Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Использование флюоресценции в Situ гибридизация (рыбы) для контроля состояния руку сплоченности в Прометафаза и метафаза я дрозофилы ооцитов

Published: December 6, 2017 doi: 10.3791/56802
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biological Sciences, Dartmouth College

Summary

Эта рукопись представляет подробный метод для генерации X-хромосомы руку зондов и исполняющая флуоресценции в situ гибридизация (рыбы) для изучения состояния сестра хроматиды сплоченности в Прометафаза и метафаза я арестован Дрозофила ооцитов. Этот протокол предназначен для определения, является ли meiotic руку сплоченности нетронутыми или нарушена в различных генотипов.

Abstract

В организме человека хромосома сегрегации ошибки в ооциты отвечают за большинство выкидышей и врожденных дефектов. Кроме того, как возраст женщины их риск зачатие что анеуплоидных плода резко возрастает и это явление называется эффект возраст матери. Одним из требований для точного хромосома сегрегации во время meiotic отделов является поддержание сестра хроматиды сплоченности в период расширенной профаза, что опыт ооцитов. Цитологические доказательства как людей, так и модельные организмы свидетельствует о том, что meiotic сплоченности ухудшается во время процесса старения. Кроме того, ошибки сегрегации в человеческой яйцеклетки являются наиболее распространенными во время мейоза I, в соответствии с преждевременной потери сцепления руку. Использование модели организмов имеет решающее значение для распутывая механизмы, которые лежат в основе возрастные потери сцепления. Drosophila melanogaster предлагает ряд преимуществ для изучения регуляции meiotic сплоченности в ооцитов. Однако до недавнего времени только генетические тесты были доступны для анализа потери руку сплоченности в ооциты различных генотипов или в различных экспериментальных условиях. Здесь подробный протокол предоставляется для использования флуоресценции в situ гибридизация (рыба) непосредственно визуализировать дефекты в руку сплоченности в Прометафаза я и метафаза я арестован дрозофилы ооцитов. Генерации рыбы зонд, который скрестил на дистальном плече хромосомы X и собирая конфокальный Z стеки, исследователь может визуализировать количество отдельных сигналов рыбы в трех измерениях и определить, является ли сестра хроматиды оружие отдельно. Процедура, изложенная делает возможным количественно руку сплоченности дефекты в сотни дрозофилы ооцитов. Таким образом этот метод обеспечивает важный инструмент для изучения механизмов, которые способствуют сплоченности обслуживания, а также факторы, которые приводят к ее гибели во время процесса старения.

Introduction

Надлежащего разделения хромосом во время мейоза и митоз требует что сестра хроматиды сплоченности установлено, поддерживал и выпущен в скоординированно1,2. Сплоченности устанавливается на этапе S и опосредовано когезинов комплекс, который образует физических связей, которые держат сестра chromatids вместе. В мейоз, сплоченность, дистальнее кроссовер также функции провести рекомбинантных гомолог вместе и это физическое объединение помогает обеспечить надлежащей ориентации из двухвалентного на метафаза я шпинделя (рис. 1)3,4, 5. Освобождении рычага сцепления в анафазе позволяет гомолог отделить к противоположным полюсам шпинделя. Однако если рука сплоченности потерял преждевременно, рекомбинантных гомолог будет терять их физическое соединение и разбить случайным образом, что может привести к анеуплоидных гамет (рис. 1).

В человеческих яйцеклеток ошибки в хромосоме сегрегации являются основной причиной выкидышей и врожденных дефектов, таких как синдром Дауна6, и их заболеваемость возрастает экспоненциально с возрастом матери7. Сестра хроматиды сплоченности устанавливается в плода ооцитов и meiotic рекомбинации завершена до рождения. Ооциты затем арестовать в середине профазе I до овуляции и во время этого ареста, продолжение физической ассоциации рекомбинантных гомолог опирается на сестра хроматиды сплоченности. Таким образом Точная сегрегации во время мейоза и исходы нормальной беременности требуют, что сплоченность остаются нетронутыми до пяти десятилетий.

Преждевременная потеря сцепления во время длительного ареста meiotic человеческих яйцеклеток было предложено вносить эффект возраст матери и несколько строк доказательства поддержки эта гипотеза8,9. Однако, учитывая проблемы изучения meiotic сплоченности в человеческих яйцеклеток, большая часть нашего понимания этого явления основывается на использовании модели организмов5,10,11,12, 13,14,15.

Ооциты Drosophila melanogaster предлагают многочисленные преимущества для изучения meiotic сплоченности и хромосомы сегрегации. Простой генетического анализа позволяет восстановить потомства от анеуплоидных гамет и измерить точность X-хромосомы сегрегации на больших масштабах11,16,17. Кроме того, может также определить ли хромосома сегрегации ошибки возникают потому, что рекомбинантных гомолог missegregate во время мейоза я, фенотип, что согласуется с преждевременной потери руку сплоченности11,18, 19. прямые наблюдения состояния meiotic сплоченности в дрозофилы яйцеклеток также возможно с помощью флуоресценции в situ гибридизация (рыбы). Хотя флуоресцентные олигонуклеотидов который гибридизируйте Спутниковое повторяющихся последовательностей были использованы для более десяти лет для мониторинга pericentromeric сплоченности в зрелых дрозофилы ооциты4,20, анализ руки сплоченность был гораздо более сложным. Визуализация состояния руку сплоченности требует зонд, который охватывает большой регион одной копии последовательностей и достаточно ярким, чтобы привести к видимых сигналов для отдельных сестра chromatids, когда рука сплоченности отсутствует. Кроме того условия фиксации ооцитов и размер помечены ННО должны способствовать проникновения21 в больших зрелых ооцитов дрозофилы (200 мкм длиной 500 мкм). Недавно, и рука зонд был успешно использован визуализировать дрозофилы ооцитов chromatids в анафазе я, но авторы заявили, что они не могут обнаружить сигнал в Прометафаза или метафаза я арестован ооциты22. Здесь мы предоставляем подробный протокол для поколения X-хромосомы руки, рыбы зонды и ооцитов подготовке условий, которые позволили нам пробирного преждевременной потери сестры хроматиды сплоченности в Прометафаза я и метафаза я ооцитов. Эти методы, которые позволили нам определить продукты гена, которые требуются для поддержания meiotic сплоченности, позволит другим, чтобы проба для сестры хроматиды сплоченности дефекты в зрелых яйцеклеток дрозофилы различных генотипов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка

  1. Подготовка решения для флуоресценции в situ гибридизация (рыбы). Подготовьте все решения с использованием ультрачистая вода.
    1. Подготовить 5 x изменения Робб буфера: калия ацетат 275 мм, ацетат натрия 200 мм, 500 мм сахарозы, глюкозы 50 мм, 6 мм магния хлорид, кальция хлорида 5 мм, 500 мм HEPES рН = 7,4. Принести рН 7,4, используя 10 N NaOH. Фильтр стерилизовать и хранить при температуре от-20 ° C. Размораживание и разбавляют до 1 x, при необходимости и хранить 1 x аликвоты при-20 ° C.
    2. Подготовка 10 x фосфатный буфер (PBS) с помощью 1,3 М NaCl, 70 мм Na2HPO4, 30 мм NaH2PO4. Принести pH 7.0 с помощью 10 N NaOH. Стерилизация автоклавированием или фильтрации стерилизации.
  2. Подготовить поли L-лизин coverslips один день до того, как необходимо.
    1. Пипетка 70% этиловом спирте, содержащей 1% соляной кислоты на поверхность coverslip 18 x 18 мм #1.5 и инкубировать и 5 минут использования вакуумной аспирации для удаления жидкости. Повторите с стерильных ультрачистая вода. Покрывают поверхность coverslip с 0,1 мг/мл поли L-лизин и проинкубируйте втечение 10 мин.
    2. Удалить для удаления жидкости и воздуха сухой для 10 мин магазина coverslips поли L-лизин стороной вверх в пластиковый контейнер с плотно закрывающейся крышкой, чтобы избежать пыли.
  3. Подготовьте вытащил Пастер пипетки для удаления жидкие растворы без удаления яйцеклеток. Над пламенем горелки Бунзена тепло в середине долгого стеклянная пипетка Пастера во время осторожно потянув на каждом конце, до тех пор, пока стекло плавится и тянет друг от друга.

2. поколение Arm зонд для рыбы

Примечание: Все центрифуги шаги выполняются на ~ 16 000-21 000 x g (максимальная скорость на большинстве столешница microcentrifuges). Краткий центрифуги спинов указывают спиннинг 5-15 с. Vortex указывает vortexing ~ 15 s Макс скорость, если не указано иное.

Примечание: BACs за руку зонды могут быть получены BAC PAC ресурсов. Два зонда эухроматиновых руку хромосома X были использованы успешно с этим методом. Одна рука зонд состояла из шести клонов BAC соответствующий для цитологического полос 6E-7B (BACR17C09, BACR06J12, BACR35J16, BACR20K01, BACR35A18, BACR26L11). Другой рукой зонд состояла из шести клонов BAC, соответствующий для цитологического полос 2F - 3C (BACR13K19, BACR21G11, BACR09H13, BACR30B01, BACR34O03, BACR03D13). BACs другие Drosophila хромосома регионы могут быть просмотрены на: http://www.fruitfly.org/sequence/X1-11-assembly.html. С помощью этого метода успешно используются два pericentric зонды, которые признают 359 bp Спутниковое repeat X -хромосомы. 22 нуклеотидов зонд широко используется и работает хорошо (5'-Cy3-AGGGATCGTTAGCACTCGTAAT)19,23. 28 нуклеотидов зонд был недавно испытан и также работал хорошо (5'-Cy3-GGGATCGTTAGCACTGGTAATTAGCTGC)24. ВЭЖХ очищенного олигонуклеотиды, 5', помеченным конкретными Флюорофор были заказаны из коммерческих источников (например, комплексная ДНК-технологий).

  1. Подготовьте дна BAC клон комплект инструкции как указано в Таблице материалов. Ресуспензируйте ДНК гранулы, полученные из 100 мл культуры в 200 мкл TE; конечная концентрация ДНК должна варьироваться от 5-40 нг/мкл в зависимости от клонов BAC.
  2. Выполните амплификации ДНК для каждого BAC, с помощью комплекта усиления, как указано в таблице материалов и следующий протокол. Процесс дна BAC индивидуально для каждого клона. Использование ферментов и поставляется с комплектом в шагах 2.2.1 через 2.2.3 буферов.
    1. Случайные фрагментация ДНК BAC: для каждого BAC, используйте TE подготовить 10 мкл раствора 1 нг/мкл ДНК в ПЦР-пробирку 200 мкл. 1 мкл 10 X фрагментации буфера. Трубка в машину ПЦР на 95 ° C для ровно 4 мин немедленно прохладно образца в ледяной воде и центрифуги кратко. Инкубации время чувствительной и любое отклонение может изменить результаты.
    2. Подготовка библиотеки
      Примечание: Этот метод использует случайных праймеров для создания библиотеки мы фрагментов.
      1. К трубе содержащий ДНК добавьте следующий: 2 мкл 1 x библиотека подготовка буфера, 1 мкл раствора стабилизации библиотеки. Тщательно перемешать, vortexing, центрифуга кратко и место трубки в машину ПЦР на 95 ° C на 2 мин немедленно прохладно образца в ледяной воде и центрифуги кратко.
      2. Добавьте 1 мкл библиотека приготовления фермента ПЦР-пробирку, смеси и центрифуги кратко. Место ПЦР трубки в машину ПЦР и инкубировать следующим: 16 ° C в течение 20 мин., 24 ° C в течение 20 мин, 37 ° C в течение 20 минут, 75 ° C за 5 мин, затем провести на 4 ° C.
      3. Удалить образцы из машины ПЦР и центрифуги кратко. Образцы могут быть усилены сразу или хранятся при температуре-20 ° C до трех дней.
    3. Амплификация дна BAC библиотеки
      1. Добавьте следующие реагентов на всю реакцию случайный фрагмент 15 мкл: 7.5 мкл 10 x амплификации Мастер микс, 47,5 мкл нуклеиназы свободной воды, 5 мкл WGA ДНК-полимеразы. Тщательно перемешать, vortexing и кратко центрифуги.
      2. Место ПЦР трубки в машину ПЦР и инкубировать следующим: первоначальный денатурации 95 ° C на 3 мин, 14 циклов денатурации на 94 ° C 15 s, следуют отжиг/расширение при 65 ° C за 5 мин, затем провести на 4 ° C.
      3. После завершения Велоспорт пробирного концентрации ДНК. Концентрация ДНК должны быть по крайней мере 800 нг / мкл. хранить образцы на 4 ° C или хранить при-20 ° C до готовности для пищеварения. При необходимости оценить размер фрагментов ДНК, запустив 400 нг ДНК на 2% агарозном геле. Фрагменты должны варьироваться от 200 bp к kb 3 (рис. 2).
  3. Пищеварение энзима ограничения амплифицированного ДНК
    1. Место 20 мкг амплифицированного ДНК из предыдущего раздела в 1,5 мл отцентрифугировать. Добавить 20 единиц Alul, Haelll, Msel, Mspl, "РСАЛ", 25 единиц BfuCl, 0.5 мкл 100 x BSA, 5 мкл 10 x буфер пищеварения энзима ограничения и отрегулируйте громкость до 50 мкл, добавляя соответствующее количество сверхчистого H2O.
    2. Инкубируйте дайджест на ночь при 37 ° C в инкубаторе для предотвращения конденсации на крышке. Этанол осадок переваривается ДНК. Добавить в дайджест: 1 мкл гликогена, ацетат натрия 3M 1/10 объема, 2.5 тома молекулярной класс 100% этанола. Инкубируйте на-80 ° C для 1 h или на ночь.
    3. Центрифуги для 30 мин при 4 ° C. Вымойте ДНК Пелле объемом 1 номер темп 70% этанола и спина на 5 мин при 4 ° C. Удалить супернатант и пусть ДНК гранул сухого воздуха или Осторожно высушить с устойчивый поток воздуха.
    4. Ресуспензируйте Пелле ДНК в 36 мкл стерильные сверхчистого H2O и использовать 1 мкл ДНК для анализа концентрации ДНК, которая должна быть приблизительно 285 нг / мкл. магазин ДНК при-20 ° C.
    5. При необходимости оценить размер фрагментов ДНК работает 400 нг ДНК на 2% агарозном геле. Большинство фрагментов должен варьироваться от 100-200 bp, с слабее сигнала до 500 bp (рис. 2).
  4. 3', хвостохранилища реакции
    1. Денатурируйте переваривается ДНК при 100 ° C за 1 мин в блоке тепла. Сразу же охладите в ледяной воде. Для 35 мкл ДНК, добавьте следующее: 50 мкл cacodylate натрия 400 мм, 1 мкл 10 мм DTT и вихревой хорошо. Добавить 4 мкл 25 мм CoCl2, 2,5 мм 2 5-(3-aminoallyl)-dUTP мкл от ARES маркировки комплект, как указано в таблице 18 мкл, материалы, 5 мкл 1 мм dTTP, 5 x TdT буфер и трансферазы deoxynucleotidyl терминала 1 мкл (TdT) 400 U / мкл. вихрь и центрифуги кратко.
      Предупреждение: CoCl2 является токсичным, носить соответствующую защиту.
    2. Проинкубируйте втечение 2 ч при 37 ° C в инкубаторе для предотвращения конденсации. 1 мкл 250 мм ЭДТА остановить реакции и вихревой кратко, чтобы смешивать. Этанол осадок хвостатых ДНК, как описано выше (шаги 2.3.2 - 2.3.4). Ресуспензируйте сушеные Пелле ДНК в 10 мкл стерильные сверхчистого H2O. хранилище ДНК при-20 ° C до готовности продолжать.
  5. Проведение спряжение Люминесцентную краску с помощью маркировки набор ДНК как указано в таблице материалы.
    Примечание: После добавления красителя Храните пробы в темноте.
    1. Денатурируйте хвостатых ДНК при 95 ° C за 5 мин в блоке тепла. Остудите ДНК в ледяной воде и центрифуги кратко. Подготовка маркировки буфера согласно инструкции по установке и 6 мкл каждого образца ДНК. Ресуспензируйте каждой трубки красителя в 4 мкл ДМСО из комплекта. Вортекс и центрифуги кратко.
    2. Использование одной трубки красителя для каждой обозначая реакции. Кратко добавьте раствор красителя в ДНК, вихрь и центрифуги. Инкубируйте обозначая реакции при комнатной температуре в течение 2 ч в темноте. 3 мкл 3M гидроксиламина для остановки реакции, следуют 77 мкл нуклеиназы-Free H2O из комплекта. Вортекс и центрифуги кратко.
  6. Удаление не спрягаются краситель, используя комплект для очистки PCR как указано в таблице материалов. Следуйте инструкциям производителя. Элюировать ДНК из столбца в два раза с помощью 40 мкл буфера каждый раз.
  7. Преципитат этанола помечены ДНК как описано ранее (шаги 2.3.2 - 2.3.4). Ресуспензируйте сухие гранулы ДНК в 10 мкл Элюирующий буфер.
  8. Приготовить смесь зонд
    1. Приклеенные этикетку ДНК определите концентрацию флюрохром красителя в пмоль/мкл. Флюорофор концентрация может варьироваться от 30-100 пмоль/мкл, в зависимости от BAC. Концентрации ДНК может варьироваться от 300-800 нг/мкл.
      Примечание: Параметр microarray хорошо работает на microvolume спектрофотометром, например, указанной в таблице материалов. В окне microarray выберите ДНК-50 и укажите флюрохром.
    2. Создайте основной микс, объединяя эквимолярных количествах (пмоль Флуор) каждого из датчиков BAC. Вихрь 30 s до объединения. Чтобы избежать циклов замораживания/оттаивания, подготовить аликвоты мастер смеси, применение парафина фильм к трубы для предотвращения испарения и хранить в темноте при температуре-20 ° C.
      Примечание: Mastermix, содержащий 250 пмоль каждого из 6 отдельных BAC зонды в общем объеме 30-50 мкл работает хорошо. Алиготе, содержащих 25 пмоль (фтор) для каждого BAC будет достаточно для реакций гибридизации двух 40 мкл, с концентрацией окончательный зонд 0.31 Флуор пмоль/мкл для каждого BAC.

3. Вскрытие и фиксации яйцеклеток

  1. Сбор 30 самок девственной соответствующие генотипа. Для обогащения для поздней стадии ооцитов, удерживайте женщины без мужчины во флаконе с покупать продовольствие и сухие дрожжи для 3-5 дней до вскрытия25. За день до вскрытия, передать свежие флакон с дрожжами женщины без газа.
  2. Выполнения диссекции.
    Примечание: Смотрите Рисунок 3 для необходимые инструменты. Решения будут удалены с помощью вытащил пипетка Пастера, если не указано иное. При передаче яичников всегда используете наконечник пипетки покрытием с 10% раствором BSA.
    1. В мелкое блюдо рассечения, содержащий буфер изменения Робб Используйте щипцы для удаления яичников с незамужней женщиной. Используйте щипцы или вольфрама иглы для слегка скошенный каждый яичник, позволяя решение связаться с внутренней ovarioles. Передать пару растопыренные яичников 1,5 мл отцентрифугировать трубка, содержащая изменение Робб 1 мл буфера.
    2. Повторите шаг 3.2.1 накапливать яичников от 20-25 женщин в 1,5 мл отцентрифугировать. Закончите Анатомирование 20-25 женщин в течение 10 мин.
  3. Выполняйте фиксации.
    1. С вытащил пипетка Пастера удалить жидкость в трубе отцентрифугировать, использовать P1000, чтобы быстро добавить 500 мкл раствора исправить 37 ° C в яичниках и затем сразу же добавить 500 мкл комнатной температуре гептана в яичниках.
    2. Трясти отцентрифугировать трубки смешать и поставить на nutator на 3 мин удалить отцентрифугировать трубка из nutator и место в стойке трубки 1 мин позволить яйцеклеток оседают на дно. Время полной фиксации-4 мин.
      Осторожностью: Решения и гептане являются токсичными, носить соответствующую защиту.
    3. Удаление исправления решения и промойте яичников 3 раза в 500 мкл PBS, содержащих BSA 0,5% и 0,1% тритон X-100 (PBSBTx)
  4. Повторите для остальных генотипов.

4. Удаление Chorions и Vitelline оболочек

Примечание: Смотрите Рисунок 3 для необходимые инструменты.

  1. Отдельные поздней стадии ооцитов
    1. Добавьте 1 мл PBSBTx мелкое блюдо рассечения. Используйте Р200 с BSA покрытием наконечником для передачи фиксированной яичников (в ~ 150 мкл) в мелкое блюдо. Пипетка яичников вверх и вниз с наконечником с покрытием пипеткой BSA выбить зрелой яйцеклетки из менее зрелых яйцеклеток.
    2. При поздней стадии ооциты достаточно разделены, передать все ткани трубу отцентрифугировать 500 мкл. Удалите избыток жидкости с вытащил пипетка Пастера, оставив около 150-200 мкл в трубе. Повторите раздел 4.1 для оставшихся генотипов.
  2. Подготовить для прокатки
    1. Предварительно намочить глубинно блюдо с 200 мкл PBSBTx. покрова и отложите в сторону. Получите 3 матовое стекло слайды и установить слайд #3 сторону. Аккуратно руб матовое стекло регионах слайды #1 и #2 вместе. Промойте их в деионизированной воде для удаления любой осколки стекла и сухой одноразовой салфеткой.
    2. Слой матового регионов слайды #1 и #2 с PBSBTx, добавляя 50 мкл PBSBTx к одному слайду и потирая этого региона с другими слайд. Удалите жидкость одноразовой салфеткой.
    3. Место слайды под микроскопом рассечения в конфигурации, показанной на рисунке 4A. Морозная регионов слайды #1 и #2 в контакте, с слайд #3 поддерживать слайд #2.
  3. Ролл яйцеклеток; Убедитесь, что направление прокатки всегда находится в прямой линии и никогда не круговыми движениями.
    1. Дозатор prewet Р200 отзыв в PBSBTx и разгонять яйцеклеток в трубке отцентрифугировать, закупорить вверх и вниз. Передача 50 мкл жидкости содержащих яйцеклеток в центр матовое стекло частью слайд #1. Поднимите слайд #2 это сделать.
    2. Медленно опустите слайд #2 до тех пор, пока поверхностное натяжение жидкости создает уплотнение между двумя регионами матовое стекло. Там должно быть достаточное количество жидкости для покрытия области, матовое, но никто не должен просачивается из. Если жидкость переполнена, используйте вытащил пипетка Пастера чтобы удалить лишнюю жидкость.
    3. Держите вниз слайд (#1) в месте, с одной стороны и использовать другой рукой переместите верхний (#2) и обратно в горизонтальном направлении, сохраняя слайд #2 уровня и поддерживаются на слайд #3. Выполняют под микроскопом для легкой визуализации ооцитов движений и прогресса.
      Примечание: Это движение будет генерировать трения и вызвать ооциты «roll» и потерять их chorions. Минимальное давление разрыва должно использоваться и движения должны быть короткими и быстро.
    4. После нескольких движений в горизонтальном направлении слегка измените угол движения (рис. 4В). Несколькими шагами постепенно увеличивайте этот угол до 90° до тех пор, пока движение верхней слайдов (#2) перпендикулярна начальное направление (рис. 4В). Обратите внимание, что пустые chorions будет виден в жидкости и яйцеклетки, не хватает chorions появится длиннее и тоньше.
    5. Повторите шаги 4.3.3 - 4.3.4 около 7 - 10 раз, до тех пор, пока решение становится немного мутным. Остановите прокатки когда большинство ооцитов (75-85%), как представляется, потеряли их vitelline мембраны.
      Примечание: Характерный острый конец часто видна на ооциты не хватает vitelline мембраны. Vitelline мембраны являются более трудно удалить, чем chorions. Светового давления могут быть применены на верхней слайд (слайд #2) при прокатке добиться удаления vitelline мембран. Попытка удалить vitelline мембраны из всех яйцеклеток часто приводит к разрушению других ооцитов.
    6. Аккуратно поднимите верхний слайд (#2), перетаскивания одного из его углов в центр матовое региона внизу слайда (#1) так что проката ооцитов накапливаются в центре матовое региона. Хорошо промойте ооциты от обоих слайдов с PBSBTx в глубь блюдо, содержащие PBSBTx.
    7. Очистить слайды #1 и #2 с ультрачистая вода, сухие одноразовой салфеткой и сброс. Повторите шаги 4.3.1 - 4.3.6 пока свертывали все ооциты же генотипом. Это обычно требуется 3-4 раундов прокатки на генотип.
  4. Удаление мусора после прокатки
    1. Добавьте 1 mL PBSBTx в 15 мл Конические трубки. Вихрем жидкость Пальто сторонах трубки.
    2. С помощью PBSBTx покрытием P1000 пипеткой кончиком, передачи проката яйцеклеток из глубин хорошо блюдо в коническую пробирку, содержащую 1 мл PBSBTx. добавить еще 2 мл PBSBTx в коническую пробирку, содержащую яйцеклеток.
    3. Пусть начинают оседают на дно, затем удалить верхней 2 мл раствора, содержащего мусора (chorions, vitellines и т.д.) с P1000 и отбросить ооцитов. При необходимости, провести конические пробки на темном фоне, чтобы увидеть непрозрачный ооцитов, как они раковина.
    4. Добавьте еще 2 мл PBSBTx ооцитов и повторите шаг 4.4.3. Повторите 4.4.3. в общей сложности 3 раундов вывоза мусора.
    5. С помощью PBSBTx покрытием P1000 пипеткой кончиком, ооциты передачи обратно в оригинальный 500 мкл отцентрифугировать трубки. 20 - 25 женщин должна принести около 50 мкл проката зрелых яйцеклеток.
  5. Повторите раздел 4 для остальных генотипов, используя свежие матовое слайды, чистой глубинно блюдо и новые Конические трубки для каждого генотипа.
  6. При необходимости хранения, передачи ооциты ПБС с 0,1% TritionX-100 и хранить на ночь при 4 ° C. Долгосрочного хранения не рекомендуется, поскольку сшивки формальдегида могут быть отменены неионных моющих средств.

5. РЫБЫ

Примечание: Все моет, выполняются на nutator при комнатной температуре, если не указано иное. Ооциты, которые были проката дольше оседают на дно отцентрифугировать трубки, особенно в растворах, содержащих формамида. Важно быть терпеливыми при изменении решения, так что ооциты не теряются в процессе. Это может потребовать ожидания 5-15 мин позволить урегулировать после полоскания и моет ооцитов. Также, обратите внимание, что яйцеклеток в формамид менее непрозрачными.

  1. Добыча и РНКазы лечение
    1. Промойте яйцеклеток с 500 мкл PBS, содержащей 1% тритон X-100 (PBSTx). Удалите жидкость и 500 мкл извлечения буфер (PBSTx, содержащие РНКазы). Инкубируйте на nutator при комнатной температуре в течение 2 ч.
  2. Предварительно гибридизации смывки
    1. Промойте ооцитов 3 раза с 500 мкл 2 x физиологическим цитрат натрия, содержащий 20 анимации (SSCT). Разогрейте Алиготе (~ 500 мкл/генотипа) 2 x SSCT + 50% формамида до 37 ° C.
      Осторожностью: формамид токсичных, носить соответствующую защиту.
    2. Вымойте ооцитов 3 раза по 10 мин в 500 мкл 2 x SSCT. Вымойте яйцеклеток для 10 мин в 500 мкл 2 x SSCT + 20% формамида. Вымойте яйцеклеток для 10 мин в 500 мкл 2 x SSCT + 40% формамида. Вымойте яйцеклеток для 10 мин в 500 мкл 2 x SSCT + 50% формамида.
    3. Удалите жидкость и 500 мкл 37 ° C 2 x SSCT + 50% формамида из шага 5.2.1 образца и проинкубируйте втечение 2 ч при 37 ° C с вращением.
      Примечание: Печь гибридизации, оснащены ротатор работает хорошо для этого. Трубу отцентрифугировать пены «поплавок» придает ротатор может использоваться для защиты трубы.
  3. Денатурации и гибридизации
    1. Для каждой трубы яйцеклеток используйте 40 мкл 1 x гибридизации буфера, содержащий 2,5 нг/мкл прицентромерного зонд и 0.31 Флуор пмоль/мкл каждого BAC зонда. Приготовляют раствор зонда в гибридизации буфере достаточно для всех генотипов. Вихревой зонд микс 30 s перед добавлением.
    2. С помощью кончика пипетки BSA-покрытием P200, ооциты передавать 200 мкл ПЦР-пробирку. Хранить пробы при 37 ° C и пусть ооциты оседают на дно, а затем вытащил пипетка Пастера удалить как можно больше жидкости.
    3. 40 мкл раствора гибридизации, содержащий зонд (подготовлен в разделе 2) яйцеклеток. Поместите ПЦР-пробирки, содержащие яйцеклеток в машину ПЦР и инкубировать следующим образом: 37 ° C за 5 мин., 92 ° C на 3 мин, затем 37 ° C на ночь. После того, как зонд добавляется яйцеклеток, держите их в темноте как можно больше.
  4. После гибридизации смывки
    1. Разогреть 2 x SSCT + 50% формамида до 37 ° C и держать его в инкубаторе гибридизации. С BSA покрытием Р200 Пипетка наконечник, 100 мкл 37 ° C 2 x SSCT + 50% формамида для ПЦР-пробирку с яйцеклеток и передать трубку отцентрифугировать новый 500 мкл яйцеклеток.
    2. Добавьте дополнительные 400 мкл 37 ° c 2 x SSCT + 50% формамида же трубки и пусть яйцеклеток урегулировать при 37 ° C в инкубаторе.
      Примечание: Урегулирования часто занимает больше времени на этот шаг. Это не необычные принять 15 минут или дольше. Отсутствие терпения приведет к значительной потере ооцитов.
    3. Вымойте ооцитов 3 раза по 20 мин в 500 мкл 37 ° C 2 x SSCT + 50% формамида при 37 ° C с вращением. Держите яйцеклеток при 37 ° C, в то время как они поселяются.
    4. Вымойте ооцитов 3 раза по 10 мин в 500 мкл 37 ° C 2 x SSCT + 50% формамида при 37 ° C с вращением. Держите яйцеклеток при 37 ° C, в то время как они поселяются.
    5. При комнатной температуре мыть яйцеклеток для 10 мин в 500 мкл 2 x SSCT + 40% формамида на nutator. Вымойте яйцеклеток для 10 мин в 500 мкл 2 x SSCT + 20% формамида. Вымойте яйцеклеток для 10 мин в 500 мкл 2 x SSCT.
  5. Пятно с DAPI
    Предупреждение: DAPI является токсичным, носить соответствующую защиту.
    1. Вымойте яйцеклеток на 20 мин в 500 мкл DAPI растворе (1 мкг/мл) 2 x SSCT на nutator. Промойте ооцитов 3 раза в 500 мкл 2 x SSCT. Вымойте ооциты 2 раза по 10 мин в 500 мкл 2 x SSCT на nutator. Образцы могут храниться до 4 ч при комнатной температуре в темноте до тех пор, пока они готовы монтировать на coverslips.
  6. Монтаж
    Примечание: Смотрите Рисунок 3 для необходимые инструменты.
    1. Место поли L-лизин с покрытием coverslip под микроскопом рассечения. Удалите жидкость из трубки ооцитов, регулируя общий объем около 150 мкл. С BSA покрытием Р200 пипеткой кончиком, Пипетка вверх и вниз для разгона ооциты во всем решение и затем передать 40 мкл раствора ооциты поли L-лизин с покрытием coverslip.
    2. Удалите некоторые из жидкости из coverslip, используя вытащил пипетка Пастера до тех пор, пока яйцеклеток придерживаться coverslip, но по-прежнему окружены жидкость. Пинцетом удерживая крышку выскальзования на одной стороне и использовать вольфрамовой иглой для осторожно отделить сгустки яйцеклеток, перемещая их достижения в один слой non перекроя яйцеклеток.
    3. Удалите оставшуюся часть жидкости вокруг яйцеклеток с вытащил пипетка Пастера. Возьмите на чистой стеклянное скольжение и использовать сжатый газ для сдуть пыль. 22 мкл монтажа СМИ (например, удлинённый-GOLD) в середине слайда. Медленно опустите сползание к coverslip, с монтажа СМИ сталкиваются с образца, до тех пор, пока средства массовой информации затрагивает образца. Поверхностное натяжение приведет к coverslip присоединиться к слайду.
    4. Место слайды в пластиковый контейнер с плотно закрывающейся крышкой, содержащий слой свежего осушителем (например, drierite). Дайте высохнуть в течение 3-5 дней в темноте перед изображений слайдов. Время высыхания может варьироваться в зависимости от влажности воздуха комнаты.

6. обработка изображений

  1. После удаления сухих слайды из окна осушителем, очистите их, чтобы удалить все частицы пыли. Уплотнение coverslips с ногтей. Запечатанный слайды могут храниться бессрочно при-20 ° C.
  2. Приобрести лазерного сканирования конфокальный изображения с помощью высокая числовая апертура 40 X нефти цель с 6 X цифровой зум.
    Примечание: В идеале, системного программного обеспечения позволит найти и пометить X-Y расположение meiotic хромосом для нескольких яйцеклеток при их просмотре с помощью эпифлуоресцентного. Эта возможность экономит время во время сеанса работы с образами. Быстрое отбеливание с целью высокая числовая апертура 60 X сделал его использование неподходящих с выбранной конфокальный системы, но это может работать для других систем.
  3. Захват серии Z для каждого ооцитов, установка верхней и нижней части серии, используя DAPI сигнала.
    Примечание: Получить, компенсировать, и мощность лазера будет необходимо будет определить эмпирически с использованием подмножества яйцеклеток. После того, как будут найдены подходящие параметры, лишь незначительные корректировки должны быть сделаны.
    Если изменены приобретения необходимы параметры, используйте стек ранее собранных изображений для оценки необходимых изменений. Во избежание обесцвечивания, воздерживаться от предварительно imaging руку зонд до захвата серии Z. С размером шаг 0,25 мкм серии Z обычно варьируются от 25 до 30 шагов в зависимости от ориентации и размещение хромосом. Меньший размер шага может улучшить способность оценить ли две рыбы пятна отделены в измерении осевой, но существует компромисс с время, необходимое для захвата небольших шагов и потеря интенсивности сигнала благодаря отбеливанию. 40 X цель с 6 X цифровым зумом и изображения 1024 x 512 поле создает изображения с размером пикселя 0,05 мкм.

7. изображение анализа и скоринга для сплоченности дефектов

  1. Deconvolve серии Z, чтобы оптимизировать соотношение сигнал-шум для каждого ооцитов19.
    Примечание: Пакет программного обеспечения, например, указанного в Таблице материалов позволяет deconvolve с помощью комплексного восстановления, а также культур и повысить контрастность изображения. Важно отметить, что важно, программный пакет, который позволяет просматривать изображения и оценка для сплоченности дефекты в трех измерениях.
  2. Для каждого ооцитов табулирование количество руку и прицентромерного очагов, которые colocalize с DAPI сигнала. Потеря сцепления приводит три или четыре отдельных и разделенных сигналов для конкретного ПЭП. Это не редкость, чтобы наблюдать два очагов, которые соединены тонкой ниткой. По самым строгим критериям эти приоритеты не будут рассматриваться «разделены».

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Рисунок 5 представлены изображения, полученные с руку зонд, который скрестил цитологического региона 6E-7B на Х -хромосоме. Этот зонд результаты в сигнал, который совместно локализуется с этим DAPI, легко отличить от фона и успешно используется для количественного определения руку сплоченности дефекты в различных генотипов19. Количественная оценка сплоченности дефектов был ограничен к Прометафаза я и метафаза я этапах; ооциты до пробоя ядерная оболочка были исключены из анализа19. Нетронутыми ядерная оболочка очевидна, когда сканирование в канале DAPI потому что хромосом яйцеклетка будет окружена дискретных круговой области, которые темнее, чем окружающий цитоплазму.

Рисунок 5B показывает максимальную интенсивность прогнозы отдельных серии Z после улучшение Обратная свёртка и контраст. Количественная оценка сплоченности дефектов требует определения для каждого зонда, что количество рыбы сигнализирует что дублирования с DAPI сигнала. Для такого анализа важно визуализация слияния изображений в трех измерениях. Только рыбы пятен, которые явно связаны с DAPI сигнала во всех трех измерениях должны быть включены в анализ.

Нетронутыми сестра хроматиды сплоченности проявляется как две рыбы пятна на руку и pericentric зонды (Рисунок 5B, слева). Ооциты, содержащий три или четыре разделенных пятна рыбы для либо зонд считаются сплоченности дефектов (Рисунок 5B, право). Классифицируется как отдельные места, две рыбы сигналы должны быть минимально разделены во всех трех измерениях на расстоянии, соответствующий диаметр наименьшего пятно. Тонкие слабые потоки, соединяющий две рыбы пятна не являются редкостью. Такие сигналы не считаются полностью разлученных и поэтому не учитываются как экземпляры сплоченности дефектов.

С зонд гибридизации руку 6E-7Б примерно 15-20% яйцеклеток imaged полностью отсутствует сигнал или сигнал был слишком слаб, чтобы уверенно оценка. Кроме того примерно 5% яйцеклеток imaged выставлены на большой площади диффузных хромосомных сигнала, и они были исключены из анализа. Напротив это было редко сталкиваются ооцитов, для которых pericentric гибридизации сигнал был слишком размыты, чтобы оценка или отсутствует.

6E-7B руку зонд широко используется для количественного определения руку сплоченности дефекты Прометафаза и метафаза я арестован дрозофилы яйцеклеток из19различных генотипов. Когда когезинов Субблок СМТ3 был сбит во время середины профаза, 16,3% зрелых яйцеклеток проанализированы содержится больше, чем две руки пятна, свидетельствует о преждевременной потери сцепления руку. Напротив мы наблюдали пятна разлученных руку только 5,1% яйцеклеток, которые содержали нормальных уровней СМТ319. Интересно, что хотя частота руку сплоченности дефектов был возведен в нескольких после нокдауна генотипов, сестра-близнец chromatids редко были разделены в их регионах pericentric19.

Figure 1
Рисунок 1: возрастные потери сцепления во время расширенной профаза, я ареста из женского мейоз может привести к ошибок в хромосоме сегрегации и Анеуплоидия в яйце. Сплоченность представлена черные полосы между сестрой chromatids. Рука сплоченности функции провести рекомбинантных гомолог вместе и требуется для точного сегрегации в анафазе я. Если рука сплоченности теряется преждевременно, хромосоме missegregation может произойти, что приводит к анеуплоидных яйцо. Эта цифра была адаптирована из ссылка19. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: размер молекул ДНК после BAC фрагментации и амплификации (слева) и после Пищеварение энзима ограничения (справа) для трех различных BACs. 400 нг амплифицированного ДНК продуктов отображаются в первых трех полос. Последние три полосы показать фрагменты ДНК после ночной дайджест ограничения. Амплифицированного ДНК продукты варьируются от 200 bp до 3 КБ. После ограничения дайджест, большинство фрагментов, варьировались от 100-200 bp, но более крупных фрагментов (до 500 bp) были видны. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: инструменты цитологии. Инструменты, используемые в протоколе: (1) пара щипцов (Дюмон #5); (2) вольфрамовой иглой; (3) глубинно блюдо с крышкой; (4) мелкой стекла, рассекает блюдо; (5) вытащил пипетка Пастера. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4. Расположение и перемещение слайдов для прокатки ооцитов. (A) схема слайд создан для прокатки яйцеклеток, как описано в протоколе. Темные области обозначает матовое стекло часть слайда. (B) направление векторов движения для слайд #2 во время прокатки ооцитов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5. РЫБЫ анализа результатов. (A) схема изображает Дрозофилы Х -хромосоме и где две руки зонды (по 6 BACs) и Гибридизируйте зонд pericentromeric 22 олигонуклеотида, указанных в протоколе. Для простоты зонд 6E-7B обозначен 7B и 2F - 3C зонд обозначен 3C. (B) представитель изображения рыб результаты (зонд 6E-7B) для сплоченности нетронутыми руку (две руки зонд пятна, одному гомолога) и нарушается руку сплоченности (три-четыре руки зонд пятна). ДНК является синий, желтый сигнал зонда руку, и сигнал зонда pericentric красный. Изображения соответствуют прогнозам максимальная интенсивность Z серии после деконволюции и контраст улучшение. Шкалы бар = 2 мкм. Эта цифра была адаптирована из ссылка19. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Использование рыбы зонды для оценки состояния руку сплоченности в Прометафаза я и метафаза я дрозофилы яйцеклеток является значительное продвижение в области дрозофилы мейоз. Исторически дрозофила исследователи были ограничены генетические тесты для выведения преждевременной потери руку сплоченности в зрелых яйцеклеток11,18,19. Теперь с методами, представленные здесь, состояние единства руку можно assayed непосредственно с помощью рыбы. Возможность получения вещественных доказательств для преждевременной потери сцепления рука значительно расширяет репертуар подходов к изучению механизмов, которые приводят к преждевременной потере сплоченности и хромосомы missegregation руку в дрозофилы ооцитов.

Важнейшие шаги
Хотя мы не выполнили систематический анализ критических параметров, необходимых для успешной визуализации флуоресцентного зонда, что скрестил одной копии последовательности вдоль хромосомы руки в зрелых яйцеклеток дрозофилы , мы предлагаем следующий перечень факторов, которые могут способствовали успеху этой техники. Для создания зонд руку, мы использовали сочетание шести перекрывающихся BAC зондами, которые охватывают интервал примерно 0,8 МБ на X-хромосомы руку. Наши первые попытки, используя меньшее количество BACs, которые охватили меньшего региона не были успешными. Кроме того мы использовали метод фрагмент и усилить дна BAC до конца маркировки с Alexa-647. Большинство фрагментов ограничения, которые были помечены были 100-200 bp длинные (рис. 2), который соглашается также с целевым размером 150 нуклеотидов, который необходим для эффективного распространения через толстые ткани21. Важны условия фиксации, которые сохранить морфология большой дрозофилы ооцитов, но также позволяют проникновение зонда. Мы изменили наш ранее использовавшихся фиксации метод23 путем добавления комнатной температуре гептана решения, разогретую до 37 ° C. Мы считаем, что это возможно, что оба добавлением гептана увеличить проникновение через vitelline мембрану, а также пониженной температуре для фиксации способствовали успешной фиксации условий для визуализации АРМ сплоченности.

Когда опробование преждевременной потери сцепления, одна требует размер выборки, который позволяет количественной оценки дефектов, которые присутствуют в низкой до умеренных уровней. Для получения большого количества зрелых яйцеклеток, другие использовали блендер нарушение взрослых самок, в сочетании с фильтровать 26,27. Здесь мы описываем метод передать вскрыть яичников от женщин 20-25, с ручной разделения позднего этапа ооцитов, закупорить. В то время как блендер/просеивание метод должен также работать с настоящим Протоколом, одним из преимуществ стороны диссекции является что без просеивания шаг, ооциты тратить меньше времени в буфере до фиксации, которая снижает вероятность анафазе я начала из-за искусственных яиц активации. Кроме того этот метод требует меньше женщин как исходный материал, использует меньшие объемы реагентов и имеет простой рабочий процесс, все из которых облегчить обработку нескольких генотипов.

Рука диссекции и руководство разделения зрелых яйцеклеток обеспечивает достаточное количество яйцеклеток «свернуть» для удаления хориона и vitelline мембраны и приводит к примерно 75-150 яйцеклеток в конце моет гибридизации. Один трюк, чтобы максимизировать урожайность метафаза я арестован ооцитов – провести девственной женщины в дрожжевого флаконов в отсутствие мужчин до вскрытия25. Прокатки для удаления chorions и vitelline мембраны яйцеклетки должны выполняться с нежным прикосновением во избежание уничтожить ооцитов. Однако удаление chorions и vitelline мембраны из 100% яйцеклеток не является реалистичной целью и чрезмерного прокатки только приводит к в потере яйцеклеток. Таким образом, каждый скользящий цикл должна быть остановлена когда примерно 75-85% яйцеклеток отсутствие chorions и vitelline мембраны.

Ограничения
Несмотря на наш успех в генерации и использования руку датчики для мониторинга состояния сплоченности в зрелых яйцеклеток дрозофилы процедура по-прежнему страдает от ограничения. Хотя мы редко удалось обнаружить сигнал для pericentromeric зонд, сигнал зонда руку был слабый или отсутствует в приблизительно 15-20% яйцеклеток, что мы образы. Одним из факторов может быть дифференциального проникновения pericentric олигонуклеотидных зондов (22-28 нуклеотидов) против больших руку зонд (100-200 нуклеотидов). Кроме того, большой повторяющиеся последовательности, признанные результаты зонд pericentric в сигнал, который ярче, чем для зонда руку. Ориентация ооцитов и размещения meiotic хромосом в пределах ооцитов также представляют собой проблему при визуализации. Хотя meiotic хромосом, относительно недалеко от клеток коры, невозможно контролировать ориентацию ооцитов, при креплении на coverslip. Поэтому некоторые фракции яйцеклеток, meiotic хромосом может быть 100-200 мкм от coverslip и интенсивности сигнала и качества может негативно сказывается при попытке изображения через основную часть ооцитов. Эти ограничения означают, что количество яйцеклеток, включенных в окончательный анализ количественный значительно меньше, чем количество яйцеклеток, обработанных в протоколе. Определение состояния руку сплоченности в 100 ооциты скорее всего потребует два независимых препаратов. Дополнительным сдерживающим фактором в количественной сплоченности дефектов с помощью лазера, Сканирующий конфокальный микроскоп является время, требуемое для захвата типичный серии Z (примерно 5 минут), даже когда захватили район ограничен 1024 x 512 пикселей. Это означает, что сравнение сплоченности в управления и экспериментальной генотипов (по 100 ооцитов) потребует примерно в 16 ч время коллекции изображений.

Модификации и устранение неполадок
Мы были в состоянии контролировать состояние руку сплоченности с помощью зонда, который признает Х -хромосоме цитологического позиции 6E-7B19. Зонд, который скрестил более дистальных место на Х -хромосоме может быть более желанным для обнаружения сбоя хиазма обслуживания. Кроме того другие исследователи, возможно, пожелает проанализировать сплоченности руку на другие хромосомы. В то время как мы не пытались зонд аутосомами, предварительные данные показывают, что зонд, который признает регионе 2F - 3C X -хромосомы также приводит к обнаружению сигнала. Однако основываясь на предварительных данных, сигнал зонда 2F - 3C может быть менее «Компакта», чем для зонда 6E-7B. Хотя рыбы сигналы сжатые и четкие для некоторых хромосом яйцеклетки, гибридизации сигнал на хромосомы других ооциты значительно более расплывчатыми. Ли эти различия в сигнал отражают подлинное различия в морфологии хромосомы между двумя точками цитологическое, изменчивость в гибридизации эффективность двух зондов, или будет просто стохастических изменчивость между различными ооцитов требуется более тщательный анализ.

Важно отметить, что даже для зонда 6E-7B, мы наблюдали диффузных хромосомных сигнал в некоторых ооцитов, и это часто требует их исключение из анализа. Кроме того, мы заметили изменения в качество сигнала и яркости между различных препаратов 6E-7B зонда, и это требует что изображений соответственно скорректировать параметры. Повышение температуры гибридизации до 42 ° C не сделал сократить количество яйцеклеток с диффузным сигнала, но он серьезно повлиять сигнал для зондов олигонуклеотида pericentric. В попытке лучше сохранить хромосома морфология24мы также стараемся больше шага denaturation при более низкой температуре (80 ° C), но обнаружил, что это лечение не увеличил интенсивность сигнала не сократили количество яйцеклеток с диффузной Хромосомная рыбы сигнал. Мы также попытались получить ярче сигнал рукой с помощью 12 перекрывающихся BACs, соответствует примерно 1,5 МБ интервал, который охватывает цитологического региона 5E-7B. При использовании 12 зонд BAC, степень различия в интенсивности сигнала, а также процент ооцитов, отсутствует сигнал был ничем не отличается от когда шесть BACs были использованы для сделать руку зонд. Было также более сложным, чтобы оценка сплоченности дефектов при использовании 12 зонд BAC, потому что рыба сигналы были больше, что делает его более трудным для устранения пятен, соответствующие отдельным chromatids. В тех случаях, в которых сигнал не получается с зондом свежеподготовленные исследователи должны проверить размер усиливается и ограничение переваривается BAC ДНК для подтверждения, что фрагменты, используемые для маркировки конце находятся главным образом в диапазоне 100-200 bp. Это может быть одним из важнейших факторов при подготовке успешных зонд.

Будущие направления деятельности
Будущей работы для улучшения захвата изображений, а также адаптация протокола включить иммуноокрашивания бы значительные улучшения, которые принесли бы пользу других исследователей. В коллекции изображений собирая большее количество изображений в осевой измерения, а также быстрее загрузки изображений будет выгодным для количественного определения дефектов сплоченности. В оптимизации изображений параметров для сканирования конфокальный лазерный, мы обнаружили, что 0,25 мкм был наименьший размер шага, который мог бы использоваться для серии Z во избежание ощутимый отбеливания рыбы сигналов. Однако для рыбы сигналов, которые разделены менее 0,25 мкм в стеке Z, этот размер шага может привести к невозможности захвата «пространство» между центрами и поэтому могут недооценивать количество дефектов сплоченности. Скорость приобретения изображения диска спиннинг конфокальный может позволить меньшие размеры шаг использоваться без сигнала отбеливания. Это будет предоставлять более точные реконструкции изображения в измерении осевой, а также разрешение на большее количество яйцеклеток, чтобы быть проанализированы для сплоченности дефектов. Кроме того возможность комбинировать иммуноокрашивания с рыбы визуализации состояния руку сплоченности значительно усилит протокол. Для ряда препаратов мы пытались выполнить шпинделя иммуноокрашивания после процедуры гибридизации. Однако надежные шпинделя окрашивание было видно в лишь небольшая часть яйцеклеток. Кроме того по причинам, которые не ясны, более высокий уровень паразитных сигналов рыбы окружили meiotic хромосом, когда рыба и иммуноокрашивания были объединены. Дальнейшая работа по оптимизации протокол, чтобы иммуноокрашивания до или после процедуры рыбы существенно расширит возможности этой техники.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют не конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана NIH Грант GM59354 присуждена Шарон E. Bickel. Мы благодарим Huy Q. Nguyen за помощь в разработке протокола для генерации люминесцентные руки зонды, Энн Lavanway за помощь с confocal микроскопии и Дж. Рид Emiliano для оказания технической помощи. Мы также благодарим многочисленных коллег в общине дрозофилы полезные обсуждения и консультации.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Kits
Midi Prep kit Qiagen 12143 Prep BAC clone DNA
GenomePlex Complete Whole Genome Amplification (WGA) Kit Sigma WGA2 Amplify BAC clone DNA
ARES Alexa Fluor 647 DNA labeling kit Invitrogen A21676 Label BAC clone DNA
PCR purification kit Qiagen 28104 Remove non-conjugated dye following labeling of BAC clone DNA
Name Company Catalog Number Comments
Chemicals & Solutions
Note: All solutions are prepared using sterile ultrapure water and should be sterilized either by autoclave or filter sterilization.
Bovine serum albumin (BSA) Fisher Scientific BP1600-100 Prepare 10% stock
Freeze aliquots
Calcium chloride Fisher Scientific C75-500
DAPI (4’, 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Invitrogen D1306 Toxic: wear appropriate protection. Prepare 100µg/ml stock in 100% ethanol, store in aliquots at -20 °C. Prepare 1 µg/ml solution in 2X SSCT before use.
Dextran sulfate Sigma D-8906
Drierite Drierite Company 23001
Dithiothreitol (DTT) Invitrogen 15508-013 Prepare 10 mM stock
dTTP (10 µmol, 100 µl) Boehringer Mannheim 1277049 Prepare 1 mM stock
EDTA (Disodium ethylenediamine tetraacetic acid) Fisher Scientific S311-500 Prepare 250 mM stock
100% ethanol (molecular grade, 200 proof) Decon Laboratories 2716
Tris (Ultra Pure) Invitrogen 15504-020
EGTA (Ethylenebis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid) Sigma E-3889
16% formaldehyde Ted Pella, Inc. 18505 Toxic: wear appropriate protection
Formamide Invitrogen AM9342 Toxic: wear appropriate protection
Glucose Fisher Scientific D16-1
Glycogen Roche 901393
HEPES Boehringer Mannheim 737-151
Heptane Fisher Scientific H350-4 Toxic: wear appropriate protection.
Hydrochloric acid Millipore HX0603-4 Toxic: wear appropriate protection.
Hydroxylamine Sigma 438227 Prepare 3 M stock
4.9 M Magnesium chloride Sigma 104-20
Na2HPO4 Ÿ 7H2O Fisher Scientific S373-500
NaH2PO4 Ÿ 2H2O Fisher Scientific S369-500
Poly-L-lysine (0.1mg/ml) Sigma P8920-100
Potassium acetate Fisher Scientific BP364-500
Sodium acetate Fisher Scientific S209-500 Prepare 3M stock
Sodium cacodylate Polysciences, Inc. 1131 Toxic: wear appropriate protection. Prepare 400mM stock
Sodium citrate Fisher Scientific BP327-1
Sodium chloride Fisher Scientific S271-3 Sodium chloride
Sucrose Fisher Scientific S5-500
10% Tween 20 Thermo Scientific 28320 Surfact-Amps
10% Triton X-100 Thermo Scientific 28314 Surfact-Amps
Name Company Catalog Number Comments
Solutions
Note: All solutions are prepared using sterile ultrapure water and should be sterilized either by autoclave or filter sterilization.
TE buffer 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH = 8.0
20X SSC (Saline Sodium Citrate) 3 M NaCl, 300 mM sodium citrate
2X cacodylate fix solution Toxic: wear appropriate protection. 200 mM sodium cacodylate, 200 mM sucrose, 80 mM sodium acetate, 20 mM EGTA
1.1X Hybridization buffer 3.3X SSC, 55% formamide, 11% dextran sulfate
Fix solution Toxic: wear appropriate protection. 4% formaldehyde, 1X cacodylate fix solution
PBSBTx 1X PBS, 0.5% BSA, 0.1% Trition X-100
PBSTx 1X PBS, 1% Trition X-100
Extraction buffer (PBSTx + Rnase) 1X PBS, 1% Trition X-100, 100 µg/mL RNase
2X SSCT 2X SSC, 0.1% Tween 20
2X SSCT + 20% formamide Toxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 20% formamide
2X SSCT + 40% formamide Toxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 40% formamide
2X SSCT + 50% formamide Toxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 50% formamide
Name Company Catalog Number Comments
Enzymes
AluI New England Biolabs R0137S
HaeIII New England Biolabs R0108S
MseI New England Biolabs R0525S
MspI New England Biolabs R0106S
RsaI New England Biolabs R0167S
BfuCI New England Biolabs R0636S
100X BSA New England Biolabs Comes with NEB enzymes
10X NEB buffer #2 New England Biolabs Restriction enzyme digestion buffer. Comes with NEB enzymes
Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) 400 U/µl Roche/Sigma 3333566001
TdT buffer Roche/Sigma Comes with TdT enzyme
Cobalt chloride Roche/Sigma Toxic: wear appropriate protection. Comes with TdT enzyme
RNase A (10 mg/mL) Thermo-Scientific EN0531
Name Company Catalog Number Comments
Cytology Tools etc.
Forceps Dumont #5 INOX, Biologie
9” Disposable glass Pasteur pipettes Fisher 13-678-20C Autoclave to sterilize
Shallow glass dissecting dish Custom made
Deep well dish (3 wells) Pyrex 7223-34
Fisherfinest Premium microscope slides Fisher Scientific 22-038-104 Used to cover deep well dishes
Frosted glass slides, 25 x 75 mm VWR Scientific 48312-002
Glass slides, 3 x 1 in, 1 mm thick Thermo-Scientific 3051
Coverslips, 10 x 10 mm, No. 1.5 Thermo-Scientific 3405
Tungsten needle homemade
Prolong GOLD mounting media Molecular Probes P36930
Compressed-air in can Various
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
PCR machine Various
Nanodrop 2000, spectrophotometer Thermo-Scientific microvolume spectrophotometer
Vortexer Various
Table top microfuge at room temperature Various
Table top microfuge at 4 °C Various
Heat block Various
Hybridization oven or incubator with rotator Various
Nutator Various
A1RSi laser scanning confoal Nikon 40X oil Plan Fluor DIC (NA 1.3)
Name Company Catalog Number Comments
Consumables etc.
50 mL conical tubes Various
15 mL conical tubes Various
1.5 mL microfuge tubes Various
500 µl microfuge tubes Various
200 µl PCR tubes Various
Plastic container with tight fitting lid Various To hold Drierite
Kimwipes Various disposable wipes
Parafilm Various paraffin film
Name Company Catalog Number Comments
Other
HPLC purified 5'-labeled oligonucleotides Integrated DNA Technologies Cy3-labeled probes that recognize the 359 bp satellite repeat of the X chromosome
Volocity 3D Image Analysis Software PerkinElmer Version 6.3

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Peters, J. M., Nishiyama, T. Sister chromatid cohesion. CSH Perspect Biol. 4 (11), (2012).
  2. McNicoll, F., Stevense, M., Jessberger, R. Cohesin in gametogenesis. Curr Top Dev Biol. 102, 1-34 (2013).
  3. Buonomo, S. B., et al. Disjunction of homologous chromosomes in meiosis I depends on proteolytic cleavage of the meiotic cohesin Rec8 by separin. Cell. 103 (3), 387-398 (2000).
  4. Bickel, S. E., Orr-Weaver, T., Balicky, E. M. The sister-chromatid cohesion protein ORD is required for chiasma maintenance in Drosophila oocytes. Curr. Biol. 12 (11), 925-929 (2002).
  5. Hodges, C. A., Revenkova, E., Jessberger, R., Hassold, T. J., Hunt, P. A. SMC1beta-deficient female mice provide evidence that cohesins are a missing link in age-related nondisjunction. Nat Genet. 37 (12), 1351-1355 (2005).
  6. Freeman, S. B., et al. The National Down Syndrome Project: design and implementation. Public Health Rep. 122 (1), 62-72 (2007).
  7. Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nat Rev Genet. 13 (7), 493-504 (2012).
  8. Angell, R. R. First-meiotic-division nondisjunction in human oocytes. Am. J. Hum. Genet. 61, 23-32 (1997).
  9. Tsutsumi, M., et al. Age-related decrease of meiotic cohesins in human oocytes. PLoS One. 9 (5), e96710 (2014).
  10. Liu, L., Keefe, D. L. Defective cohesin is associated with age-dependent misaligned chromosomes in oocytes. Reprod Biomed Online. 16 (1), 103-112 (2008).
  11. Subramanian, V. V., Bickel, S. E. Aging predisposes oocytes to meiotic nondisjunction when the cohesin subunit SMC1 is reduced. PLoS Genet. 4 (11), e1000263 (2008).
  12. Chiang, T., Duncan, F. E., Schindler, K., Schultz, R. M., Lampson, M. A. Evidence that weakened centromere cohesion is a leading cause of age-related aneuploidy in oocytes. Curr. Biol. 20 (17), 1522-1528 (2010).
  13. Lister, L. M., et al. Age-related meiotic segregation errors in mammalian oocytes are preceded by depletion of cohesin and Sgo2. Curr. Biol. 20 (17), 1511-1521 (2010).
  14. Duncan, F. E., et al. Chromosome cohesion decreases in human eggs with advanced maternal age. Aging Cell. 11 (6), 1121-1124 (2012).
  15. Yun, Y., Lane, S. I., Jones, K. T. Premature dyad separation in meiosis II is the major segregation error with maternal age in mouse oocytes. Development. 141 (1), 199-208 (2014).
  16. Subramanian, V. V., Bickel, S. E. Heterochromatin-mediated association of achiasmate homologues declines with age when cohesion is compromised. Genetics. 181, 1207-1218 (2009).
  17. Jeffreys, C. A., Burrage, P. S., Bickel, S. E. A model system for increased meiotic nondisjunction in older oocytes. Curr. Biol. 13 (6), 498-503 (2003).
  18. Weng, K. A., Jeffreys, C. A., Bickel, S. E. Rejuvenation of Meiotic Cohesion in Oocytes during Prophase I Is Required for Chiasma Maintenance and Accurate Chromosome Segregation. PLoS Genetics. 10 (9), e1004607 (2014).
  19. Perkins, A. T., Das, T. M., Panzera, L. C., Bickel, S. E. Oxidative stress in oocytes during midprophase induces premature loss of cohesion and chromosome segregation errors. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (44), E6823-E6830 (2016).
  20. Dernburg, A. F., Sedat, J. W., Hawley, R. S. Direct evidence of a role for heterochromatin in meiotic chromosome segregation. Cell. 86, 135-146 (1996).
  21. Dernburg, A. F., Sedat, J. W. Method Cell Biol. 53, Academic Press. 187-233 (1998).
  22. Guo, Z., Batiha, O., Bourouh, M., Fifield, E., Swan, A. Role of Securin, Separase and Cohesins in female meiosis and polar body formation in Drosophila. J Cell Sci. 129 (3), 531-542 (2016).
  23. Giauque, C. C., Bickel, S. E. Heterochromatin-Associated Proteins HP1a and Piwi Collaborate to Maintain the Association of Achiasmate Homologs in Drosophila Oocytes. Genetics. 203 (1), 173-189 (2016).
  24. Joyce, E. F., Apostolopoulos, N., Beliveau, B. J., Wu, C. T. Germline progenitors escape the widespread phenomenon of homolog pairing during Drosophila development. PLoS Genet. 9 (12), e1004013 (2013).
  25. Gilliland, W. D., Hughes, S. F., Vietti, D. R., Hawley, R. S. Congression of achiasmate chromosomes to the metaphase plate in Drosophila melanogaster oocytes. Dev Biol. 325 (1), 122-128 (2009).
  26. Gyuricza, M. R., et al. Dynamic and Stable Cohesins Regulate Synaptonemal Complex Assembly and Chromosome Segregation. Curr Biol. 26 (13), 1688-1698 (2016).
  27. Radford, S. J., McKim, K. S. Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes. J Vis Exp. (116), (2016).

Tags

Биология развития выпуск 130 дрозофилы мейоз яйцеклетки сестра хроматиды единство сплоченность руку флуоресценции в situ гибридизация (рыба)
Использование флюоресценции <em>в Situ</em> гибридизация (рыбы) для контроля состояния руку сплоченности в Прометафаза и метафаза я <em>дрозофилы</em> ооцитов
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Perkins, A. T., Bickel, S. E. Using… More

Perkins, A. T., Bickel, S. E. Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) to Monitor the State of Arm Cohesion in Prometaphase and Metaphase I Drosophila Oocytes. J. Vis. Exp. (130), e56802, doi:10.3791/56802 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter