Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Ved hjælp af fluorescens In Situ hybridisering (FISH) til at overvåge status for Arm samhørighed i Prometaphase og metafase jeg Drosophila oocyter

Published: December 6, 2017 doi: 10.3791/56802
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biological Sciences, Dartmouth College

Summary

Dette manuskript præsenterer en detaljeret metode til at generere X-kromosom arm sonder og udfører fluorescens i situ hybridisering (FISH til at undersøge tilstanden af søster) chromatid samhørighed i prometaphase og metafase jeg arresteret Drosophila oocyter. Denne protokol er egnet til at bestemme, om meiotiske arm samhørighed er intakt eller forstyrret i forskellige genotyper.

Abstract

Hos mennesker er kromosom segregation fejl i oocyter ansvarlig for størstedelen af aborter og fødselsdefekter. Desuden, som kvinder alder, er deres risiko for at undfange en aneuploid Foster stiger dramatisk, og dette fænomen kendt som moderens alder effekt. Det er et krav til nøjagtig kromosom segregation under de meiotiske divisioner vedligeholdelse af søster chromatid samhørighed den udvidede prophase periode, oocyter oplever. Cytologiske tyder i både mennesker og modelorganismer på, at meiotiske samhørighed forværres under modningen. Derudover segregation fejl i menneskelige oocyter er mest fremherskende under meiose I, i overensstemmelse med tidlig tab af arm samhørighed. Brugen af modelorganismer er kritisk for optrevling de mekanismer, der ligger bag aldersbetinget tab af samhørighed. Drosophila melanogaster giver flere fordele for at studere regulering af meiotiske samhørighed i oocytter. Men indtil for nylig kun genetiske tests var tilgængelige til analyse for tab af arm samhørighed i oocytter af forskellige genotyper eller under forskellige forsøgsbetingelser. Her, er en detaljeret protokol forudsat for at bruge fluorescens i situ hybridisering (FISH) til direkte visualisere defekter i arm samhørighed i prometaphase jeg og metafase jeg arresteret Drosophila oocyter. Ved at generere en fisk sonde, der hybridiserer de distale arm af X -kromosom og indsamle Konfokal Z stakke, en forsker kan visualisere antallet af enkelte fisk signaler i tre dimensioner og afgøre, om søster chromatid arme adskilt. Den procedure, der er skitseret gør det muligt at kvantificere arm samhørighed defekter i hundredvis af Drosophila oocyter. Som sådan, giver denne metode et vigtigt redskab for at undersøge de mekanismer, der bidrager til samhørighed vedligeholdelse samt de faktorer, der fører til sin død under modningen.

Introduction

Korrekt adskillelse af kromosomerne under mitose og meiose kræver at søster chromatid samhørighed etableret, opretholdes, og udgivet i en koordineret1,2. Samhørighed er etableret under S fase og er medieret af cohesin kompleks, der danner fysiske forbindelser, der holder søsteren kromatider sammen. Meiose, samhørighed distalt for en crossover fungerer også for at holde rekombinante homologs sammen og denne fysiske forening hjælper med at sikre korrekt orientering af bivalent på metafase jeg spindel (figur 1)3,4, 5. Frigivelse af arm samhørighed på anaphase jeg tillader homologs at adskille til spindel to modsatrettede poler. Men hvis arm samhørighed er mistet for tidligt, rekombinante homologs vil miste deres fysiske forbindelse og adskille tilfældigt, hvilket kan resultere i aneuploid mælke (figur 1).

I menneskelige oocytter, fejl i kromosom segregation er den hyppigste årsag til aborter og medfødte defekter, såsom Downs syndrom6, og deres forekomsten stiger eksponentielt med moderens alder7. Søster chromatid samhørighed er etableret i føtal oocyter og meiotiske rekombination er afsluttet før fødslen. Oocytter derefter anholde i midten prophase jeg indtil ægløsning og under denne anholdelse, fortsatte fysiske sammenslutningen af rekombinante homologs afhænger af søster chromatid samhørighed. Nøjagtig segregation under meiose og normal graviditet resultater kræver derfor, at samhørighed forbliver intakt i op til fem årtier.

Tidlig tab af samhørighed under den langvarige meiotiske anholdelse af menneskelige oocyter er blevet foreslået at bidrage til moderens alder effekt og flere linjer af beviser understøtter denne hypotese8,9. Dog i betragtning af udfordringerne ved at studere meiotiske samhørighed i menneskers oocytter, meget af vores forståelse af dette fænomen er baseret på brugen af model organismer5,10,11,12, 13,14,15.

Drosophila melanogaster oocyter tilbyder mange fordele for studiet af meiotiske samhørighed og kromosom adskillelse. En simpel genetisk analyse gør det muligt at inddrive afkom fra aneuploid mælke og måle troskab x-kromosom segregation på en stor skala11,16,17. Desuden kan man også bestemme, om kromosom segregation fejl opstår fordi rekombinante homologs missegregate under meiose jeg, en fænotype, der er i overensstemmelse med tidlig tab af arm samhørighed11,18, 19. direkte observation af meiotiske samhørighed i Drosophila oocyter sundhedstilstand er også muligt at bruge fluorescens i situ hybridisering (FISH). Selvom fluorescerende oligonukleotider at krydse sig til gentagne satellit sekvenser har været brugt i over et årti for at overvåge pericentromeric samhørighed i modne Drosophila oocyter4,20, analyse af arm samhørighed er blevet meget mere udfordrende. Visualisering af arm samhørighed sundhedstilstand kræver en sonde, der strækker sig over et stort område af enkelt kopi sekvenser og er lys nok til at resultere i synlige signaler for individuelle Søster kromatider når arm samhørighed er fraværende. Derudover skal oocyt fiksering betingelser og størrelse af mærket DNAs lette penetration21 i den store modne Drosophila oocyt (200 µm bred af 500 µm lange). For nylig, en arm sonde blev med succes udnyttet til at visualisere Drosophila oocyt kromatider under anaphase jeg, men forfatterne udtalt at de ikke kunne registrere et signal i prometaphase eller metafase jeg arresteret oocyter22. Her giver vi en detaljeret protokol for generation af X-kromosom arm fisk sonder og oocyt forberedelse betingelser, der har tilladt os at assay for tidlig tab af søster chromatid samhørighed i prometaphase jeg og metafase jeg oocyter. Disse teknikker, som har gjort det muligt at identificere genprodukter, der er nødvendige for opretholdelsen af meiotiske samhørighed, vil tillade andre at assay for søster chromatid samhørighed defekter i modne Drosophila oocytter af forskellige genotyper.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. præparater

  1. Forberede fluorescens i situ hybridisering (FISH) løsninger. Forberede alle løsninger ved hjælp af ultrarent vand.
    1. Forberede 5 x ændret Robb buffer: 275 mM kalium acetat, 200 mM natriumacetat, 500 mM saccharose, 50 mM glucose, 6 mM magnesiumchlorid, 5 mM calciumchlorid, 500 mM HEPES pH = 7.4. Bringe pH 7,4 bruger 10 N NaOH. Filter steriliseres og opbevares ved-20 ° C. Tø og fortyndes til 1 x efter behov og gemme 1 x alikvoter ved-20 ° C.
    2. Forberede 10 x fosfatbufferet saltopløsning (PBS) ved hjælp af 1,3 M NaCl, 70 mM Na2HPO4, 30 mM NaH2PO4. Bringe pH 7.0 ved hjælp af 10 N NaOH. Steriliseres ved autoklavering eller filter sterilisation.
  2. Forberede poly-L-lysin coverslips en dag før behov.
    1. Med pipette udtages 70% ethanol indeholdende 1% saltsyre på overfladen af en 18 mm x 18 mm #1.5 coverslip og Ruger 5 min. Brug vakuum aspiration til at fjerne væske. Gentag med sterilt ultrarent vand. Dække overfladen af coverslip med 0,1 mg/mL poly-L-lysin og inkuberes i 10 min.
    2. Opsug for at fjerne væske og luft tørre i 10 min. butik coverslips poly-L-lysin side op i en plast beholder med tætsluttende låg til at undgå støv.
  3. Forberede trak Pasteur pipetter til at fjerne flydende løsninger uden at fjerne oocyter. Over en bunsenbrænder flamme, varme midten af en lang glas Pasteur pipette mens du forsigtigt trækker i hver ende indtil glasset smelter og trækker fra hinanden.

2. generation af Arm sonden for fisk

Bemærk: Alle centrifuge trin udføres på ~ 16.000-21.000 x g (maksimal hastighed på de fleste bordplade microcentrifuger). Korte centrifuge spins anføres spinning for 5-15 s. Vortex angiver vortexing for ~ 15 s på max speed medmindre andet er angivet.

Bemærk: BACs for arm sonder kan fås fra BAC PAC ressourcer. To X kromosom euchromatic arm sonder har været anvendt med succes med denne metode. Ene arm sonde bestod af seks BAC kloner svarende til cytologiske bands 6E-7B (BACR17C09, BACR06J12, BACR35J16, BACR20K01, BACR35A18, BACR26L11). Anden arm sonden bestod af seks BAC kloner svarende til cytologiske bands 2F - 3C (BACR13K19, BACR21G11, BACR09H13, BACR30B01, BACR34O03, BACR03D13). BACs til andre Drosophila kromosom regioner kan gennemses på: http://www.fruitfly.org/sequence/X1-11-assembly.html. To pericentric sonder, som genkender den 359 bp satellit gentagelse af X -kromosom har været anvendt med succes med denne metode. En 22 nukleotid sonden har været brugt i udstrakt grad og fungerer godt (5'-Cy3-AGGGATCGTTAGCACTCGTAAT)19,23. En 28 nukleotid sonde blev for nylig testet og også fungeret godt (5'-Cy3-GGGATCGTTAGCACTGGTAATTAGCTGC)24. HPLC renset oligonukleotider 5' mærket med en specifik fluorophore blev bestilt fra en kommerciel kilde (f.eks.integreret DNA teknologier).

  1. Prep BAC klon DNA kit instruktionerne som angivet i Tabel af materialer. Resuspenderes DNA fra 100 mL af kultur i 200 µL TE; DNA slutkoncentration bør ligge mellem 5-40 ng/µL afhængigt af BAC klon.
  2. Udføre DNA amplifikation for hver BAC ved hjælp af forstærkning kit, som angivet i tabellen i materialer, og følgende protokol. Behandle BAC DNA for hver klon individuelt. Bruge enzymer og buffere leveres med kittet i trin 2.2.1 gennem 2.2.3.
    1. Tilfældige fragmentering af BAC DNA: For hver BAC, bruge TE til at forberede 10 µL af en 1 ng/µL DNA løsning i 200 µL PCR rør. Tilføj 1 µL af 10 X fragmentering Buffer. Glasset anbringes i en PCR-maskine på 95 ° C for præcis 4 min. straks cool prøven i isvand og centrifugeres kort. Inkuberingen er tid følsomme og enhver afvigelse kan ændre resultater.
    2. Biblioteket forberedelse
      Bemærk: Denne metode bruger tilfældige primere til at generere et bibliotek af amplifiable fragmenter.
      1. Røret indeholder DNA tilføje følgende: 2 µL 1 x bibliotek forberedelse Buffer, 1 µL af bibliotek stabilisering løsning. Blandes grundigt ved vortexing, centrifugeres kortvarigt, og røret anbringes i PCR-maskine på 95 ° C i 2 min. straks cool prøven i isvand og centrifugeres kort.
      2. Tilføj 1 µL af bibliotek forberedelse enzym til PCR rør, mix og centrifugeres kort. Sted PCR rør i PCR-maskine og inkuberes som følger: 16 ° C i 20 min, 24 ° C i 20 min., 37 ° C i 20 min., 75 ° C i 5 min, derefter holde ved 4 ° C.
      3. Fjern prøver fra PCR-maskine og centrifugeres kort. Prøver kan forstærkes umiddelbart eller opbevares ved-20 ° C i op til tre dage.
    3. Forstærkning af BAC DNA bibliotek
      1. Tilføj de følgende reagenser til hele 15 µL tilfældige fragment reaktion: 7,5 µL 10 x forstærkning Master Mix, 47,5 µL nukleasen gratis vand, 5 µL WGA DNA Polymerase. Blandes grundigt ved vortexing og centrifugeres kort.
      2. Sted PCR rør i PCR-maskine og inkuberes som følger: indledende denaturering 95 ° C i 3 min, 14 cyklusser af denaturering på 94 ° C til 15 s, efterfulgt af udglødning/udvidelse på 65 ° C i 5 min, derefter holde ved 4 ° C.
      3. Efter cykling er komplet, assay DNA-koncentrationen. Koncentrationen af DNA skal være mindst 800 ng / µL. holde prøver ved 4 ° C eller opbevares ved-20 ° C indtil klar til fordøjelsen. Valgfrit, vurdere DNA fragment størrelse ved at køre 400 ng af DNA på en 2%-agarosegel. Fragmenter bør variere fra 200 bp til 3 kb (figur 2).
  3. Begrænsning enzym fordøjelsen af amplificerede DNA
    1. Sted 20 µg amplificerede DNA fra det foregående afsnit i 1,5 mL mikrofuge rør. Tilføj 20 enheder af Alul, Haelll, Msel, Mspl, Rsal, 25 enheder af BfuCl, 0,5 µL 100 x BSA, 5 µL 10 x begrænsning enzym fordøjelsen buffer, og justere lydstyrken til 50 µL ved at tilføje den passende mængde ultrarent H2O.
    2. Inkuber digest natten over ved 37 ° C i en inkubator til at hindre kondensering på låget. Ethanol bundfald fordøjet DNA. Tilføj til at fordøje: 1 µL glykogen, 1/10 bind 3M natriumacetat, 2,5 diskenheder 100% molekylærbiologisk kvalitet ethanol. Der inkuberes ved-80 ° C i 1 time eller natten over.
    3. Der centrifugeres i 30 min. ved 4 ° C. Vaske DNA pellet med 1 volumen af værelse temp 70% ethanol og spin i 5 min. ved 4 ° C. Fjern supernatanten og lad DNA pellet luft tørre eller forsigtigt tørre med en jævn strøm af luft.
    4. Resuspenderes DNA i 36 µL sterilt ultrarent H2O og bruge 1 µL DNA til assay DNA-koncentrationen, som bør være omkring 285 ng / µL. Store DNA ved-20 ° C.
    5. Valgfrit vurdere DNA fragment størrelse kører 400 ng af DNA på en 2%-agarosegel. De fleste fragmenter bør spænder fra 100-200 bp, med en svagere signal op til 500 bp (figur 2).
  4. 3' affaldsgruber reaktion
    1. Denaturere fordøjet DNA ved 100 ° C i 1 min i en varme blok. Straks chill i isvand. De 35 µL DNA, føjer følgende: 50 µL 400 mM natrium cacodylate, 1 µL 10 mM DTT og vortex godt. Tilføj 4 µL 25 mM CoCl2, 2,5 µL 2 mM 5-(3-aminoallyl)-dUTP fra ARES mærkning kit som angivet i tabellen af materialer, 5 µL 1 mM dTTP, 18 µL 5 x TdT buffer, og 1 µL terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) 400 U / µL. Vortex og centrifugeres kort.
      Forsigtig: CoCl2 giftige, bære passende beskyttelse.
    2. Der inkuberes i 2 timer ved 37 ° C i en inkubator til at forhindre kondensation. Tilføj 1 µL af 250 mM EDTA at stoppe reaktion og vortex kortvarigt at blande. Ethanol bundfald tailed DNA som beskrevet ovenfor (trin 2.3.2 - 2.3.4). Resuspenderes tørrede DNA i 10 µL sterilt ultrarent H2O. butik DNA ved-20 ° C indtil klar til at fortsætte.
  5. Gennemføre fluorescerende farvestof konjugation ved hjælp af DNA mærkning kit som angivet i tabellen materialer.
    Bemærk: Når farvestof er tilsat holde prøver i mørke.
    1. Denaturere tailed DNA ved 95 ° C i 5 min i en varme blok. Straks cool DNA i isvand og centrifugeres kort. Forberede mærkning buffer ifølge instruktionerne kit og tilføje 6 µL til hver DNA-prøve. Resuspend hver tube af farvestof i 4 µL af DMSO fra sættet. Vortex og centrifugeres kort.
    2. Bruge et rør af farvestoffet for hver mærkning reaktion. Tilføj farvestof løsning til DNA, vortex og centrifugeres kort. Inkuber den mærkning reaktion ved stuetemperatur i 2 timer i mørke. Tilføje 3 µL af 3M hydroxylamin at stoppe reaktionen efterfulgt af 77 µL af nukleasen-fri H2O fra sættet. Vortex og centrifugeres kort.
  6. Fjern ikke-konjugeret farvestof ved hjælp af PCR rensning kit som angivet i tabellen i materialer. Følg producentens anvisninger. Elueres DNA fra kolonnen to gange med 40 µL af eluering buffer hver gang.
  7. Ethanol bundfaldet mærket DNA som beskrevet tidligere (trin 2.3.2 - 2.3.4). Resuspenderes tørrede DNA i 10 µL eluering buffer.
  8. Forbered sondens blanding
    1. Mærket DNA, bestemmes koncentrationen af fluorokrom farvestof i pmol/µL. Fluorophore koncentration kan variere fra 30-100 pmol/µL, afhængigt af BAC. DNA-koncentrationen kan variere fra 300-800 ng/µL.
      Bemærk: Indstillingen microarray fungerer godt på et microvolume Spektrofotometer, som angivet i tabellen af materialer. I vinduet microarray Vælg DNA-50, og Angiv fluorokrom.
    2. Oprette en master mix ved at kombinere equimolar mængder (pmol fluor) af hver af BAC sonder. Vortex 30 s før kombinere. At undgå at fryse/tø cykler, forberede delprøver af master mix, anvende paraffin film til rør til at forhindre fordampning, og opbevares i mørke ved-20 ° C.
      Bemærk: En mastermix, der indeholder 250 pmol af hver af de 6 individuelle BAC sonder i en samlet maengde paa 30-50 µL fungerer godt. En alikvot del indeholdende 25 pmol (fluor) for hver BAC vil være tilstrækkeligt til to 40 µL hybridisering reaktioner, med en afsluttende sonde koncentration af 0.31 pmol fluor/µL for hver BAC.

3. dissektion og fiksering af oocyter

  1. Saml 30 voksne jomfruelige hunner af passende genotype. For at berige for sene etape oocytter, holde kvinder uden mænd i et hætteglas med flyve mad og tørgær i 3-5 dage før dissektion25. Dagen før dissektion, overføre hunner uden gas til en frisk hætteglas med gær.
  2. Udføre dissektion.
    Bemærk: Se figur 3 for nødvendige redskaber. Løsninger er fjernet ved hjælp af en trak Pasteur pipette, medmindre andet er angivet. Når du overfører æggestokkene altid bruge en pipette tip belagt med en 10% BSA løsning.
    1. I en lavvandet dissekere parabol indeholdende ændret Robb buffer, skal du bruge pincet til at fjerne æggestokkene fra en enkelt kvinde. Brug pincet eller en wolfram nål til forsigtigt splay hver æggestok, så løsningen at kontakte indre ovarioles. Overføre spredte æggestokkene par til en 1,5 mL mikrofuge rør indeholdende 1 mL ændret Robb buffer.
    2. Gentag trin 3.2.1 at akkumulere æggestokke fra 20-25 hunner i 1,5 mL mikrofuge tube. Afslutte dissektioner af de 20-25 kvinder inden for 10 min.
  3. Udføre fiksering som følger.
    1. Med et trak Pasteur pipette, Fjern væsken i det mikrofuge rør, bruge en P1000 tilføjes 500 µL af 37 ° C løsning hurtigt til æggestokkene og derefter straks tilføje 500 µL af stuetemperatur heptan til æggestokkene.
    2. Ryst mikrofuge rør til at blande og placere på en nutator i 3 min. Fjern mikrofuge tube fra nutator og sted i en tube rack for 1 min til at tillade oocyter at bilægge til bunden. Den samlede fiksering er 4 min.
      Forsigtighed: Løsning og heptan er giftige, bære passende beskyttelse.
    3. Fjerne løsningen og skyl æggestokkene 3 gange i 500 µL af PBS indeholdende 0,5% BSA og 0,1% Triton X-100 (PBSBTx)
  4. Gentag for resterende genotyper.

4. fjernelse af Chorions og Vitelline membraner

Bemærk: Se figur 3 for nødvendige redskaber.

  1. Separat sene fase oocyter
    1. Der tilsættes 1 mL PBSBTx til en lavvandet dissekere fad. Bruge en P200 med BSA belagt spids til at overføre fast æggestokke (i ~ 150 µL) ind i en dyb tallerken. Der afpipetteres æggestokkene op og ned med BSA belagt pipette tip til at løsne de modne oocyter fra de mindre modne oocyter.
    2. Når sent stadium oocyter er tilstrækkeligt adskilt, overføre alle væv til en 500 µL mikrofuge tube. Fjern overskydende væske med en trak Pasteur pipette, forlader omkring 150-200 µL i røret. Gentag punkt 4.1 for resterende genotyper.
  2. Forberede rullende
    1. Pre våd en dyb brønd parabol med 200 µL PBSBTx. dækning og der er afsat. Få 3 matteret glas lysbilleder og sæt dias #3 til side. Forsigtigt gnide regionerne matteret glas i dias #1 og #2 sammen. Skyl dem i ionbyttet vand for at fjerne enhver glas skårene og tør med en engangs tørre.
    2. Coat de matterede regioner af dias #1 og #2 med PBSBTx ved at tilføje 50 µL af PBSBTx til ét dias og gnide denne region med de andre dias. Fjern væsken med en engangs tørre.
    3. Placer dias under et mikroskop for dissekere i den konfiguration, der er vist i figur 4A. Holde dias #1 og #2 i kontakt, med slide #3 matteret regioner støtter slide #2.
  3. Roll oocyter; sikre at retning af rullende er altid i en lige linje og aldrig en cirkulær bevægelse.
    1. Prewet en P200 pipette tip i PBSBTx og sprede oocyter i det mikrofuge rør af pipettering op og ned. Overføre 50 µL af flydende indeholdende oocytter til midten af matteret glas del af slide #1. Løft slide #2 at gøre dette.
    2. Langsomt sænke slide #2 indtil overfladespænding væskens skaber en forsegling mellem regionerne to matteret glas. Der bør være nok væske til at dække området matteret men ingen bør siver ud. Hvis væsken overfyldte, bruge trak Pasteur pipette til at fjerne overskydende væske.
    3. Hold bunden dias (#1) på plads med én hånd og bruge anden hånden til at flytte den øverste dias (#2) frem og tilbage i en horisontal retning, at holde slide #2 niveau og understøttede på slide #3. Udføre under et mikroskop for nem visualisering af oocyt bevægelser og fremskridt.
      Bemærk: Denne bevægelse vil generere friktion og forårsage oocyter at "rulle" og mister deres chorions. Minimal tryk bør anvendes og bevægelser skal være korte og hurtige.
    4. Efter et par bevægelser i den vandrette retning, ændre lidt vinkel bevægelighed (figur 4B). I flere trin, gradvist øge denne vinkel 90 ° indtil bevægelse af de øverste dias (#2) er vinkelret på den begyndende retning (figur 4B). Bemærk at Tom chorions bliver synlig i væsken og oocyter mangler chorions vises længere og tyndere.
    5. Gentag trin 4.3.3 - 4.3.4 omkring 7 - 10 gange indtil løsningen bliver lidt uklar. Stoppe rullende når flertallet af oocyter (75-85%) synes at have mistet deres vitelline membraner.
      Bemærk: En karakteristiske spidse ende er ofte synlig på oocyter mangler vitelline membraner. Vitelline membraner er sværere at fjerne end chorions. Let tryk kan anvendes til de øverste dias (dias #2) mens rullende for at opnå fjernelse af vitelline membraner. Forsøger at fjerne vitelline membraner fra alle oocyter ofte resulterer i ødelæggelse af andre oocyter.
    6. Løfte forsigtigt det øverste dias (#2), at trække i et af sine hjørner til midten af regionen matteret i bunden dias (#1) så rullede oocyter ophobes i midten af regionen matteret. Skyl oocytter fra begge dias med PBSBTx ind i dyb brønd fadet indeholdende PBSBTx.
    7. Ren dias #1 og #2 med ultrarent vand, tør med en engangs tørre, og reset. Gentag trin 4.3.1 - 4.3.6 indtil alle oocytter af samme genotype er blevet rullet. Dette kræver som regel 3-4 runder af rullende pr. genotype.
  4. Fjerne snavs efter valsningen
    1. Der tilsættes 1 mL PBSBTx til en 15 mL konisk slange. Swirl væske til at coat sider af røret.
    2. Ved hjælp af et PBSBTx belagt P1000 pipette tip, overførsel de rullede oocytter fra dybet godt parabol til den koniske rør indeholdende 1 mL PBSBTx. Tilføj en ekstra 2 mL af PBSBTx til det koniske rør indeholdende oocyter.
    3. Lad oocytter begynder at bilægge til bunden, derefter fjerne top 2 mL af opløsning indeholdende vragrester (chorions, vitellines, osv.) med en P1000 og kassér. Hvis det er nødvendigt, skal du holde den koniske rør mod en mørk baggrund for at se de uigennemsigtige oocyter som de synker.
    4. Tilføje en yderligere 2 mL af PBSBTx til oocytter, og Gentag trin 4.4.3. Gentag 4.4.3. i alt 3 runder af vragrester fjernelse.
    5. Ved hjælp af et PBSBTx belagt P1000 pipette tip, overførsel oocyter tilbage til den oprindelige 500 µL mikrofuge tube. 20 - 25 kvinder bør give ca 50 µL af valsede modne oocyter.
  5. Gentag punkt 4 for de resterende genotyper bruger friske matteret dias, en ren dyb brønd parabol og et nyt koniske rør til hver genotype.
  6. Hvis opbevaring er nødvendige, overføre oocytter til 1 x PBS med 0,1% TritionX-100 og opbevares natten over ved 4 ° C. Langtidsopbevaring anbefales ikke, da formaldehyd crosslinking kan vendes ved nonioniske detergenter.

5. FISK

Bemærk: Alle vasker er udført på en nutator ved stuetemperatur, medmindre andet er angivet. Oocytter, som er blevet rullet tage længere tid at bilægge til bunden af det mikrofuge rør, især i løsninger, der indeholder formamid. Det er vigtigt at være tålmodig, når du ændrer løsninger, således at oocyter ikke er tabt i processen. Dette kan kræve venter 5-15 min at lade oocyter bosætte sig efter skylninger og vasker. Bemærk også at oocyter i formamid mindre uigennemsigtig.

  1. Udvinding og RNAse behandling
    1. Skyl oocyter med 500 µL af PBS, som indeholder 1% Triton X-100 (PBSTx). Fjern væsken og tilsæt 500 µL ekstraktionsbuffer (PBSTx indeholdende RNAse). Ruger på nutator ved stuetemperatur i 2 timer.
  2. Før hybridisering vasker
    1. Skyl oocyter 3 gange med 500 µL 2 x saltvand natriumcitrat indeholdende Tween 20 (SSCT). Forvarm en alikvot (~ 500 µL/genotype) af 2 x SSCT + 50% formamid til 37 ° C.
      Forsigtighed: formamid er giftigt, bære passende beskyttelse.
    2. Vask oocyter 3 gange i 10 min i 500 µL 2 x SSCT. Vask oocyter for 10 min i 500 µL 2 x SSCT + 20% formamid. Vask oocyter for 10 min i 500 µL 2 x SSCT + 40% formamid. Vask oocyter for 10 min i 500 µL 2 x SSCT + 50% formamid.
    3. Fjern væsken og tilsæt 500 µL af 37 ° C 2 x SSCT + 50% formamid fra trin 5.2.1 til prøve og inkuberes i 2 timer ved 37 ° C med rotation.
      Bemærk: En hybridisering ovnen udstyret med en rotator fungerer godt for dette. En skum mikrofuge tube "float" knyttet til rotator kan bruges til at sikre rør.
  3. Denaturering og hybridisering
    1. For hver tube oocytter, bruge 40 µL 1 x hybridisering buffer indeholdende 2,5 ng/µL centromeric sonde og 0.31 pmol fluor/µL af hver BAC sonde. Der fremstilles en opløsning af sonden i hybridisering buffer tilstrækkelig for alle genotyper. Vortex sonde mix 30 Sørensen før tilføjer.
    2. Brug en BSA-belagt P200 pipette tip, overførsel oocytter til en 200 µL PCR rør. Holde prøver ved 37 ° C og lad oocyter bilægge til bunden, så brug en trak Pasteur pipette til at fjerne så meget væske som muligt.
    3. Tilføje 40 µL af hybridisering løsning indeholdende sonde (udarbejdet i afsnit 2) til oocyter. Placer PCR rør indeholdende oocyter i PCR-maskine, og der inkuberes som følger: 37 ° C i 5 min, 92 ° C i 3 min, derefter 37 ° C natten over. Når sonden er føjet til oocytter, holde dem i mørke så meget som muligt.
  4. Efter hybridisering vasker
    1. Forvarme 2 x SSCT + 50% formamid til 37 ° C og holde det i hybridisering inkubator. Med en BSA belagt P200 afpipetteres tip, tilføje 100 µL af 37 ° C 2 x SSCT + 50% formamid til PCR rør med oocyter og overføre oocytter til en ny 500 µL mikrofuge tube.
    2. Tilføje en yderligere 400 µL af 37 ° C 2 x SSCT + 50% formamid til samme rør og lad oocyter afregne ved 37 ° C i inkubatoren.
      Bemærk: Afregning ofte tager længere tid på dette trin. Det er ikke usædvanligt at tage 15 minutter eller længere. En mangel på tålmodighed vil resultere i betydelige tab af oocytter.
    3. Vask oocyter 3 gange i 20 min. i 500 µL 37 ° C 2 x SSCT + 50% formamid ved 37 ° C med rotation. Holde oocyter ved 37 ° C, mens de slår sig ned.
    4. Vask oocyter 3 gange i 10 min i 500 µL 37 ° C 2 x SSCT + 50% formamid ved 37 ° C med rotation. Holde oocyter ved 37 ° C, mens de slår sig ned.
    5. Ved stuetemperatur, vaske oocyter for 10 min i 500 µL 2 x SSCT + 40% formamid på en nutator. Vask oocyter for 10 min i 500 µL 2 x SSCT + 20% formamid. Vask oocyter for 10 min i 500 µL 2 x SSCT.
  5. Pletten med DAPI
    Forsigtig: DAPI er giftigt, bære passende beskyttelse.
    1. Vask oocyter i 20 min. i 500 µL DAPI løsning (1 µg/ml) i 2 x SSCT på nutator. Skyl oocyter 3 gange i 500 µL 2 x SSCT. Vask oocyter 2 gange i 10 min i 500 µL 2 x SSCT på nutator. Prøver kan opbevares i op til 4 timer ved stuetemperatur i mørke, indtil de er klar til at montere på coverslips.
  6. Montering
    Bemærk: Se figur 3 for nødvendige redskaber.
    1. Sted en poly-L-lysin belagt coverslip dissekere mikroskopet. Fjern væsken fra røret af oocytter, justere det samlede volumen til omkring 150 µL. Med en BSA belagt P200 pipette tip, pipetteres op og ned for at sprede oocyter hele løsningen, og derefter overføre 40 µL af oocytter/løsning til en poly-L-lysin belagt coverslip.
    2. Fjern nogle af væsken fra coverslip ved hjælp af en trak Pasteur pipette, indtil oocyter holde sig til coverslip, men er stadig omgivet af væske. Med pincet, holde dække slip på den ene side og bruge en wolfram nål til at forsigtigt adskille klumper af oocytter, flytte dem til at opnå en enkelt lag af ikke-overlappende oocyter.
    3. Fjerne resten af væsken omkring oocyter med trak Pasteur pipette. Tag et rent glas dias og bruge komprimeret gas til at blæse ud eventuelt støv. Tilføje 22 µL af montering medier (f.eks.forlængelse-guld) til midten af diaset. Langsomt sænke dias mod coverslip, med montering medier står over for eksemplet, indtil medierne rører prøven. Overfladespænding vil forårsage coverslip til at overholde diasset.
    4. Anbring dias i en plast beholder med en tætsiddende låg, der indeholder et lag af frisk tørringsmiddel (fx, drierite). Lad dias tørre i 3-5 dage i mørke før billeddannelse. Tørretid kan variere afhængigt af luftfugtigheden i rummet.

6. billedbehandling

  1. Ved at fjerne tørre dias fra boksen tørringsmiddel, rense dem for at fjerne alle støvpartikler. Forsegle coverslips med neglelak. Forseglet dias kan opbevares på ubestemt tid ved-20 ° C.
  2. Erhverve laser scanning Konfokal billeder ved hjælp af en høj numerisk blænde 40 X olie mål med 6 X digital zoom.
    Bemærk: Ideelt, systemsoftware giver mulighed for en til at finde og markere X-Y sted meiotiske kromosomer for flere oocytter mens du ser dem ved hjælp af epifluorescensmikroskop. Denne mulighed sparer tid under en imaging-session. Hurtig blegning med en høj numerisk blænde 60 X mål gjorde sin brug uegnet med den valgte Konfokal system, men det kan arbejde for andre systemer.
  3. Fange en Z serie for hver oocyt, fastsættelse af toppen og bunden af serien ved hjælp af DAPI signal.
    Bemærk: Få, offset, og laser power skal bestemmes empirisk ved hjælp af en delmængde af oocytter. Når passende parametre findes, bør kun mindre justeringer skal gøres.
    Hvis ændret erhvervelse indstillinger skal angives, bruges den tidligere indsamlede billedstak til at anslå de nødvendige ændringer. For at undgå blegning, afstå fra pre imaging arm sonden før fange Z-serien. Med et trin størrelse på 0,25 µm, Z-serien typisk spænder fra 25 til 30 skridt afhængigt af retningen og placeringen af kromosomerne. En mindre trin størrelse kan forbedre ens evne til at vurdere, om to fisk steder er adskilt i den aksiale dimension, men der er et trade-off med den tid, der kræves til at indfange små skridt og tab af signal intensitet på grund af blegning. Et 40 X mål med 6 X digital zoom og en 1.024 x 512 billedfelt genererer billeder med en pixelstørrelse på 0,05 µm.

7. billede analyse og scoring for samhørighed defekter

  1. Deconvolve Z-serien for at optimere signal-støj-forholdet for hver oocyt19.
    Bemærk: En softwarepakke som angivet i Materialer tabel giver mulighed for en deconvolve ved hjælp af Integrativ restaurering, samt beskære og kontrast-forbedre billeder. Vigtigere, er en software-pakke, der tillader en at se billeder og score for samhørighed defekter i tre dimensioner bydende nødvendigt.
  2. For hver oocyt tabulate antallet af arm og centromeric foci, der colocalize med DAPI signal. Tab af samhørighed resulterer i tre eller fire forskellige og adskilte signaler for en bestemt probe. Det er ikke ualmindeligt at observere to poler, der er forbundet af en tynd tråd. Af de strengeste kriterier, disse foci ville ikke blive betragtet som "adskilt."

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 5 præsenterer billeder fås med en arm sonde, der hybridiserer til cytologiske region 6E-7B på X -kromosom. Denne probe resulterer i et signal om, at co lokaliserer med de DAPI, kan skelnes let fra baggrunden, og har været anvendt med succes til at kvantificere arm samhørighed defekter i forskellige genotyper19. Kvantificering af samhørighed defekter var begrænset til prometaphase jeg og metafase jeg stadier; oocytter før nuklear kuvert opdeling blev udelukket fra analyse19. En intakt nukleare konvolut er indlysende, når scanning i DAPI kanal, fordi oocyt kromosomer vil være omgivet af en diskret cirkulære område, der er mørkere end de omkringliggende cytoplasma.

Figur 5B viser maksimal intensitet fremskrivninger af individuelle Z serie efter deconvolution og kontrast enhancement. Kvantificering af samhørighed defekter kræver bestemmelse for hver probe antallet af fisk signaler at overlapning med DAPI signal. For en sådan analyse er visualisering af de flettede billeder i tre dimensioner bydende nødvendigt. Kun fisk steder, der er klart forbundet med DAPI signal i alle tre dimensioner skal indgå i analysen.

Intakt søster chromatid samhørighed fremgår som to fisk steder for både arm og pericentric sonder (figur 5B, venstre). Oocytter indeholdende tre eller fire adskilte fisk steder for enten sonden er anset for at have samhørighed defekter (figur 5B, højre). For at blive klassificeret som enkelte steder, skal to fisk signaler være minimalt adskilt i alle tre dimensioner af en afstand svarende til diameteren af den mindste plet. Tynde svag tråde forbinder to fisk steder er ikke ualmindelige. Sådanne signaler betragtes ikke som helt adskilte og derfor tælles ikke som forekomster af samhørighed defekter.

Med 6E-7B arm hybridisering sonde var ca 15-20% af oocytter afbildet helt manglede signal eller signalet for svagt at trygt score. Derudover ca 5% af oocytter afbildet udstillet et stort område af diffuse kromosomale signal og disse blev kasseret fra analysen. Derimod var det sjældent, at støde oocyter som pericentric hybridisering signal var mangler eller er alt for diffust at score.

6E-7B arm sonden er blevet brugt flittigt til at kvantificere arm samhørighed defekter i prometaphase og metafase jeg arresteret Drosophila oocytter af forskellige genotyper19. Hvornår cohesin subunit SMC3 blev slået ned i midten prophase, 16,3% af de modne oocyter analyseret indeholdt mere end to arm steder, tegn på for tidlig tab af arm samhørighed. Derimod bemærkede vi adskilt arm steder i kun 5,1% af oocytter, der indeholdt normale niveauer af SMC319. Interessant, selv om hyppigheden af arm samhørighed mangler blev forhøjet i flere knockdown genotyper, Søster kromatider blev sjældent adskilt i deres pericentric periferi19.

Figure 1
Figur 1: aldersbetinget tab af samhørighed under den udvidede prophase jeg anholde af kvindelige meiose kan resultere i fejl i kromosom segregation og aneuploidi i ægget. Samhørighed er repræsenteret af sorte bjælker mellem Søster kromatider. Arm samhørighed funktioner for at holde rekombinante homologs sammen og er nødvendig for korrekt adskillelse på anaphase jeg. Hvis arm samhørighed mistes for tidligt, kan kromosom missegregation forekomme, hvilket resulterer i et aneuploid æg. Dette tal blev tilpasset fra reference19. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: størrelse af DNA molekyler efter BAC fragmentering og forstærkning (venstre) og efter begrænsning enzym fordøjelsen (til højre) for tre forskellige BACs. 400 ng af amplificerede DNA produkter er vist i de første tre baner. De tre sidste baner vise DNA fragmenter efter de natten begrænsning digest. De amplificerede DNA produkter spænder fra 200 bp op til 3 kb. Efter begrænsning digest, de fleste fragmenter varierede fra 100-200 bp, men større fragmenter (op til 500 bp) var synlige. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: cytologi værktøjer. Værktøjer, der anvendes i protokollen: (1) par pincet (#5 Dumont); (2) wolfram nål; (3) dyb brønd fad med låg; (4) lavvandede glas dissekere parabol; (5) trak Pasteur pipette. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4. Arrangement og flytning af dias til rullende oocyter. (A) Diagram af diaset oprettet til akkumulering af oocytter, som beskrevet i protokollen. De mørkere område betegner matteret glas del af diaset. (B) retning af bevægelse vektorer for slide #2 under oocyt rullende. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5. FISK assay resultater. (A) skematisk skildrer Drosophila X -kromosom og hvor de to arm sonder (6 BACs) og 22 oligonukleotid pericentromeric sonden beskrevet i protokollen krydse. For enkelhed, 6E-7B sonden er mærket 7B og 2F - 3C sonden er mærket 3C. (B) repræsentative billeder af fisk resultater (6E-7B sonde) for intakt arm samhørighed (to arm sonde steder, én pr homolog) og forstyrret arm samhørighed (tre til fire arm sonde steder). DNA er blå, arm sonde signal er gule og pericentric sonde signal er rød. Billeder svarer til maksimal intensitet fremskrivninger af Z serien efter deconvolution og kontrast enhancement. Skalalinjen = 2 µm. Dette tal blev tilpasset fra reference19. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Brugen af fisk sonder for at vurdere tilstanden af arm samhørighed i prometaphase jeg og metafase jeg Drosophila oocyter er en betydelig fremgang i feltet af Drosophila meiose. Drosophila forskere har historisk set været begrænset til genetiske tests til at udlede for tidlig tab af arm samhørighed i modne oocyter11,18,19. Nu, med de metoder, der præsenteres her, tilstand af arm samhørighed kan analyseres direkte ved hjælp af fisk. Evnen til at opnå fysiske beviser for tidlig tab af arm samhørighed betydeligt udvider repertoiret af tilgange tilgængelige at studere de mekanismer, der fører til tidlig tab af arm samhørighed og kromosom missegregation i Drosophila oocyter.

Kritiske trin
Selvom vi ikke har udført en systematisk analyse af kritiske parametre, der er nødvendige for vellykket visualisering af en fluorescerende sonde, der hybridiserer til enkelt kopi sekvenser langs kromosom arm i modne Drosophila oocytter, kan vi tilbyde den følgende liste over faktorer, der kan have bidraget til succesen af denne teknik. For at generere arm sonden, vi brugte en kombination af seks overlappende BAC sonder, der dækker et interval på ca. 0,8 Mb på X-kromosom arm. Vores indledende forsøg på ved hjælp af færre BACs, som strakte sig over et mindre område var ikke vellykket. Derudover har vi brugt en metode at fragmentere og forstærke BAC DNA før slutningen-mærkning med Alexa-647. Fleste af begrænsning fragmenter, der var mærket var 100-200 bp lang (figur 2), som er enig godt med Målstørrelse af 150 nukleotider, som er nødvendig for effektiv diffusion gennem tykt væv21. Fiksering betingelser, at bevare morfologi af den store Drosophila oocyt men også tillade sonde indtrængen er afgørende. Vi har ændret vores tidligere anvendte fiksering metode23 ved at tilføje stuetemperatur heptan til en løsning, der er forvarmet til 37 ° C. Vi synes, at det er muligt, at begge tilsætning af heptan at øge penetration gennem vitelline membranen samt sænket temperaturen til fiksation bidraget til vellykket fiksering betingelser for visualisering af arm samhørighed.

Når kørsler for tidlig tab af samhørighed, kræver en stikprøve, der giver mulighed for kvantificering af defekter, der er til stede ved lav til moderat niveau. For at opnå store antal modne oocyter, har andre brugt blender afbrydelse af voksne hunner kombineret med sigtning 26,27. Her beskriver vi en metode til at aflevere dissekere æggestokke fra 20-25 hunner, med manuel adskillelse af sene fase oocytter af pipettering. Mens metoden blender/sigtning bør også arbejde med denne protokol, er en fordel ved hånd dissektion, uden de sieving skridt, oocyter tilbringer mindre tid i bufferen før fiksering, hvilket mindsker chancen for anaphase jeg debut på grund af kunstige æg aktivering. Desuden, denne metode kræver færre kvinder som udgangspunkt materiale, bruger mindre mængder reagenser, og har en enklere arbejdsproces, som alle lette behandlingen flere genotyper.

Hånd dissektion og manuel adskillelse af modne oocyter giver tilstrækkelige mængder af oocytter til at "rulle" for chorion og vitelline membran fjernelse og resulterer i ca 75-150 oocyter i slutningen af hybridisering vasker. Et trick til at maksimere udbyttet af metafase jeg arresteret oocyter er at holde jomfruelige hunner i gæret hætteglas i mangel af hannerne før dissektion25. Oocyt rullende for at fjerne chorions og vitelline membraner skal udføres med en blid touch for at undgå at ødelægge oocyter. Men at fjerne chorions og vitelline membraner fra 100% af oocyter er ikke et realistisk mål og overdreven rullende kun resulterer i tab af oocytter. Derfor, hvert rullende cyklus bør stoppes når ca 75-85% af oocytter manglende chorions og vitelline membraner.

Begrænsninger
Trods vores succes på generering og benytter arm sonder til at overvåge status for samhørighed i modne Drosophila oocyter lider proceduren stadig under begrænsninger. Mens vi ikke sjældent kunnet registrere et signal til pericentromeric sonde, arm sonde signal var svage eller fraværende i ca 15-20% af oocyter at vi filmede. En medvirkende faktor kan være differentieret penetration af pericentric oligonukleotid sonde (22-28 nukleotider) versus større arm sonden (100-200 nucleotider). Endvidere er de store gentagne sekvens genkendes af pericentric sonde resultater i et signal, der er lysere end for arm sonden. Orientering af oocyt og placering af meiotiske kromosomer inden for oocyt udgør også en udfordring, når imaging. Selvom meiotiske kromosomerne er relativt tæt på celle cortex, er det umuligt at styre retningen af oocyt ved montering på coverslip. Derfor, i en brøkdel af oocytter, meiotiske kromosomerne kan være 100-200 µm fra coverslip og signal intensitet og kvalitet kan påvirkes negativt, når de forsøger at image gennem størstedelen af oocyt. Disse begrænsninger betyder, at antallet af oocytter medtaget i den endelige kvantitativ analyse er betydeligt lavere end antallet af oocytter behandles i protokollen. Bestemmelse af tilstanden af arm samhørighed i 100 oocyter vil højst sandsynligt kræve to uafhængige præparater. En yderligere begrænsende faktor i kvantificere samhørighed defekter ved hjælp af en laser scanning Konfokal mikroskop er tidsforbruget til at fange en typisk Z serie (ca. 5 min.), selv når det erobrede område er begrænset til 1.024 x 512 pixel. Det betyder, at sammenligning af samhørighed i kontrol og eksperimentelle genotyper (100 oocyter) vil nødvendiggøre ca 16 h billede indsamling tid.

Ændringer og fejlfinding
Vi har været i stand til at overvåge status for arm samhørighed ved hjælp af en sonde, der genkender X -kromosom cytologiske holdning 6E-7B19. En sonde, der hybridiserer til en mere distale placering på X -kromosom kan være mere ønskeligt til påvisning af manglende chiasma vedligeholdelse. Derudover kan andre forskere ønske at analysere arm samhørighed på andre kromosomer. Mens vi ikke har forsøgt at sonde i autosome, viser de foreløbige data, at en sonde, der genkender regionen 2F - 3C i X -kromosom også medfører en påviselig signal. Imidlertid kan baseret på begrænsede foreløbige data, signalet fra 2F - 3C sonden være mindre "kompakt" end for 6E-7B sonden. Selv om signalerne, fisk er stram og skarp for nogle oocyt kromosomer, er hybridisering signal på kromosomer af andre oocyter betydeligt mere diffust. Om, hvorvidt disse forskelle i signal afspejler reelle forskelle i kromosom morfologi mellem de to cytologiske steder, variation i hybridisering effektiviteten af to sonder, eller bare stokastiske variation mellem forskellige oocyter vil kræve en mere grundig analyse.

Vigtigere, selv for 6E-7B sonden, vi observeret en diffus kromosomale signalet i nogle oocytter, og dette ofte nødvendiggjorde deres udelukkelse fra analyse. Derudover har vi bemærket variation i signalkvalitet og lysstyrke mellem forskellige præparater af 6E-7B sonden og dette krævede at billeddannelse parametre justeres i overensstemmelse hermed. At hæve temperaturen i hybridisering til 42 ° C ikke reducere antallet af oocyter med diffuse signal, men det påvirke alvorligt signalet til pericentric oligonukleotid sonde. I et forsøg på bedre bevare kromosom morfologi24, vi også prøvet en længere denaturering skridt ved en lavere temperatur (80 ° C), men fandt at denne behandling hverken øget signal intensitet eller reduceret antallet af oocyter med diffuse kromosomale fisk signal. Vi forsøgte også at få en lysere arm signal ved hjælp af 12 overlappende BACs svarende til en ca 1,5 Mb interval, der strakte sig cytologiske region 5E-7B. Når du bruger en 12 BAC sonde, var graden af variation i signal intensitet samt procentdelen af oocytter mangler signal ikke anderledes end når seks BACs blev brugt til at gøre arm sonden. Det var også mere udfordrende at score for samhørighed mangler, når du bruger 12 BAC sonden fordi fisk signaler blev større, hvilket gør det vanskeligere at løse steder svarende til individuelle kromatider. I tilfælde hvor ingen signal er opnået med en nypræparerede sonde, forskere bør kontrollere størrelsen af den forstærkede og begrænsning fordøjet BAC DNA for at bekræfte, at fragmenterne bruges til udgangen mærkning er primært inden for 100-200 bp sortiment. Dette er sandsynligvis en af de mest kritiske faktorer vellykket sondens forberedelelse.

Fremtidige retninger
Fremtidige arbejde for at forbedre image erhvervelse samt tilpasning af protokollen til at omfatte immunfarvning ville være store forbedringer, som vil gavne andre forskere. Under billedsamling, ville indsamle et større antal billeder i aksial dimension samt hurtigere billede erhvervelse være en fordel for kvantificering samhørighed defekter. I optimering imaging parametrene for laser scanning Konfokal, fandt vi, at 0,25 µm var den mindste skridt størrelse, der kunne bruges til Z-serien for at undgå nævneværdig blegning af FISKEN signaler. Dog for fisk signaler, der er adskilt af mindre end 0,25 µm i Z stakken, dette trin størrelse kan resultere i manglende evne til at fange "rum" mellem foci og derfor kan undervurdere antallet af samhørighed defekter. Hurtigere billede erhvervelse hastigheden af en roterende disk Konfokal kan tillade mindre step størrelser uden signal blegning anvendes. Dette ville give mere præcise billede genopbygning i dimensionen aksial samt tillade større antal oocyter skal analyseres for samhørighed defekter. Desuden forbedre evnen til at kombinere immunfarvning med fisk visualisering af tilstanden af arm samhørighed betydeligt protokollen. For en række præparater forsøgte vi at udføre spindel immunfarvning proceduren hybridisering. Men robust spindel farvning var synlig i kun en lille brøkdel af oocyter. Desuden, af årsager, ikke der er klare, højere niveauer af spurious fisk signaler omgivet meiotiske kromosomerne når fisk og immunfarvning blev kombineret. Yderligere arbejde for at optimere protokol til at lade immunfarvning enten før eller efter proceduren for fisk ønsker høj grad udvide kapacitet af denne teknik.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ikke konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af NIH Grant GM59354 tildeles Sharon E. Bickel. Vi takker Huy Q. Nguyen for bistand i forbindelse med udviklingen af protokollen til at generere fluorescerende arm sonder, Ann Lavanway til hjælp med Konfokal mikroskopi og J. Emiliano Reed for teknisk bistand. Vi takker også mange kolleger i Drosophila Fællesskabet til nyttige diskussioner og rådgivning.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Kits
Midi Prep kit Qiagen 12143 Prep BAC clone DNA
GenomePlex Complete Whole Genome Amplification (WGA) Kit Sigma WGA2 Amplify BAC clone DNA
ARES Alexa Fluor 647 DNA labeling kit Invitrogen A21676 Label BAC clone DNA
PCR purification kit Qiagen 28104 Remove non-conjugated dye following labeling of BAC clone DNA
Name Company Catalog Number Comments
Chemicals & Solutions
Note: All solutions are prepared using sterile ultrapure water and should be sterilized either by autoclave or filter sterilization.
Bovine serum albumin (BSA) Fisher Scientific BP1600-100 Prepare 10% stock
Freeze aliquots
Calcium chloride Fisher Scientific C75-500
DAPI (4’, 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Invitrogen D1306 Toxic: wear appropriate protection. Prepare 100µg/ml stock in 100% ethanol, store in aliquots at -20 °C. Prepare 1 µg/ml solution in 2X SSCT before use.
Dextran sulfate Sigma D-8906
Drierite Drierite Company 23001
Dithiothreitol (DTT) Invitrogen 15508-013 Prepare 10 mM stock
dTTP (10 µmol, 100 µl) Boehringer Mannheim 1277049 Prepare 1 mM stock
EDTA (Disodium ethylenediamine tetraacetic acid) Fisher Scientific S311-500 Prepare 250 mM stock
100% ethanol (molecular grade, 200 proof) Decon Laboratories 2716
Tris (Ultra Pure) Invitrogen 15504-020
EGTA (Ethylenebis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid) Sigma E-3889
16% formaldehyde Ted Pella, Inc. 18505 Toxic: wear appropriate protection
Formamide Invitrogen AM9342 Toxic: wear appropriate protection
Glucose Fisher Scientific D16-1
Glycogen Roche 901393
HEPES Boehringer Mannheim 737-151
Heptane Fisher Scientific H350-4 Toxic: wear appropriate protection.
Hydrochloric acid Millipore HX0603-4 Toxic: wear appropriate protection.
Hydroxylamine Sigma 438227 Prepare 3 M stock
4.9 M Magnesium chloride Sigma 104-20
Na2HPO4 Ÿ 7H2O Fisher Scientific S373-500
NaH2PO4 Ÿ 2H2O Fisher Scientific S369-500
Poly-L-lysine (0.1mg/ml) Sigma P8920-100
Potassium acetate Fisher Scientific BP364-500
Sodium acetate Fisher Scientific S209-500 Prepare 3M stock
Sodium cacodylate Polysciences, Inc. 1131 Toxic: wear appropriate protection. Prepare 400mM stock
Sodium citrate Fisher Scientific BP327-1
Sodium chloride Fisher Scientific S271-3 Sodium chloride
Sucrose Fisher Scientific S5-500
10% Tween 20 Thermo Scientific 28320 Surfact-Amps
10% Triton X-100 Thermo Scientific 28314 Surfact-Amps
Name Company Catalog Number Comments
Solutions
Note: All solutions are prepared using sterile ultrapure water and should be sterilized either by autoclave or filter sterilization.
TE buffer 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH = 8.0
20X SSC (Saline Sodium Citrate) 3 M NaCl, 300 mM sodium citrate
2X cacodylate fix solution Toxic: wear appropriate protection. 200 mM sodium cacodylate, 200 mM sucrose, 80 mM sodium acetate, 20 mM EGTA
1.1X Hybridization buffer 3.3X SSC, 55% formamide, 11% dextran sulfate
Fix solution Toxic: wear appropriate protection. 4% formaldehyde, 1X cacodylate fix solution
PBSBTx 1X PBS, 0.5% BSA, 0.1% Trition X-100
PBSTx 1X PBS, 1% Trition X-100
Extraction buffer (PBSTx + Rnase) 1X PBS, 1% Trition X-100, 100 µg/mL RNase
2X SSCT 2X SSC, 0.1% Tween 20
2X SSCT + 20% formamide Toxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 20% formamide
2X SSCT + 40% formamide Toxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 40% formamide
2X SSCT + 50% formamide Toxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 50% formamide
Name Company Catalog Number Comments
Enzymes
AluI New England Biolabs R0137S
HaeIII New England Biolabs R0108S
MseI New England Biolabs R0525S
MspI New England Biolabs R0106S
RsaI New England Biolabs R0167S
BfuCI New England Biolabs R0636S
100X BSA New England Biolabs Comes with NEB enzymes
10X NEB buffer #2 New England Biolabs Restriction enzyme digestion buffer. Comes with NEB enzymes
Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) 400 U/µl Roche/Sigma 3333566001
TdT buffer Roche/Sigma Comes with TdT enzyme
Cobalt chloride Roche/Sigma Toxic: wear appropriate protection. Comes with TdT enzyme
RNase A (10 mg/mL) Thermo-Scientific EN0531
Name Company Catalog Number Comments
Cytology Tools etc.
Forceps Dumont #5 INOX, Biologie
9” Disposable glass Pasteur pipettes Fisher 13-678-20C Autoclave to sterilize
Shallow glass dissecting dish Custom made
Deep well dish (3 wells) Pyrex 7223-34
Fisherfinest Premium microscope slides Fisher Scientific 22-038-104 Used to cover deep well dishes
Frosted glass slides, 25 x 75 mm VWR Scientific 48312-002
Glass slides, 3 x 1 in, 1 mm thick Thermo-Scientific 3051
Coverslips, 10 x 10 mm, No. 1.5 Thermo-Scientific 3405
Tungsten needle homemade
Prolong GOLD mounting media Molecular Probes P36930
Compressed-air in can Various
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
PCR machine Various
Nanodrop 2000, spectrophotometer Thermo-Scientific microvolume spectrophotometer
Vortexer Various
Table top microfuge at room temperature Various
Table top microfuge at 4 °C Various
Heat block Various
Hybridization oven or incubator with rotator Various
Nutator Various
A1RSi laser scanning confoal Nikon 40X oil Plan Fluor DIC (NA 1.3)
Name Company Catalog Number Comments
Consumables etc.
50 mL conical tubes Various
15 mL conical tubes Various
1.5 mL microfuge tubes Various
500 µl microfuge tubes Various
200 µl PCR tubes Various
Plastic container with tight fitting lid Various To hold Drierite
Kimwipes Various disposable wipes
Parafilm Various paraffin film
Name Company Catalog Number Comments
Other
HPLC purified 5'-labeled oligonucleotides Integrated DNA Technologies Cy3-labeled probes that recognize the 359 bp satellite repeat of the X chromosome
Volocity 3D Image Analysis Software PerkinElmer Version 6.3

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Peters, J. M., Nishiyama, T. Sister chromatid cohesion. CSH Perspect Biol. 4 (11), (2012).
  2. McNicoll, F., Stevense, M., Jessberger, R. Cohesin in gametogenesis. Curr Top Dev Biol. 102, 1-34 (2013).
  3. Buonomo, S. B., et al. Disjunction of homologous chromosomes in meiosis I depends on proteolytic cleavage of the meiotic cohesin Rec8 by separin. Cell. 103 (3), 387-398 (2000).
  4. Bickel, S. E., Orr-Weaver, T., Balicky, E. M. The sister-chromatid cohesion protein ORD is required for chiasma maintenance in Drosophila oocytes. Curr. Biol. 12 (11), 925-929 (2002).
  5. Hodges, C. A., Revenkova, E., Jessberger, R., Hassold, T. J., Hunt, P. A. SMC1beta-deficient female mice provide evidence that cohesins are a missing link in age-related nondisjunction. Nat Genet. 37 (12), 1351-1355 (2005).
  6. Freeman, S. B., et al. The National Down Syndrome Project: design and implementation. Public Health Rep. 122 (1), 62-72 (2007).
  7. Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nat Rev Genet. 13 (7), 493-504 (2012).
  8. Angell, R. R. First-meiotic-division nondisjunction in human oocytes. Am. J. Hum. Genet. 61, 23-32 (1997).
  9. Tsutsumi, M., et al. Age-related decrease of meiotic cohesins in human oocytes. PLoS One. 9 (5), e96710 (2014).
  10. Liu, L., Keefe, D. L. Defective cohesin is associated with age-dependent misaligned chromosomes in oocytes. Reprod Biomed Online. 16 (1), 103-112 (2008).
  11. Subramanian, V. V., Bickel, S. E. Aging predisposes oocytes to meiotic nondisjunction when the cohesin subunit SMC1 is reduced. PLoS Genet. 4 (11), e1000263 (2008).
  12. Chiang, T., Duncan, F. E., Schindler, K., Schultz, R. M., Lampson, M. A. Evidence that weakened centromere cohesion is a leading cause of age-related aneuploidy in oocytes. Curr. Biol. 20 (17), 1522-1528 (2010).
  13. Lister, L. M., et al. Age-related meiotic segregation errors in mammalian oocytes are preceded by depletion of cohesin and Sgo2. Curr. Biol. 20 (17), 1511-1521 (2010).
  14. Duncan, F. E., et al. Chromosome cohesion decreases in human eggs with advanced maternal age. Aging Cell. 11 (6), 1121-1124 (2012).
  15. Yun, Y., Lane, S. I., Jones, K. T. Premature dyad separation in meiosis II is the major segregation error with maternal age in mouse oocytes. Development. 141 (1), 199-208 (2014).
  16. Subramanian, V. V., Bickel, S. E. Heterochromatin-mediated association of achiasmate homologues declines with age when cohesion is compromised. Genetics. 181, 1207-1218 (2009).
  17. Jeffreys, C. A., Burrage, P. S., Bickel, S. E. A model system for increased meiotic nondisjunction in older oocytes. Curr. Biol. 13 (6), 498-503 (2003).
  18. Weng, K. A., Jeffreys, C. A., Bickel, S. E. Rejuvenation of Meiotic Cohesion in Oocytes during Prophase I Is Required for Chiasma Maintenance and Accurate Chromosome Segregation. PLoS Genetics. 10 (9), e1004607 (2014).
  19. Perkins, A. T., Das, T. M., Panzera, L. C., Bickel, S. E. Oxidative stress in oocytes during midprophase induces premature loss of cohesion and chromosome segregation errors. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (44), E6823-E6830 (2016).
  20. Dernburg, A. F., Sedat, J. W., Hawley, R. S. Direct evidence of a role for heterochromatin in meiotic chromosome segregation. Cell. 86, 135-146 (1996).
  21. Dernburg, A. F., Sedat, J. W. Method Cell Biol. 53, Academic Press. 187-233 (1998).
  22. Guo, Z., Batiha, O., Bourouh, M., Fifield, E., Swan, A. Role of Securin, Separase and Cohesins in female meiosis and polar body formation in Drosophila. J Cell Sci. 129 (3), 531-542 (2016).
  23. Giauque, C. C., Bickel, S. E. Heterochromatin-Associated Proteins HP1a and Piwi Collaborate to Maintain the Association of Achiasmate Homologs in Drosophila Oocytes. Genetics. 203 (1), 173-189 (2016).
  24. Joyce, E. F., Apostolopoulos, N., Beliveau, B. J., Wu, C. T. Germline progenitors escape the widespread phenomenon of homolog pairing during Drosophila development. PLoS Genet. 9 (12), e1004013 (2013).
  25. Gilliland, W. D., Hughes, S. F., Vietti, D. R., Hawley, R. S. Congression of achiasmate chromosomes to the metaphase plate in Drosophila melanogaster oocytes. Dev Biol. 325 (1), 122-128 (2009).
  26. Gyuricza, M. R., et al. Dynamic and Stable Cohesins Regulate Synaptonemal Complex Assembly and Chromosome Segregation. Curr Biol. 26 (13), 1688-1698 (2016).
  27. Radford, S. J., McKim, K. S. Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes. J Vis Exp. (116), (2016).

Tags

Udviklingsmæssige biologi spørgsmålet 130 Drosophila meiose oocyt søster chromatid samhørighed arm samhørighed fluorescens i situ hybridisering (FISH)
Ved hjælp af fluorescens <em>In Situ</em> hybridisering (FISH) til at overvåge status for Arm samhørighed i Prometaphase og metafase jeg <em>Drosophila</em> oocyter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Perkins, A. T., Bickel, S. E. Using… More

Perkins, A. T., Bickel, S. E. Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) to Monitor the State of Arm Cohesion in Prometaphase and Metaphase I Drosophila Oocytes. J. Vis. Exp. (130), e56802, doi:10.3791/56802 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter