأدلة الخلوية في كل من البشر والكائنات نموذج أن التماسك هو تتدهور خلال عملية الشيخوخة. وبالإضافة إلى ذلك، أخطاء العزل في بويضات بشرية الأكثر انتشارا خلال الانقسام الاختزالي الأول، اتساقا مع فقدان التماسك الذراع سابق لأوانه. استخدام نموذج الكائنات أمر بالغ الأهمية لكشف الآليات التي تكمن وراء فقدان التماسك تعتمد على العمر. Melanogaster المورفولوجية يوفر العديد من المزايا لدراسة تنظيم هو التماسك في بويضات. ومع ذلك، حتى وقت قريب، فقط الاختبارات الوراثية متاحة للاعتداء لفقدان التماسك الذراع في بويضات الأنماط الجينية المختلفة أو في إطار ظروف تجريبية مختلفة. هنا، بروتوكول مفصل شرط للأسفار في الموقع باستخدام التهجين (الأسماك) لمباشرة تصور العيوب في الذراع التماسك في بروميتافاسي والطوريه اعتقلت بويضات المورفولوجية . توليد تحقيق أسماك التي هيبريديزيس على ذراع الكروموسوم X القاصي وجمع [كنفوكل] ض المكدسات، باحث يمكن تصور عدد إشارات الأسماك الفردية في الأبعاد الثلاثة وتحديد ما إذا كانت الشقيقة الأسلحة تشروماتيد فصل. الإجراء المبين يجعل من الممكن تحديد مقدار الذراع التماسك العيوب في مئات بويضات المورفولوجية . على هذا النحو، يوفر هذا الأسلوب أداة هامة للتحقيق في الآليات التي تسهم في الحفاظ على التماسك، فضلا عن العوامل التي تؤدي إلى زوال خلال عملية الشيخوخة.

Introduction

الفصل السليم بين الكروموسومات أثناء الانقسام والانقسام الاختزالي يتطلب أن الأخت التماسك chromatid تكون المنشأة، الحفاظ على، وصدر في أزياء منسقة1،2. التماسك أنشئت خلال المرحلة S وهو توسط كوسين المعقدة، التي تشكل الروابط المادية التي تحمل الأخت شقاً الصبغي معا. في الانقسام الاختزالي، التماسك القاصي إلى روس يعمل أيضا لعقد homologs المؤتلف معا وهذه الرابطة المادية تساعد على ضمان التوجه السليم لموعدا على الطورية وأنا المغزل (الشكل 1)3،4، 5. إطلاق سراح الذراع التماسك في طور الصعود أنا يسمح هومولوجس فصل لعكس محور دوران القطبين. بيد إذا التماسك الذراع فقدت قبل الأوان، homologs المؤتلف سوف تفقد الاتصال الجسدي بهم وفصل عشوائياً، الذي يمكن أن ينتج الأمشاج أنيوبلويد (الشكل 1).

في بويضات بشرية، أخطاء في العزل كروموسوم هي السبب الرئيسي لحالات الإجهاض والعيوب الخلقية، مثل متلازمة داون6، وحدوث ما يزيد أضعافاً مضاعفة مع الأمهات من سن7. تشروماتيد أخت التماسك في بويضات الأجنة وممارسو هو اكتمال قبل الولادة. بويضات ثم إلقاء القبض في منتصف الطور الأول أنا حتى التبويض وأثناء عملية الاعتقال هذه، ورابطة homologs المؤتلف الجسدي المستمر يعتمد على أخت chromatid التماسك. ولذلك، يتطلب فصل دقيقة أثناء الانقسام الاختزالي ونتائج الحمل العادي أن التماسك تظل على حالها لمدة تصل إلى خمسة عقود.

قد اقترح سابقا لأوانه فقدان التماسك أثناء التوقيف هو المطول من بويضات بشرية للمساهمة في تأثير عمر الأمهات وأسطر متعددة من أدلة تدعم هذه الفرضية8،9. ومع ذلك، نظراً للتحديات من الدراسة هو التماسك في بويضات بشرية، الكثير من فهمنا لهذه الظاهرة يعتمد على استخدام نموذج الكائنات الحية5،10،،من1112، 13،،من1415.

بويضات melanogaster المورفولوجية توفر مزايا عديدة لدراسة الفصل هو تماسك وصبغي. يسمح فحص الوراثي بسيطة واحدة لاسترداد ذرية من الأمشاج أنيوبلويد وقياس الدقة العاشر-العزل الصبغي في16،1711،واسعة نطاق. وعلاوة على ذلك، واحد قد يحدد أيضا ما إذا كانت أخطاء العزل الصبغي تنشأ بسبب homologs المؤتلف ميسيجريجاتي خلال الانقسام الاختزالي الأول، النمط الظاهري الذي يتسق مع فقدان سابق لأوانه للذراع التماسك11،18، 19-توجيه الملاحظة للدولة هو التلاحم في بويضات المورفولوجية من الممكن أيضا استخدام الفلورية في الموقع التهجين (الأسماك). استخدمت رغم النوكليوتيد الفلورية التي هجن إلى تسلسل الساتلية المتكررة لأكثر من عشر سنوات لرصد التماسك بيريسينتروميريك في النضج المورفولوجية بويضات4،20، تحليل للذراع وكان التلاحم تحديا أكبر بكثير. تصور حالة التماسك الذراع يتطلب تسلسل تحقيق يمتد على منطقة كبيرة من نسخة واحدة وهو مشرق بما فيه الكفاية ليؤدي إلى إشارات مرئية للأخت الفردية شقاً الصبغي عند التماسك الذراع غائب. وبالإضافة إلى ذلك، يجب تيسير شروط التثبيت البويضات وحجم المعينة المسمى اختراق21 إلى البويضيه المورفولوجية ناضجة كبيرة (200 ميكرومتر واسعة من 500 ميكرومتر طويلة). في الآونة الأخيرة، كان ذراع مسبار بنجاح المستخدمة لتصور المورفولوجية البويضيه شقاً الصبغي خلال طور الصعود لي، ولكن المؤلفين ذكر أنهم لا يمكن اكتشاف إشارة في بروميتافاسي أو الطورية اعتقلت بويضات22. هنا نقدم بروتوكول مفصل للجيل العاشر-ذراع الكروموسوم يسبر الأسماك وشروط إعداد البويضات التي سمحت لنا بالاعتداء للخسارة المبكرة للأخت التماسك تشروماتيد في بروميتافاسي والطوريه وأنا بويضات. هذه التقنيات، والتي مكنتنا من التعرف على منتجات الجينات المطلوبة للحفاظ على التماسك هو، سيتم السماح للآخرين بالاعتداء على شقيقة التماسك chromatid العيوب في بويضات المورفولوجية ناضجة من الأنماط الجينية المختلفة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-الأعمال التحضيرية

  1. إعداد حلول للأسفار في الموقع التهجين (الأسماك). إعداد جميع الحلول باستخدام الماء عالي النقاوة.
    1. إعداد 5 × المخزن المؤقت "روب تعديل": خلات البوتاسيوم 275 مم، خلات الصوديوم 200 ملم، السكروز 500 مم، الجلوكوز 50 مم، وكلوريد المغنيسيوم 6 مم، وكلوريد الكالسيوم 5 مم، حموضة حبيس 500 ملم = 7.4. تحقيق درجة الحموضة 7.4 استخدام 10 N هيدروكسيد الصوديوم. فلتر تعقيم وتخزين في-20 درجة مئوية. ذوبان الجليد وتمييع إلى 1 x حسب الحاجة وتخزين 1 x مختبرين في-20 درجة مئوية.
    2. إعداد 10 × الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) استخدام 1.3 م كلوريد الصوديوم، 70 مم نا2هبو4، 30 مم NaH2ص4. تحقيق درجة الحموضة 7.0 باستخدام 10 N هيدروكسيد الصوديوم. تعقيم بالتعقيم التعقيم أو تصفية.
  2. إعداد كوفيرسليبس بولي-L-يسين يوم واحد قبل اللازمة.
    1. "الماصة؛" الإيثانول 70% يحتوي على 1% حمض الهيدروكلوريك على سطح ساترة 18 ملم × 18 ملم #1.5 واحتضان 5 دقيقة استخدام الشفط بالتخلية لإزالة السائل. كرر مع الماء المعقم عالي النقاوة. وتغطي سطح ساترة مع 0.1 مغ/مل بولي-L-يسين واحتضان لمدة 10 دقائق.
    2. نضح لإزالة السائل والهواء الجاف لأدنى 10 مخزن كوفيرسليبس بولي-L-يسين الجانب الأعلى في وعاء من بلاستيك مع غطاء ضيقة لتجنب الغبار.
  3. إعداد باستور سحبت الماصات لإزالة السائل الحلول دون إزالة بويضات. فوق لهب موقد بنسن، الحرارة منتصف الزجاج طويلة ماصة باستور حين سحب بلطف في كل نهاية حتى يذوب الزجاج وتسحب بعيداً.

2-جيل من ذراع المسبار للأسماك

ملاحظة: جميع أجهزة الطرد المركزي خطوات تتم في ~ 16,000-21,000 س ز (السرعة القصوى في معظم الجدول الأعلى ميكروسينتريفوجيس). يدور الطرد المركزي موجزة تبين الغزل لدوامة س. 5-15 تشير إلى فورتيكسينج ~ 15 s في أقصى سرعة إلا إذا ذكر خلاف ذلك.

ملاحظة: يمكن الحصول على BACs لتحقيقات الذراع من "الموارد باك باك". كروموسوم X اثنين الذراع يوتشروماتيك المسابير استخدمت بنجاح باستخدام هذا الأسلوب. واحد ذراع المسبار كان يتألف من ستة BAC استنساخ المقابلة الخلوية إلى العصابات 7B 6E (BACR17C09، BACR06J12، BACR35J16، BACR20K01، BACR35A18، BACR26L11). ذراع المسبار أخرى تتألف من ست باك استنساخ المقابلة لعصابات الخلوية 2 واو-3 ج (BACR13K19، BACR21G11، BACR09H13، BACR30B01، BACR34O03، BACR03D13). BACs على كروموسوم المورفولوجية الأخرى قد تصفحها المناطق في: http://www.fruitfly.org/sequence/X1-11-assembly.html. اثنين بيريسينتريك المسابير التي تعترف بتكرار فضائية بي بي 359 من كروموسوم إكس قد استخدمت بنجاح باستخدام هذا الأسلوب. تحقيق النوكليوتيدات 22 وقد استخدمت على نطاق واسع، ويعمل بشكل جيد (5 '-Cy3-أججاتكجتاجكاكتكجتات)19،23. تحقيق النوكليوتيدات 28 تم اختبارها مؤخرا وعملت أيضا بشكل جيد (5 '-Cy3-ججاتكجتاجكاكتجتاتاجكتجك)24. [هبلك] تنقية النوكليوتيد 5 ' المسمى مع فلوروفوري محددة صدرت من مصدر تجاري (مثلاً، تقنيات الحمض النووي المتكاملة).

  1. الإعدادية BAC استنساخ الحمض النووي بعد عدة تعليمات كما هو محدد في الجدول للمواد. ريسوسبيند بيليه الحمض النووي التي تم الحصول عليها من 100 مل ثقافة في 200 TE ميليلتر؛ تركيز الحمض النووي النهائي يجب أن تتراوح بين 5-40 نانوغرام/ميليلتر اعتماداً على استنساخ باك.
  2. أداء تضخيم الحمض النووي لكل باك باستخدام مجموعة التضخيم، كما هو محدد في الجدول للمواد، وبروتوكول التالية. عملية "باك الحمض النووي" لاستنساخ كل على حدة. استخدام المخازن المؤقتة المتوفرة مع مجموعة أدوات في الخطوات 2.2.1 من خلال 2.2.3 والأنزيمات.
    1. تجزئة عشوائي للحمض النووي BAC: لكل باك، استخدام الشركة المصرية للاتصالات لإعداد 10 ميليلتر من حل الحمض النووي 1 نانوغرام/ميليلتر في أنبوب بكر 200 ميليلتر. إضافة ميليلتر 1 X 10 تجزئة المخزن المؤقت. ضع الأنبوبة في جهاز PCR عند 95 درجة مئوية للضبط 4 دقيقة بارد فورا العينة في الماء المثلج والطرد المركزي بإيجاز. الحضانة وقت حساس وأي انحراف قد يغير النتائج.
    2. إعداد المكتبة
      ملاحظة: يستخدم هذا الأسلوب كبسولة تفجير عشوائي لإنشاء مكتبة شظايا أمبليفيابل.
      1. للأنبوبة التي تحتوي على الحمض النووي إضافة ما يلي: 2 ميليلتر من 1 × مكتبة إعداد المخزن المؤقت، 1 ميليلتر من "مكتبة تثبيت الحل". مزيج دقيق من فورتيكسينج والطرد المركزي لفترة وجيزة، ووضع الأنبوب في جهاز PCR عند 95 درجة مئوية للحد الأدنى 2 بارد فورا العينة في الماء المثلج والطرد المركزي بإيجاز.
      2. إضافة 1 ميليلتر من "إنزيم إعداد مكتبة" بأنبوب بكر ومزيج وأجهزة الطرد المركزي بإيجاز. بكر مكان الأنبوبة في جهاز PCR واحتضان كما يلي: 16 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة، 24 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة, 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة، 75 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، ثم عقد في 4 درجات مئوية.
      3. إزالة عينات من الجهاز بكر والطرد المركزي بإيجاز. وقد تضخم فورا عينات أو المخزنة في-20 درجة مئوية لمدة تصل إلى ثلاثة أيام.
    3. تضخيم مكتبة BAC الحمض النووي
      1. إضافة الكواشف التالية إلى رد فعل عشوائي جزء 15 ميليلتر الكامل: ميليلتر 7.5 10 x ميكس ماجستير التضخيم، ميليلتر 47.5 Nuclease المياه مجاناً، 5 ميليلتر "وغ دنا بوليميريز". مزيج دقيق من فورتيكسينج والطرد المركزي بإيجاز.
      2. بكر مكان الأنبوبة في جهاز PCR واحتضان كما يلي: الأولى تمسخ 95 درجة مئوية لمدة دقيقة 3، 14 دورات تمسخ في 94 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، تليها الصلب/ملحق في 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، ثم عقد في 4 درجات مئوية.
      3. بعد الانتهاء من ركوب الدراجات، الاعتداء تركيز الحمض النووي. يجب أن يكون تركيز الحمض النووي على الأقل 800 نانوغرام/الحفاظ على عينات ميليلتر. في 4 درجات مئوية أو مخزن في-20 درجة مئوية حتى جاهزة الهضم. بشكل اختياري، تقييم حجم جزء الحمض النووي عن طريق تشغيل 400 نانوغرام من الحمض النووي على 2% [اغروس] هلام. الأجزاء يجب أن تتراوح من 200 شركة بريتيش بتروليوم إلى 3 كيلو بايت (الشكل 2).
  3. هضم إنزيم التقييد لتضخيم الحمض النووي
    1. مكان 20 ميكروغرام لتضخيم الحمض النووي من المقطع السابق في أنبوب [ميكروفوج] 1.5 مل. إضافة 20 وحدة العالول، هايلل، مسيل، مسبل، والشركة، والوحدات 25 بفوكل، 0.5 ميليلتر 100 x جيش صرب البوسنة، ميليلتر 5 10 × تقييد إنزيم الهضم المخزن المؤقت، وضبط حجم الصوت إلى 50 ميليلتر بإضافة المقدار المناسب من النقاوة H2o.
    2. احتضان الخلاصة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في حاضنة لمنع التكثيف على الغطاء. الإيثانول يعجل بالحمض النووي هضمها. إضافة إلى الخلاصة: 1 ميليلتر الجليكوجين، المجلد 1/10 م 3 خلات الصوديوم، 2.5 حجم الصف الجزيئية 100 ٪ الإيثانول. احتضان في-80 درجة مئوية ح 1 أو بين عشية وضحاها.
    3. أجهزة الطرد المركزي لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية. بيليه "يغسل الحمض النووي" مع حجم 1 غرفة الإيثانول 70% temp وتدور لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. إزالة المادة طافية والسماح للحمض النووي بيليه الجوية الجافة أو الجافة بلطف مع تيار مستمر من الهواء.
    4. ريسوسبيند بيليه الحمض النووي في 36 ميليلتر العقيمة عالي النقاوة ح2س واستخدم 1 ميليلتر من الحمض النووي للاعتداء تركيز الحمض النووي، الذي ينبغي أن يكون حوالي 285 نانوغرام/ميليلتر. تخزين الحمض النووي في-20 درجة مئوية.
    5. تقييم اختيارياً الحمض النووي جزء حجم تشغيل 400 نانوغرام من الحمض النووي على 2% [اغروس] هلام. معظم الشظايا يجب أن تتراوح بين 100-200 شركة بريتيش بتروليوم، مع إشارة خفوتا ما يصل إلى 500 bp (الشكل 2).
  4. 3 ' رد فعل المخلفات
    1. تؤذي الحمض النووي هضمها عند 100 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة في كتلة حرارة. البرد فورا في الماء المثلج. ميليلتر 35 من الحمض النووي، قم بإضافة ما يلي: 50 مم 400 ميليلتر الصوديوم كاكوديلاتي، 1 ميليلتر 10 مم DTT ودوامه جيدا. إضافة 4 ميليلتر 25 مم كوكل2، ميليلتر 2.5 مم 2 5-(3-aminoallyl)-dUTP من آريس وسم كيت على النحو المحدد في جدول المواد، 5 ميليلتر 1 مم دتتب، ميليلتر 18 5 x TdT المخزن المؤقت، وترانسفيراز ديوكسينوكليوتيديل المحطة الطرفية 1 ميليلتر (TdT) 400 ش/ميليلتر. ودوامه، وأجهزة الطرد المركزي بإيجاز.
      تنبيه: كوكل2 السمية، وارتداء الحماية المناسبة.
    2. احتضانها ح 2 في 37 درجة مئوية في حاضنة لمنع التكثيف. أضف 1 ميليلتر من 250 مم يدتا التوقف عن الرد ودوامه بإيجاز مزيج. الإيثانول يعجل الحمض النووي الذيل كما هو موضح أعلاه (الخطوات 2.3.2-2.3.4). ريسوسبيند بيليه الحمض النووي المجففة في 10 ميليلتر العقيمة عالي النقاوة ح2"مخزن سين" الحمض النووي في-20 درجة مئوية حتى على استعداد للاستمرار.
  5. إجراء اقتران صبغة الفلورسنت استخدام الحمض النووي عدة وضع العلامات كما هو محدد في "الجدول المواد".
    ملاحظة: بمجرد إضافة صبغة الاحتفاظ بعينات في الظلام.
    1. تؤذي الحمض النووي الذيل عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق في كتلة حرارة. فورا بارد الحمض النووي في الماء المثلج وأجهزة الطرد المركزي بإيجاز. إعداد المخزن المؤقت وضع العلامات وفقا لتعليمات كيت وإضافة 6 ميليلتر لكل عينة من الحمض النووي. ريسوسبيند كل أنبوب صبغة في 4 ميليلتر من [دمس] من الطقم. دوامة وأجهزة الطرد المركزي بإيجاز.
    2. استخدام أنبوب واحد من الصبغة لكل رد فعل وضع العلامات. إضافة حل صبغ للحمض النووي، ودوامه، وأجهزة الطرد المركزي بإيجاز. تبني رد فعل وضع العلامات في درجة حرارة الغرفة ح 2 في الظلام. إضافة 3 ميليلتر من هيدروكسيلاميني م 3 التوقف عن رد فعل تتبعها 77 ميليلتر من خالية نوكلاس ح2س من الطقم. دوامة وأجهزة الطرد المركزي بإيجاز.
  6. إزالة الصبغة غير مترافق باستخدام مجموعة تنقية بكر كما هو محدد في الجدول للمواد. اتبع إرشادات الشركة المصنعة. الوت الحمض النووي من العمود مرتين باستخدام ميليلتر 40 شطف المخزن المؤقت في كل مرة.
  7. الإيثانول يعجل بالحمض النووي المسمى كما هو موضح سابقا (الخطوات 2.3.2-2.3.4). ريسوسبيند بيليه الحمض النووي المجففة في 10 ميليلتر شطف العازلة.
  8. إعداد الخليط مسبار
    1. للحمض النووي، المسمى وتحديد تركيز الصبغة fluorochrome في pmol/ميليلتر. أن تركيز fluorophore قد تتراوح بين 30-100 pmol/ميليلتر، اعتماداً البكالوريا. تركيز الحمض النووي قد تتراوح بين 300-800 نانوغرام/ميليلتر.
      ملاحظة: الإعداد ميكرواري يعمل جيدا على ميكروفولومي جهاز المطياف الضوئي، مثل تلك المحددة في الجدول للمواد. في إطار ميكرواري، حدد الحمض النووي-50، وحدد في فلوروتشرومي.
    2. إنشاء مزيج رئيسي عن طريق الجمع بين كميات اكويمولار (بمول فلور) من كل من المسابر باك. دوامة 30 ثانية قبل الجمع. لتجنب دورات تجميد/ذوبان الجليد، وتحضير مختبرين لمزيج الرئيسي، وتطبيق الفيلم البارافين للأنابيب لمنع التبخر، وتخزينها في الظلام في-20 درجة مئوية.
      ملاحظة: mastermix التي تحتوي على 250 بمول كل من باك الفردية 6 تحقيقات في إجمالي حجم 30-50 ميليلتر يعمل جيدا. قاسمة تتضمن 25 بمول (فلور) لكل باك سيكون كافياً لردود فعل التهجين ميليلتر 40 اثنين، مع تركيز تحقيق نهائي ل 0.31 pmol فلور/ميليلتر لكل باك.

3-تشريح والتثبيت من بويضات

  1. جمع 30 من الإناث العذراء للنمط الوراثي المناسب. لإثراء لأواخر المرحلة بويضات، عقد الإناث دون الذكور في قنينة مع الغذاء يطير والخميرة الجافة لمدة 3-5 أيام قبل تشريح25. قبل التشريح، اليوم نقل الإناث دون الغاز إلى قنينة جديدة مع الخميرة.
  2. إجراء التشريح.
    ملاحظة: انظر الشكل 3 للأدوات اللازمة. تتم إزالة الحلول باستخدام ماصة باستور سحبت إلا إذا ذكر خلاف ذلك. عند نقل المبيض دائماً استخدام تلميح ماصة مطلية بحل جيش صرب البوسنة "10%".
    1. في طبق تشريح ضحلة التي تحتوي على المخزن المؤقت "تعديل روب"، استخدام الملقط لإزالة المبيض من أنثى واحدة. استخدام الملقط أو إبرة تنغستن تباعد بلطف كل المبيض، مما يتيح الحل للاتصال أوفاريوليس الداخلية. نقل زوج المبايض مفلطح إلى 1.5 مل [ميكروفوج] أنبوب يحتوي على المخزن المؤقت 1 مل "روب تعديل".
    2. كرر الخطوة 3.2.1 تتراكم المبيض من الإناث 20-25 في 1.5 مل [ميكروفوج] أنابيب. الانتهاء من تشريح الإناث 20-25 في 10 دقيقة.
  3. إجراء التثبيت كما يلي.
    1. مع سحبت ماصة باستور، إزالة السائل في [ميكروفوج] أنابيب واستخدام P1000 لإضافة 500 ميليلتر من 37 درجة مئوية حل بسرعة المبايض وثم إضافة 500 ميليلتر من درجة حرارة الغرفة هيبتان فورا إلى المبايض.
    2. إزالة اهتزاز [ميكروفوج] أنابيب لخلط ووضع على نوتاتور لدقيقة 3 [ميكروفوج] أنابيب من نوتاتور ومكان في حامل أنبوب لمدة 1 دقيقة للسماح بويضات لتترسب في القاع. وقت التثبيت الإجمالي 4 دقيقة.
      تنبيه: حل وهيبتان السامة، وارتداء الحماية المناسبة.
    3. إزالة الحل الإصلاح وشطف المبيض 3 مرات في 500 ميليلتر من برنامج تلفزيوني يحتوي على جيش صرب البوسنة 0.5% و 0.1% Triton X-100 (ببسبتكس)
  4. كرر للأنماط الجينية المتبقية.

4-إزالة تشوريونس والأغشية فيتيلين

ملاحظة: انظر الشكل 3 للأدوات اللازمة.

  1. منفصلة في أواخر المرحلة بويضات
    1. أضف 1 مل ببسبتكس إلى طبق تشريح ضحلة. استخدم P200 مع تلميح المغلفة جيش صرب البوسنة لتحويل المبايض الثابتة (في ~ 150 ميليلتر) إلى الطبق الضحلة. "الماصة؛" المبايض صعودا وهبوطاً بطرف ماصة المغلفة جيش صرب البوسنة طرد بويضات ناضجة من بويضات أقل نضجاً.
    2. عندما يتم فصل أواخر المرحلة بويضات بما فيه الكفاية، نقل جميع الأنسجة إلى أنبوب [ميكروفوج] 500 ميليلتر. إزالة السائل الزائد مع سحبت ماصة باستور، مما أسفر عن 150-200 ميليلتر في الأنبوب. تكرار المقطع 4.1 للأنماط الجينية المتبقية.
  2. إعداد للمتداول
    1. قبل الرطب طبق عميق جيدا مع 200 ميليلتر ببسبتكس-الغطاء وتوضع جانبا. الحصول على 3 شرائح الزجاج متجمد وتعيين الشريحة #3 جانبا. فرك بلطف المناطق متجمد الزجاج للشرائح #1 و #2 معا. شطف لهم في المياه إزالة أي شظايا الزجاج وجاف مع مسح المتاح.
    2. معطف المناطق متجمد من الشرائح #1 و #2 مع ببسبتكس بإضافة 50 ميليلتر من ببسبتكس إلى شريحة واحدة وفرك هذه المنطقة مع الشريحة الأخرى. إزالة السائل مع مسح المتاح.
    3. ضع الشرائح تحت مجهر تشريح في التكوين هو موضح في الشكل 4A. الحفاظ على دعم المناطق متجمد من الشرائح #1 و #2 في الاتصال، مع الشريحة #3 الشريحة #2.
  3. بويضات لفة؛ التأكد من أن الاتجاه من المتداول دائماً في خط مستقيم وحركة دائرية ابدأ.
    1. ماصة برويت P200 نصيحة في ببسبتكس وتفريق بويضات في [ميكروفوج] أنابيب من بيبيتينج صعودا وهبوطاً. نقل 50 ميليلتر من بويضات تحتوي على سائل إلى وسط الجزء متجمد الزجاج من الشريحة #1. رفع الشريحة #2 للقيام بذلك.
    2. انخفاض ببطء الشريحة #2 حتى يخلق التوتر السطحي للسائل ختم بين المنطقتين متجمد الزجاج. ينبغي أن يكون هناك سائل ما يكفي لتغطية منطقة متجمد ولكن لا شيء ينبغي أن تتسرب خارج. إذا كان هو فيضان السائل، استخدام ماصة باستور سحبت لإزالة السائل الزائد.
    3. اضغط أسفل الشريحة (#1) في مكان يد واحدة واستخدام اليد الأخرى لتحريك الشريحة الأعلى (#2) ذهابا وإيابا في اتجاه أفقي، والحفاظ على مستوى الشريحة #2، ومعتمد على الشريحة #3. أداء تحت مجهر للتصور سهل تحركات البويضات والتقدم.
      ملاحظة: هذه الحركة سوف تولد الاحتكاك وتسبب بويضات "رول" وتفقد تشوريونس بهم. ينبغي أن تستخدم الحد الأدنى من الضغوط والتحركات ينبغي أن تكون قصيرة وسريعة.
    4. بعد بضع حركات في الاتجاه الأفقي، قليلاً تغيير زاوية حركة (الشكل 4 باء). زيادات متعددة، تزيد تدريجيا هذه الزاوية إلى 90° حتى حركة الشريحة الأعلى (رقم 2) عمودي على اتجاه انطلاق (الشكل 4 باء). لاحظ أن تشوريونس الفارغة ستكون مرئية في السائل وسوف تظهر بويضات تفتقر إلى تشوريونس أطول وأرق.
    5. كرر الخطوات 4.3.3-4.3.4 حوالي 7-10 مرات حتى يصبح الحل غائم قليلاً. إيقاف المتداول عندما يبدو أن غالبية بويضات (75-85 في المائة) قد فقدت هذه الأغشية فيتيلين.
      ملاحظة: وضع نهاية مدببة مميزة غالباً ما مرئياً على بويضات تفتقر إلى أغشية فيتيلين. فيتيلين الأغشية أكثر صعوبة لإزالة من تشوريونس. قد يتم تطبيق الضغط الخفيف إلى الشريحة الأعلى (الشريحة #2) حين المتداول لتحقيق إزالة الأغشية فيتيلين. في محاولة لإزالة الأغشية فيتيلين من جميع بويضات غالباً ما تسفر عن تدمير بويضات أخرى.
    6. بلطف رفع الشريحة الأعلى (رقم 2)، وسحب أحد أركانه إلى مركز المنطقة متجمد أسفل الشريحة (#1) حيث أن توالت بويضات تتراكم في وسط منطقة متجمد. كذلك طبق بويضات شطف من كل الشرائح مع ببسبتكس في الأعماق المحتوية على ببسبتكس.
    7. تنظيف الشرائح #1 و #2 مع الماء عالي النقاوة، الجافة مع مسح المتاح، وإعادة تعيين. كرر الخطوات 4.3.1-4.3.6 حتى قد تم إرجاع جميع بويضات من نفس النمط الوراثي. وهذا يتطلب عادة 3-4 جولات من المتداول في التركيب الوراثي.
  4. إزالة الأنقاض بعد المتداول
    1. أضف 1 مل ببسبتكس إلى أنبوب مخروطي 15 مل. دوامة السائل معطف الجانبين من الأنبوب.
    2. استخدام ببسبتكس المغلفة P1000 ماصة تلميح، نقل بويضات تدحرجت من الأعماق طبق أيضا إلى أنبوب مخروطي الشكل يحتوي على 1 مل من ببسبتكس. إضافة مل 2 إضافية من ببسبتكس إلى الأنبوبة المخروطية التي تحتوي على بويضات.
    3. واسمحوا بويضات البدء في تسوية للأسفل، ثم إزالة الجزء العلوي 2 مل محلول يحتوي على الحطام (تشوريونس، فيتيلينيس، إلخ) مع P1000 وتجاهل. إذا لزم الأمر، إجراء الأنبوبة المخروطية على خلفية داكنة لمشاهدة بويضات معتمة كما أنها تغرق.
    4. إضافة مل 2 إضافية من ببسبتكس إلى بويضات، وكرر الخطوة 4.4.3. كرر 4.4.3. لما مجموعة 3 جولات لإزالة الأنقاض.
    5. استخدام ببسبتكس المغلفة P1000 ماصة تلميح، بويضات نقل مرة أخرى إلى الأصلي 500 ميليلتر [ميكروفوج] أنابيب. 20-25 الإناث ينبغي أن تسفر عن حوالي 50 ميليلتر من بويضات ناضجة توالت.
  5. تكرار المقطع 4 للأنماط الجينية المتبقية باستخدام الشرائح الطازجة متجمد وطبق تنظيف عميق جيدا وأنبوب مخروطي الشكل جديد لكل الوراثي.
  6. إذا كان من الضروري تخزين، نقل بويضات لبرنامج تلفزيوني 1 x 0.1% 100 تريتيونكس ومخزن بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. لا ينصح بتخزين طويل الأجل لأنه يمكن عكس crosslinking فورمالدهايد بالمنظفات غير الأيونية.

5-الأسماك

ملاحظة: يتم تنفيذ يغسل جميع على نوتاتور في درجة حرارة الغرفة إلا إذا ذكر خلاف ذلك. بويضات قد تم توالت يستغرق وقتاً أطول لتسوية إلى الأسفل [ميكروفوج] أنابيب، لا سيما في الحلول التي تحتوي على ميثلامين. من المهم أن يكون المريض عند تغيير الحلول بحيث لا يتم فقدان بويضات في العملية. وهذا قد يتطلب الانتظار 5-15 دقيقة للسماح لبويضات تسوية بعد يشطف ويغسل. كما لاحظ أن بويضات في ميثلامين أقل معتمة.

  1. معاملة استخراج ورناسي
    1. شطف بويضات مع 500 ميليلتر من برنامج تلفزيوني يحتوي على 1% Triton X-100 (ببستكس). إزالة السائل وإضافة 500 ميليلتر "استخراج المخزن المؤقت" (ببستكس التي تحتوي على رناسي). تبني على نوتاتور في درجة حرارة الغرفة ح 2.
  2. يغسل التهجين قبل
    1. شطف بويضات 3 مرات مع 500 ميليلتر 2 × المالحة سترات الصوديوم الذي يحتوي على 20 توين (سكت). يسخن قاسمة (~ 500 ميليلتر/النمط الوراثي) 2 × سكت + ميثلامين 50% إلى 37 درجة مئوية.
      تنبيه: ميثلامين السامة، وارتداء الحماية المناسبة.
    2. أغسل بويضات 3 مرات لكل 10 دقيقة في 500 ميليلتر 2 x SSCT. أغسل بويضات لمدة 10 دقائق في 500 ميليلتر 2 × سكة + ميثلامين 20%. أغسل بويضات لمدة 10 دقائق في 500 ميليلتر 2 × سكة + ميثلامين 40%. أغسل بويضات لمدة 10 دقائق في 500 ميليلتر 2 × سكة + ميثلامين 50%.
    3. إزالة السائل وإضافة 500 ميليلتر من 37 درجة مئوية 2 × سكة + ميثلامين 50% من الخطوة 5.2.1 العينة واحتضانها ح 2 في 37 درجة مئوية بالتناوب.
      ملاحظة: يعمل فرن تهجين مجهزة دوار جيدا لهذا. يمكن استخدامها رغوة [ميكروفوج] أنابيب "تعويم" يعلق على محور دوار لتأمين الأنابيب.
  3. تمسخ والتهجين
    1. لكل أنبوبة من بويضات، استخدام 40 ميليلتر من 1 x التهجين العازلة التي تحتوي على 2.5 نانوغرام/ميليلتر سينتروميريك التحقيق و 0.31 pmol فلور/ميليلتر من كل مسبار BAC. تعد حلاً للتحقيق في التهجين المخزن المؤقت كافية لجميع الأنماط الجينية. دوامة التحقيق مزيج 30 ثانية قبل إضافة.
    2. استخدام تلميح ماصة P200 المغلفة بجيش صرب البوسنة، نقل بويضات لأنبوب بكر 200 ميليلتر. الاحتفاظ بعينات في 37 درجة مئوية وتسوية بويضات السماح للأسفل، ثم استخدم ماصة باستور سحبت لإزالة السائل قدر الإمكان.
    3. إضافة 40 ميليلتر من التهجين محلول يحتوي على مسبار (أعد في القسم 2) لبويضات. ضع الأنبوب PCR التي تحتوي على بويضات في الجهاز بكر واحتضان كما يلي: 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، 92 درجة مئوية لمدة 3 دقائق، ثم 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. بعد التحقيق إضافة إلى بويضات، الاحتفاظ بها في الظلام بقدر الإمكان.
  4. يغسل بعد التهجين
    1. يسخن 2 × سكة + ميثلامين 50% إلى 37 درجة مئوية والاحتفاظ بها في الحاضنة التهجين. مع جيش صرب البوسنة المغلفة P200 "الماصة؛" تلميح، إضافة 100 ميليلتر من 37 درجة مئوية 2 × سكة + ميثلامين 50% إلى أنبوب بكر مع بويضات ونقل بويضات لأنبوب [ميكروفوج] جديدة 500 ميليلتر.
    2. إضافة ميليلتر 400 إضافية من 37 درجة مئوية 2 × سكة + ميثلامين 50% إلى نفس الأنبوب واسمحوا بويضات يستقر عند 37 درجة مئوية في الحاضنة.
      ملاحظة: تسوية غالباً ما يستغرق وقتاً أطول في هذه الخطوة. ليس من غير المألوف أن يستغرق 15 دقيقة أو أكثر. انعدام الصبر سيؤدي إلى خسائر كبيرة من بويضات.
    3. أغسل بويضات 3 مرات لكل 20 دقيقة في 500 ميليلتر 37 درجة مئوية 2 × سكة + ميثلامين 50% عند 37 درجة مئوية بالتناوب. تبقى بويضات في 37 درجة مئوية في حين أنها تسوية.
    4. أغسل بويضات 3 مرات لكل 10 دقيقة في 500 ميليلتر 37 درجة مئوية 2 × سكة + ميثلامين 50% عند 37 درجة مئوية بالتناوب. تبقى بويضات في 37 درجة مئوية في حين أنها تسوية.
    5. في درجة حرارة الغرفة، تغسل بويضات لمدة 10 دقائق في 500 ميليلتر 2 × سكة + ميثلامين 40% في نوتاتور. أغسل بويضات لمدة 10 دقائق في 500 ميليلتر 2 × سكة + ميثلامين 20%. أغسل بويضات لمدة 10 دقائق في 500 ميليلتر 2 x SSCT.
  5. وصمة عار مع DAPI
    تنبيه: DAPI السامة، وارتداء الحماية المناسبة.
    1. أغسل بويضات لمدة 20 دقيقة في 500 ميليلتر DAPI الحل (1 ميكروغرام/مل) في 2 x SSCT على نوتاتور. شطف بويضات 3 مرات في 500 ميليلتر 2 x SSCT. أغسل بويضات 2 مرات لكل 10 دقيقة في 500 ميليلتر 2 x SSCT على نوتاتور. ويمكن تخزين عينات لما يصل إلى 4 س في درجة حرارة الغرفة في الظلام حتى أنهم على استعداد لجبل على كوفيرسليبس.
  6. تصاعد
    ملاحظة: انظر الشكل 3 للأدوات اللازمة.
    1. مكان بولي-L-يسين المغلفة ساترة تحت مجهر تشريح. إزالة السائل من أنبوب بويضات، ضبط الحجم الإجمالي لحوالي 150 ميليلتر. مع جيش صرب البوسنة المغلفة P200 نصيحة ماصة, ماصة صعودا وهبوطاً لتفريق بويضات طوال الحل، ومن ثم نقل 40 ميليلتر من بويضات/الحل إلى ساترة مغلفة بولي-L-يسين.
    2. قم بإزالة بعض من السائل من ساترة استخدام ماصة باستور سحبت حتى بويضات التمسك ساترة ولكن لا تزال محاطة بسائل. مع الملقط، اضغط باستمرار بكشف الغطاء عن جانب واحد واستخدام إبرة تنغستن لننأى بلطف بكتل من بويضات، نقلها إلى تحقيق طبقة واحدة من بويضات غير متداخلة.
    3. قم بإزالة ما تبقى السائل حول بويضات مع ماصة باستور سحبت. تأخذ شريحة زجاجية نظيفة واستخدام الغاز المضغوط لتفجير أي الغبار. إضافة 22 ميليلتر من تركيب وسائط (مثل، برولونج--الذهب) إلى منتصف الشريحة. انخفاض ببطء الانزلاق نحو ساترة، مع وسائل الإعلام المتزايدة التي تواجه العينة، حتى وسائل الإعلام يمس العينة. سوف يسبب التوتر السطحي ساترة الانضمام إلى الشريحة.
    4. وضع الشرائح في وعاء من بلاستيك مع غطاء ضيقة يحتوي على طبقة من ديسيكانت الطازجة (مثلاً، دريريتي). واسمحوا الشرائح جاف لمدة 3-5 أيام في الظلام قبل التصوير. وقت الجفاف قد تختلف تبعاً لدرجة رطوبة الغرفة.

6-التصوير

  1. عند إزالة الشرائح الجافة من مربع ديسيكانت، تنظيفها لإزالة أي جزيئات الغبار. ختم كوفيرسليبس بطلاء الأظافر. قد يتم تخزين الشرائح مختومة إلى أجل غير مسمى في-20 درجة مئوية.
  2. اكتساب الليزر مسح الصور [كنفوكل] استخدام هدفا نفط X 40 ارتفاع فتحه عددية مع 6 X التكبير الرقمي.
    ملاحظة: من الناحية المثالية، برامج النظام سيسمح واحدة للبحث عن ووضع علامة على موقع س ص من الكروموسومات هو لبويضات متعددة أثناء عرضها باستخدام ابيفلوريسسينسي. هذه الإمكانية يوفر الوقت أثناء جلسة تصوير. السريع تبيض مع هدفا X ارتفاع فتحه عددية 60 التي قد تعمل استعماله غير مناسب مع النظام [كنفوكل] الذي تم اختياره، ولكن لأنظمة أخرى.
  3. التقاط سلسلة Z لكل البويضات، إعداد أعلى وأسفل السلسلة باستخدام إشارة DAPI.
    ملاحظة: كسب، الإزاحة، وسوف تحتاج إلى طاقة الليزر يحدد تجريبيا باستخدام مجموعة فرعية بويضات. حالما يتم العثور على المعايير المناسبة، ينبغي بذل سوى تعديلات طفيفة.
    إذا غيرت اكتساب إعدادات مطلوبة، واستخدام المكدس الصورة التي تم جمعها سابقا لتقدير التغييرات الضرورية. لتفادي تبييض، الامتناع عن التصوير ذراع المسبار مسبقاً قبل التقاط سلسلة Z. مع حجم خطوة 0.25 ميكرومتر، سلسلة Z عادة تتراوح بين 25 30 الخطوات تبعاً لاتجاه والموضع من الكروموسومات. حجم أصغر لخطوة قد يحسن قدرة المرء على تقييم ما إذا كان يتم فصل الأسماك المكانين في البعد المحوري، ولكن هناك مفاضلة مع الوقت المطلوب لالتقاط أصغر الخطوات وفقدان كثافة إشارة بسبب تبيض. هدف العاشر 40 مع 6 × زوم رقمي، وحقل صورة 1,024 × 512 ينشئ صور بحجم بكسل من 0.05 ميكرومتر.

7-صورة التحليل والتهديف لعيوب التماسك

  1. ديكونفولفي سلسلة Z لتحسين إشارة إلى نسبة الضوضاء لكل البويضات19.
    ملاحظة: مجموعة من برامج مثل تلك المحددة في الجدول المواد يسمح أحد ديكونفولفي باستخدام استعادة التكاملية، فضلا عن المحاصيل والتباين-تعزيز الصور. الأهم من ذلك، لا بد من مجموعة من برامج التي يسمح أحد لمشاهدة الصور ونقاط لعيوب التماسك في ثلاثة أبعاد.
  2. لكل البويضات، جدولة عدد الذراع والبؤر سينتروميريك التي كولوكاليزي مع إشارة DAPI. ويؤدي فقدان التماسك ثلاث أو أربع إشارات مميزة والمنفصلين عن ذويهم لإجراء تحقيق معين. فإنه ليس من غير المألوف لمراقبة اثنين من البؤر التي ترتبط بخيط رفيع. بالمعايير الأكثر صرامة، هذه البؤر لا يعتبر "فصل".

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

الرقم 5 ويعرض الصور التي تم الحصول عليها مع تحقيقا ذراع هيبريديزيس إلى المنطقة الخلوية 6E-7B على كروموسوم إكس . نتائج هذا التحقيق في إشارة إلى أن يموضع يشترك مع DAPI ويمكن تمييزها بسهولة من الخلفية، وقد استخدمت بنجاح لقياس الذراع التماسك العيوب في الأنماط الجينية المختلفة19. التحديد الكمي لعيوب التماسك كان مقيد إلى بروميتافاسي والطوريه وأنا المراحل؛ بويضات قبل انهيار المغلف النووية استبعدت من التحليل19. ويتضح مغلف النووية سليمة عند المسح في قناة DAPI نظراً للكروموزومات البويضيه سوف تكون محاطة بمساحة دائرية منفصلة التي أكثر قتامة من السيتوبلازم المحيطة.

ويبين الشكل 5B إسقاطات أقصى شدتها من سلسلة Z الفردية بعد تعزيز deconvolution والتباين. التحديد الكمي لعيوب التماسك يتطلب تحديد لكل مسبار عدد الأسماك إشارات هذا التداخل مع إشارة DAPI. لمثل هذا تحليل، لا بد من التصور الصور المدمجة في ثلاثة أبعاد. ينبغي إدراج فقط الأسماك البقع التي تقترن وضوح إشارة DAPI في جميع الأبعاد الثلاثة في التحليل.

الأخت سليمة يدل على التماسك chromatid كمركزين الأسماك للذراع وبيريسينتريك على السواء المسابر (الشكل 5B، اليسار). وتعتبر بويضات يحتوي على ثلاثة أو أربعة بقع الأسماك المنفصلين للتحقيق أما العيوب التماسك (الشكل 5B، حق). تصنف كبقع الفردية، يجب فصل إشارتين أسماك الحد الأدنى في جميع الأبعاد الثلاثة بمسافة المقابلة للقطر من بقعة أصغر. المواضيع الباهتة رقيقة ربط المكانين الأسماك ليست غير شائعة. هذه الإشارات لا تعتبر منفصلة تماما و ولذلك لا تحسب كحالات العيوب التماسك.

مع 6E 7B ذراع المسبار التهجين، كان حوالي 15-20% بويضات تصويرها تماما تفتقر إلى إشارة أو الإشارة ضعيفة جداً لدرجة ثقة. وبالإضافة إلى ذلك، تقريبا 5% بويضات تصويرها تعرض مساحة كبيرة من إشارة الصبغية منتشر وهذه تم إهمالها من التحليل. على النقيض من ذلك، كان من النادر أن تصادف بويضات الذي كان إشارة التهجين بيريسينتريك مفقود أو منتشر جداً لدرجة.

6E 7B ذراع المسبار قد استخدمت على نطاق واسع لقياس الذراع التماسك العيوب في بروميتافاسي والطوريه اعتقلت بويضات المورفولوجية للأنماط الجينية المختلفة19. عندما فرعية كوسين SMC3 تم ترسيتها خلال منتصف الطور الأول، 16.3% بويضات ناضجة حلل الواردة أكبر من اثنين الذراع البقع، يدل على فقدان التماسك الذراع سابق لأوانه. وفي المقابل، لاحظنا بقع الذراع المنفصلين عن ذويهم في 5.1 في المائة فقط من بويضات يحتوي على مستويات طبيعية من SMC319. من المثير للاهتمام، على الرغم من أن وتيرة التماسك الذراع العيوب كانت مرتفعة في الأنماط الجينية ضربة قاضية متعددة، الأخت شقاً الصبغي نادراً ما فصلت في تلك المناطق بيريسينتريك19.

Figure 1
رقم 1: العمر-تعتمد على فقدان التماسك خلال الطور الأول تمديد اعتقال أنا الانقسام الاختزالي الإناث يؤدي إلى أخطاء في العزل الصبغي وانيوبلويدي في البيضة. ويمثل التماسك أشرطة سوداء بين الأخت شقاً الصبغي. التماسك ذراع يعمل على تماسك homologs المؤتلف ومطلوب للتفرقة الدقيقة في طور الصعود وأنا. إذا فقدت التماسك الذراع قبل الأوان، يمكن أن تحدث ميسيجريجيشن كروموسوم، أسفر بيضة أنيوبلويد. وكان هذا الرقم مقتبس من مرجع19. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: حجم جزيئات الحمض النووي بعد تجزئة باك والتضخيم (يسار) وبعد تقييد إنزيم الهضم (يمين) لثلاثة مختلفة BACs. 400 نانوغرام من تضخيم الحمض النووي المنتجات مبينة في الممرات الثلاثة الأولى. إظهار الممرات الثلاثة الأخيرة شظايا من الحمض النووي بعد خلاصة القيد بين عشية وضحاها. تضخيم الحمض النووي المنتجات تتراوح من 200 شركة بريتيش بتروليوم يصل إلى 3 كيلو بايت. بعد خلاصة القيد، معظم الشظايا التي تتراوح بين 100-200 شركة بريتيش بتروليوم، ولكن أجزاء كبيرة (تصل إلى 500 bp) كانت واضحة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: أدوات عنق. الأدوات المستخدمة في البروتوكول: (1) زوج من الملقط (#5 دومون)؛ (2) إبرة التنغستن؛ (3) الطبق جيدا عميقة مع غلاف؛ (4) الضحلة الزجاج تشريح طبق؛ (5) سحبت باستور ماصة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4. الترتيب وحركة الشرائح للمتداول بويضات. (أ) إعداد الرسم التخطيطي للشريحة للمتداول من بويضات كما هو موضح في البروتوكول. منطقة قتامة يدل الجزء متجمد الزجاج من الشريحة. (ب) اتجاه حركة ناقلات للشريحة #2 خلال البويضيه المتداول. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الرقم 5. الأسماك الاعتداء النتائج. (أ) التخطيطي يصور كروموسوم إكس المورفولوجية وأين هما الذراع المسابر (6 BACs في كل) وهجن المسبار بيريسينتروميريك اليغنوكليوتيد 22 المبينة في البروتوكول. للبساطة، يسمى المسبار 6E 7B 7B ويسمى المسبار ج 2 واو-3 جيم 3 (ب) صور الممثل من الأسماك النتائج (6E 7B المسبار) للذراع سليمة التماسك (هما ذراع المسبار البقع، واحد لكل هومولوج) والذراع تعطل التماسك (ثلاثة أو أربعة ذراع المسبار البقع). الحمض النووي الأزرق وإشارة مسبار الذراع الأصفر وإشارة مسبار بيريسينتريك الأحمر. صور تتوافق مع إسقاطات أقصى شدتها من سلسلة Z بعد تعزيز deconvolution والتباين. شريط المقياس = 2 ميكرومتر. وكان هذا الرقم مقتبس من مرجع19. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

استخدام الأسماك يسبر لتقييم حالة التماسك الذراع في بروميتافاسي والطوريه أنا المورفولوجية بويضات تقدما هاما في المجال الانقسام الاختزالي المورفولوجية . تاريخيا، كانت محدودة للاختبارات الجينية لاستنتاج سابق لأوانه فقدان التماسك الذراع في بويضات ناضجة11،،من1819الباحثين المورفولوجية . الآن، مع الأساليب المعروضة هنا، حالة التماسك الذراع يمكن أن جزيئي مباشرة باستخدام الأسماك. القدرة على الحصول على الأدلة المادية لفقدان التماسك الذراع سابقا لأوانه إلى حد كبير يوسع مرجع النهج المتاحة لدراسة الآليات التي تؤدي إلى فقدان الذراع ميسيجريجيشن تماسك وصبغي في بويضات المورفولوجية سابق لأوانه.

خطوات حاسمة
على الرغم من أننا لا تنفيذ إجراء تحليل منهجي لمعلمات الحاسمة اللازمة للتصور الناجح للتحقيق الفلورسنت التي هيبريديزيس إلى تسلسل نسخة واحدة على طول الذراع كروموسوم في ناضجة المورفولوجية بويضات، ونحن نقدم التالية قائمة من العوامل التي ربما تكون قد أسهمت نجاح هذا الأسلوب. لإنشاء ذراع المسبار، استخدمنا مزيج من ستة تداخل BAC المسابير التي تغطي فترة حوالي 0.8 Mb في العاشر-ذراع الكروموسوم. لم تنجح محاولاتنا الأولى استخدام أقل BACs التي امتدت منطقة أصغر. وباﻹضافة إلى ذلك، أننا استخدمنا أسلوب تجزئة وتضخيم "الحمض النووي باك" قبل نهاية الوسم مع أليكسا-647. وكانت أغلبية تقييد الشظايا التي تم تسميتها 100-200 شركة بريتيش بتروليوم طويلة (الشكل 2)، الذي يتفق تماما مع حجم الهدف من 150 النيوكليوتيدات اللازمة لنشر تتسم بالكفاءة من خلال أنسجة سميكة21. شروط التثبيت أن الحفاظ على مورفولوجية البويضيه المورفولوجية كبيرة ولكن أيضا السماح بتغلغل مسبار ضرورية. أننا لديك تعديل أسلوب التثبيت المستخدمة سابقا لدينا23 عن طريق إضافة هيبتان درجة حرارة الغرفة إلى حل يسخن إلى 37 درجة مئوية. نعتقد أنه من الممكن أن كلا إضافة هيبتان زيادة اختراق من خلال الغشاء فيتيلين، فضلا عن انخفاض درجة الحرارة لتثبيت ساهمت شروط التثبيت الناجح للتصور التماسك الذراع.

عندما المعايرة لفقدان التماسك سابقة لأوانها، واحد يتطلب حجم عينة التي يسمح التحديد الكمي للعيوب الموجودة في أدنى مستويات معتدلة. للحصول على إعداد كبيرة من بويضات ناضجة، آخرين قد استخدمت الخلاط انقطاع الإناث البالغات جنبا إلى جنب مع النخل 26،27. هنا يصف لنا طريقة لتسليم تشريح المبيض من الإناث 20-25، مع الفصل اليدوي في الآونة الأخيرة مرحلة بويضات قبل بيبيتينج. بينما الأسلوب خلاط/النخل ينبغي العمل أيضا مع هذا البروتوكول، ميزة واحدة من تشريح اليد هو أن دون هذه الخطوة سيفينج، بويضات قضاء وقت أقل في المخزن المؤقت قبل التثبيت، مما يقلل من فرصة لطور الصعود أنا بداية بسبب البيض الاصطناعي التنشيط. وبالإضافة إلى ذلك، هذا الأسلوب يتطلب الإناث أقل كابتداء من المواد، ويستخدم كميات أصغر من الكواشف، وسير عمل أبسط، كل منها تيسير معالجة متعددة الأنماط الجينية.

توفر كميات كافية من بويضات "دحر" لإزالة غشاء المشيمة والصفار فصل التشريح ودليل اليد من بويضات ناضجة وينتج حوالي 75-150 بويضات في نهاية يغسل التهجين. خدعة واحدة لتعظيم العائد من الطورية اعتقلت بويضات عقد الإناث العذراء في قارورة ييستيد في غياب الذكور قبل تشريح25. يجب أن يتم البويضيه المتداول لإزالة تشوريونس والأغشية فيتيلين مع لمسة رقيقة من أجل تجنب تدمير بويضات. ومع ذلك، إزالة تشوريونس والأغشية فيتيلين من 100% لبويضات ليس هدفا واقعيا والمتداول المفرط إلا يؤدي إلى فقدان بويضات. ولذلك، كل دورة متجددة يجب أن تتوقف عند حوالي 75-85% من بويضات نقص تشوريونس والأغشية فيتيلين.

القيود
على الرغم من النجاح الذي حققناه في توليد واستخدام المسابير الذراع لرصد الحالة التماسك في ناضجة المورفولوجية بويضات، الإجراء الذي لا يزال يعاني من القيود. في حين أننا نادراً ما فشلت في الكشف عن إشارة للتحقيق بيريسينتروميريك، ذراع المسبار الإشارة كانت ضعيفة أو غائبة في حوالي 15-20% بويضات أنه يمكننا تصويرها. قد يكون أحد العوامل المساهمة تغلغل فرق التحقيق اليغنوكليوتيد بيريسينتريك (22-28 النيوكليوتيدات) مقابل أكبر ذراع المسبار (100-200 النيوكليوتيدات). وباﻹضافة إلى ذلك، تسلسل المتكررة الكبيرة المعترف بها نتائج التحقيق بيريسينتريك في إشارة إلى أن أكثر إشراقا من ذلك لذراع المسبار. اتجاه البويضيه وتنسيب من الكروموسومات هو داخل البويضات أيضا تحديا عند التصوير. على الرغم من الكروموسومات هو نسبيا قريبة من قشرة الخلية، من المستحيل للتحكم في اتجاه البويضات عند تركيب على ساترة. ولذلك، في بعض جزء من بويضات، قد تكون الكروموسومات هو 100-200 ميكرون من ساترة وكثافة إشارة ونوعية قد أثرت تأثيراً سلبيا عندما تحاول أن الصورة من خلال الجزء الأكبر من البويضات. هذه القيود تعني أن عدد بويضات المدرجة في التحليل الكمي النهائي أقل بكثير من عدد بويضات المجهزة في البروتوكول. تحديد حالة التماسك الذراع في بويضات 100 سيتطلب على الأرجح اثنين من الأعمال التحضيرية المستقلة. عامل تحد إضافي في التحديد الكمي للتماسك عيوب استخدام ليزر المسح مجهر [كنفوكل] هو الوقت المطلوب لالتقاط سلسلة Z نموذجية (حوالي 5 دقائق)، حتى عندما يقتصر مجال تم التقاطها على 1,024 × 512 بكسل. وهذا يعني أن مقارنة تماسك في السيطرة والوراثية التجريبية (100 بويضات في كل) سيتطلب حوالي 16 ح وقت جمع صورة.

التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها
وقد تمكنا من رصد حالة التماسك الذراع باستخدام مسبار يعترف كروموسوم إكس في موقف الخلوية 6E 7B19. قد يكون من المستصوب أكثر للكشف عن فشل الصيانة chiasma تحقيق التي هيبريديزيس إلى موقع أكثر القاصي على كروموسوم إكس . وبالإضافة إلى ذلك، قد يرغب الباحثين الآخرين تحليل التماسك الذراع في الكروموسومات الأخرى. بينما لا حاولنا للتحقيق في أوتوسوميس، البيانات الأولية تشير إلى أن نتائج تحقيق التي تعترف أيضا بمنطقة 2F-3 ج من كروموسوم إكس في إشارة قابلة للاكتشاف. بيد استناداً إلى البيانات الأولية المحدودة، إشارة المسبار 2 واو-3 ج قد تكون أقل "الميثاق" من ذلك لأن التحقيق 6E 7B. على الرغم من الإشارات الأسماك هش لبعض الصبغيات البويضات وضيق، إشارة التهجين في الكروموسومات بويضات أخرى أكثر انتشارا كبيرا. ما إذا كانت هذه الاختلافات في إشارة تعكس اختلافات حقيقية في مورفولوجيا كروموسوم بين موقعين الخلوية، يسبر تقلب في كفاءة التهجين بينهما، أو سوف تقلب العشوائية فقط بين بويضات مختلفة يتطلب إجراء تحليل أكثر تعمقاً.

الأهم من ذلك، حتى بالنسبة للتحقيق 6E 7B، لاحظنا إشارة صبغية منتشر في بعض بويضات، وهذا كثيرا ما يستلزم استبعادها من التحليل. وباﻹضافة إلى ذلك، لاحظنا التباين في جودة الإشارة والسطوع بين استعدادات مختلفة المسبار 6E 7B، وهذا يتطلب أن التصوير تبعاً للمعلمات. رفع درجة الحرارة إلى 42 درجة مئوية التهجين لم تخفض عدد بويضات مع إشارة منتشر، ولكن يؤثر بشدة في إشارة للتحقيق اليغنوكليوتيد بيريسينتريك. في محاولة لتحسين الحفاظ على كروموسوم مورفولوجيا24، نحن أيضا حاولت خطوة تمسخ أطول في درجة حرارة أقل (80 درجة مئوية)، ولكن تبين أن هذا العلاج لا زيادة كثافة إشارة لا إلى خفض عدد بويضات مع منتشر صبغي الأسماك إشارة. حاولنا أيضا للحصول على إشارة أكثر إشراقا في ذراع باستخدام 12 BACs متداخلة المقابلة للفاصل زمني حوالي 1.5 ميغابايت التي امتدت المنطقة الخلوية 5E-7B. عند استخدام مجس BAC 12، درجة التباين في كثافة إشارة وكذلك النسبة المئوية لبويضات تفتقر إلى إشارة كان لا يختلف عن عندما استخدمت BACs ستة جعل ذراع المسبار. وكان أيضا أكثر تحديا لنقاط لعيوب التماسك عند استخدام المسبار BAC 12 لإشارات الأسماك كانت أكبر، مما يزيد من صعوبة حل البقع المقابلة الفردية شقاً الصبغي. وفي الحالات التي يتم الحصول عليها من أي إشارة مع تحقيق أعدت حديثا، الباحثين ينبغي التحقق من حجم تضخيم وتقييد يهضم BAC الحمض النووي للتأكد من أن الأجزاء المستخدمة لوصفها بنهاية أساسا داخل نطاق bp 100-200. وهذا يحتمل أن يكون واحداً من أهم العوامل في إعداد التحقيق الناجح.

التوجهات المستقبلية
وسيكون العمل في المستقبل تعزيز الحصول على الصور، فضلا عن تكييف البروتوكول لتشمل immunostaining التحسينات الرئيسية التي ستفيد الباحثين الآخرين. أثناء جمع صورة، وجمع أكبر عدد من الصور في البعد المحوري، فضلا عن اقتناء الصورة أسرع سيكون من المفيد للتحديد الكمي لعيوب التماسك. في الاستفادة المثلى من المعلمات التصوير الليزر من المسح الضوئي [كنفوكل]، وجدنا أن إشارات 0.25 ميكرومتر وكان أصغر حجم الخطوة التي يمكن أن تستخدم لسلسلة Z تفاديا تبيض ملموس من الأسماك. ومع ذلك، لإشارات الأسماك التي تكون مفصولة بواسطة أقل من 0.25 ميكرومتر في المكدس Z، حجم هذه الخطوة قد يؤدي الفشل في القبض على "المسافة" بين البؤر ولذلك قد يقلل من عدد العيوب التماسك. قد تسمح سرعة اكتساب صورة قرص الغزل [كنفوكل] أحجام خطوة صغيرة لاستخدامها دون إشارة تبيض. هذا سوف تقدم الإعمار صورة أكثر دقة في البعد المحوري فضلا عن السماح بعدد أكبر من بويضات يتم تحليلها لعيوب التماسك. وباﻹضافة إلى ذلك، سيعزز القدرة على الجمع بين إيمونوستينينج مع التصور الأسماك الدولة التماسك الذراع كثيرا البروتوكول. لعدد من الأعمال التحضيرية، حاولنا أن أداء immunostaining المغزل اتباع الإجراء التهجين. ومع ذلك، تلطيخ المغزل قوية كانت مرئية في جزء صغير فقط من بويضات. وعلاوة على ذلك، لأسباب غير واضحة، محاطة أعلى مستويات زائفة الأسماك إشارات الكروموزومات هو عندما تم الجمع بين السمك وإيمونوستينينج. مزيد من العمل لتحسين البروتوكول للسماح إيمونوستينينج أما قبل أو بعد الإجراء الأسماك سوف توسع إلى حد كبير القدرة على هذا الأسلوب.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب يعلن لا تضارب المصالح المالية.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل GM59354 منحة "المعاهد الوطنية للصحة" منح شارون بيكيل هاء. ونشكر هوي Q. نغوين للمساعدة في وضع بروتوكول لتوليد المسابير الذراع الفلورسنت، لافانواي Ann للحصول على مساعدة مع [كنفوكل] مجهرية، وياء إميليانو ريد للمساعدة التقنية. ونشكر أيضا العديد من الزملاء في المجتمع المورفولوجية لإجراء مناقشات مفيدة والمشورة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Kits
Midi Prep kit Qiagen 12143 Prep BAC clone DNA
GenomePlex Complete Whole Genome Amplification (WGA) Kit Sigma WGA2 Amplify BAC clone DNA
ARES Alexa Fluor 647 DNA labeling kit Invitrogen A21676 Label BAC clone DNA
PCR purification kit Qiagen 28104 Remove non-conjugated dye following labeling of BAC clone DNA
Name Company Catalog Number Comments
Chemicals & Solutions
Note: All solutions are prepared using sterile ultrapure water and should be sterilized either by autoclave or filter sterilization.
Bovine serum albumin (BSA) Fisher Scientific BP1600-100 Prepare 10% stock
Freeze aliquots
Calcium chloride Fisher Scientific C75-500
DAPI (4’, 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Invitrogen D1306 Toxic: wear appropriate protection. Prepare 100µg/ml stock in 100% ethanol, store in aliquots at -20 °C. Prepare 1 µg/ml solution in 2X SSCT before use.
Dextran sulfate Sigma D-8906
Drierite Drierite Company 23001
Dithiothreitol (DTT) Invitrogen 15508-013 Prepare 10 mM stock
dTTP (10 µmol, 100 µl) Boehringer Mannheim 1277049 Prepare 1 mM stock
EDTA (Disodium ethylenediamine tetraacetic acid) Fisher Scientific S311-500 Prepare 250 mM stock
100% ethanol (molecular grade, 200 proof) Decon Laboratories 2716
Tris (Ultra Pure) Invitrogen 15504-020
EGTA (Ethylenebis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid) Sigma E-3889
16% formaldehyde Ted Pella, Inc. 18505 Toxic: wear appropriate protection
Formamide Invitrogen AM9342 Toxic: wear appropriate protection
Glucose Fisher Scientific D16-1
Glycogen Roche 901393
HEPES Boehringer Mannheim 737-151
Heptane Fisher Scientific H350-4 Toxic: wear appropriate protection.
Hydrochloric acid Millipore HX0603-4 Toxic: wear appropriate protection.
Hydroxylamine Sigma 438227 Prepare 3 M stock
4.9 M Magnesium chloride Sigma 104-20
Na2HPO4 Ÿ 7H2O Fisher Scientific S373-500
NaH2PO4 Ÿ 2H2O Fisher Scientific S369-500
Poly-L-lysine (0.1mg/ml) Sigma P8920-100
Potassium acetate Fisher Scientific BP364-500
Sodium acetate Fisher Scientific S209-500 Prepare 3M stock
Sodium cacodylate Polysciences, Inc. 1131 Toxic: wear appropriate protection. Prepare 400mM stock
Sodium citrate Fisher Scientific BP327-1
Sodium chloride Fisher Scientific S271-3 Sodium chloride
Sucrose Fisher Scientific S5-500
10% Tween 20 Thermo Scientific 28320 Surfact-Amps
10% Triton X-100 Thermo Scientific 28314 Surfact-Amps
Name Company Catalog Number Comments
Solutions
Note: All solutions are prepared using sterile ultrapure water and should be sterilized either by autoclave or filter sterilization.
TE buffer 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH = 8.0
20X SSC (Saline Sodium Citrate) 3 M NaCl, 300 mM sodium citrate
2X cacodylate fix solution Toxic: wear appropriate protection. 200 mM sodium cacodylate, 200 mM sucrose, 80 mM sodium acetate, 20 mM EGTA
1.1X Hybridization buffer 3.3X SSC, 55% formamide, 11% dextran sulfate
Fix solution Toxic: wear appropriate protection. 4% formaldehyde, 1X cacodylate fix solution
PBSBTx 1X PBS, 0.5% BSA, 0.1% Trition X-100
PBSTx 1X PBS, 1% Trition X-100
Extraction buffer (PBSTx + Rnase) 1X PBS, 1% Trition X-100, 100 µg/mL RNase
2X SSCT 2X SSC, 0.1% Tween 20
2X SSCT + 20% formamide Toxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 20% formamide
2X SSCT + 40% formamide Toxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 40% formamide
2X SSCT + 50% formamide Toxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 50% formamide
Name Company Catalog Number Comments
Enzymes
AluI New England Biolabs R0137S
HaeIII New England Biolabs R0108S
MseI New England Biolabs R0525S
MspI New England Biolabs R0106S
RsaI New England Biolabs R0167S
BfuCI New England Biolabs R0636S
100X BSA New England Biolabs Comes with NEB enzymes
10X NEB buffer #2 New England Biolabs Restriction enzyme digestion buffer. Comes with NEB enzymes
Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) 400 U/µl Roche/Sigma 3333566001
TdT buffer Roche/Sigma Comes with TdT enzyme
Cobalt chloride Roche/Sigma Toxic: wear appropriate protection. Comes with TdT enzyme
RNase A (10 mg/mL) Thermo-Scientific EN0531
Name Company Catalog Number Comments
Cytology Tools etc.
Forceps Dumont #5 INOX, Biologie
9” Disposable glass Pasteur pipettes Fisher 13-678-20C Autoclave to sterilize
Shallow glass dissecting dish Custom made
Deep well dish (3 wells) Pyrex 7223-34
Fisherfinest Premium microscope slides Fisher Scientific 22-038-104 Used to cover deep well dishes
Frosted glass slides, 25 x 75 mm VWR Scientific 48312-002
Glass slides, 3 x 1 in, 1 mm thick Thermo-Scientific 3051
Coverslips, 10 x 10 mm, No. 1.5 Thermo-Scientific 3405
Tungsten needle homemade
Prolong GOLD mounting media Molecular Probes P36930
Compressed-air in can Various
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
PCR machine Various
Nanodrop 2000, spectrophotometer Thermo-Scientific microvolume spectrophotometer
Vortexer Various
Table top microfuge at room temperature Various
Table top microfuge at 4 °C Various
Heat block Various
Hybridization oven or incubator with rotator Various
Nutator Various
A1RSi laser scanning confoal Nikon 40X oil Plan Fluor DIC (NA 1.3)
Name Company Catalog Number Comments
Consumables etc.
50 mL conical tubes Various
15 mL conical tubes Various
1.5 mL microfuge tubes Various
500 µl microfuge tubes Various
200 µl PCR tubes Various
Plastic container with tight fitting lid Various To hold Drierite
Kimwipes Various disposable wipes
Parafilm Various paraffin film
Name Company Catalog Number Comments
Other
HPLC purified 5'-labeled oligonucleotides Integrated DNA Technologies Cy3-labeled probes that recognize the 359 bp satellite repeat of the X chromosome
Volocity 3D Image Analysis Software PerkinElmer Version 6.3

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Peters, J. M., Nishiyama, T. Sister chromatid cohesion. CSH Perspect Biol. 4 (11), (2012).
  2. McNicoll, F., Stevense, M., Jessberger, R. Cohesin in gametogenesis. Curr Top Dev Biol. 102, 1-34 (2013).
  3. Buonomo, S. B., et al. Disjunction of homologous chromosomes in meiosis I depends on proteolytic cleavage of the meiotic cohesin Rec8 by separin. Cell. 103 (3), 387-398 (2000).
  4. Bickel, S. E., Orr-Weaver, T., Balicky, E. M. The sister-chromatid cohesion protein ORD is required for chiasma maintenance in Drosophila oocytes. Curr. Biol. 12 (11), 925-929 (2002).
  5. Hodges, C. A., Revenkova, E., Jessberger, R., Hassold, T. J., Hunt, P. A. SMC1beta-deficient female mice provide evidence that cohesins are a missing link in age-related nondisjunction. Nat Genet. 37 (12), 1351-1355 (2005).
  6. Freeman, S. B., et al. The National Down Syndrome Project: design and implementation. Public Health Rep. 122 (1), 62-72 (2007).
  7. Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nat Rev Genet. 13 (7), 493-504 (2012).
  8. Angell, R. R. First-meiotic-division nondisjunction in human oocytes. Am. J. Hum. Genet. 61, 23-32 (1997).
  9. Tsutsumi, M., et al. Age-related decrease of meiotic cohesins in human oocytes. PLoS One. 9 (5), e96710 (2014).
  10. Liu, L., Keefe, D. L. Defective cohesin is associated with age-dependent misaligned chromosomes in oocytes. Reprod Biomed Online. 16 (1), 103-112 (2008).
  11. Subramanian, V. V., Bickel, S. E. Aging predisposes oocytes to meiotic nondisjunction when the cohesin subunit SMC1 is reduced. PLoS Genet. 4 (11), e1000263 (2008).
  12. Chiang, T., Duncan, F. E., Schindler, K., Schultz, R. M., Lampson, M. A. Evidence that weakened centromere cohesion is a leading cause of age-related aneuploidy in oocytes. Curr. Biol. 20 (17), 1522-1528 (2010).
  13. Lister, L. M., et al. Age-related meiotic segregation errors in mammalian oocytes are preceded by depletion of cohesin and Sgo2. Curr. Biol. 20 (17), 1511-1521 (2010).
  14. Duncan, F. E., et al. Chromosome cohesion decreases in human eggs with advanced maternal age. Aging Cell. 11 (6), 1121-1124 (2012).
  15. Yun, Y., Lane, S. I., Jones, K. T. Premature dyad separation in meiosis II is the major segregation error with maternal age in mouse oocytes. Development. 141 (1), 199-208 (2014).
  16. Subramanian, V. V., Bickel, S. E. Heterochromatin-mediated association of achiasmate homologues declines with age when cohesion is compromised. Genetics. 181, 1207-1218 (2009).
  17. Jeffreys, C. A., Burrage, P. S., Bickel, S. E. A model system for increased meiotic nondisjunction in older oocytes. Curr. Biol. 13 (6), 498-503 (2003).
  18. Weng, K. A., Jeffreys, C. A., Bickel, S. E. Rejuvenation of Meiotic Cohesion in Oocytes during Prophase I Is Required for Chiasma Maintenance and Accurate Chromosome Segregation. PLoS Genetics. 10 (9), e1004607 (2014).
  19. Perkins, A. T., Das, T. M., Panzera, L. C., Bickel, S. E. Oxidative stress in oocytes during midprophase induces premature loss of cohesion and chromosome segregation errors. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (44), E6823-E6830 (2016).
  20. Dernburg, A. F., Sedat, J. W., Hawley, R. S. Direct evidence of a role for heterochromatin in meiotic chromosome segregation. Cell. 86, 135-146 (1996).
  21. Dernburg, A. F., Sedat, J. W. Method Cell Biol. 53, Academic Press. 187-233 (1998).
  22. Guo, Z., Batiha, O., Bourouh, M., Fifield, E., Swan, A. Role of Securin, Separase and Cohesins in female meiosis and polar body formation in Drosophila. J Cell Sci. 129 (3), 531-542 (2016).
  23. Giauque, C. C., Bickel, S. E. Heterochromatin-Associated Proteins HP1a and Piwi Collaborate to Maintain the Association of Achiasmate Homologs in Drosophila Oocytes. Genetics. 203 (1), 173-189 (2016).
  24. Joyce, E. F., Apostolopoulos, N., Beliveau, B. J., Wu, C. T. Germline progenitors escape the widespread phenomenon of homolog pairing during Drosophila development. PLoS Genet. 9 (12), e1004013 (2013).
  25. Gilliland, W. D., Hughes, S. F., Vietti, D. R., Hawley, R. S. Congression of achiasmate chromosomes to the metaphase plate in Drosophila melanogaster oocytes. Dev Biol. 325 (1), 122-128 (2009).
  26. Gyuricza, M. R., et al. Dynamic and Stable Cohesins Regulate Synaptonemal Complex Assembly and Chromosome Segregation. Curr Biol. 26 (13), 1688-1698 (2016).
  27. Radford, S. J., McKim, K. S. Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes. J Vis Exp. (116), (2016).

Tags

علم الأحياء التنموي، 130 قضية، و المورفولوجية، والانقسام الاختزالي، البويضيه، أخت chromatid الترابط والتماسك الذراع، والأسفار في الموقع التهجين (الأسماك)
استخدام Fluorescence <em>في الموقع</em> التهجين (الأسماك) لرصد حالة التماسك الذراع في بروميتافاسي والطوريه وأنا بويضات <em>المورفولوجية</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Perkins, A. T., Bickel, S. E. Using… More

Perkins, A. T., Bickel, S. E. Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) to Monitor the State of Arm Cohesion in Prometaphase and Metaphase I Drosophila Oocytes. J. Vis. Exp. (130), e56802, doi:10.3791/56802 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter