Summary
この原稿は、 Xを生成するための詳細な方法を提示-染色体腕プローブおよび実行する蛍光その場で交配 (魚) の妹の状態を調べるに染色分け体結束の prometaphase とを逮捕した中期ショウジョウバエ卵。このプロトコルは、減数分裂の腕の結合はそのままか、異なった遺伝子型の崩壊かどうかを決定するのに適しています。
Abstract
ヒトでは、卵母細胞における染色体分離エラーが流産や先天性欠損症の大半を担当です。さらに、女性の年齢、妊娠 aneuploid 胎児が大幅に増加、このような現象のリスクは母体年齢効果と呼ばれます。減数分裂の分裂時の正確な染色体分離の要件の 1 つは妹のメンテナンス卵母細胞が発生する拡張前期期間中に染色分け体結束。人間のモデル生物細胞学的証拠では、老化の過程減数分裂凝集度を劣化させることを示唆しています。人間の卵子に偏析エラーは減数分裂の間に最も普及している、さらに、私は、腕の結束の早期喪失と一貫性のあります。モデル有機体の使用は、凝集度の年齢依存性損失の根底にあるメカニズムの解明にとって重要です。キイロショウジョウバエでは、卵母細胞の減数分裂の凝集の制御を勉強するためのいくつかの利点を提供しています。しかし、最近まで、遺伝テストのみでした腕結束異なった遺伝子型の異なる実験条件下で卵母細胞の損失の分析に利用できます。ここでは、詳細なプロトコルで、私は、ショウジョウバエの卵母細胞を逮捕された中期の腕 prometaphase の結束の交配 (魚) を直接可視化する蛍光その場で使用するため欠陥を提供。X染色体の遠位腕に交配魚プローブを生成および共焦点 Z スタックを収集、研究者が 3 つの次元での個々 の魚信号数を視覚化して姉妹かどうかを決定する染色分け体腕区切られました。手順では、ショウジョウバエの卵母細胞の何百もの arm 結束欠陥を定量化可能です。そのため、このメソッドは、結束のメンテナンスだけでなく、老化プロセスの間に死につながる要因に寄与するメカニズムを調査するため重要なツールを提供します。
Introduction
有糸分裂と減数分裂時の染色体の分離が適切な必要とその姉妹染色分け体の凝集性の確立、維持、・連携1,2のリリースします。凝集度は S 期の間に確立され、姉妹を保持する物理の連携を形成するコヒーシン複雑、により媒介される染色分け体一緒に。減数分裂、クロス オーバーの遠位結束も組換え同族体を一緒に保持する機能し、この物理的な関連付けにより、適切な方向 (図 1)3,4、減数分裂に 2価の紡錘 5。リリース アームの後期で結束対極スピンドルに分離する同族体が可能します。ただし、腕結束がある場合途中で失われた組換え同族体の物理的な接続を失う、異数性配偶子 (図 1) につながることができます、ランダムに分離します。
人間の卵子の染色体分配のエラー6、ダウン症候群などの先天異常と流産の原因、その発生率は、母体年齢7とともに指数関数的に増加します。胎児卵母細胞で姉妹染色分け体の凝集が確立され、出生前に減数分裂組み換えが完了しました。卵母細胞、中期前期私排卵までと逮捕この逮捕中に、組換え同族体の継続的な物理的な連合の依存姉妹染色分け体結束。したがって、減数分裂と正常妊娠の転帰の間に正確な分離は、最大 5 年間の凝集力がそのまま残ること必要があります。
人間の卵子の減数分裂長期逮捕時に結束の早期喪失は母親年齢の効果に貢献する提案されているし、証拠の複数のラインは、この仮説8,9をサポートします。ただし、ヒトの卵母細胞の減数分裂の結束を研究の課題を考えると、この現象の私達の理解の多くは、モデル生物5,10、11,12,の使うことで13,14,15。
ショウジョウバエの卵母細胞は減数分裂の結束と染色体の偏析の研究のための多数の利点を提供しています。単純な遺伝的アッセイ異数性配偶子から子孫を回復し、 Xの忠実度を測定することができます-大規模な11,16,17染色体分離。さらに、1 つも減数分裂期組換え同族体 missegregate アーム結束11,18,の早期喪失と一貫性のある表現型、私ために染色体分離エラーが発生するかどうかを決定可能性があります19. 直接ショウジョウバエの卵母細胞の減数分裂の結束の状態の観察が可能な蛍光現場の交配 (魚) を使用しても。反復的な衛星シーケンスに交配する蛍光のオリゴヌクレオチドが使用されているため 10 年以上 pericentromeric 結束の成熟したショウジョウバエ卵4、20アームの分析を監視するには凝集度は、はるかに困難されています。腕の結束の状態の可視化には、シングル コピーの大規模な地域にわたるプローブ シーケンスし、アーム結合が存在しないときに個々 の妹のため目に見えるシグナル染色分け体が発生するには十分に明るいですが必要です。さらに、卵母細胞固定条件と分類された Dna のサイズは大きな成熟したショウジョウバエ卵母細胞 (200 μ m 幅 500 μ m 長で) に浸透21を促進する必要があります。最近、腕プローブが正常に利用いる prometaphase で信号の検出できませんでした述べたけど、著者、後期中ショウジョウバエ卵母細胞染色分け体を可視化するまたは中期卵22を逮捕しました。ここでは、 Xの生成のための詳しいプロトコルを提供-私と中期染色分け体結束 prometaphase の妹の早期喪失の試金する私たちを許可している卵母細胞調製条件と魚プローブ染色体腕私卵。減数分裂の結束の維持に必要な遺伝子の製品を識別するために私たちを有効に、これらのテクニックになります他の姉妹のために試金する染色分け体結束異なった遺伝子型の成熟のショウジョウバエ卵の欠陥します。
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Protocol
1. 準備
-
蛍光の in situの交配 (魚) のためのソリューションを準備します。超純水を使用してすべてのソリューションを準備します。
- 5 x 変更ロブのバッファーを準備: 275 mM 酢酸カリウム、酢酸ナトリウム 200 mM、500 mM ショ糖、50 mM グルコース、6 mM 塩化マグネシウム、塩化カルシウム 5 mM、500 mM HEPES pH 7.4 を =。7.4 10 N NaOH を使用して pH をもたらします。フィルター滅菌し、-20 ° C で保存解凍し必要に応じて 1 倍に希釈し、-20 ° C で 1 x 因数を格納
- リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 1.3 M の NaCl、70 mM Na2HPO430 mM NaH2PO4x 10 を準備します。10 N NaOH を使用して 7.0 に pH をもたらします。オートクレーブまたはフィルターの殺菌によって殺菌しなさい。
-
ポリ-L-リジン coverslips に一日を準備する前に必要な。
- ピペットの 18 mm × 18 mm #1.5 カバーガラスの表面に 1% 塩酸を含む 70% エタノールや 5 分液体を削除する使用して真空吸引を孵化させなさい。滅菌超純水を繰り返します。0.1 mg/mL ポリ-L-リジンのカバーガラスの表面をカバーし、10 分間インキュベートします。
- 液体を除去し、空気乾燥で 10 分間ほこりを避けるためにタイトなフィッティングふた付きプラスチック容器にアップ ストア coverslips ポリ L リジン側吸引します。
- 引っ張られたパスツール ピペット卵母細胞を削除せず液体のソリューションを削除するを準備します。ブンゼン バーナーの炎でガラスを溶かすし、離れて引っ張るまで優しく両端を引っぱりながら長いガラス パスツール ピペットの中間を熱します。
2. 魚の腕プローブの生成
注: すべての遠心分離機手順は 16,000 〜 21,000 x g (ほとんどのテーブルの上の microcentrifuges の最高速度) で実行されます。簡単なの遠心分離機スピン回転を示すは、5-15 s. 渦を示します ~ 15 のボルテックスの max で s 特記を高速化します。
注意: アームのプローブの BACs は BAC PAC リソースから入手できます。2 つのX染色体ユークロマチン腕プローブは、この方法で正常に使用されています。1 つのアームのプローブで構成されていた六つの BAC クローンの細胞に対応する 6E 7B (BACR17C09、BACR06J12、BACR35J16、BACR20K01、BACR35A18、BACR26L11) のバンドします。他のアームのプローブを細胞学的バンド 2 階-3 C (BACR13K19、BACR21G11、BACR09H13、BACR30B01、BACR34O03、BACR03D13) に対応する六つの BAC クローン成っていた。BACs 他ショウジョウバエの染色体領域可能性があります参照する: http://www.fruitfly.org/sequence/X1-11-assembly.html。X染色体の 359 bp 衛星繰り返しを認識する 2 つの番プローブは、この方法で正常に使用されています。22 ヌクレオチド プローブは、広く使用されていて、(5'-Cy3-AGGGATCGTTAGCACTCGTAAT)19,23をうまきます。28 ヌクレオチド プローブ テストは最近、(5'-Cy3-GGGATCGTTAGCACTGGTAATTAGCTGC)24もうまくいった。高速液体クロマトグラフィー精製オリゴヌクレオチド 5' 特定の蛍光ラベルの付いた市販のソース (例えばDNA の統合の技術) から命じられました。
- BAC クローン DNA材料のテーブルで指定されているキットの手順を準備します。100 mL 200 μ L TE; 文化から得られる DNA の餌を再停止しなさいBAC クローンによって 5-40 ng/μ L の間最終的な DNA 濃度の範囲。
- 材料の表および次のプロトコルで指定された増幅キットを使用して各 BAC DNA 増幅を実行します。各クローンの BAC DNA を個別に処理します。酵素と 2.2.1 2.2.3 からの手順でキットに付属しているバッファーを使用します。
- BAC DNA の断片化をランダム: 各 BAC の TE を使用して 200 μ L の PCR チューブに 1 ng/μ L の DNA 溶液の 10 μ L を準備します。10 X 断片化バッファーの 1 μ L を追加します。チューブ PCR マシンで丁度 4 分 95 ° C ですぐにクールな氷の水のサンプルを置き、遠心分離機の簡潔に。インキュベーション時間に敏感であり任意の偏差は、結果を変更可能性があります。
- ライブラリの準備
注: このメソッドは、増幅断片のライブラリを生成するのにランダムなプライマーを使用します。- 管に次の追加 DNA を含む: 1 x ライブラリの準備バッファー、ライブラリ安定化溶液 1 μ L の 2 μ L。ボルテックス、簡潔に、遠心分離機、チューブを置き、PCR マシンで 95 ° c で 2 分間すぐにクールな氷の水のサンプル、遠心分離機の簡潔に。
- 簡単に PCR チューブ、ミックス、遠心分離機に図書館準備酵素の 1 μ L を追加します。場所 PCR チューブは PCR マシン、および次のように孵化させなさい: 16 ° C、20 分、20 分、20 分、5 分の 75 ° C の 37 ° C のための 24 の ° C、4 ° C で押し
- PCR マシンからサンプルを削除し、遠心分離機の簡潔に。サンプルをすぐに増幅または 3 日間-20 ° C で保存されている可能性があります。
- BAC DNA ライブラリの増幅
- 次の試薬を加える全体の 15 μ L ランダム フラグメント反応: 増幅マスター ミックス、47.5 μ x 7.5 μ 10 ヌクレアーゼ フリー水、5 μ L WGA DNA ポリメラーゼ。ボルテックスし、遠心分離機の簡潔に。
- 場所 PCR チューブは PCR マシン、および次のように孵化させなさい: 初期変性 95 ° C 3 分、14 サイクルの変性 94 ° C で 15 秒、5 分の 65 ° C で熱処理/拡張子が続くが、4 ° C で押し
- サイクリングの完了後 DNA の集中の試金します。DNA 濃度は、少なくとも 800 べき ng/μ L。 維持サンプル 4 ° c または-20 ° C まででストアが消化の準備。必要に応じて、400 を実行することによって DNA のフラグメント サイズを評価 2% の agarose のゲルの DNA の ng。フラグメントの範囲に 200 から bp 3 kb (図 2)。
- 増幅された DNA の制限の酵素の消化力
- 1.5 mL および microfuge の管で前のセクションからの増幅された DNA の場所 20 μ g。アルール、Haelll、Msel、Mspl、Rsal、BfuCl、0.5 μ L 100 x BSA、制限酵素消化バッファー x 5 μ 10 の 25 単位 20 単位を追加し、超純水 H2o. の適切な量を追加することによって 50 μ L にボリュームを調整
- 一晩で蓋の上の結露を防ぐためにインキュベータ 37 ° C ダイジェストを孵化させなさい。エタノールは、消化の DNA を沈殿させます。ダイジェストに追加: 1 μ L グリコーゲン、1/10 ボリューム 3 M 酢酸ナトリウム 2.5 ボリューム 100% 分子グレード エタノール。-80 ° C 1 時間または一晩で孵化させなさい。
- 4 ° C で 30 分間遠心1 ルーム一時 70% エタノール、4 ° C で 5 分間スピン量で洗う DNA の餌上澄みを除去し、ペレット乾燥空気または空気の着実なストリームを優しく乾燥 DNA をしましょう。
- 36 μ L 滅菌超純水 H2O で DNA ペレットを再懸濁します、1 μ L の DNA を使用して試金 DNA 濃度は、約 285 すべき ng/μ L-20 ° C で DNA の店舗
- 400 実行している DNA のフラグメントのサイズを必要に応じて評価 2% の agarose のゲルの DNA の ng。ほとんどのフラグメントの範囲に 500 まで薄く信号の 100-200 bp から bp (図 2)。
- 3 ' 反応を尾行
- 熱ブロックで 1 分間 100 ° C で消化の DNA を変化させなさい。すぐに氷水で冷やします。DNA の 35 μ L に以下を追加します: 50 μ L 400 mM ナトリウム cacodylate、1 μ L 10 mM DTT、渦も。4 μ L 25 mM CoCl2、dUTP ラベリング キット 5 x TdT バッファー、および 1 μ L ターミナルトランスフェラーゼ (TdT) 400 U 18 μ L、5 μ L 1 mM dTTP 材料のテーブルで指定されたアレスから - 2.5 μ L 2 mM 5-(3-aminoallyl) を追加/μ L。 渦と遠心分離機を簡潔に。
注意: CoCl2は有毒である、適切な保護具を着用します。 - 結露を防止するインキュベーターで 37 ° C で 2 時間インキュベートします。250 mM 反応と簡単にミックスする渦を停止する EDTA の 1 μ L を追加します。エタノールは、(手順 2.3.2 - 2.3.4) 上記のように尾の DNA を沈殿させます。再懸濁します 10 μ L 滅菌超純水 H2o. ストアで乾燥 DNA の餌 DNA-20 ° C で続行する準備ができるまで。
- 熱ブロックで 1 分間 100 ° C で消化の DNA を変化させなさい。すぐに氷水で冷やします。DNA の 35 μ L に以下を追加します: 50 μ L 400 mM ナトリウム cacodylate、1 μ L 10 mM DTT、渦も。4 μ L 25 mM CoCl2、dUTP ラベリング キット 5 x TdT バッファー、および 1 μ L ターミナルトランスフェラーゼ (TdT) 400 U 18 μ L、5 μ L 1 mM dTTP 材料のテーブルで指定されたアレスから - 2.5 μ L 2 mM 5-(3-aminoallyl) を追加/μ L。 渦と遠心分離機を簡潔に。
- 材料表で指定されている DNA ラベリング キットを使用して蛍光色素活用を行ってください。
注: 染料を追加するは、暗闇の中でサンプルを保持します。- 熱ブロックで 5 分 95 ° C で尾の DNA を変化させなさい。すぐに氷の水と遠心力で簡単に DNA をクールします。キットの指示に従ってラベル バッファーを準備し、6 μ L を各 DNA のサンプルに追加します。キットから DMSO の 4 μ L で染料の各チューブを再懸濁します。渦と遠心分離機を簡潔に。
- 各標識反応染料の 1 つの管を使用します。簡単に DNA、渦、および遠心分離機に色素溶液を追加します。暗闇の中 2 時間室温でラベリングの反応を孵化させなさい。ヌクレアーゼ フリーの 77 μ L に続いて反応を停止する 3 M のヒドロキシルアミンの 3 μ L を追加 H2O キットから。渦と遠心分離機を簡潔に。
- 非共役系色素材料の表の指定に従って PCR 精製キットを使用してを削除します。製造元の指示に従ってください。2 回するたびに 40 μ L の溶出バッファーを使用して、列から DNA を溶出します。
- エタノールは、(手順 2.3.2 - 2.3.4) 前述標識 DNA を沈殿させます。10 μ L の溶出バッファーで乾燥 DNA ペレットを再懸濁します。
- プローブの混合物を準備します。
- ラベル付けされた DNA pmol/μ L で螢光色素の濃度を決定します。Fluorophore 濃度 30 100 pmol/μ L、BAC によって範囲があります。DNA 濃度は 300-800 ng/μ L の範囲があります。
注: マイクロ アレイ設定は材料の表に指定されているなど、微量分光光度計でうまく機能します。マイクロ アレイの] ウィンドウで DNA-50 を選択し、螢光色素を指定します。 - 各 BAC プローブの等モル量 (pmol 蛍光) を組み合わせることによりマスター ミックスを作成します。結合する前に渦 30 s。凍結/解凍サイクルを避けるためには、マスター ミックスの因数を準備、蒸発を防止し、-20 ° C で暗闇の中を格納するチューブにパラフィン フィルムを適用
注: 各 6 個々 BAC の 250 pmol を含むマスター ミックスは 30-50 μ L 作品の容量でもプローブします。各 BAC の 25 pmol (蛍光) を含む、因数 2 40 μ L の交配反応、0.31 pmol 蛍光/μ l 各 BAC の最終的なプローブの濃度で十分であります。
- ラベル付けされた DNA pmol/μ L で螢光色素の濃度を決定します。Fluorophore 濃度 30 100 pmol/μ L、BAC によって範囲があります。DNA 濃度は 300-800 ng/μ L の範囲があります。
3. 郭清と卵母細胞の固定
- 適切な遺伝子型の 30 のアダルト処女女性を収集します。後期段階卵子の豊かにするには、郭清25まで 3-5 日はえの食糧と乾燥酵母を瓶でなく男性女性を保持します。郭清、前日はガスなし女性を酵母と新鮮なバイアルに転送します。
-
郭清を実行します。
注: 必要なツールの図 3を参照してください。ソリューションは、特に断らない限り、引っ張られたパスツール ピペットを使用して削除されます。卵巣を常に転送する場合は、10 %bsa 溶液でコーティングされたピペット チップを使用します。- 浅い解剖皿に変更ロブのバッファーを含む、単一の女性から卵巣を削除するのに鉗子を使用します。使用鉗子またはタングステン針内部卵巣小管に連絡するソリューションをできるように、それぞれの卵巣を軽くスプレーします。1 mL 変更ロブのバッファーを含む 1.5 mL microfuge の管にスプレイ卵巣のペアを転送します。
- 3.2.1 1.5 mL および microfuge の管で 20-25 女性から卵巣を蓄積するためのステップを繰り返します。10 分以内 20-25 女性の解剖を終了します。
-
固定をとおり実行します。
- 引っ張られたパスツール ピペットおよび microfuge の管に液体を削除、P1000 を使用する卵巣を 500 μ L の 37 ° C の解決策をすばやく追加し、すぐに卵巣に室温ヘプタンの 500 μ L を追加します。
- ミックス、3 分 nutator に振るおよび microfuge チューブは、底に沈殿する nutator と卵母細胞を許可する 1 分管ラックの場所からおよび microfuge の管を削除します。合計固定時間は 4 分です。
注意:解決策とヘプタン有毒である、適切な保護具を着用します。 - 解決策を削除し、卵巣リンス 500 μ L の PBS 0.5 %bsa および 0.1% を含む 3 回トリトン X-100 (PBSBTx)
- 残りの遺伝子型を繰り返します。
4. 絨毛と卵黄膜の除去
注: 必要なツールの図 3を参照してください。
-
別の後期段階卵子
- 浅い解剖皿に 1 mL PBSBTx を追加します。BSA コーティング チップで P200 を使用して (~ 150 μ L) で固定の卵巣を浅い皿に転送。卵巣を上下に未成熟卵母細胞から成熟した卵母細胞を除去する BSA コーティング ピペット チップ ピペットします。
- 後半ステージ卵子が十分に分離されている場合は、すべての組織を 500 μ L および microfuge の管に転送します。について残してプル パスツール ピペットで余分な液体を削除する管に 150-200 μ L。残りの遺伝子型のセクション 4.1 を繰り返します。
-
ロールバックの準備します。
- 中古ウェット PBSBTx カバーの 200 μ L で深いよく料理しておきます。3 の曇らされたガラス スライドとセット スライド #3 脇を取得します。一緒にスライド #1 と 2 の曇らされたガラス領域をこすり。任意のガラスの破片を取り除き、使い捨てワイプで乾燥脱イオン水でそれらをすすいでください。
- 1 つのスライドに PBSBTx の 50 μ L を追加し、他のスライドでこの地域をこすりスライド #1 と PBSBTx #2 の霜で覆われた地域をコートします。使い捨て可能なワイプで液体を除去します。
- 図 4 aに示すように構成に解剖顕微鏡の下でスライドを配置します。#3 のスライドとスライド #1 と接触、#2 の霜で覆われた領域はスライド #2 をサポートし続けます。
-
ロールの卵;圧延の方向は直線、決して円を描くように常にことを確認します。
- Prewet P200 ピペットは PBSBTx のヒントし、上下にピペッティングによるおよび microfuge の管で卵母細胞を分散します。液体含む卵母細胞の 50 μ L をスライド #1 の曇らされたガラス部分のセンターに転送します。# これを行う 2 スライドを持ち上げます。
- 液体の表面張力は 2 つの曇らされたガラス領域間のシールを作成するまで、スライド #2 をゆっくりと下ろします。すりガラスのエリアをカバーする十分な液体がありますがどれも浸出が。液体があふれている、余分な液体を削除するのにプル パスツール ピペットを使用します。
- 下部スライド (#1) 片手で押しながらスライド #2 レベルとのサポートされているスライド #3 維持する水平方向の一番上のスライド (#2) を行き来する他の手を使用します。卵母細胞の動きと進行中の簡単な可視化のための顕微鏡の下で実行します。
注: この動きでは、「ロール」と、絨毛を失うに卵母細胞を引き起こす、摩擦が生成されます。最小限の圧力を使用する必要がありの動きが短く、簡単にする必要があります。 - いくつか水平方向に動き後、少し動き (図 4 b) の角度を変えます。複数単位で (#2) の一番上のスライドの動きが (図 4 b) の開始の方向に垂直になるまで徐々 に 90 ° に角度を増加します。空の絨毛が液体に表示される、絨毛を欠けている卵母細胞は長く、薄く表示されますに注意してください。
- ソリューションが曇りがちになるまで手順 4.3.3 - 4.3.4 を約 7-10 回繰り返します。卵母細胞 (75-85%) の大半は彼らの卵黄膜を失っていると圧延を停止します。
注: 独特の先の尖った端は卵の卵黄膜を欠けている上に表示されます。卵黄膜が絨毛より削除は難しいです。光の圧力は、卵黄膜の除去を達成するために転がりながら一番上のスライド (スライド #2) に適用する可能性があります。すべての卵母細胞は、しばしば他の卵母細胞の破壊の結果から卵黄膜を削除しようとしました。 - フワリと一番上のスライド (#2)、霜で覆われた領域の中心に蓄積卵母細胞をロールバックできるように下部スライド (#1) の霜で覆われた領域の中心にそのコーナーの一つをドラッグします。PBSBTx の入った皿を深井戸に PBSBTx と両方のスライドから卵子をすすいでください。
- #1 と超純水、使い捨て可能なワイプ乾燥 #2 スライドをクリーンし、リセットします。4.3.1 - 4.3.6 卵母細胞は、同じ遺伝子がロールされているまでの手順を繰り返します。これは通常圧延遺伝子あたりの 3-4 ラウンドを必要があります。
-
圧延後の残骸を削除します。
- 15 mL の円錐管に 1 mL PBSBTx を追加します。チューブの側面に塗るに液体を旋回します。
- P1000 ピペット チップ、PBSBTx 追加 PBSBTx の追加の 2 mL の卵母細胞を含む円錐管に 1 mL を含む円錐管に深いから圧延の卵の皿も転送をコーティング、PBSBTx を使用しています。
- 卵母細胞の底に沈殿し、トップ、P1000 の破片 (絨毛、vitellinesなど) を含む溶液 2 mL を削除、破棄を開始しましょう。必要な場合は、彼らがシンク不透明な卵母細胞を見る暗い背景に円錐管を保持します。
- PBSBTx の追加 2 mL を加える卵母細胞、および 4.4.3 の手順を繰り返します。4.4.3 を繰り返します。瓦礫撤去の 3 ラウンドの合計。
- P1000 ピペット チップ、元の 500 μ L および microfuge の管に戻る転送卵子をコーティング、PBSBTx を使用しています。20-25 女性は圧延の成熟した卵子の約 50 μ L を得られるはず。
- 各遺伝子型の新鮮な曇らされたスライド、きれいな深い井戸の料理、新しい円錐管を使用して残りの遺伝子型のセクション 4 を繰り返します。
- ストレージが必要な場合は、転送と 0.1% TritionX 100 ストア 1 × PBS に卵子が 4 ° C で一晩非イオン性洗剤によって架橋結合するホルムアルデヒドを反転できますので長期保存はお勧めできません。
5. 魚
注: すべて洗浄は室温で nutator で実行されます限り。ロールされている卵子ホルムアミドを含むソリューションで特に、および microfuge の管の底に沈殿する時間がかかります。卵母細胞はプロセスで失われないようにソリューションを変更するときに患者をすることが重要です。これは、卵の洗口液と洗浄後解決させる 5-15 分を待っている必要があります。またホルムアミドの卵母細胞が少ない不透明なことに注意してください。
-
抽出と RNAse 処理
- 500 μ L の PBS 1% を含む卵をすすぎトリトン X-100 (PBSTx)。液体を削除し、500 μ L を追加抽出バッファー (PBSTx RNAse を含む)。Nutator 2 時間室温で孵化させなさい。
-
前の交配の洗浄
- トゥイーン 20 (SSCT) を含む生理食塩水クエン酸ナトリウム x 500 μ L 2 で 3 回卵をすすいでください。SSCT + 37 ° C に 50% ホルムアミド x 2 (〜 500 μ L/遺伝子型) に硫酸を予熱します。
注意:ホルムアミドは有毒である、適切な保護具を着用します。 - 500 μ L 2 で 3 回 10 分ずつの卵を洗う x SSCT。10 分の卵を 500 μ L 2 x SSCT + 20% ホルムアミドに洗ってください。10 分の卵を 500 μ L 2 x SSCT + 40% ホルムアミドに洗ってください。10 分の卵を 500 μ L 2 x SSCT + 50% ホルムアミドに洗ってください。
- 液体を除去し、サンプルし、回転と 37 ° C で 2 時間インキュベートするステップ 5.2.1 から 37 ° C 2 x SSCT + 50% ホルムアミドの 500 μ L を追加します。
注: ローテーター装備ハイブリダイゼーション オーブンはこのためにうまく動作します。泡 microfuge の管「フロート」、回転子に接続されているは、チューブを保護する使用ことができます。
- トゥイーン 20 (SSCT) を含む生理食塩水クエン酸ナトリウム x 500 μ L 2 で 3 回卵をすすいでください。SSCT + 37 ° C に 50% ホルムアミド x 2 (〜 500 μ L/遺伝子型) に硫酸を予熱します。
-
変性および交配
- 卵母細胞の各チューブ、2.5 ng/μ L のセントロメア プローブと 0.31 pmol 蛍光/μ 各 BAC プローブを含む 1 x 交配バッファーの 40 μ L を使用します。交配バッファーのすべての遺伝子のために十分にプローブのソリューションを準備します。渦プローブ ミックス 30 秒追加する前に。
- BSA コーティング P200 ピペット チップを使用して、200 μ L の PCR チューブに卵母細胞を転送します。下に 37 ° C および let 卵子セトルでサンプルを維持し、引っ張られたパスツール ピペットを使用してできるだけ多くの液体を削除します。
- 卵母細胞にプローブ (セクション 2 の準備) を含むハイブリダイゼーション溶液 40 μ L を追加します。PCR マシンで卵母細胞を含む PCR チューブを置き、次のように孵化させなさい: 37 ° C、5 分、3 分、し 37 ° C 一晩 92 ° C。卵母細胞にプローブを追加すると後を保つそれら暗闇の中で可能な限り。
-
ポスト交配の洗浄
- SSCT + 37 ° C に 50% ホルムアミド x 2 を予熱し、ハイブリダイゼーション インキュベーターでそれを保ちます。BSA を用いたコーティング P200 ピペットの先端卵子と PCR チューブに 37 ° C 2 x SSCT + 50% ホルムアミドの 100 μ L を追加し、新しい 500 μ L および microfuge の管に卵子を転送します。
- 管および卵子をインキュベーターの 37 ° C で解決しましょうと同じ 37 ° C 2 x SSCT + 50% ホルムアミドの追加の 400 μ L を追加します。
注: 多くの場合解決この段階で時間がかかります。それは、15 分を取るには珍しい以上ではありません。忍耐力の欠如は、卵母細胞の重大な損失になります。 - 500 μ L 37 ° C 2 x SSCT + 37 ° C で 50% ホルムアミド回転で 3 回各 20 分の卵を洗います。37 ° C で卵子にまま、彼らは解決します。
- 500 μ L 37 ° C 2 x SSCT + 37 ° C で 50% ホルムアミド回転で 3 回 10 分ずつの卵母細胞を洗浄します。37 ° C で卵子にまま、彼らは解決します。
- 常温で 500 μ L 2 x SSCT + 40% ホルムアミド、nutator 上で 10 分の卵を洗います。10 分の卵を 500 μ L 2 x SSCT + 20% ホルムアミドに洗ってください。500 μ L 2 で 10 分の卵を洗う x SSCT。
-
DAPI で染色します。
注意: DAPI は有毒である、適切な保護具を着用します。- 500 μ L DAPI 溶液 (1 μ g/ml) 2 で 20 分間卵を洗って、nutator の x SSCT。500 μ L 2 で卵母細胞を 3 回リンス x SSCT。500 μ L 2 の 2 回各 10 分の卵を洗って、nutator の x SSCT。Coverslips にマウントする準備ができるまで、暗闇の中で室温で 4 h までのサンプルを格納できます。
-
取付
注: 必要なツールの図 3を参照してください。- 解剖顕微鏡の下でポリ L リジン コーティングされた coverslip の場所。約 150 μ L に容量を調整すること、卵子のチューブから液体を除去します。BSA P200 ピペット チップ、ピペットを上下に、ソリューション全体で卵母細胞を分散し、ポリ-L-リジン コーティングされた coverslip に卵母細胞/溶液 40 μ L を転送をコーティングしました。
- 卵母細胞、coverslip に固執するが、まだ液体に囲まれてまで引っ張られたパスツール ピペットを使用して coverslip から液体の一部を削除します。鉗子を押しながら 1 つの側面のカバー スリップし優しく卵母細胞、非重複の卵母細胞の単一の層を達成するためにそれらを移動の塊を分離するタングステン針を使用します。
- 引っ張られたパスツール ピペットで卵子周囲液の残りの部分を削除します。きれいなガラス スライドを取るし、圧縮ガスを使用して、任意のほこりを吹き飛ばします。スライドの中央に (例えば延長金) メディアのマウントの 22 μ L を追加します。メディア サンプルに触れるまで、サンプルを直面しているメディアをマウントで、coverslip に向かってスライドをゆっくりと下ろします。表面張力は、coverslip のスライドに付着する原因となります。
- 新鮮な乾燥剤 (例えばdrierite) のレイヤーが含まれたタイトなフィッティングふた付きプラスチック容器にスライドを配置します。スライド画像の前に暗闇の中で 3-5 日間乾燥をしましょう。乾燥時間は、部屋の湿度に応じて異なる場合があります。
6. 画像
- 乾燥剤のボックスからドライ スライドを除去する際に任意のほこりの粒子を除去するそれらをきれいにします。マニキュアと coverslips をシールします。封印されたスライドは、-20 ° C で不明確に保存される場合があります。
- レーザースキャニング 6 X デジタル ・ ズームと高開口数 40 X 石油目的を用いた共焦点画像を取得します。
注: 理想的には、システム ソフトウェアは、1 つを見つけるし、それらを見ながら複数の卵母細胞の減数分裂期染色体の X と Y の位置をマークする落射蛍光を使用します。この機能は、イメージング セッション中に時間を節約できます。漂白した高開口数 60 × 対物と急速な選ばれた共焦点システムが不適切な使用は他のシステム動作場合があります。 - DAPI 信号を使用してシリーズの上下を設定、それぞれの卵の Z シリーズをキャプチャします。
注: ゲイン、オフセット、およびレーザー パワーが経験的卵母細胞のサブセットを使用して決定する必要があります。適切なパラメーターを見つけたら、マイナーな調整のみ必要があります行われる必要があります。
買収を変更すると設定が必要です、以前に収集した画像のスタックを使用して必要な変更を評価します。漂白を避けるため、Z シリーズをキャプチャする前に腕プローブを事前イメージングを控えます。0.25 μ m のステップ サイズの Z シリーズ通常範囲 25 から方向および染色体の配置に応じて、30 の手順です。小さなステップ サイズは、1 つの魚の 2 つのスポットは、軸ディメンションに区切られていますが、小さいステップと漂白による信号強度の損失をキャプチャするために必要な時間とのトレードオフがあるかどうかを評価する能力が向上します。6 倍デジタル ズームと 1,024 x 512 イメージ フィールドと 40 X 目的は、0.05 μ m のピクセル サイズを持つ画像を生成します。
7. イメージ分析および凝集性の欠陥のためのスコアリング
- 各卵19の信号対雑音比を最適化するために Z シリーズを deconvolve します。
注:材料表で指定されているものなどのソフトウェア パッケージ統合復元を使用する deconvolve と同様にトリミングし、コントラストは、画像を向上させることができます。重要なは、3 次元表示画像と結束性欠陥のスコアことができますソフトウェア パッケージは、不可欠です。 - 各卵子の腕および DAPI 信号 colocalize セントロメアの巣の数を集計します。凝集性の損失は特定のプローブの 3 つまたは 4 つのはっきりと分離信号の結果します。細い糸で接続されている 2 つの巣を観察することは珍しくないです。最も厳しい基準でこれらの巣はみなされない「分離」。
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Representative Results
X染色体の細胞学的地域 6E 7B に交配腕プローブで得られた画像を図 5に示します。共同の DAPI、ローカライズ信号でこの検出結果の例は、背景から識別しやすいと正常に異なった遺伝子型19腕結束の欠陥を定量化するために使用されています。結束性欠陥の定量化は制限された prometaphase に私と中期私段階;核膜崩壊前に卵母細胞は、解析19から除外しました。卵母細胞の染色体に囲まれて離散円形領域は周囲の細胞より暗いので DAPI チャンネルでスキャンする場合、そのまま核封筒は明らかです。
図 5Bは、デコンボリューションとコントラスト強化後個々 の Z シリーズの最大輝度投影相関を示しています。結束性欠陥の定量化は、各プローブの魚数信号、重なる DAPI 信号を決定する必要があります。このような分析では、3 つの次元でマージされた画像の可視化が不可欠です。明確にすべての 3 次元の DAPI 信号に関連付けられている魚スポットのみが分析に含まれます。
そのまま姉妹染色分け体の凝集度は腕と番の両方のプローブ (図 5 b、左) の 2 つの魚のスポットとして立証されます。いずれかのプローブの 3 つまたは 4 つの区切られた魚スポットを含む卵母細胞凝集欠陥 (図 5 b右) を持っていると見なされます。最低限個々 のスポットとして分類される、2 つの魚の信号を最小スポット径に対応する距離によってすべての 3 つの次元で区切る必要があります。魚の 2 つのスポットを接続する薄いかすかな糸は、珍しいことではないです。このような信号は完全に分かれているとは見なされません、結束性欠陥のインスタンスとしてカウントされません。
7B 6E 腕の交配のプローブ約 15-20% イメージ化卵母細胞の完全に欠いていた信号や信号は自信を持ってスコアには弱すぎます。さらに、約 5% イメージ卵子の展示びまん性の染色体信号の広域とこれらは分析から破棄されました。対照的に、卵母細胞の番交配信号がないか、またはあまりにもスコアにびまん性に遭遇する稀でした。
7B 6E 腕プローブは prometaphase アーム結束欠陥を定量化する広く使用されており、中期私逮捕のショウジョウバエの卵母細胞遺伝子型の異なる19。ときコヒーシン サブユニット SMC3 はねられた中期前期、含まれる分析成熟した卵子の 16.3% 中 2 アーム スポット、腕結束の早期喪失を示すものよりも大きかった。対照的に、わずか 5.1% SMC319の正常なレベルに含まれている卵の分離アーム スポットを見ました。興味深いことに、腕結束回数欠陥ノックダウン遺伝子型、姉妹染色分け体の番地域19に分かれていたのほとんどの上昇だった。
図 1: 逮捕拡張の前期の間に結束の年齢依存性損失女性減数分裂の染色体分配のエラーで、卵の異数性発生ことができます。結束は姉妹の間の黒いバーで表される染色分け体。腕結束組換え同族体を一緒に保持する機能し、後期で正確な分離に必要な私。腕の結束が途中で失われた染色体紡錘により異数性卵の結果、発生します。この図は参照19から適応されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: BAC 断片化と増幅 (左) と 3 つの異なる BACs のため (右) 制限酵素消化後の DNA の分子のサイズ。400 増幅 DNA 産物の ng は、最初の 3 つの車線に表示されます。最後の 3 つの車線は、一晩の制限のダイジェストの後の DNA のフラグメントを表示します。増幅された DNA の製品範囲 200 bp 3 kb まで。制限のダイジェストが 100-200 bp からほとんどのフラグメント、フラグメントが大きい後 (最大 500 bp) が表示されていた。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 細胞診ツール。プロトコルで使用されるツール: 鉗子 (#5 ・ デュモン); (1) 組(2) 高純度タングステン針;(3) 深井皿カバー;(4) 浅いガラス皿; を解剖(5) 引っ張られたパスツール ピペット。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4。配置と卵の圧延のためのスライドの移動。(A)スライドの図は、プロトコルで説明されているように卵の圧延用を設定しました。暗い領域では、スライドの曇らされたガラスの部分を示します。#2 のスライドの動きベクトルの方向を圧延卵母細胞中(B) 。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5。魚はアッセイの結果です。(A) ショウジョウバエの X染色体および 2 つのプローブ (6 BACs) 腕し、プロトコルで説明されている 22 オリゴヌクレオチド pericentromeric プローブのハイブリダイズ概略図を示しています。便宜上、7B 6E 7B プローブのラベルは、2 階-3 C プローブは 3 c. というラベルの付いた(B)そのままアーム結合 (2 つの腕プローブ スポット、1 つの相同物) と中断腕結束 (3 ~ 4 腕プローブ スポット) の魚の結果 (7B 6E プローブ) の代表的なイメージ。DNA は青、腕プローブ信号は黄色、番プローブ信号は赤。画像は、デコンボリューションとコントラスト強化後 Z シリーズの最大強度突起に対応します。スケール バー = 2 μ m。この図は参照19から適応されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
私と中期 prometaphase の腕の結束の状態を評価するプローブの魚の使用私のショウジョウバエの卵母細胞はショウジョウバエの減数分裂の分野の重要な進歩。歴史的に、ショウジョウバエ研究者は成熟卵11,18,19腕結束の早期喪失を推論するための遺伝子検査に限られています。今、紹介した方法で腕の結束の状態ことができます試金する魚を使用して直接。大きく腕結束の早期喪失の物理的な証拠を取得する機能は、ショウジョウバエの卵母細胞腕凝集度と染色体紡錘の早期喪失につながるメカニズムを研究に利用可能なアプローチのレパートリーを展開します。
重要なステップ
成熟したショウジョウバエの卵母細胞における染色体腕に沿ってシングル コピー シーケンスに交配する蛍光プローブの成功した可視化のために必要な重要なパラメーターの系統的解析を施しておりませんが、おりますが、この手法の成功に貢献するかもしれない要因の次の一覧。約 0.8 Mb Xの間隔をカバーする BAC プローブを重複する六つの組み合わせを用いて腕プローブを生成-染色体腕。小さい地域をまたがる少ない BACs を使用して私たちの初期の試みは成功しなかった。また、フラグメントし、Alexa 647 と終り分類前に BAC DNA を増幅する方法を使いました。ラベルの貼られた制限のフラグメントの大半はだった 100 200 bp 長い (図 2)、厚い組織21を通じて効率的な拡散に必要な 150 のヌクレオチドのターゲット サイズと同様です。大規模なショウジョウバエの卵母細胞の形態を維持がもプローブの浸透を許可する固定条件が不可欠です。室温ヘプタンを 37 ° C に予熱した修正プログラム ソリューションに追加することにより、以前使用していた固定法23を変更しました。固定のため体温の低下と同様、卵黄膜を浸透させるヘプタン添加が腕の凝集度の可視化に成功した固定状況に寄与していることが可能だと考えています。
存在する欠陥の定量化を可能にするサンプル サイズが必要です 1 つときに早期喪失結束のための試金、低中程度のレベルで。多数の成熟した卵子を得るためには、他の26,27をふるい併用成人女性のミキサー破壊を使用しました。ここで述べる手に 20-25 女性から卵巣を解剖、手動分離後半のピペッティングによる卵母細胞をステージします。ミキサー/篩方法もこのプロトコルで動作しますが、手解剖の利点の 1 つが、ふるいステップなし卵時間を費やす少ない固定の後期の可能性が減少する前にバッファーに私人工卵による発症活性化。さらに、このメソッドは、開始材料として少ない女性を必要とする、試薬の小さいボリュームを使用複数遺伝子の処理を容易にするすべてのワークフローを単純には。
成熟卵の手郭清とマニュアルの分離卵黄膜と卵殻膜の除去のための「ロール」に卵母細胞の十分な量を提供して交配の洗浄の最後に 75-150 の卵母細胞になります。1 つのトリックの収率を最大限に卵子を逮捕された中期郭清25前に男性の不在で yeasted バイアルに処女雌を保持することです。絨毛と卵黄の膜を削除するローリング卵母細胞は卵母細胞を破壊することを避けるために優しいタッチで行う必要があります。しかし、卵子の 100% から絨毛と卵黄膜を削除は現実的な目標ではありません、卵母細胞の損失の結果だけ過剰なローリングします。したがって、各ローリング サイクルする必要があります停止するとき卵不足絨毛と卵黄膜の約 75-85%。
制限
生成と成熟したショウジョウバエの卵母細胞の結束の状態を監視するアームのプローブを使用して私たちの成功にもかかわらず、プロシージャはまだ制限から苦しみます。Pericentromeric プローブの信号を検出する失敗したほとんどの腕プローブ信号は弱いまたはイメージを描き、卵子の約 15-20% で欠席します。要因の 1 大きい腕プローブ (100-200 のヌクレオチド) 対番オリゴヌクレオチド プローブ (22-28 ヌクレオチド) の差分の浸透があります。また、腕プローブよりも明るくなっている信号で番プローブにより認識される大きな反復配列。卵母細胞と卵母細胞の減数分裂期染色体の配置の向きは、イメージングとも課題を提示.減数分裂の染色体が細胞の皮質に近い比較的、上、マウントする際、卵の向きを制御することはないです。したがって、卵子の一部の減数分裂の染色体があります、coverslip と信号強度から 100-200 μ m と品質が低下する場合が卵母細胞の大部分をイメージしようとしたとき。これらの制限は、最終的な定量的分析に含まれる卵の数がプロトコルで処理卵母細胞の数よりもかなり低いという意味します。100 卵母細胞腕結束の状態を決定する 2 つの独立準備が必要になりますほとんど。レーザー共焦点顕微鏡を用いた凝集欠陥の定量化における追加の制限要因は典型的な Z シリーズ (約 5 分) をキャプチャするために必要な時間キャプチャー エリアが 1,024 × 512 ピクセルに限定される場合も。つまり制御と実験的遺伝子型 (100 卵) における結束性の比較は画像コレクション時間の約 16 時間を必要とします。
変更とトラブルシューティング
我々 は細胞学的位置 7B 6E19 X染色体を認識するプローブを用いた腕の結束の状態を監視することができた。X染色体上のより遠位の場所に交配するプローブは、キアズマ メンテナンス障害検出より望ましいかもしれません。さらに、他の研究者は、他の染色体の腕の凝集を分析したい場合があります。我々 はない、座位をプローブを試みている、またX染色体の 2 階-3 C 領域を認識するプローブの探索可能なシグナルの結果、予備的なデータを示しています。しかし、限られた予備的なデータに基づき、2 階-3 C プローブの信号かもしれません 7B 6E プローブよりも少ない「コンパクト」。魚信号がしっかりといくつかの卵母細胞の染色体の鮮明な他の卵母細胞の染色体に交配信号はかなり拡散。信号のこれらの相違は 2 つの細胞の場所の染色体形態の本物の違いを反映して、かどうか 2 つのハイブリダイゼーション効率の変動はプローブ、または異なる卵子間だけ確率変動徹底的な分析が必要です。
重要なは、6 e 7B プローブのもいくつか卵母細胞のびまん性染色体信号を見ましたこれはしばしば解析から除外を必要とします。さらに、信号の品質および 7B 6E プローブの異なる製剤間の明るさの変化を気づいている、これはその画像を必要なパラメーター調整。交配温度 42 ° c を上げる拡散信号と卵母細胞数下がりませんでしたが、それは番オリゴヌクレオチド プローブの信号に影響を与える深刻な。私たちはまた (80 ° C) 低い温度で長く変性のステップを試みたがこの治療に信号強度を増加もびまん性と卵母細胞の数を減らしたことを見つけたより良い染色体形態24を維持する努力、染色体の魚の信号。我々 はまた細胞領域 5 e 7B をスパン約 1.5 Mb 間隔に対応する 12 の重なり合う BACs を使用して明るい腕信号を取得ましょう。12 BAC プローブを使用している場合、信号強度の変動の程度だけでなく、信号に欠けている卵子の割合が 6 BACs が腕プローブに使われたときよりも異なっていた。またより魚信号が大きく、個々 の染色分け体に対応するスポットを解決することが難しく、12 の BAC プローブを使用する場合、凝集性欠陥のスコアに挑戦的だった。新しく準備されたプローブを信号が得られない場合、研究者は増幅のサイズを確認する必要があります、制限消化 BAC DNA 最後のラベルに使われるフラグメントが 100-200 bp の範囲の内で主にことを確認します。これは成功したプローブの準備の最も重要な要因の 1 つになります。
今後の方向性
免疫染色を含めるプロトコルの適応し同様、画像の取得を強化する将来の仕事には、他の研究者の利益となる大きな改善となります。イメージ コレクション中に高速画像取得と同様、軸ディメンション内のイメージの大きい数を集める結束欠陥の定量化のために有利でしょう。共焦点走査型レーザー用撮像パラメーターの最適化、0.25 μ m だった魚のかなり漂白を避けるために Z シリーズに使用できる最小のステップ サイズが信号を発見しました。ただし、Z スタック未満 0.25 μ m で区切られている魚信号、このステップ サイズは焦点間の「スペース」をキャプチャする失敗可能性があります、したがって結束欠陥の数を過小評価する可能性があります。回転のディスク共焦点画像集録速度が信号を漂白せずに使用するステップ サイズを小さくできます。これより正確な画像再構成軸ディメンションを提供として結束欠陥で分析する卵子の数が大きい許可でしょう。さらに、腕の結束の状態の魚の可視化による免疫染色を組み合わせる機能はプロトコルを大幅強化するでしょう。準備作業の数、スピンドル染色交配の手順を実行しました。しかし、堅牢なスピンドルの染色は卵母細胞のごく一部のみに表示されます。また、理由は明確ではないが、高レベル魚スプリアスの囲まれた減数分裂の染色体魚や免疫染色が結合されたとき。さらに魚のプロシージャのこの技術の機能大幅拡大に向けて前後に免疫染色を許可するプロトコルを最適化する作業です。
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Disclosures
著者は競合する金銭的な利益を宣言しません。
Acknowledgments
この作品は、NIH グラント GM59354 シャロン E. Bickel に授与によって支えられました。Q. ウイ グエンにアン Lavanway 共焦点顕微鏡のヘルプとテクニカル サポートに J. エミリアーノ リード蛍光腕プローブの生成のためのプロトコルの開発に支援ありがちましょう。また、有用な議論やアドバイスのためのショウジョウバエのコミュニティで多くの同僚らを感謝いたします。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Kits | |||
| Midi Prep kit | Qiagen | 12143 | Prep BAC clone DNA |
| GenomePlex Complete Whole Genome Amplification (WGA) Kit | Sigma | WGA2 | Amplify BAC clone DNA |
| ARES Alexa Fluor 647 DNA labeling kit | Invitrogen | A21676 | Label BAC clone DNA |
| PCR purification kit | Qiagen | 28104 | Remove non-conjugated dye following labeling of BAC clone DNA |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals & Solutions | |||
| Note: All solutions are prepared using sterile ultrapure water and should be sterilized either by autoclave or filter sterilization. | |||
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1600-100 | Prepare 10% stock Freeze aliquots |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | C75-500 | |
| DAPI (4’, 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | Toxic: wear appropriate protection. Prepare 100µg/ml stock in 100% ethanol, store in aliquots at -20 °C. Prepare 1 µg/ml solution in 2X SSCT before use. |
| Dextran sulfate | Sigma | D-8906 | |
| Drierite | Drierite Company | 23001 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Invitrogen | 15508-013 | Prepare 10 mM stock |
| dTTP (10 µmol, 100 µl) | Boehringer Mannheim | 1277049 | Prepare 1 mM stock |
| EDTA (Disodium ethylenediamine tetraacetic acid) | Fisher Scientific | S311-500 | Prepare 250 mM stock |
| 100% ethanol (molecular grade, 200 proof) | Decon Laboratories | 2716 | |
| Tris (Ultra Pure) | Invitrogen | 15504-020 | |
| EGTA (Ethylenebis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid) | Sigma | E-3889 | |
| 16% formaldehyde | Ted Pella, Inc. | 18505 | Toxic: wear appropriate protection |
| Formamide | Invitrogen | AM9342 | Toxic: wear appropriate protection |
| Glucose | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Glycogen | Roche | 901393 | |
| HEPES | Boehringer Mannheim | 737-151 | |
| Heptane | Fisher Scientific | H350-4 | Toxic: wear appropriate protection. |
| Hydrochloric acid | Millipore | HX0603-4 | Toxic: wear appropriate protection. |
| Hydroxylamine | Sigma | 438227 | Prepare 3 M stock |
| 4.9 M Magnesium chloride | Sigma | 104-20 | |
| Na2HPO4 Ÿ 7H2O | Fisher Scientific | S373-500 | |
| NaH2PO4 Ÿ 2H2O | Fisher Scientific | S369-500 | |
| Poly-L-lysine (0.1mg/ml) | Sigma | P8920-100 | |
| Potassium acetate | Fisher Scientific | BP364-500 | |
| Sodium acetate | Fisher Scientific | S209-500 | Prepare 3M stock |
| Sodium cacodylate | Polysciences, Inc. | 1131 | Toxic: wear appropriate protection. Prepare 400mM stock |
| Sodium citrate | Fisher Scientific | BP327-1 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S271-3 | Sodium chloride |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| 10% Tween 20 | Thermo Scientific | 28320 | Surfact-Amps |
| 10% Triton X-100 | Thermo Scientific | 28314 | Surfact-Amps |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions | |||
| Note: All solutions are prepared using sterile ultrapure water and should be sterilized either by autoclave or filter sterilization. | |||
| TE buffer | 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH = 8.0 | ||
| 20X SSC (Saline Sodium Citrate) | 3 M NaCl, 300 mM sodium citrate | ||
| 2X cacodylate fix solution | Toxic: wear appropriate protection. 200 mM sodium cacodylate, 200 mM sucrose, 80 mM sodium acetate, 20 mM EGTA | ||
| 1.1X Hybridization buffer | 3.3X SSC, 55% formamide, 11% dextran sulfate | ||
| Fix solution | Toxic: wear appropriate protection. 4% formaldehyde, 1X cacodylate fix solution | ||
| PBSBTx | 1X PBS, 0.5% BSA, 0.1% Trition X-100 | ||
| PBSTx | 1X PBS, 1% Trition X-100 | ||
| Extraction buffer (PBSTx + Rnase) | 1X PBS, 1% Trition X-100, 100 µg/mL RNase | ||
| 2X SSCT | 2X SSC, 0.1% Tween 20 | ||
| 2X SSCT + 20% formamide | Toxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 20% formamide | ||
| 2X SSCT + 40% formamide | Toxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 40% formamide | ||
| 2X SSCT + 50% formamide | Toxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 50% formamide | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Enzymes | |||
| AluI | New England Biolabs | R0137S | |
| HaeIII | New England Biolabs | R0108S | |
| MseI | New England Biolabs | R0525S | |
| MspI | New England Biolabs | R0106S | |
| RsaI | New England Biolabs | R0167S | |
| BfuCI | New England Biolabs | R0636S | |
| 100X BSA | New England Biolabs | Comes with NEB enzymes | |
| 10X NEB buffer #2 | New England Biolabs | Restriction enzyme digestion buffer. Comes with NEB enzymes | |
| Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) 400 U/µl | Roche/Sigma | 3333566001 | |
| TdT buffer | Roche/Sigma | Comes with TdT enzyme | |
| Cobalt chloride | Roche/Sigma | Toxic: wear appropriate protection. Comes with TdT enzyme | |
| RNase A (10 mg/mL) | Thermo-Scientific | EN0531 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cytology Tools etc. | |||
| Forceps | Dumont | #5 INOX, Biologie | |
| 9” Disposable glass Pasteur pipettes | Fisher | 13-678-20C | Autoclave to sterilize |
| Shallow glass dissecting dish | Custom made | ||
| Deep well dish (3 wells) | Pyrex | 7223-34 | |
| Fisherfinest Premium microscope slides | Fisher Scientific | 22-038-104 | Used to cover deep well dishes |
| Frosted glass slides, 25 x 75 mm | VWR Scientific | 48312-002 | |
| Glass slides, 3 x 1 in, 1 mm thick | Thermo-Scientific | 3051 | |
| Coverslips, 10 x 10 mm, No. 1.5 | Thermo-Scientific | 3405 | |
| Tungsten needle | homemade | ||
| Prolong GOLD mounting media | Molecular Probes | P36930 | |
| Compressed-air in can | Various | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| PCR machine | Various | ||
| Nanodrop 2000, spectrophotometer | Thermo-Scientific | microvolume spectrophotometer | |
| Vortexer | Various | ||
| Table top microfuge at room temperature | Various | ||
| Table top microfuge at 4 °C | Various | ||
| Heat block | Various | ||
| Hybridization oven or incubator with rotator | Various | ||
| Nutator | Various | ||
| A1RSi laser scanning confoal | Nikon | 40X oil Plan Fluor DIC (NA 1.3) | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables etc. | |||
| 50 mL conical tubes | Various | ||
| 15 mL conical tubes | Various | ||
| 1.5 mL microfuge tubes | Various | ||
| 500 µl microfuge tubes | Various | ||
| 200 µl PCR tubes | Various | ||
| Plastic container with tight fitting lid | Various | To hold Drierite | |
| Kimwipes | Various | disposable wipes | |
| Parafilm | Various | paraffin film | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Other | |||
| HPLC purified 5'-labeled oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | Cy3-labeled probes that recognize the 359 bp satellite repeat of the X chromosome | |
| Volocity 3D Image Analysis Software | PerkinElmer | Version 6.3 |
References
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