Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Bruk fluorescens In Situ hybridisering (fisk) å overvåke tilstanden til Arm samhold i Prometaphase og Metaphase jeg Drosophila Oocytes

Published: December 6, 2017 doi: 10.3791/56802
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biological Sciences, Dartmouth College

Summary

Dette manuskriptet presenterer en detaljert metode for å generere X-kromosom arm sonder og utføre fluorescens i situ hybridisering (fisk) å undersøke tilstanden til søster chromatid samhold i prometaphase og metaphase jeg arrestert Drosophila oocytes. Denne protokollen er egnet for å bestemme om meiotic arm samhold er intakt eller forstyrret i ulike genotyper.

Abstract

Hos mennesker er kromosom segregering feil i oocytes ansvarlig for fleste spontanaborter og fødselsskader. Videre, som kvinner alder, er risikoen for å bli gravid en aneuploid fosteret øker dramatisk og dette fenomenet kjent som mors alder effekten. En forutsetning for nøyaktig kromosom segregering under meiotic divisjonene er vedlikehold av søster chromatid samhold i utvidet prophase perioden som oocytes erfaring. Fargemaskin tyder både mennesker og modell organismer på at meiotic samhold forverres under den aldrende prosessen. I tillegg segregering feil i menneskelig oocytes er mest utbredte under meiose I samsvar med tidlig tap av armen samhold. Bruk av modell organismer er avgjørende for unraveling mekanismer underlie alder-avhengige tap av samhold. Drosophila melanogaster tilbyr flere fordeler for å studere regulering av meiotic samhold i oocytes. Men inntil nylig var bare genetiske testene tilgjengelig for analysen for tap av armen samhold i oocytes av ulike genotyper eller annen eksperimentelle forhold. Her er en detaljert protokoll forutsatt for å bruke fluorescens i situ hybridisering (fisk) direkte visualisere mangler i armen samhold i prometaphase jeg og metaphase jeg arrestert Drosophila oocytes. Ved å generere en fisk sonde som arten til den distale armen på X -kromosomet og samle AC confocal Z stabler, en forsker kan visualisere antall individuelle fisk signaler i tre dimensjoner og bestemme om søster chromatid armene er skilt. Du fremgangsmåten gjør det mulig å kvantifisere arm samhold defekter i hundrevis av Drosophila oocytes. Som sådan, gir denne metoden et viktig verktøy for å undersøke mekanismer som bidrar til samhold vedlikehold samt faktorene som fører til undergang under den aldrende prosessen.

Introduction

Riktig segregering av kromosomer under mitose og meiose krever at søster chromatid samhold etablert, opprettholdes, og utgitt i et koordinert Vis1,2. Samholdet er etablert i S fasen og er formidlet av cohesin komplekset, som er fysisk sammenhengene som holder søster chromatids sammen. Meiose, fungerer samhold distale overganger også for å holde rekombinant homologs sammen og denne fysiske foreningen bidrar til å sikre riktig retning av bivalent på metaphase jeg vri (figur 1)3,4, 5. Utgivelsen av armen samhold på anaphase jeg lar homologs å skille til motsatt spindel polakkene. Hvis arm samhold er vil tapt for tidlig, rekombinant homologs miste deres fysisk tilkobling og skille tilfeldig, noe som kan resultere i aneuploid gameter (figur 1).

I menneskelige oocytes, feil i kromosom segregering er den ledende årsaken til aborter og misdannelser, for eksempel Down syndrom6, og deres forekomsten øker eksponentielt med mors alder7. Søster chromatid samhold er etablert i fosterets oocytes og meiotic rekombinasjon fullføres før fødselen. Oocytes deretter ble arrestert i midten av prophase jeg før eggløsning og under denne arrestasjonen, fortsatte fysiske foreningen av rekombinant homologs avhengig søster chromatid samhold. Derfor nøyaktig segregering under meiose og normal graviditet resultater krever at samhold forbli intakt i opptil fem tiår.

Tidlig tap av samhold under langvarig meiotic arrestasjonen av menneskelig oocytes har blitt foreslått å bidra til mors alder effekten og flere tekstlinjer bevis støtter denne hypotesen8,9. Imidlertid gitt utfordringer studere meiotic samhold i menneskelige oocytes, mye av vår forståelse av dette fenomenet avhengig av bruk modell organismer5,10,11,12, 13,14,15.

Drosophila melanogaster oocytes tilbyr mange fordeler for studier av meiotic samhold og kromosom raseskille. En enkel genetisk analysen gjør det mulig å gjenopprette avkom fra aneuploid gameter og måle gjengivelsen av X-kromosom segregering på en stor skala11,16,17. Videre kan man også avgjøre om kromosom segregering feil oppstår fordi rekombinant homologs missegregate under meiose I en fenotypen som samsvarer med tidlig tap av armen samhold11,18, 19. direkte observasjon av meiotic samhold i Drosophila oocytes er også mulig å bruke fluorescens i situ hybridisering (fisk). Selv om fluorescerende oligonucleotides som hybridize i repeterende satellitt sekvenser er brukt for over et tiår for å overvåke pericentromeric samhold i eldre Drosophila oocytes4,20, analyse av arm samholdet er mye mer utfordrende. Visualisering av armen samhold krever en sonde som strekker seg over et stort område av enkeltutgave sekvenser og er lys nok til å føre synlig signaler for enkelte søster chromatids når armen samhold er fraværende. I tillegg må oocyte fiksering betingelsene og størrelsen på de merket DNAs rette penetrasjon21 i den store modne Drosophila oocyte (200 μm brede av 500 µm lang). Nylig en arm sonde var vellykket utnyttet visualisere Drosophila oocyte chromatids under anaphase jeg, men forfatterne uttalte at de ikke kunne oppdage et signal i prometaphase eller metaphase jeg arrestert oocytes22. Her vi gir en detaljert protokoll for generering av X-kromosom arm fisk prober og oocyte forberedelse forhold som har tillatt oss å analysen for tidlig tap av søster chromatid samhold i prometaphase jeg og metaphase jeg oocytes. Disse teknikkene, som har aktivert oss å identifisere genet produkter som er nødvendig for vedlikehold av meiotic samhold, lar andre analysen for søster chromatid samhold mangler i eldre Drosophila oocytes av ulike genotyper.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. forberedelser

  1. Forberede løsninger fluorescens i situ hybridisering (fisk). Forberede alle løsninger med ultrapure vann.
    1. Forberede 5 x endret Robb buffer: 275 mM kalium acetate, 200 mM natrium acetate, 500 mM sukrose, 50 mM glukose, 6 mM magnesiumklorid, 5 mM veisalt, 500 mM HEPES pH = 7.4. Bringe pH 7,4 bruker 10 N NaOH. Filteret sterilisere og lagre på 20 ° C. Tine og fortynne til 1 x som nødvendig og lagre 1 x dele på 20 ° C.
    2. Forberede 10 x fosfat bufret saltvann (PBS) med 1.3 M NaCl, 70 mM Na2HPO4, 30 mM NaH2PO4. Bringe pH til 7,0 bruker 10 N NaOH. Sterilisere av autoklavering eller filter sterilisering.
  2. Forberede poly-L-Lysine coverslips en dag før nødvendig.
    1. Pipetter 70% etanol som inneholder 1% saltsyre på overflaten av en 18 x 18 mm #1.5 dekkglassvæske og ruge 5 min. Bruk vakuum aspirasjon fjerne væske. Gjenta med sterilt ultrapure vann. Dekker overflaten av dekkglassvæske med 0,1 mg/mL poly-L-lysine og ruge i 10 min.
    2. Sug opp for å fjerne væske og lufttørke for 10 min. butikken coverslips poly-L-lysine side opp i en plastboks med tettsittende lokk for å unngå støv.
  3. Forberede trakk Pasteur Pipetter fjerne oppløsninger uten å fjerne oocytes. Over Bunsen brenner varme, varme i midten av en lang glass Pasteur pipette mens forsiktig trekke i hver ende til glasset smelter og trekker fra hverandre.

2. generasjon Arm Probe for fisk

Merk: Alle sentrifuge trinnene utføres ~ 16.000-21000 x g (maksimal hastighet på de fleste bordplaten microcentrifuges). Kort sentrifuge spinner indikerer spinning for 5-15 s. Vortex angir vortexing for ~ 15 s på maks fart med mindre annet er angitt.

Merk: BACs for arm sonder kan fås fra BAC PAC ressurser. To X -kromosom euchromatic arm sonder har blitt brukt med hell med denne metoden. En arm sonde ble komponert av seks BAC kloner svarer til fargemaskin band 6E-7B (BACR17C09, BACR06J12, BACR35J16, BACR20K01, BACR35A18, BACR26L11). Andre arm sonden besto av seks BAC kloner svarer til fargemaskin band 2F - 3C (BACR13K19, BACR21G11, BACR09H13, BACR30B01, BACR34O03, BACR03D13). BACs til andre Drosophila kromosom regioner kan Blas gjennom på: http://www.fruitfly.org/sequence/X1-11-assembly.html. To pericentric sonder som gjenkjenner 359 bp satellitt gjenta på X -kromosomet har blitt brukt med hell med denne metoden. En 22 nukleotid sonde har vært brukt mye og fungerer bra (5'-Cy3-AGGGATCGTTAGCACTCGTAAT)19,23. En 28 nukleotid sonde ble sist testet og også fungert bra (5'-Cy3-GGGATCGTTAGCACTGGTAATTAGCTGC)24. HPLC renset oligonucleotides 5' merket med et bestemt fluorophore bestilt fra en kommersiell kilde (f.eksintegrert DNA-teknologi).

  1. Prep BAC klone DNA følge kit instruksjonene som angitt i Tabellen for materiale. Resuspend DNA pellet fra 100 mL kultur i 200 µL TE; siste DNA konsentrasjonen bør variere mellom 5-40 ng/µL avhengig av BAC klone.
  2. Utføre DNA amplifikasjon for hver BAC ved hjelp av forsterkning kit, som angitt i tabellen av materialer og følgende protokollen. Behandle BAC DNA for hver klone individuelt. Bruk enzymer og bufferne som ble levert med kit i trinn 2.2.1 gjennom 2.2.3.
    1. Tilfeldig fragmentering av BAC DNA: For hver BAC, bruke TE for å forberede 10 µL av en 1 ng/µL DNA løsning i et 200 µL PCR rør. Legg 1 µL 10 X fragmentering bufferen. Sett røret i et PCR-maskin på 95 ° C i nøyaktig 4 min. umiddelbart kjølig prøven i vann og sentrifuge kort. Inkubasjon er tidsavhengig og eventuelle avvik kan endre resultatene.
    2. Biblioteket forberedelse
      Merk: Denne metoden bruker tilfeldige primere for å generere et bibliotek av amplifiable.
      1. Tuben inneholder DNA legge følgende: 2 µL av 1 x biblioteket forberedelse Buffer, 1 µL av biblioteket stabilisering løsning. Bland godt av vortexing, sentrifuge kort, og sett røret i PCR maskinen på 95 ° C i 2 min. umiddelbart kjølig prøven i vann og sentrifuge kort.
      2. Legge til 1 µL av biblioteket forberedelse enzym PCR rør, mix og sentrifuger kort. Sted PCR rør i PCR maskinen og Inkuber som følger: 16 ° C for 20 min, 24 ° C for 20 min, 37 ° C for 20 min, 75 ° C i 5 min, hold på 4 ° C.
      3. Fjern prøver fra PCR maskinen og sentrifuge kort. Eksempler kan være forsterket umiddelbart eller lagret på 20 ° C i opptil tre dager.
    3. Forsterkning av BAC DNET bibliotek
      1. Legge til følgende reagensene hele 15 µL tilfeldig fragment reaksjonen: 7,5 µL 10 x forsterkning Master Mix, 47,5 µL Nuclease gratis vann, 5 µL WGA DNA Polymerase. Bland godt av vortexing og sentrifuge kort.
      2. Sted PCR rør i PCR maskinen og Inkuber som følger: første rødsprit 95 ° C for 3 min, 14 sykluser av rødsprit 94 ° c for 15 s, etterfulgt av avspenning/utvidelse ved 65 ° C i 5 min, hold på 4 ° C.
      3. Når sykling er fullført, analysen DNA konsentrasjonen. Konsentrasjonen av DNA bør være minst 800 ng / µL. holde prøver på 4 ° C eller butikken på 20 ° C til klar for fordøyelsen. Eventuelt vurdere DNA fragment størrelse ved å kjøre 400 ng av DNA på en 2% agarose gel. Fragmenter bør spenner fra 200 bp til 3 kb (figur 2).
  3. Begrensning enzym fordøyelsen forsterket DNA
    1. Sted 20 µg forsterket DNA fra forrige inndeling i en 1,5 mL microfuge tube. Legge til 20 enheter av Alul, Haelll, Msel, Mspl, Rsal, 25 enheter BfuCl, 0,5 µL 100 x BSA, 5 µL 10 x begrensning enzym fordøyelsen buffer, og juster volumet til 50 µL ved å legge til riktig mengde ultrapure H2O.
    2. Inkuber sammendraget overnatting på 37 ° C i en inkubator å hindre kondens på lokket. Etanol utløse fordøyd DNA. Legge til sammendraget: 1 µL glykogen, 1/10 volume 3M natrium acetate, 2,5 volumer 100% molekylær klasse etanol. Inkuber ved-80 ° C i 1 time eller over natten.
    3. Sentrifuger i 30 min på 4 ° C. Vask DNA pellets med 1 volum på rom temp 70% etanol og spinn for 5 min på 4 ° C. Fjern nedbryting og la DNA pellets lufttørke eller tørke forsiktig med en jevn strøm av luft.
    4. Resuspend DNA pellet i 36 µL sterilt ultrapure H2O og bruke 1 µL av DNA til analysen DNA konsentrasjonen, som bør være ca 285 ng / µL. lagre DNA på 20 ° C.
    5. Eventuelt vurdere DNA fragment størrelse kjører 400 ng av DNA på en 2% agarose gel. De fleste fragmenter bør variere fra 100-200 bp, med et fainter signal opp til 500 bp (figur 2).
  4. 3' tailing reaksjon
    1. Denature fordøyd DNA ved 100 ° C i 1 min i en varme blokk. Chill umiddelbart i isvann. Den 35 µL av DNA, legge til følgende: 50 µL 400 mM natrium cacodylate, 1 µL 10 mM DTT og vortex godt. Legge til 4 µL 25 mM CoCl2, 2,5 µL 2 mM 5-(3-aminoallyl)-dUTP fra ARES merking kit som angitt i tabellen materialer, 5 µL 1 mM dTTP, 18 µL 5 x TdT buffer, og 1 µL terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) 400 U / µL. Vortex og sentrifuger kort.
      FORSIKTIG: CoCl2 er giftig, ha passende beskyttelse.
    2. Inkuber 2 h på 37 ° C i en inkubator for å hindre kondensering. Legg 1 µL av 250 mM EDTA å stoppe reaksjon og vortex kort å blande. Etanol utløse tailed DNA som beskrevet ovenfor (trinn 2.3.2 - 2.3.4). Resuspend det tørket DNA pellet i 10 µL sterilt ultrapure H2O. Store DNA på 20 ° C til du er klar til å fortsette.
  5. Gjennomføre fluorescerende fargestoff Bøyning ved hjelp av DNA merking kit som angitt i tabellen materialer.
    Merk: Når fargestoff legges Hold prøver i mørket.
    1. Denature tailed DNA ved 95 ° C i 5 minutter i en varme blokk. Umiddelbart kule DNA i isvann og sentrifuger kort. Forberede merking buffer instruerte kit og legge til 6 µL hver DNA-prøve. Resuspend hver rør fargestoff i 4 µL av DMSO fra kit. Vortex og sentrifuger kort.
    2. Bruk en tube fargestoff for hver merking reaksjon. Legg fargestoff løsningen til DNA, vortex og sentrifuger kort. Inkuber merking reaksjonen ved romtemperatur for 2t i mørket. Legge 3 µL av 3M hydroksylamin å stoppe reaksjonen etterfulgt av 77 µL av nuclease-fri H2O fra kit. Vortex og sentrifuger kort.
  6. Fjerne ikke-konjugerte fargestoff bruker PCR rensing kit som angitt i tabellen av materialer. Følg produsentens instruksjoner. Elute DNA fra kolonnen to ganger med 40 µL av elueringsbufferen hver gang.
  7. Etanol utløse merket DNA som beskrevet tidligere (trinn 2.3.2 - 2.3.4). Resuspend tørket DNA pellet 10 µL elueringsrør buffer.
  8. Forbered sonde blanding
    1. For merket DNA, bestemme konsentrasjonen av fluorochrome fargestoff i pmol/µL. Fluorophore konsentrasjonen kan variere fra 30-100 pmol/µL, avhengig av BAC. DNA konsentrasjonen kan variere fra 300-800 ng/µL.
      Merk: Innstillingen microarray fungerer godt på en microvolume kommer som angitt i tabellen av materialer. I vinduet microarray Velg DNA-50, og angi fluorochrome.
    2. Opprette en master blanding ved å kombinere ekvimolare beløp (pmol fluor) av BAC sonder. Vortex 30 s før kombinere. For å unngå fryse/tine sykluser, forberede dele master mix, bruke parafin film til rør for å hindre fordampning, og lagre i mørket på 20 ° C.
      Merk: En mastermix som inneholder 250 pmol av 6 individuelle BAC sonder i et totalt volum på 30-50 µL fungerer godt. En aliquot som inneholder 25 pmol (fluor) for hver BAC vil være tilstrekkelig for to 40 µL hybridisering reaksjoner, med en siste sonde konsentrasjon av 0.31 pmol fluor/µL for hver BAC.

3. disseksjon og fiksering av Oocytes

  1. Samle 30 voksne jomfru kvinner av aktuelle genotype. For å berike for sent stadium oocytes, holde kvinner uten menn i ampuller med fly mat og tørr gjær for 3-5 dager før disseksjon25. Dagen før disseksjon, overføre kvinner uten gass til en ny medisinglass med gjær.
  2. Utføre dissection.
    Merk: Se Figur 3 for verktøy som trengs. Løsninger fjernes med en trakk Pasteur pipette ikke annet er oppgitt. Når du overfører eggstokkene alltid bruke en pipette tips belagt med en 10% BSA løsning.
    1. I et grunt dissecting fat som inneholder endret Robb buffer, bruke pinsett fjerne eggstokkene fra en enkelt kvinne. Bruk tang eller en tungsten nål å forsiktig splay hver eggstokk, slik at løsningen å kontakte indre ovarioles. Overføre par sprikende eggstokkene til en 1,5 mL microfuge rør som inneholder 1 mL endret Robb buffer.
    2. Gjenta trinn 3.2.1 å akkumulere eggstokkene fra 20-25 kvinner i 1,5 mL microfuge røret. Fullføre disseksjoner på 20-25 kvinner i 10 min.
  3. Utføre fiksering som følger.
    1. Med en trakk Pasteur pipette, Fjern væsken i microfuge røret, bruk en P1000 raskt legge 500 µL av 37 ° C fastsette løsning til eggstokkene, og deretter umiddelbart legge 500 µL av romtemperatur heptane til eggstokkene.
    2. Riste microfuge tube å blande og plasser på en nutator for 3 min. fjerne microfuge røret fra nutator og sted i en tube rack for 1 min at oocytes å bosette til bunnen. Den totale fiksering er 4 min.
      Forsiktig: Fastsette løsning og heptane er giftige, ha passende beskyttelse.
    3. Fjerne fastsette løsningen og skyll eggstokkene 3 ganger i 500 µL av PBS med 0,5% BSA og 0,1% Triton X-100 (PBSBTx)
  4. Gjenta for gjenværende genotyper.

4. fjerning av Chorions og eggeplomme membraner

Merk: Se Figur 3 for verktøy som trengs.

  1. Separat sent stadium oocytes
    1. Legge til 1 mL PBSBTx i et grunt dissecting fat. Bruke en P200 med BSA belagt tips for å overføre fast eggstokkene (i ~ 150 µL) til grunne parabolen. Pipetter eggstokkene opp og ned med BSA belagt pipette spissen å fjerne de eldre oocytes fra de færre modne oocytes.
    2. Når sent stadium oocytes skilles tilstrekkelig, overføre alle vev til en 500 µL microfuge tube. Fjerne overflødig væske med en trakk Pasteur pipette, etterlot om 150-200 µL i røret. Gjenta kapittel 4.1 for gjenværende genotyper.
  2. Forberede for rullende
    1. Pre våt en dypt godt parabolen med 200 µL av PBSBTx., og satt til side. Få 3 frostet glass lysbilder og angi lysbildet #3 til side. Forsiktig gni regionene frostet glass lysbilder #1 og #2 sammen. Skyll i deionisert vann for å fjerne noen glass skår og tørr med en engangs tørke.
    2. Coat frostet regionene lysbilder #1 og #2 med PBSBTx ved å legge 50 µL av PBSBTx til ett lysbilde og gni denne regionen andre lysbilde. Fjerne væske med en engangs tørke.
    3. Plass lysbildene under dissecting mikroskop i konfigurasjonen vist i figur 4A. Frostet regionene lysbilder #1 og #2 i kontakt med lysbildet #3 fortsette å støtte lysbilde #2.
  3. Rulle oocytes; Kontroller at retning av rullende er alltid i en rett linje, og aldri en sirkelbevegelse.
    1. Prewet en P200 pipette tips i PBSBTx og spre oocytes i microfuge tube av pipettering opp og ned. Overføre 50 µL av flytende inneholder oocytes til midten av delen frostet glass lysbilde #1. Løft lysbilde #2 å gjøre dette.
    2. Sakte senke lysbilde #2 til overflatespenning av væsken skaper en sel mellom de to frostet glass regionene. Det bør være nok væske å frostet, men ingen skal være siver ut. Hvis væsken er overfylte, bruk en trakk Pasteur pipette for å fjerne overflødig væske.
    3. Holde bunnen lysbildet (#1) på plass med én hånd og bruk derimot for å flytte det øverste lysbildet (#2) og tilbake i en vannrett retning, holder lysbilde #2 nivå og støttes på lysbildet #3. Utføre under et mikroskop for enkel visualisering oocyte bevegelser og fremgang.
      Merk: Denne bevegelsen vil generere friksjon og forårsake oocytes å "rulle" og miste sine chorions. Minimal trykk bør brukes og bevegelser burde være korte og raske.
    4. Etter noen bevegelser i horisontal retning, litt endre vinkelen på bevegelse (figur 4B). I flere trinn, gradvis øke denne vinkelen til 90° til bevegelse av det øverste lysbildet (#2) er vinkelrett på Start retningen (figur 4B). Merk at tomme chorions vil vises i væsken og oocytes mangler chorions vises lengre og tynnere.
    5. Gjenta trinn 4.3.3 - 4.3.4 ca 7 - 10 ganger til løsningen blir litt skyet. Stopp rulle når fleste av oocytes (75-85%) synes å ha mistet sin eggeplomme membraner.
      Merk: En særegen spisse enden er ofte synlige på oocytes mangler eggeplomme membraner. Eggeplomme membraner er vanskeligere å fjerne enn chorions. Lett trykk kan brukes på det øverste lysbildet (Skyv #2) mens du ruller for å oppnå fjerning av eggeplomme membraner. Prøver å fjerne eggeplomme membraner fra alle oocytes ofte resulterer i ødeleggelse av andre oocytes.
    6. Dra ett av hjørnene til midten av regionen frostet nederste lysbildet (#1) slik at rullet oocytes akkumuleres i midten av regionen frostet løft det øverste lysbildet (#2). Skyll oocytes fra både lysbilder med PBSBTx i deep dish godt som inneholder PBSBTx.
    7. Rengjør lysbilder #1 og #2 med ultrapure vann, tørr med en engangs tørke, og Tilbakestill. Gjenta trinn 4.3.1 - 4.3.6 før alle oocytes av samme genotype har blitt rullet. Dette krever vanligvis 3-4 rundene av rullende per genotype.
  4. Fjerne rester etter rulle
    1. Legge til 1 mL PBSBTx en 15 mL konisk rør. Swirl væsken å coat sidene av røret.
    2. Bruke en PBSBTx belagt P1000 pipette tips, overføre de rullet oocytes fra dypet vel rett til konisk røret som inneholder 1 mL av PBSBTx. Legg til en ekstra 2 mL PBSBTx til konisk røret som inneholder oocytes.
    3. La oocytes begynne å bosette til bunnen, ta av toppen 2 mL løsningen inneholder rusk (chorions, vitellines, etc.) med en P1000 og forkaste. Hvis nødvendig, holde konisk røret mot en mørk bakgrunn å se de ugjennomsiktig oocytes som de synke.
    4. Legge til en ekstra 2 mL PBSBTx av oocytes, og gjenta trinn 4.4.3. Gjenta 4.4.3. totalt 3 omg av rusk fjerning.
    5. Bruke en PBSBTx belagt P1000 pipette tips, overføring oocytes tilbake til den opprinnelige 500 µL microfuge tuben. 20 - 25 kvinner skal gi ca 50 µL av rullet eldre oocytes.
  5. Gjenta seksjon 4 for de gjenværende genotyper bruker ferske frostet lysbilder, en ren dypt godt rett og en ny konisk tube for hver genotype.
  6. Hvis lagring er nødvendig, overføre oocytes til 1 x PBS med 0,1% TritionX-100 og store overnatting på 4 ° C. Langtidslagring anbefales ikke fordi formaldehyd crosslinking kan reverseres ved ikke-ioniske vaskemidler.

5. FISK

Merk: Alle vasker utføres på et nutator ved romtemperatur med mindre annet er angitt. Oocytes som er blitt rullet ta lengre tid å bosette til bunnen av microfuge røret, spesielt i som inneholder formamide. Det er viktig å være tålmodig når du endrer løsninger slik at oocytes ikke er tapt i prosessen. Dette krever venter på 5-15 minutter å la oocytes bosette seg etter skyller og vasker. Også oppmerksom på at oocytes i formamide er mindre ugjennomsiktig.

  1. Utvinning og RNAse behandling
    1. Skyll oocytes med 500 µL av PBS med 1% Triton X-100 (PBSTx). Fjern væsken og legge 500 µL utvinning Buffer (PBSTx med RNAse). Ruge på nutator ved romtemperatur for 2T.
  2. Pre hybridisering vasker
    1. Skyll oocytes 3 ganger med 500 µL 2 x Saline natriumsitrat inneholder mellom 20 (SSCT). Forvarm en aliquot (~ 500 µL/anleggspreg) 2 x SSCT + 50% formamide til 37 ° C.
      Forsiktig: formamide er giftig, ha passende beskyttelse.
    2. Vask oocytes 3 ganger i 10 min hver i 500 µL 2 x SSCT. Legg oocytes i 10 min i 500 µL 2 x SSCT + 20% formamide. Legg oocytes i 10 min i 500 µL 2 x SSCT + 40% formamide. Legg oocytes i 10 min i 500 µL 2 x SSCT + 50% formamide.
    3. Fjern væsken og legge 500 µL av 37 ° C 2 x SSCT + 50% formamide fra trinn 5.2.1 Oppgi og ruge 2 h på 37 ° C med rotasjon.
      Merk: En hybridisering ovn utstyrt med et rotator fungerer godt for dette. Et skum microfuge rør "flyt" knyttet til rotator kan brukes å sikre rørene.
  3. Rødsprit og blanding
    1. For hver tube oocytes, bruker du 40 µL 1 x hybridisering bufferen som inneholder 2,5 ng/µL centromeric sonde og 0.31 pmol fluor/µL av hver BAC probe. Forberede en løsning av sonden hybridisering buffer tilstrekkelig for alle genotyper. Vortex sonde blanding 30 s før du legger til.
    2. Bruke et BSA-belagt P200 pipette tips, overføre oocytes til en 200 µL PCR rør. Holde eksempler på 37 ° C og la oocytes bosette til bunnen, så bruk en trakk Pasteur pipette fjerne så mye væske som mulig.
    3. Legge til 40 µL av hybridisering løsning som inneholder sonden (forberedt i § 2) å oocytes. Sett PCR røret som inneholder oocytes i PCR maskinen og Inkuber som følger: 37 ° C i 5 min, 92 ° C i 3 minutter, deretter 37 ° C over natten. Når proben er lagt til i oocytes, holde dem i mørket som mulig.
  4. Etter hybridisering vasker
    1. Forvarm 2 x SSCT + 50% formamide 37 ° c og holde det i hybridisering inkubator. Med en BSA belagt P200 Pipetter tips, legge til 100 µL av 37 ° C 2 x SSCT + 50% formamide til PCR røret med oocytes og overføre oocytes til en ny 500 µL microfuge tube.
    2. Legge til en ekstra 400 µL av 37 ° C 2 x SSCT + 50% formamide til samme rør og la oocytes bosette seg på 37 ° C i inkubator.
      Merk: Settling ofte tar lengre tid på dette trinnet. Det er ikke uvanlig å ta 15 minutter eller lenger. Manglende tålmodighet vil resultere i betydelige tap av oocytes.
    3. Vask oocytes 3 ganger for 20 min i 500 µL 37 ° C 2 x SSCT + 50% formamide på 37 ° C med rotasjon. Hold oocytes på 37 ° C mens de bunnslår.
    4. Vask oocytes 3 ganger i 10 min hver i 500 µL 37 ° C 2 x SSCT + 50% formamide på 37 ° C med rotasjon. Hold oocytes på 37 ° C mens de bunnslår.
    5. Romtemperatur, vaskes oocytes i 10 min i 500 µL 2 x SSCT + 40% formamide på en nutator. Legg oocytes i 10 min i 500 µL 2 x SSCT + 20% formamide. Vask oocytes i 10 min i 500 µL 2 x SSCT.
  5. Flekker med DAPI
    FORSIKTIG: DAPI er giftige, ha passende beskyttelse.
    1. Vask oocytes etter 20 min i 500 µL DAPI løsning (1 µg/ml) i 2 x SSCT på nutator. Skyll oocytes 3 ganger i 500 µL 2 x SSCT. Vask oocytes 2 ganger i 10 min hver i 500 µL 2 x SSCT på nutator. Eksempler kan lagres opp til 4 h ved romtemperatur i mørket før de er klare til å montere på coverslips.
  6. Montering
    Merk: Se Figur 3 for verktøy som trengs.
    1. Plass en poly-L-lysine belagt dekkglassvæske under dissecting mikroskop. Fjern væsken fra tube oocytes, justere det totale volumet til 150 µL. Med en BSA belagt P200 pipette tips, pipette opp og ned å spre oocytes i løsningen og deretter overføre 40 µL av oocytes/løsningen til en poly-L-lysine belagt dekkglassvæske.
    2. Fjern noen av væsken fra dekkglassvæske med en trakk Pasteur pipette til oocytes holde til i dekkglassvæske, men fremdeles er omgitt av væske. Med tang, hold nede cover slip på den ene siden og bruk en tungsten nål å forsiktig dissociate klumper av oocytes, flytte dem å oppnå en enkelt lag av ikke-overlappende oocytes.
    3. Fjerne resten av væske rundt oocytes med en trakk Pasteur pipette. Ta en ren objektglass og bruk komprimert gass for å blåse av støv. Legge til 22 µL av montering media (f.eksProlong-gull) til midten av lysbildet. Sakte senke lysbildet mot dekkglassvæske, med montering media mot prøven, til media berører prøven. Overflatespenning vil føre dekkglassvæske å følge lysbildet.
    4. Plasser lysbilder i en plastboks med tettsittende lokk som inneholder et lag av frisk dessicant (f.eks, drierite). La lysbilder tørke i 3-5 dager i mørket før bildebehandling. Tørketid kan variere etter luftfuktigheten i rommet.

6. imaging

  1. Ved å fjerne tørr lysbilder i boksen for dessicant, rengjør du dem for å fjerne støvpartikler. Forsegle coverslips med neglelakk. Forseglet lysbilder kan lagres på ubestemt tid på 20 ° C.
  2. Erverve laserskanning AC confocal bilder ved hjelp av en høy numeriske blenderåpning 40 X oljeobjektiv med 6 X digital bratt stigning.
    Merk: Ideelt systemprogramvaren vil tillate en å finne og markere hvor XY meiotic kromosomene for flere oocytes mens de bruker epifluorescence. Denne funksjonen sparer tid under en tenkelig. Rask bleking med en høy numeriske blenderåpning 60 X mål gjort bruken uegnet med valgte AC confocal systemet, men det fungerer for andre systemer.
  3. Fange en Z serie for hver oocyte, angi øverst og nederst i serien med DAPI signalet.
    Merk: Få, offset, og laser makt må bestemmes empirisk et delsett av oocytes. Når egnet parametere finnes, bør bare mindre justeringer må gjøres.
    Hvis endret oppkjøpet innstillinger kreves, bruk den tidligere innsamlede bildestakk til å beregne de nødvendige endringene. For å unngå bleking, avstå fra pre-tenkelig arm sonden før opptak Z-serien. Trinn størrelse på 0,25 µm, Z-serien vanligvis varierer fra 25 til 30 fremgangsmåten avhengig av retning og plassering av kromosomene. Mindre trinn størrelse kan forbedre ens evne til å vurdere om to fisk steder er separert i aksial dimensjon, men det er en avveining med tiden det tar å fange mindre trinn og tap av signal intensitet på grunn av bleking. En 40 X målsetting med 6 X digital zoom og en 1024 x 512 bildefelt genererer bilder med en pikselstørrelse på 0,05 µm.

7. image analyse og scoring samhold feil

  1. Deconvolve Z-serien for å optimalisere signalet til støyforhold for hver oocyte19.
    Merk: En programvarepakke som angitt i Materialet tabellen gjør det mulig å deconvolve med integrerende restaurering, samt beskjære og kontrast-forbedre bilder. Viktigst, er en programvarepakke som gjør det mulig å vise bilder og score samhold feil i tre dimensjoner viktig.
  2. For hver oocyte, tabulere arm og centromeric fokus som colocalize med DAPI-signalet. Tap av samhold resulterer i tre eller fire distinkte og separate signaler for en bestemt sonde. Det er ikke uvanlig å observere to foci som er koblet i en tynn tråd. Av de strengeste vilkårene betraktes disse foci ikke "skilt".

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 5 viser bilder med en arm sonde som arten til fargemaskin regionen 6E-7B på X -kromosomet. Dette sonde resulterer i et signal som co regionaliserer med at av DAPI, er lett skilles fra bakgrunnen, og har vært brukt med hell å kvantifisere arm samhold defekter i ulike genotyper19. Kvantifisering av samhold feil var begrenset til prometaphase jeg og metaphase jeg stadier; oocytes før kjernefysiske konvolutten sammenbrudd ble ekskludert fra analyse19. En intakt kjernefysiske konvolutten er tydelig når skanning i DAPI kanalen fordi oocyte kromosomene omgitt av et diskret sirkulært område som er mørkere enn omkringliggende cytoplasma.

Figur 5B viser maksimale intensitet projeksjoner av personlige Z-serien etter deconvolution og kontrast ekstrautstyr. Kvantifisering av samhold feil krever utslagsgivende for hver probe antall fisk signaler som overlapper med DAPI signalet. Slik analyse er visualisering av flettede bilder i tre dimensjoner viktig. Bare fisk flekker som er klart knyttet DAPI signalet i alle tre dimensjoner må være inkludert i analysen.

Intakt søster chromatid samhold er dokumentert som to fisk plasser for både armen og pericentric sonder (figur 5B, venstre). Oocytes inneholder tre eller fire atskilt fisk plasser for enten sonde er vurdert å ha samhold feil (figur 5B, høyre). For å bli klassifisert som enkeltsteder, må to fisk signaler være minimal atskilt i alle tre dimensjoner av avstand svarer til diameteren på den minste plass. Tynn svak tråder forbinder to fisk flekker er ikke uvanlig. Slike signaler anses ikke helt atskilt, og derfor regnes ikke som forekomster av samhold defekter.

Med 6E-7B arm hybridisering sonden var ca 15-20% av oocytes fotografert fullstendig manglet signal eller signalet for svak trygt scorer. I tillegg omtrent 5% av oocytes fotografert viste et stort område av diffus chromosomal signal og dette ble forkastet fra analyse. Derimot var det sjelden å møte oocytes som pericentric hybridisering signalet var mangler eller for diffus å score.

6E-7B arm sonden har vært brukt mye å kvantifisere arm samhold mangler i prometaphase og metaphase jeg arrestert Drosophila oocytes av ulike genotyper19. Når cohesin delenhet SMC3 ble slått ned i midten av prophase, 16.3% av de eldre oocytes analysert inneholdt større enn to arm flekker, indikativ av tidlig tap av armen samhold. I kontrast, observerte vi separerte arm flekker i bare 5,1% av oocytes som inneholdt normale nivåer av SMC319. Interessant, selv om frekvensen av armen samhold mangler ble i flere knockdown genotyper, søster chromatids ble sjelden skilt i deres pericentric regioner19.

Figure 1
Figur 1: Alder-avhengige tap av samhold under utvidet prophase jeg arrestere av kvinnelige meiose kan resultere i feil i kromosom segregering og aneuploidy i egget. Samholdet representeres av svarte mellom chromatids. Arm samhold funksjoner for å holde rekombinant homologs sammen og kreves for nøyaktig segregering på anaphase jeg. Hvis arm samhold går tapt for tidlig, kan kromosom missegregation oppstå, som resulterer i en aneuploid egg. Dette tallet ble referanse19. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: størrelsen på DNA molekyler etter BAC fragmentering og forsterkning (venstre) og etter begrensning enzym fordøyelsen (høyre) for tre ulike BACs. 400 ng forsterket DNA produkter vises i de tre første banene. De tre siste banene viser DNA bruddstykker etter natten begrensning sammendraget. Forsterket DNA produkter spenner fra 200 bp opptil 3 kb. Etter begrensning sammendraget, de fleste fragmenter varierte fra 100-200 bp, men større fragmenter (opptil 500 bp) var synlig. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: cytologi verktøy. Verktøy som brukes i protokollen: (1) par pinsett (#5 Dumont); (2) tungsten nål; (3) dyp brønn rett med det. (4) grunne glass dissekere rett; (5) trakk Pasteur pipette. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4. Ordningen og bevegelse av lysbilder for rullende oocytes. (A) av lysbildet satt opp for bølgende oocytes som beskrevet i protokollen. Mørkere området angir delen frostet glass i lysbildet. (B) retning av bevegelsen vektorer for lysbilde #2 under oocyte rullende. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5. FISK analysen resultatene. (A) skjematisk viser Drosophila X -kromosom og hvor de to arm sonder (6 BBS hver) og 22 oligonucleotide pericentromeric sonden beskrevet i protokollen hybridize. For enkelhet, 6E-7B sonden er merket 7B og 2F - 3C sonden er 3C. (B) representant bilder av fisk resultater (6E-7B sonde) for intakt arm samhold (to arm sonde flekker, ett per homolog) og forstyrret arm samhold (tre til fire arm sonde flekker). DNA er blå, arm sonde signalet er gule og pericentric sonde signalet er rød. Bilder tilsvarer maksimale intensitet projeksjoner av Z-serien etter deconvolution og kontrast ekstrautstyr. Skala bar = 2 µm. Dette tallet ble referanse19. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bruk av fisk sonder for å vurdere arm samhold i prometaphase jeg og metaphase jeg Drosophila oocytes er en betydelig forfremmelse i feltet av Drosophila meiose. Historisk har Drosophila forskere vært begrenset til genetiske tester å antyde tidlig tap av armen samhold i eldre oocytes11,18,19. Nå, med metodene som presenteres her, delstaten arm samhold kan være assayed direkte med fisk. Muligheten til å få fysiske bevis for tidlig tap av armen samhold sterkt utvider repertoaret av tilgjengelig å studere mekanismer som fører til tidlig tap av armen samhold og kromosom missegregation i Drosophila oocytes.

Avgjørende skritt
Selv om vi ikke har utført en systematisk analyse av kritiske parametere som er nødvendige for vellykket visualisering av en fluorescerende sonde som arten i enkeltutgave sekvenser langs kromosom armen i eldre Drosophila oocytes, tilbys det følgende liste over faktorer som kan ha bidratt til suksessen til denne teknikken. Vil generere arm sonden, vi brukte en kombinasjon av seks overlappende BAC sonder som dekker et intervall på omtrent 0.8 Mb på X-kromosomet arm. Vårt første forsøk med færre BACs som strakte seg over et mindre område var ikke vellykket. I tillegg har vi brukt en metode å fragmentere og forsterke BAC DNA før slutten-merking med Alexa-647. Fleste av begrensning som ble kalt var 100-200-bp lenge (figur 2), noe som stemmer godt målet størrelsen på 150 nukleotider som er nødvendig for effektiv spredning gjennom tykk vev21. Fiksering forhold som bevare morfologi av den store Drosophila oocyte, men også tillate sonde penetrasjon er viktig. Vi har endret våre tidligere brukte fiksering metoden23 ved å legge til romtemperatur heptane en fastsette løsning forvarmet til 37 ° C. Vi tror det er mulig at både tillegg av heptane å øke penetrasjon gjennom eggeplomme membranen samt senket temperaturen for fiksering bidratt til vellykket fiksering betingelser for visualisering av armen samhold.

Når assaying for tidlig tap av samhold, krever en utvalgsstørrelsen der kvantifisering av defekter som finnes på lav til moderat nivå. For å få et stort antall eldre oocytes, har andre brukt blender forstyrrelse av voksne hunner kombinert med sikting 26,27. Her vi beskriver en metode for hånden analysere eggstokkene fra 20-25 kvinner, med manuell separasjon av scenen oocytes av pipettering. Mens metoden blender/sikting bør også arbeide med denne protokollen, er ettall fordel av hånd disseksjon at uten det sieving trinnet, oocytes bruker mindre tid i bufferen før fiksering, som reduserer sjansen for anaphase jeg utbruddet på grunn av kunstige egg aktivisering. Dessuten, denne metoden krever færre kvinner som starter materiale, bruker mindre mengder reagenser, og har en enklere arbeidsflyt, alle lette bearbeiding flere genotyper.

Hånd disseksjon og manuell separasjon av eldre oocytes gir tilstrekkelige mengder oocytes "rulle" for plasmocitara og eggeplomme membran fjerning og resulterer i ca 75-150 oocytes på slutten av hybridisering vasker. Ett triks å maksimere avkastningen av metaphase jeg arrestert oocytes er å holde jomfru kvinner i yeasted ampuller i fravær av menn før disseksjon25. Oocyte rulle for å fjerne chorions og eggeplomme membraner må utføres med en mild berøring for å unngå å ødelegge oocytes. Imidlertid fjerne chorions og eggeplomme membraner fra 100% av oocytes er ikke en realistisk mål og overdreven rullende bare resulterer i tap av oocytes. Derfor hver rullende syklus bør stoppes når ca 75-85% av oocytes mangel chorions og eggeplomme membraner.

Begrensninger
Til tross for vår suksess på genererer og bruker arm sonder for å overvåke tilstanden til samhold i eldre Drosophila oocytes, lider prosedyren fortsatt av begrensninger. Mens vi ikke sjelden finner et signal for pericentromeric sonden, arm sonde signalet var svakt eller mangler i ca 15-20% av oocytes at vi fotografert. En medvirkende faktor kan være differensial penetrasjon av pericentric oligonucleotide sonden (22-28 nukleotider) versus større arm sonden (100-200 nukleotider). Dessuten, store repeterende sekvensen anerkjent av pericentric sonde resultatene i et signal som er lysere enn for arm sonden. Retningen på oocyte og plassering av meiotic kromosomer i oocyte også presentere en utfordring når imaging. Selv meiotic kromosomene er relativt nær cellen cortex, er det umulig å styre retningen på oocyte ved montering på dekkglassvæske. Derfor, i en brøkdel av oocytes, meiotic kromosomene kan være 100-200 µm fra dekkglassvæske og signal intensiteten og kvalitet kan påvirkes negativt når du prøver å image igjennom meste av oocyte. Disse begrensningene bety at antallet oocytes som er inkludert i den endelige kvantitativ analysen er betydelig lavere enn oocytes behandlet i protokollen. Å bestemme tilstanden av armen samhold i 100 oocytes vil mest sannsynlig kreve to uavhengige forberedelser. En ytterligere begrensende faktor i kvantifisere samhold defekter ved hjelp av en laser skanning AC confocal mikroskopet er tiden det tar å fange en typisk Z-serien (ca 5 min), selv når fanget området er begrenset til 1024 x 512 bildepunkter. Dette betyr at sammenligning av samhold i kontroll og eksperimentelle genotyper (100 oocytes hver) vil nødvendiggjøre ca 16 h bilde samlingen tid.

Endringer og feilsøking
Vi har vært i stand til å overvåke tilstanden til arm samhold bruker en sonde som gjenkjenner X -kromosomet fargemaskin posisjon 6E-7B19. En sonde som arten på en mer distale X -kromosomet kan være mer ønskelig for å oppdage feil på chiasma vedlikehold. I tillegg kan andre forskere vil analysere arm samholdet om andre kromosomer. Mens vi ikke har forsøkt å undersøke autosomes, indikerer de foreløpige dataene at en sonde som gjenkjenner regionen 2F - 3C på X -kromosomet også fører til en detectable signal. Men kan basert på begrenset foreløpige data, signalet fra sonden 2F - 3C være mindre "compact" enn for 6E-7B sonden. Selv om FISKEN signalene er stramt og klar for noen oocyte kromosomer, er hybridisering signalet på kromosomene av andre oocytes betydelig mer diffus. Om disse forskjellene i signal gjenspeile ekte kromosom morfologi mellom de to fargemaskin plasseringene, variasjon i hybridisering effektiviteten av to sonder, eller bare Stokastisk variasjon mellom ulike oocytes vil kreve en grundigere analyse.

Viktigere, selv for 6E-7B proben, observerte vi en diffus chromosomal signalet i noen oocytes, og dette ofte nødvendiggjort deres utelukkelse fra analyse. I tillegg har vi lagt merke til variasjoner signalkvaliteten og lysstyrke mellom forskjellige preparater av 6E-7B sonden og dette krevde at imaging parametere justeres tilsvarende. Øke hybridisering temperaturen til 42 ° C ikke redusere antall oocytes med diffus signal, men det påvirke alvorlig signalet for pericentric oligonucleotide sonden. I et forsøk på å bedre bevare kromosom morfologi24, vi også prøvde en lengre rødsprit trinn ved lavere temperatur (80 ° C), men fant at denne behandlingen verken økt signal intensiteten eller redusert antall oocytes med diffus chromosomal fisk signal. Vi også forsøkte å få et klarere arm-signal ved hjelp av 12 overlappende BACs tilsvarer en ca 1,5 Mb intervallet som spredte fargemaskin regionen 5E-7B. Når du bruker en 12 BAC sonde, var graden av variasjon i signal intensitet og prosentandelen av oocytes mangler signal ikke annerledes enn når seks BACs ble brukt til å lage arm sonden. Det var også mer utfordrende å score samhold feil når du bruker 12 BAC sonden fordi fisk signalene ble større, gjør det vanskeligere å løse flekker tilsvarer personlige chromatids. I tilfeller der ingen signal er oppnådd med en nylig utarbeidet sonde forskere bør sjekke størrelsen på forsterket og begrensning fordøyd BAC DNA for å bekrefte at fragmenter brukes til slutt merking er hovedsakelig innenfor 100-200 bp området. Dette er sannsynligvis en av de viktigste faktorene i vellykket sonde forberedelse.

Fremtidige retninger
Fremtidige arbeid å forbedre bildeopptak samt tilpasse protokollen for å inkludere immunostaining ville være store forbedringer som ville gagne andre forskere. Under bildet samling, ville samle et større antall bilder i aksial dimensjon så vel som raskere bildeopptak være fordelaktig for kvantifisere samhold defekter. Optimalisere tenkelig parameterne for laser skanning AC confocal, fant vi at 0,25 µm var den minste trinn størrelsen som kan brukes for Z-serien for å unngå merkbar bleking av FISKEN signaler. Men for fisk signaler som er atskilt med mindre enn 0,25 µm i Z-stakken, denne steg størrelse kan føre til manglende evne til å fange "rommet" mellom fokuspunktene og kan derfor undervurdere antall samhold defekter. Raskere bildet oppkjøpet hastigheten på en roterende plate AC confocal kan mindre trinn størrelser brukes uten signal bleking. Dette vil gi mer nøyaktige bildet gjenoppbygging i aksial dimensjon samt tillate større antall oocytes som skal analyseres samhold feil. I tillegg ville muligheten til å kombinere immunostaining med fisk visualisering av armen samhold betydelig styrke protokollen. For en rekke preparater prøvde vi å utføre spindel immunostaining fremgangsmåten hybridisering. Men var robust spindel flekker synlig i bare en brøkdel av oocytes. Videre grunner som ikke er klare, omgitt høyere nivåer av falske fisk signaler meiotic kromosomene fisk og immunostai-ble kombinert. Videre arbeid å optimalisere protokollen for å tillate immunostaining enten før eller etter fisk prosedyren vil utvide evnen til denne teknikken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av NIH Grant GM59354 til Sharon E. Bickel. Vi takker Huy Q. Nguyen for hjelp til å utvikle protokollen for å generere fluorescerende arm sonder, Ann Lavanway hjelp med AC confocal mikroskopi og J. Emiliano Reed for teknisk assistanse. Vi takker også mange kolleger i Drosophila samfunnet for nyttig diskusjoner og råd.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Kits
Midi Prep kit Qiagen 12143 Prep BAC clone DNA
GenomePlex Complete Whole Genome Amplification (WGA) Kit Sigma WGA2 Amplify BAC clone DNA
ARES Alexa Fluor 647 DNA labeling kit Invitrogen A21676 Label BAC clone DNA
PCR purification kit Qiagen 28104 Remove non-conjugated dye following labeling of BAC clone DNA
Name Company Catalog Number Comments
Chemicals & Solutions
Note: All solutions are prepared using sterile ultrapure water and should be sterilized either by autoclave or filter sterilization.
Bovine serum albumin (BSA) Fisher Scientific BP1600-100 Prepare 10% stock
Freeze aliquots
Calcium chloride Fisher Scientific C75-500
DAPI (4’, 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Invitrogen D1306 Toxic: wear appropriate protection. Prepare 100µg/ml stock in 100% ethanol, store in aliquots at -20 °C. Prepare 1 µg/ml solution in 2X SSCT before use.
Dextran sulfate Sigma D-8906
Drierite Drierite Company 23001
Dithiothreitol (DTT) Invitrogen 15508-013 Prepare 10 mM stock
dTTP (10 µmol, 100 µl) Boehringer Mannheim 1277049 Prepare 1 mM stock
EDTA (Disodium ethylenediamine tetraacetic acid) Fisher Scientific S311-500 Prepare 250 mM stock
100% ethanol (molecular grade, 200 proof) Decon Laboratories 2716
Tris (Ultra Pure) Invitrogen 15504-020
EGTA (Ethylenebis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid) Sigma E-3889
16% formaldehyde Ted Pella, Inc. 18505 Toxic: wear appropriate protection
Formamide Invitrogen AM9342 Toxic: wear appropriate protection
Glucose Fisher Scientific D16-1
Glycogen Roche 901393
HEPES Boehringer Mannheim 737-151
Heptane Fisher Scientific H350-4 Toxic: wear appropriate protection.
Hydrochloric acid Millipore HX0603-4 Toxic: wear appropriate protection.
Hydroxylamine Sigma 438227 Prepare 3 M stock
4.9 M Magnesium chloride Sigma 104-20
Na2HPO4 Ÿ 7H2O Fisher Scientific S373-500
NaH2PO4 Ÿ 2H2O Fisher Scientific S369-500
Poly-L-lysine (0.1mg/ml) Sigma P8920-100
Potassium acetate Fisher Scientific BP364-500
Sodium acetate Fisher Scientific S209-500 Prepare 3M stock
Sodium cacodylate Polysciences, Inc. 1131 Toxic: wear appropriate protection. Prepare 400mM stock
Sodium citrate Fisher Scientific BP327-1
Sodium chloride Fisher Scientific S271-3 Sodium chloride
Sucrose Fisher Scientific S5-500
10% Tween 20 Thermo Scientific 28320 Surfact-Amps
10% Triton X-100 Thermo Scientific 28314 Surfact-Amps
Name Company Catalog Number Comments
Solutions
Note: All solutions are prepared using sterile ultrapure water and should be sterilized either by autoclave or filter sterilization.
TE buffer 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH = 8.0
20X SSC (Saline Sodium Citrate) 3 M NaCl, 300 mM sodium citrate
2X cacodylate fix solution Toxic: wear appropriate protection. 200 mM sodium cacodylate, 200 mM sucrose, 80 mM sodium acetate, 20 mM EGTA
1.1X Hybridization buffer 3.3X SSC, 55% formamide, 11% dextran sulfate
Fix solution Toxic: wear appropriate protection. 4% formaldehyde, 1X cacodylate fix solution
PBSBTx 1X PBS, 0.5% BSA, 0.1% Trition X-100
PBSTx 1X PBS, 1% Trition X-100
Extraction buffer (PBSTx + Rnase) 1X PBS, 1% Trition X-100, 100 µg/mL RNase
2X SSCT 2X SSC, 0.1% Tween 20
2X SSCT + 20% formamide Toxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 20% formamide
2X SSCT + 40% formamide Toxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 40% formamide
2X SSCT + 50% formamide Toxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 50% formamide
Name Company Catalog Number Comments
Enzymes
AluI New England Biolabs R0137S
HaeIII New England Biolabs R0108S
MseI New England Biolabs R0525S
MspI New England Biolabs R0106S
RsaI New England Biolabs R0167S
BfuCI New England Biolabs R0636S
100X BSA New England Biolabs Comes with NEB enzymes
10X NEB buffer #2 New England Biolabs Restriction enzyme digestion buffer. Comes with NEB enzymes
Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) 400 U/µl Roche/Sigma 3333566001
TdT buffer Roche/Sigma Comes with TdT enzyme
Cobalt chloride Roche/Sigma Toxic: wear appropriate protection. Comes with TdT enzyme
RNase A (10 mg/mL) Thermo-Scientific EN0531
Name Company Catalog Number Comments
Cytology Tools etc.
Forceps Dumont #5 INOX, Biologie
9” Disposable glass Pasteur pipettes Fisher 13-678-20C Autoclave to sterilize
Shallow glass dissecting dish Custom made
Deep well dish (3 wells) Pyrex 7223-34
Fisherfinest Premium microscope slides Fisher Scientific 22-038-104 Used to cover deep well dishes
Frosted glass slides, 25 x 75 mm VWR Scientific 48312-002
Glass slides, 3 x 1 in, 1 mm thick Thermo-Scientific 3051
Coverslips, 10 x 10 mm, No. 1.5 Thermo-Scientific 3405
Tungsten needle homemade
Prolong GOLD mounting media Molecular Probes P36930
Compressed-air in can Various
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
PCR machine Various
Nanodrop 2000, spectrophotometer Thermo-Scientific microvolume spectrophotometer
Vortexer Various
Table top microfuge at room temperature Various
Table top microfuge at 4 °C Various
Heat block Various
Hybridization oven or incubator with rotator Various
Nutator Various
A1RSi laser scanning confoal Nikon 40X oil Plan Fluor DIC (NA 1.3)
Name Company Catalog Number Comments
Consumables etc.
50 mL conical tubes Various
15 mL conical tubes Various
1.5 mL microfuge tubes Various
500 µl microfuge tubes Various
200 µl PCR tubes Various
Plastic container with tight fitting lid Various To hold Drierite
Kimwipes Various disposable wipes
Parafilm Various paraffin film
Name Company Catalog Number Comments
Other
HPLC purified 5'-labeled oligonucleotides Integrated DNA Technologies Cy3-labeled probes that recognize the 359 bp satellite repeat of the X chromosome
Volocity 3D Image Analysis Software PerkinElmer Version 6.3

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Peters, J. M., Nishiyama, T. Sister chromatid cohesion. CSH Perspect Biol. 4 (11), (2012).
  2. McNicoll, F., Stevense, M., Jessberger, R. Cohesin in gametogenesis. Curr Top Dev Biol. 102, 1-34 (2013).
  3. Buonomo, S. B., et al. Disjunction of homologous chromosomes in meiosis I depends on proteolytic cleavage of the meiotic cohesin Rec8 by separin. Cell. 103 (3), 387-398 (2000).
  4. Bickel, S. E., Orr-Weaver, T., Balicky, E. M. The sister-chromatid cohesion protein ORD is required for chiasma maintenance in Drosophila oocytes. Curr. Biol. 12 (11), 925-929 (2002).
  5. Hodges, C. A., Revenkova, E., Jessberger, R., Hassold, T. J., Hunt, P. A. SMC1beta-deficient female mice provide evidence that cohesins are a missing link in age-related nondisjunction. Nat Genet. 37 (12), 1351-1355 (2005).
  6. Freeman, S. B., et al. The National Down Syndrome Project: design and implementation. Public Health Rep. 122 (1), 62-72 (2007).
  7. Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nat Rev Genet. 13 (7), 493-504 (2012).
  8. Angell, R. R. First-meiotic-division nondisjunction in human oocytes. Am. J. Hum. Genet. 61, 23-32 (1997).
  9. Tsutsumi, M., et al. Age-related decrease of meiotic cohesins in human oocytes. PLoS One. 9 (5), e96710 (2014).
  10. Liu, L., Keefe, D. L. Defective cohesin is associated with age-dependent misaligned chromosomes in oocytes. Reprod Biomed Online. 16 (1), 103-112 (2008).
  11. Subramanian, V. V., Bickel, S. E. Aging predisposes oocytes to meiotic nondisjunction when the cohesin subunit SMC1 is reduced. PLoS Genet. 4 (11), e1000263 (2008).
  12. Chiang, T., Duncan, F. E., Schindler, K., Schultz, R. M., Lampson, M. A. Evidence that weakened centromere cohesion is a leading cause of age-related aneuploidy in oocytes. Curr. Biol. 20 (17), 1522-1528 (2010).
  13. Lister, L. M., et al. Age-related meiotic segregation errors in mammalian oocytes are preceded by depletion of cohesin and Sgo2. Curr. Biol. 20 (17), 1511-1521 (2010).
  14. Duncan, F. E., et al. Chromosome cohesion decreases in human eggs with advanced maternal age. Aging Cell. 11 (6), 1121-1124 (2012).
  15. Yun, Y., Lane, S. I., Jones, K. T. Premature dyad separation in meiosis II is the major segregation error with maternal age in mouse oocytes. Development. 141 (1), 199-208 (2014).
  16. Subramanian, V. V., Bickel, S. E. Heterochromatin-mediated association of achiasmate homologues declines with age when cohesion is compromised. Genetics. 181, 1207-1218 (2009).
  17. Jeffreys, C. A., Burrage, P. S., Bickel, S. E. A model system for increased meiotic nondisjunction in older oocytes. Curr. Biol. 13 (6), 498-503 (2003).
  18. Weng, K. A., Jeffreys, C. A., Bickel, S. E. Rejuvenation of Meiotic Cohesion in Oocytes during Prophase I Is Required for Chiasma Maintenance and Accurate Chromosome Segregation. PLoS Genetics. 10 (9), e1004607 (2014).
  19. Perkins, A. T., Das, T. M., Panzera, L. C., Bickel, S. E. Oxidative stress in oocytes during midprophase induces premature loss of cohesion and chromosome segregation errors. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (44), E6823-E6830 (2016).
  20. Dernburg, A. F., Sedat, J. W., Hawley, R. S. Direct evidence of a role for heterochromatin in meiotic chromosome segregation. Cell. 86, 135-146 (1996).
  21. Dernburg, A. F., Sedat, J. W. Method Cell Biol. 53, Academic Press. 187-233 (1998).
  22. Guo, Z., Batiha, O., Bourouh, M., Fifield, E., Swan, A. Role of Securin, Separase and Cohesins in female meiosis and polar body formation in Drosophila. J Cell Sci. 129 (3), 531-542 (2016).
  23. Giauque, C. C., Bickel, S. E. Heterochromatin-Associated Proteins HP1a and Piwi Collaborate to Maintain the Association of Achiasmate Homologs in Drosophila Oocytes. Genetics. 203 (1), 173-189 (2016).
  24. Joyce, E. F., Apostolopoulos, N., Beliveau, B. J., Wu, C. T. Germline progenitors escape the widespread phenomenon of homolog pairing during Drosophila development. PLoS Genet. 9 (12), e1004013 (2013).
  25. Gilliland, W. D., Hughes, S. F., Vietti, D. R., Hawley, R. S. Congression of achiasmate chromosomes to the metaphase plate in Drosophila melanogaster oocytes. Dev Biol. 325 (1), 122-128 (2009).
  26. Gyuricza, M. R., et al. Dynamic and Stable Cohesins Regulate Synaptonemal Complex Assembly and Chromosome Segregation. Curr Biol. 26 (13), 1688-1698 (2016).
  27. Radford, S. J., McKim, K. S. Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes. J Vis Exp. (116), (2016).

Tags

Utviklingspsykologi biologi problemet 130 Drosophila meiose oocyte søster chromatid samhold arm samhold fluorescens i situ hybridisering (fisk)
Bruk fluorescens <em>In Situ</em> hybridisering (fisk) å overvåke tilstanden til Arm samhold i Prometaphase og Metaphase jeg <em>Drosophila</em> Oocytes
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Perkins, A. T., Bickel, S. E. Using… More

Perkins, A. T., Bickel, S. E. Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) to Monitor the State of Arm Cohesion in Prometaphase and Metaphase I Drosophila Oocytes. J. Vis. Exp. (130), e56802, doi:10.3791/56802 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter