Summary
準備とラットの両側膝蓋腱欠損モデル臍帯マトリックス由来間葉系幹細胞スフェロイドの評価について述べる。このモデルは、未処理と処理の腱との間の違いを検出する発見だったし、2 処置間テスト許容罹患率に関連付けられていた。
Abstract
再生医療は、伝統的な治療法に挑戦する条件に新しい選択肢を提供します。有病率と罹患率、生物種間の寛解のこの組織の限られた癒しのプロパティと組み合わせて細胞療法に関する検索を求め、その有効性を検討するための実験モデルの開発を推進します。臍帯マトリックス由来間葉系幹細胞 (UCM MSC) は、豊富な簡単に収集、倫理的な問題と奇形腫形成の危険性回避まだ原始胚性幹細胞をもっと密接に類似している魅力的な候補者よりも大人の組織由来の MSCs。 重要な関心は、スフェロイドの形成を通じて MSCs のプロパティを強化する戦略としてキトサンを重視しています。UCM-MSCs を分離するこの紙詳細テクニックはキトサン フィルムの回転楕円体を準備し、表面マーカー式回転楕円体形成の効果を分析します。その結果、キトサン膜上に形成した UCM MSC 回転楕円体の体内注入のラットの両側膝蓋腱損傷モデルの作成を説明します。合併症を認めなかった罹患率に関して研究、ストレス上昇の効果、または組織感染症。7 日手術群の合計機能スコアは正常ラットよりも低かったが、手術後 28 日以内に正常に返されます。組織の治癒の組織学的スコアは、異物反応と 28 日で治癒の進行がないこと 7 日間に評価処理の欠陥で血栓の存在を確認しました。この両側膝蓋腱欠損モデルが許容可能な罹患率に関連付けられているは、未処理の腱とトリートメントの違いの検出を許可各ラットにおける内部統制の作成による個体間変動を制御します。
Introduction
腱損傷は、種1にわたって大幅に痛みや筋肉萎縮の最も一般的な原因の 1 つです。獣医学で腱と靱帯損傷は、馬に特別な関心の競走馬のすべての傷害の 82% を含む筋骨格系とそれらの 46% の腱や靭帯の2,3に影響を与えます。瘢痕形成が癒される腱の力学的特性に影響を与えるし、屈筋腱の傷害後運動の使用へのリターンに守られた予後を説明します再傷害は最大で 2 年以内発生パワードップラーを馬の 67%4。再生医療は、伝統的な治療法に挑戦する条件に新しい選択肢を提供します。自家幹細胞療法はいくつかの励みになる結果5,6を生産しているが、組織の採取、細胞の処理/リプログラミングによる遅延管理の影響に関連する罹患率によって制限されます、幹の特性に (年齢) などの患者さんの健康状態は、7、8 を細胞します。これらの制限は、既製の代替として同種幹細胞を調査するための理論的根拠を提供します。胎児の付属器由来の細胞は、倫理的な問題および胚性幹細胞に関連する奇形腫形成の危険性を回避するために魅力的な候補です。胎児の付属器の中で臍帯マトリックス (UCM)、Wharton のゼリーとも呼ばれますが豊富、集めやすいです。
細胞ソースに関係なく幹細胞性を高めることは同種の再生医療細胞バンクの確立に不可欠です。機能的観点から自己複製と多系統分化9の可能性として幹細胞性を定義できます。幹細胞性の証拠は、アッセイ、遺伝子マーカー Oct4、 Sox2, Nanog9の式と一緒に増殖と分化に依存します。幹細胞性を強化する方法の 1 つは、void のフィラーと UCM MSCs の増殖・分化を高めるキャリアとして機能する生体材料の使用に依存します。このアプローチは、多能性細胞に成熟した細胞を再プログラムする転写因子の操作に関する懸念を排除できます。生体幹細胞の潜在的なキャリアとして考慮される間、キトサンは生体適合性と分解性10魅力的です。この天然アミノ多糖類は、主に上位製貝10品として得られる 2 番目の最も豊富な天然多糖類キチン質のアルカリ脱アセチル化によって形成されます。以前 MSCs とキトサン足場間の相互作用を調査して回転楕円体11,12,13,14,15,の形成の観察16. 我々 はまたキトサン行列12,13,14,15,16,17、軟骨分化の優位性を報告 18。最近では、2 つの独立した研究は、脂肪組織によってスフェロイド形成を説明および胎盤組織由来キトサン フィルム19,20上で培養した MSCs。回転楕円体のこの形成だけでなく、幹細胞性を強化、また生体内注入20後幹細胞の保存を改善しました。
有病率と罹患率の種にわたって寛解の伸張の病態を検討して幹細胞注射など新しい治療法をテストする実験モデルの開発を求めています。馬、コラゲナーゼによる腱鞘炎は腱修復21で MSCs を使用して有効性を発揮する一般的なモデルです。注射は急性炎症性変化を引き起こすので、このアプローチの妥当性は限られている、臨床の伸張は通常慢性の結果に対し22,23ストレスを掛けすぎています。さらに、腱の疾患の化学的誘導は治癒反応を誘発して症例22,23に障害の治癒過程をレプリケートしません。浅指屈筋腱の部分の切除は、馬24で腱鞘炎の手術モデルとして記載されています。最近では、低侵襲アプローチは、浅指屈筋腱25の中核への外傷性の損傷を制限する使用されました。手術モデルは自然な腱の病気につながる可能性があります、25を作成された損傷の範囲内の再現性に欠けがち疲労機構をシミュレートしません。モデル, 罹患率と腱の馬のモデルに関連付けられているコストに関係なく病気は体内の新規治療法の評価のための最初のステップとして齧歯動物モデルに関心を正当化するための制限です。
齧歯動物の実験モデルの主な利点の 1 つは、費用と個体間変動を制御する能力で構成されています。齧歯動物は、その急速な成長率により様々 な生理的要因に関して標準化することができますおよび短い寿命のスパンの変化の源を制限して、その違いを検出するために必要な動物の数を減らします。齧歯動物の腱疾患を誘導する戦略は、化学的誘導部分の腱欠陥21の外科的創造にもに依存しています。手術モデルの化学モデルをより自然な伸張をシミュレートすることが、高い罹患率と損傷した腱の壊滅的な障害につながることができます。その点、ラットだこれらのモデルのマウスよりもより良い候補者のサイズは、組織の治癒の評価を促進することにより、大規模な欠陥を作成できます。ラットは、4 つの主要な腱グループの伸張の実験的研究で使用されている: 腱、屈筋、アキレス、膝蓋腱26。これらのうち、膝蓋腱を含むモデルは、この腱の大きなサイズと27それへのアクセスの容易さのため特に魅力的です。膝蓋腱が脛骨粗面に大腿四頭筋をアタッチします。この伸筋機構内膝蓋骨は、大腿四頭筋の操作を指示し、膝蓋腱の近位の範囲を区別する種子骨です。膝蓋腱の近位と遠位の範囲で骨アンカーの存在生体力学的テストが容易になります。通常膝蓋腱を含むモデルは、コントロール28,29として対側そのまま腱の片側手術の欠陥に依存します。最も一般的な膝蓋腱欠損モデルは、対側の膝蓋腱がそのまままま、脛骨粗面の挿入に膝蓋骨の遠位の頂点から膝蓋腱の中央部分 (幅 1 mm) を切除します。組織、非破壊力学的試験や生体力学的障害、超音波画像診断、 ex vivo蛍光イメージング、肉眼観察および機能テスト28,30 をテスト結果の措置が含まれています。 ,31。一方的なモデルは提案された治療と同じ動物内で同様の負傷の保守的な管理とを比較できないようにします。同様に、いくつかの治療の比較では、別の動物が必要です。二国間のモデルは個体間変動を取り除き、32の研究に必要な動物の数を減らすでしょう。しかし、二国間の傷害の罹患率を高める可能性があり、二国間跛行の治療評価を妨げる可能性が。簡単にいくつかの研究のレポート モデル33,34の罹患率・周術期管理ではなく、治療の効果に関する両側膝蓋腱欠損ラットがフォーカスの使用。
この研究の長期的な目標は、UCM MSCs 宛ての同種移植の幹細胞性と生体内での生存率を改善するための戦略を開発することです。この目標を達成するために最近キトサン フィルムと35低酸素環境下での培養でスフェロイドの形成による UCM MSCs の改良された幹細胞性を報告した.これらの体外プロパティ エアコン UCM と扱われる膝蓋腱欠損の改善された生体力学的特性と関連していた-MSCs これらの結果に基づいて、ラット両側膝蓋腱欠損モデルが候補者をテストするには適しているようだ。腱の傷害の36のトリートメント。研究の目的は、分離とキャラクタリゼーション UCM MSCs の幹細胞、作成と両側膝蓋骨腱障害、手術後の治療のための生物学的デリバリー システムの準備のための詳しいプロトコルを提供するためにはここで報告回復と組織欠陥の中に癒しの評価。
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Protocol
ここで説明したすべてのメソッドは、機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) ウエスタン大学の保健学科によって承認されています。
1. 分離とウマ臍帯行列から MSCs の拡大
- 観察 foaling 後大人の牝馬 (妊娠している) から胎盤を入手して無菌胎盤から臍帯を分離します。おいて臍帯リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 1% ペニシリン-ストレプトマイシン (P/S) の 4 ° C での転送中に処理まで。
- 1% と室温 PBS で 2 回臍帯を洗う P/S 50 mL のチューブに。セクション 2 インチ長さ 150 mm の板と P/S 50 mL のチューブの 2 つのまたは 3 回まで血液のほとんどをすすいだ 1% 室温 PBS で洗浄断章に臍帯。
- 船を公開する縦へその緒を切る。2 動脈、静脈、鉗子、はさみを使用してコードから尿の茎などの血管を削除します。メスで削って 150 mm の板の上にゼリーのようなマトリックスの周囲血管臍帯マトリックス (Wharton のゼリー) を収集し、細かい部分にゼリーをみじん切り。
- 場所ワルトン 15 ml の PBS の 0.1% (w/v) コラゲナーゼ タイプ IA ソリューションの 50 mL チューブに 2-3 臍帯断片 (約 12-15 g) から。3-4 時間溶解するまで穏やかな揺れで 37 ° C で孵化させなさい。
- 15 分間 300 x g で消化組織を遠心し、上清を吸引します。室温 PBS 1% の 15 mL で消化組織を再懸濁します P/S、ピペッティングで混ぜる、5 分間 150 × g で遠心、上清 (洗浄) を吸引します。二回以上洗濯を繰り返します。
- 室温 PBS 1% の 15 mL のセルを洗浄再懸濁します P/S、ピペッティングで混ぜる、100 μ m セル ストレーナー付け, 150 x g で 5 分間遠心によるひずみ、上清を吸引します。
- 低血糖ダルベッコを混合することによって培養液 (CM) を準備変更イーグル培地 (LG DMEM) ウシ胎児血清 (FBS) と 1 %p/s. 濾過により培地を滅菌します。
- 37 ° C に加温 CM の 10 mL で緊張した細胞を再懸濁します、ピペッティングで混ぜる、25 cm2培養フラスコに移す、5% CO2 90% の湿度と 37.0 ° c. で孵化させなさい変更 CM 文化文化、継代時に 70-80% の合流点に達するまで 3 日おき。
- 文化を通路にフラスコから CM を吸引、室温 PBS の 5 mL で 2 回洗浄、3 ml の 5 分の 37 ° C で 0.25% トリプシン/エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) のデタッチします。
- トリプシン/EDTA 37.0 ° C に加温 CM の 6 ml を中和する、ピペッティングで混ぜる、150 x g で 5 分間遠心 15 mL チューブに移す、上清を吸引します。CM の 1 mL 中の剥離細胞を再懸濁します、ピペッティングで混ぜます。トリパン ブルーと検定を使用して実行可能なセルを数えます。5,000 セル/cm2で 25 cm2培養フラスコに再シードし、5% CO2 90% の湿度と 37.0 ° c. で孵化させなさい
2. UCM mscs キトサン膜上で培養した回転楕円体の準備
- 1% (w/v) キトサン溶液の 100 mL を準備するには、キトサンの 1 g を加えて 99 mL の蒸留水 (dH2O)、および磁性攪拌器でよく混ぜます。
- 氷酢酸の 670 μ L を追加し、キトサンを溶解して粘性になるまで混合を続行します。これは通常 3-4 時間がかかります。
- 12 ウェル培養プレートの各ウェルにキトサン溶液 500 μ L を追加し、キトサン ソリューションを均等に分散し、すべて底面のカバー プレートを旋回します。
- キトサン コーティング ソリューション平板層流 24 時間一晩カバーなしキャビネットを乾燥させます。一度乾燥、薄膜を形成・ プレートに付着されます。
- 各ウェルに 0.5 N 水酸化ナトリウム (NaOH) 溶液の 1 mL を追加してキトサン フィルムを中和し、室温で 2 時間インキュベートします。各ウェルから NaOH を吸引し、それぞれを洗ってよく dH2O の 1 mL で 3 回。それぞれを洗って一度 70% エタノール (エタノール) 1 mL でも。
- キトサン フィルムを殺菌するには、層流れのキャビネットで一晩 70 %etoh それぞれによく、インキュベートの 1 mL を追加します。次の日に各ウェルから残りのエタノールを吸引します。それぞれを洗っても 1 ml 滅菌 PBS の 3 回。キトサン フィルム流カバーなし一晩キャビネットの下紫外光を滅菌します。
- フォームは UCM MSCs の回転楕円体に種子を拡大し 5,000 セル/cm2、各ウェルに、細胞を継代そして 5% CO2 90% の湿度と 37.0 ° c. で孵化させなさい
注: セルは、低酸素症又は治験責任医師の関心に応じて常孵化することができます。
3 フローサイトメトリー分析表面マーカーの発現
-
単一細胞懸濁液の準備
- 標準プレート
- 各ウェルからメディアを削除し、室温 PBS で 2 回洗います。
- 室温で 5-10 分の 12 ウェル プレートの各ウェルに、細胞解離試薬の 500 μ L でセルをデタッチします。
- インキュベーション後、染色バッファー (0.5 %bsa を含む PBS) 1 ml を各ウェルに、細胞をデタッチするピペッティングで混ぜます。
- 15 mL の円錐管 150 x g で 5 分間遠心し、細胞懸濁液を転送します。
- キトサン プレート
- 先端が 1,000 μ L ピペットを使用して吸引媒体によってすべての回転楕円体を収集します。15 mL の円錐管に集められた媒体。媒体を収集した後、PBS の 1 mL を追加してよく洗うし、同じ 15 mL の円錐管に洗浄 PBS を転送します。
- 5 分間 150 x g で回転楕円体を遠心し、上清を除去します。
- 細胞解離試薬 (例えばaccutase) を 500 μ l 添加し、室温で 5-10 分の間孵化させなさい。ミックスによるピペット 1 mL 先端まで回転楕円体を切り離して考えるし、表示されなくなります。
- 単一細胞懸濁液や 150 x g で 5 分間遠心に染色バッファーの 1 つの mL を追加します。
- 標準プレート
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洗浄のセル
- 円錐管から上澄みを除去し、再バッファーを染色冷 3 mL のセルを中断します。このステップから氷上実験を通して細胞を保ちます。
- 5 分 (洗濯) 300 × g で遠心分離機します。
- 2 回洗います。
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セルを汚す
- 5 分間 300 × g で遠心し、上清を除去します。
- トリパン ブルーと検定を使用して実行可能なセルを数えます。50 μ L ブロックで 1 x 10 の6セルを再停止 (PBS 含む 10% 馬血清) をバッファーし、氷の上で 30 分間インキュベートします。
- 10 μ L フルオレセイン イソチオ シアン酸 (FITC) 共役抗体 (CD44、CD90, CD105、CD34、主要組織適合遺伝子複合体 (MHC) クラス II、または各抗体アイソタイプ コントロール) とバッファーを染色の 40 μ L を追加し、氷の上の 1 h の光から保護します。
- 染色バッファー冷 3 mL を加えるとミックス、5 分 300 × g で遠心、上清 (洗浄) を吸引します。
- 二回洗濯を繰り返します。
- 再バッファーを染色の 0.5 mL の細胞ペレットを中断します。
- 7 AAD (生存率色素) の 5 μ L を追加し、氷の上で 30 分間インキュベート
- フローサイト メーターによる細胞染色サンプルを分析します。小さく SSC と FSC によって破片を除外し、7 AAD の吸収性の低い実行可能なセルを識別します。プロット FL1 と FL2 に、y 軸と x 軸、それぞれ。アイソタイプ コントロールを使用すると、対角線上のゲートを作成できます。地域で積極的に陽性細胞の割合を測定します。少なくとも 20,000 イベント/サンプル (補足図 1) をカウントします。
- ゲーティング生菌と自動蛍光抗体染色細胞の割合を測定し、染色のアイソタイプ コントロールのセルの割合を減算します。
4. 両側膝蓋腱欠損モデル ラットの
- ラット (成人男性、4-5 ヶ月、体重 350-375 g) を選択します。このモデルに使用されるラットの比較的大きいサイズに注意してください。
- 麻酔し、誘導室でピンチからつま先まで反射の消失までマスクを介して配信される 2 L/分 100% 酸素を 8% セボフルラン ラット人工眼の潤滑剤を適用します。
- 先制鎮痛としてメロキシカム (1 mg/kg の筋肉内注射を管理します。
- 暖かい水で満たされ、皮膚傷害を防ぎながら体の温度と位置を維持するために布で覆われた 2 つの 0.5 L 水ボトル間ネズミを配置します。テーブルにそれぞれの端をテープします。低体温症のリスクを減らすためには、バブルラップ (図 1) と体をカバーします。
- 5% セボフルラン 1 L 100% 酸素混合背臥床水加熱パッドの上に動物の鼻の円錐形の連続的な流れで麻酔を維持します。
- 皮膚外傷を避けるためには、施術部位を切てはいけない。代わりに、両方の抑圧に除去クリームを適用します。舌圧子を使用して、クリームや髪を削除します。
- クロルヘキシジン酸スクラブで手術部位をスクラブし、3 回を 70% エタノールでリンスします。
- 抑圧の craniomedial の側面に、遠位、近位方向に滅菌 #15 メス刃で皮膚を切開します。膝蓋骨のレベルに近位部に約 1 cm の切開を開始し、約 5 mm 脛骨結節の遠位はそれを拡張します。
- #15 メス刃を持つ基になる皮下組織の解放によって膝蓋腱を公開するスキンが反映されます。
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#15 メス刃を使用して、脛骨粗面に膝蓋骨の遠位面から各膝蓋腱 (1 mm) の中央 3 分の 1 を切除します。
- 各肢 (図 2) の欠陥のサイズを標準化するためのテンプレートとして腱に対して 0.99 mm 径 Kirschner 金網を合わせます。
- (図 3) の腱の中央部分を分離する #15 メス刃を Kirschner 線の各側に 2 全層切開を作る。近位および遠位罰金アイリスはさみ (図 4) で中央部を切除します。
- 膝関節の筋膜を閉じる前に 5.5 で説明したように、適切な治療グループの血栓 (混合細胞懸濁液および ACP) を挿入します。十字パターンと筋膜と皮膚 5-0 polyglactin 910 縫合糸 (図 5) を使って皮のパターンを閉じます。
- 対側の抑圧に手順を繰り返します。
注: 1 つの欠陥は無作為に治療 (キトサン エアコンまたは標準プレート上で培養した幹細胞)。対側の欠陥が内部統制として機能する、空のまま。 - 手術後管理エンロフロキサシンの 4 錠 (2 mg/錠、経口投与、1 日 1 回) とメロキシカム錠 (2 mg/錠経口投与、1 日 1 回) を 7 日間。これらの用量は実験動物の獣医師が推奨され、IACUC プロトコルで承認します。
5. 膝蓋腱欠損内の MSCs の配信
- 2 L/分 100% 酸素マスクを届け誘導室でピンチからつま先まで反射の消失までに 8% セボフルランを膝蓋腱欠損を作成使用されていない健康なラットを麻酔します。
- 収集する 5 mL の血液心臓穿刺によって麻酔 Sprague-dawley ラット (成人男性、4-5 ヶ月、体重 350-375 g)、5 mL シリンジで酸-クエン酸-ブドウ糖 (5:1 v/v) 1 mL を含む 20 G 針で。
- ペントバルビ タール (100 mg/kg)、同じ麻酔中の intracardial 注入による心臓穿刺・採血後のラットを安楽死させます。
- 室温で 15 分間 350 x g でサンプルを遠心します。上清を転送し、使用するまで-20 ° C で因数 (各 120 μ L) を格納します。
- 体内注入の直前に上記の因数を解凍しミックス 0.5 x 10 と 20 μ L6 MSCs (1.9 または 3.1.2.1) からトリプシン/EDTA を用いた標準的な板から分離または (PBS/中) とフラッシュしてキトサン プレートから収集します。
- 解凍プラズマ プラズマをアクティブにし、血栓の形成を誘導する 96 ウェル プレートのウェル内の残りの 100 μ L に 10% 塩化カルシウム (CaCl2) の 6 μ L を追加 (エアコン プラズマをアクティブ化: ACP)。
- 細胞懸濁液 (20 μ L) をミックスし、ACP (100 μ L) (図 6) 血栓を形成します。膝関節の筋膜を閉じる前に作成した膝蓋腱欠損内血栓を配置 (4.10.3 の手順を参照してください)。
6. 機能的予後
- ラットのラット顔をしかめるスケール (RGS)37,38に基づいて、着床に腫れ、痛みの兆候を 1 日 2 回を監視します。
注: スコアリング システム (0-6) (0-3) サポート前肢と後肢の時間立っているを含む 3 の活動に基づく歩行の機能を評価するため開発された、時間自力で後肢に立って (0-2) と 17 cm プラスチック製ケージの壁 (0-1) (を登る能力表 1)。 - 朝と夕方には平均スコアを計算する各時点のラットの 2 つの後肢に立って活動を評価します。
- ラット正常に登頂両後肢と 17 cm プラスチック製ケージの壁を登る能力を評価します。
7. 総外観と膝蓋腱の病理組織学
- (炎症の評価) に 7 日目にラットを安楽死させるか (組織の治癒を評価) に 28 日の投稿 (100 mg/kg) ペントバルビ タール麻酔 8% セボフルランと 2 L 100% 酸素マスクを介して配信の intracardial 注射治療。
- 安楽死した後膝蓋腱-脛骨結節台メスとはさみを収穫します。軟部組織や靭帯膝蓋腱を除いて、抑圧の周りを削除します。
- 外見と (図 7) 腱の肥厚のため検体を調べる。
- 腱の近位部と外側面に 5.0 Polydioxanone の外科医の結び目を置くことによって試料に合わせます。10% 中性緩衝ホルマリン液で検体を修正し、各腱の中間部分から横断 (5 μ m) を取得します。
- ヘマトキシリンとエオシン、次の標準的なプロトコルを染色、マッソンの Trichrome を使用してセクションを染色します。
- 炎症などの病理学的変化と同様、欠陥、内血腫の存在を検出するセクションを確認します。
- コラーゲン生、血管新生、および軟骨形成 (表 2)39度に基づいて、以前に発行されたスコアリング システムを使用してセクションの組織学的スコアを評価します。
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Representative Results
現在の研究では、平均 ± SD (標準偏差) に結果が表示されます。セルは 6 馬のへその緒から隔離され標準またはキトサンのエアコンの下で各細胞の表面マーカーを表現する分離細胞の割合を比較したフリードマン検定との非パラメトリック解析の分散として繰り返し対策。腱欠損モデル作成用 7 日術後評価 8 ラットを用い、12 ラット 28 日間評価のため使用されました。機能結果の結果は ± SEM (平均値の標準誤差) を意味するように表示されます、t 検定を用いて比較しました。UCM は、その豊富なコレクション、およびその他胎児ソルーション ソース40を基準にして優れた拡散性により細胞ソースとして選ばれました。UCM 標準プレート上で培養した細胞には、拡大中の線維芽細胞のような形が維持されます。セルは、キトサン プレート (図 8) で培養したときの回転楕円体を形成しました。
標準的な条件下で培養された細胞の大部分は、CD44 を表明した (98.6 ± 1.62%)、CD90 (88.7 ± 3.04%)、および CD105 (77.9 ± 6.84%)、CD34 発現をしながら (0.07 ± 0.17%) MHC II (1.33 ± 1.12%) は非常に低かったと。エアコン文化、CD44 の発現レベルの下で (97.0 ± 2.12%) および CD34 (1.13 ± 1.58%) CD90 の発現レベル中の標準的な文化から差はなかった (33.3 ± 37.1%) と CD105 (54.0 ± 19.0%) 減少し、MHC II (2.84 ± 0.98%) 増加35。
次の単離と UCM MSCsの in vitro解析、調節された細胞の生物学的挙動はラットの両側膝蓋腱欠損モデルの標準的な条件下で培養した細胞を比較しました。各ラットにおける未処理の欠陥は内部統制として提供しています。術後腫れされすべてのラットで最低 48 h 以内に解決。RGS によると、ラットのは軌道強化、鼻/頬部平坦化、または耳/ひげの変更など痛みや苦痛の兆候を表示されません。すべてのラットは、3-4 ペレットの通常の範囲や研究を通して毎日フィードの 15-20 グラムを消費しました。合計機能スコア支援を含む、正常ラットと比較して作動させたラットの 7 日間でスコアを登山し同様に立っている自力で後肢が高かった (n = 8, p < 0.0001、表 3)。ただし、合計機能スコアは、手術後 28 日以内正常に戻りました (n = 12、p = 0.78)。したがって、ラット両側膝蓋腱欠損モデル個体間変動を制限して、重大な合併症 (ビデオ 1-5) を発生させることがなく動物の必要数を減らすに効果的であることが示されています。
28 日に採取した腱の約 37% には、著しく肥厚 (図 7) が登場しました。この肥厚は空および処理の欠陥の間均等に配られました。合計の組織学的スコア増加未処理欠損 (n = 20 p = 0.0034)。7 から 28 日の間増加した軟骨の形成から成っていたとき癒しのスコアの各コンポーネントは個別に評価、時間を変更する唯一のパラメーター (n = 20 p < 0.0001)。血管新生が時間とともに増加する傾向があった (p = 0.3)、コラーゲンの形成の差はなかった (p = 0.69)。病理組織学的検査で炎症は治療の有無にかかわらず、手術後 7 日で検討した腱のティッシュ セクションのすべての観察されました。すべての処理の欠陥に血腫でした。組織の血管新生スコア (表 2 図 9) 0 〜 1、適度な細動脈と毛細血管の浸透、コラーゲン グレード スコア (表 2 図 10) 中 〜 2 から 3、全体的な示唆を示唆広範囲に適度なコラーゲンの形成。軟骨形成スコア 2 軟骨形成腱断面積の 25% から 50% を緩和するための軟骨形成がないことを示す 0 〜 (表 2 図 11)。すべての組織図は、前部の側面として左サイド、内側の腱の中間の部分の横断面としてトップ志向に。
図 1: ラットおよび無菌手術のための準備の位置決め。それぞれのラットは、暖かい水で満たされ、皮膚傷害を防ぎながら体の温度と位置を維持するために布で覆われた 2 つの 0.5 L 水のボトルの間置かれました。テーブルに録音された各ラットの四肢と体がプチプチで覆われていた。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 膝蓋腱欠損症 (の配置) の手術モデル。各リムの欠陥のサイズを標準化するためのテンプレートとして腱に対して 0.99 mm 直径 Kirschner ワイヤを配置します。
図 3: 膝蓋腱欠損 (切開) の手術モデル。2 全層切開 Kirschner 線の各側に腱の中央部分を分離します。
図 4: 膝蓋腱欠損 (切除) 手術モデル。中央部は切除位置の近位および遠位、Kirschner ワイヤーのサイズに一致する欠陥を作成します。切除領域が点線のボックス内に表示されます。
図 5: 運営阻害の術後外観。筋膜は十字パターンで閉鎖され、皮膚が皮のパターンで閉鎖されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6: UCM MSCs の活性調節されたプラズマの準備。幹細胞は、活性化の前にエアコンのプラズマで中断されました。結果血栓は、膝蓋腱欠損部に挿入されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 7:総師範 (C, D) の外観と (A, B) を厚く腱。(A, C)後方ビューがあります。(B、 D)側面眺め。ブロック矢印が脛骨を識別し、薄い矢印が腱を識別します。
図 8: 組織培養上で培養した細胞の形態はプレート下 19% 酸素レベル (標準グループ: A) とキトサン フィルム 5% の下の酸素レベル (エアコン グループ: B).紡錘標準グループ (A) の形をした細胞を分離し、形成エアコン グループ (B) 回転楕円体。スケール バー 400 μ m =この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 9: 代表的な血管新生のグレーディングに使用される顕微鏡の光します。癒しの日の 7 日後 (C, F) エアコンのセルまたは標準のセル (B, E) とのそれらはそれぞれ 0.5 と 0 のグレードを受けたに対し、無治療で腱は 0 (A, D) のグレードを受け取った。28 日、未処理の腱 (G、 J) 受信 0、グレード、エアコン (私、L) セルまたは標準的な細胞を (H,K) それぞれ 0.5、1.0 のスコアを受信したに対し。矢印は、腱のサンプルで現在の血管を識別します。100 倍の倍率で血管を指す矢印は、400 倍の倍率で血管を指す同じ矢印に対応します。通常の腱組織 (M, N)。マッソンのヒアリン染色 (A、B、C、G、H、I、M);ヘマトキシリンとエオシン染色 (D、E、F、J、K、L、N);スケールバー = 100 μ m (A N)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 10: 代表的なコラーゲンのグレーディングに使用される顕微鏡の光します。癒しの日の 7 日後無治療で腱は 3.0 の等級を受け取った治療 (B、C、E、F) とのそれらに対し 2.5 (a, D) の等級を受け取った。28 日、未処理腱 (G、J)、エアコン (I, L) セルまたは 1.0 と 3.0 でのスコアを受信した標準のセル (H, K) のそれぞれに対し、3.0 のグレード受け取った。400 X インセット (H, K) の腱線維の解体がいただければ幸いです。通常の腱組織 (M, N)。マッソンのヒアリン染色 (A、B、C、G、H、I、M);ヘマトキシリンとエオシン染色 (D、E、F、J、K、L、N);スケールバー = 100 μ m (A N)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 11: 代表的な軟骨のグレーディングに使用される顕微鏡の光します。癒しの 7 日は、次のいずれかとのそれらない治療 (A, D)、腱完備 (C, F) セルまたは標準のセル (B, E)、0 の等級を受け取ったすべて。28 日未処理腱 (G, J) は、エアコン (I, L) セルまたは 0 と 2.0 では、受信した標準のセル (H, K) のスコアそれぞれに対し 1.0 のグレードを受け取った。矢印は、軟骨細胞、腱のサンプルで現在を指しています。100 倍の倍率で軟骨細胞を指す矢印は、400 倍の倍率で軟骨細胞を指す同じ矢印に対応します。通常の腱組織 (M, N)。マッソンのヒアリン染色 (A、B、C、G、H、I、M);ヘマトキシリンとエオシン染色 (D、E、F、J、K、L、N);スケールバー = 100 μ m (A N)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
ビデオ 1: ラットの歩行機能評価。自力で後肢に立ってのタイミング (1-5 s: スコア 1) 手術後 4 h が観察されました。してくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード)
ビデオ 2: ラットの歩行機能評価します。アシスト前肢と後肢立ってをタイムアウト (0-5 s: スコア 0) 作動後の 4 h が認められました。してくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード)
ビデオ 3: ラットの歩行機能評価。自力で後肢に立ってのタイミング (1-5 s: スコア 1)、アシスト前肢と後肢立ってをタイムアウト (5-10 s: スコア 1) 作動後の 14 日に認められました。してくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード)
ビデオ 4: ラットの歩行機能評価します。アシスト前肢と後肢立ってをタイミング (10-15 s: スコア 2)、17 cm プラスチック製ケージの壁を登る能力なし (ない登山: スコア 0) 作動後の 27 日が認められました。してくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード)
ビデオ 5: ラットの歩行機能評価します。アシスト前肢と後肢立ってをタイムアウト (5-10 s: スコア 1)、17 cm プラスチック製ケージの壁を登る能力を持つ (はい: スコア 1) 作動後の 14 日に認められました。してくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード)
| 機能テスト | 0 | 1 | 2 | 3 | スコア |
| 後肢スタンド アシスト | 0-5 s | > 5-10 s | > 10-15 s | > 15 s | |
| 自力で後肢スタンド | 0-1 s | > 1-5 s | > 5 s | ||
| 登坂力 | 違います | うん | |||
| 合計 |
表 1: ラットの歩行機能を評価するシステムを得点。スコアリング システム (0-6) は、自力で後肢に立って (0-2) と (0-1) 17 cm プラスチック製ケージ壁を登る能力をタイミング (0-3) サポート前肢と後肢の時間立っているを含む 3 の活動に基づく歩行の関数を評価するため開発されました。
| コラーゲン グレード | |||||
| 0 | 通常のコラーゲンを接線方向に指向 | ||||
| 1 | 軽度な解体 25% 未満のコラーゲン線維 | ||||
| 2 | 25% と 50% 間のコラーゲン線維の適度な変更解体 | ||||
| 3 | コラーゲン解体 50% 以上の変化が著明 | ||||
| 血管新生の程度 | |||||
| 0 | 細動脈組織の中程度の浸透 | ||||
| 1 | 毛細血管の存在 | ||||
| 2 | なし血管浸潤 | ||||
| 軟骨形成 | |||||
| 0 | ない軟骨形成 | ||||
| 1 | 孤立した硝子軟骨結節 | ||||
| 2 | 適度な軟骨形成 25 ~ 50% | ||||
| 3 | 豊富な軟骨組織の形成、関連するフィールドの 50% 以上 | ||||
表 2:組織学の成績を得点します。セクションの組織学的スコア度 (ローゼンバウムらから適応軟骨形成と血管新生、コラーゲン グレードに基づいて等級別になった39)
| グループ | ± SEM を意味します。 |
| ノーマル (n = 3) | 6.00 ± 0.48 |
| 術後後 7 日目 (n = 8) | 2.25 ± 0.30 |
| 術後後 28 日目 (n = 12) | 5.83 ± 0.24 |
テーブル 3:正常ラットと未処理のラットの機能スコア。術後正常ラットと未処理のラットにおける 7 及び 28 日の機能のスコア、傾斜されました。n = ラットの数。
補足図 1: ゲーティング戦略と表面マーカー式の例:破片は、小型の FSC と SSC (A) に基づく除外されました。7 AAD FL3 によって検出の否定的な汚損に基づいて生きているセルが選ばれた (B)。アイソタイプ一致するコントロール (C) は CD44 FITC 陽性細胞 (D) のゲートを作成する否定的な制御として使用されました。
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Discussion
馬のセルは、最終的に馬の自然な伸張の管理の候補者のアプローチをテストしていきますのでこのプロジェクトに選ばれました。確かに、馬の腱損傷は浅指屈筋と人間41アキレス腱の生物学的類似性のため男で寛解の自然なモデルとして訴えています。細胞表面マーカー CD44、CD90, CD105、CD34 と MHC II は、細胞、細胞療法42国際社会によって推薦の基準に従って診療に選ばれました。最近の調査で eqUCM MSCs され、CD44 のために肯定的な培養条件に関係なく CD34 と MHC II の負。CD90 の CD105、表面マーカーの発現の点で MSCs の基準を満たすことにより標準的な条件下で培養した細胞も陽性。さらに、本研究は、eqUCM MSCs は、ヒト MSCs19,20の以前のレポートを確認するキトサン フィルム上培養スフェロイドの形成の最初のレポートです。3 D 細胞培養の技術は何十年も生理学的ニッチに似た環境を作成することを目指して広く検討されています。確かに、今回示したOct4、 Sox2, Nanogと改善された分化の改良された幹細胞性遺伝子発現レベル、潜在的な他レポート19,20に一貫しています。他は改良された免疫調節特性43と硝子軟骨再生44 MSCs 回転楕円体を使用して報告。スピナー フラスコ、回転細胞バイオリアクター、非付着プレートなど様々 な 3次元培養技術、間天然および合成行列、キトサン フィルムはいくつかの理由のため魅力的に見えます。このアプローチは、高価な機器を必要としない、費用対効果と比較されます非付着板に合成行列、キトサン水産業の副産物であるので。キトサン膜の細胞を培養することは技術的に容易です。組み合わせることで、これらの利点は臨床応用をする大規模な45上。
両側膝蓋腱モデルを提案するここで罹患率の面で許容範囲が表示されます。最近の研究では合併症は認められなかった。検出可能な生体力学的・組織学的変更を許可するのに十分な大きさの欠陥によって誘起されるストレスの影響のリスクを特に心配ができました。これらの懸念は、サイズと腱の傷害の前臨床モデルの成熟度に関連する従来研究に基づくこの研究用マウスにラットの選択を求められます。'ウィンドウ欠陥' または中央第三膝蓋腱欠損は、腱の治癒と豊胸を検討するウサギ46とラット30,31に記載されています。組織学31,39, テスト30,31, および前のヴィヴォ蛍光生体ラット腱修復の勉強のため再現性のある膝蓋腱 'ウィンドウの欠陥' モデルが見つかってください。31をイメージングします。この研究では、欠陥のサイズは膝蓋腱の中央 3 分の 1 に相当してテンプレートとして 0.99 mm 直径 Kirschner ワイヤーで標準化されました。これらの寸法は腱治癒手術後の破裂を引き起こすことがなく研究には十分だったラットはマウスと解剖学的より大きいサイズのため怪我・治療・結果の措置の再現性の向上、大規模な欠陥に対応できます。
本研究ではラットに投与鎮痛プロトコルは、RGS37,38の評価と術後疼痛の制御に有効でした。この採点システムは、それは以前ラット37,38の痛みを反映して術後の行動変更の検出として検証されたのでここに下されました。RGS は、軌道強化、鼻・頬が平坦化、耳/ひげの変更などを識別する比較的単純な兆候に基づいています。ラットには、この鎮痛プロトコルの有効性をさらにサポートしていますこの研究を通して通常の食物摂取も維持されます。確かに、以前のレポートは、メロキシカム47などの非ステロイド性抗炎症薬投与の術後の痛みと体重の増減と相関を発見しました。このエージェントは、本研究で選択した、プリエンプティブな管理はラット37,48犬49, に発見されました手術直前に抗炎症剤の投与の研究から派生しました。外科的に誘発される痛みを減衰します。関数は、スコアリング システム両方の骨盤の肢の使用を評価するように設計を使用して術後の疼痛の追加のインジケーターとして評価されました。ここで選択した 3 つの活動は、運動と骨盤の肢の重量を負担する意思の範囲の一般的な評価を提供します。この得点システムはラット50,51で両方の静的および動的な機能回復の研究から派生した、観測機能の成果の経過を比較する設計されました。スコアは、二国間の腱欠陥が通常 28 日以内に戻ると 7 日で機能の一時的な低下を誘発を示します。RGS より整形外科の条件に二次的痛みの検出でより敏感に機能スコアが表示されます。アキレス機能インデックス28など腱の治癒を評価し、足のストライド対策51、または巨視的スコアリング システム52同様の機能テストを使用されています。
このモデルは、未処理の腱と 2 つの幹細胞ベースの治療の成果を区別しながら、研究に登録の動物の数を減らすために設計されました。本研究でテスト治療の効果は、別のパブリケーション36で説明します。ここで使用するモデルは、内部統制を使用して 28 日 (データはここで表示されません)、腱の非破壊力学的テストと組み合わせるそれぞれのラットでの治療の違いの検出を許可しました。
活性調節されたプラズマは、幹細胞、生体適合性、アクセシビリティ、および伸張53,54の管理における現在の臨床応用のためのキャリアとして共通使用するため選ばれました。それ扱われた腱の治癒に貢献している可能性しますが、あります幹細胞のローカル保存を許可し、活性調節されたプラズマのと同じ量が含まれて両方に治療群の比較と干渉しません。未処理の腱の組織学的特徴は、どこ壊死組織と乱れたコラーゲン束外して貧食能および細胞壁溶解酵素によってマクロファージ炎症段階で、腱の治癒の前の記述と一致しているがまで続く 10 日後に損傷54,55,56。増殖の段階で、腱修復57,58から 28 日後に細胞増殖およびサイトの修復の動脈血供給量は最大。標本の低い弾性係数、断面積、腱の明白な肥厚との相関関係を発見しました。これらの結果に基づき、組織学的スコアは望ましくないかもしれない、軟骨、血管新生、コラーゲン線維の解体などの生体力学的強度につながるしない組織の変更を反映するようです。線、細胞外マトリックス組織、プロテオグリカン コンテンツの存在など他の条件を統合することでこのモデルの組織学的特徴に基づく治療を判別能力を向上可能性があります将来的とエラスチン繊維52,59の分布。
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Disclosures
著者はある利益相反を開示します。
Acknowledgments
著者は、データの統計的分析のため博士 Su 博士を認めたいと思います。著者もありがとう博士 McClure、DVM、博士 DACLAM、麻酔に関する彼女のアドバイスと痛み管理プロトコルが研究に使用します。このプロジェクトは、研究 (12678v) および米国農務省セクション 1433 資金 (2090) 副社長の西保健大学理学部学務係からの補助金によって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS 10x | Hyclone | SH30258.01 | Consumable |
| Collagenase type IA | Worthington | LS004197 | Consumable |
| DMEM low glucose | Hyclone | SH30021.FS | Consumable |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30910.03 | Consumable |
| Penicillin/Streptomycin 100x | Hyclone | SV30010 | Consumable |
| Trypsin 0.25% | Hyclone | SH30042.01 | Consumable |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | Consumable |
| Trypan blue | Hyclone | SV30084.01 | Consumable |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma | D2650 | Consumable |
| Chitosan | Sigma | C3646 | Consumable |
| Sodium Hydroxide | Sigma | S8045 | Consumable |
| Bovine Serum Albumin | Hyclone | SH30574.01 | Consumable |
| Round bottom polystyrene tube | Corning | 149591A | Consumable |
| Mouse anti-horse CD44 (FITC) | AbD serotec | MCA1082F | Consumable |
| Mouse anti-rat CD90 (FITC) | AbD serotec | MCA47FT | Consumable |
| Mouse anti-horse MHC-II (FITC) | AbD serotec | MCA1085F | Consumable |
| Mouse IgG1 (FITC) - Isotype Control | AbD serotec | MCA928F | Consumable |
| Mouse monoclonal [SN6] to CD105 (FITC) | abcam | ab11415 | Consumable |
| Mouse IgG1 (FITC) - Isotype Control | abcam | ab91356 | Consumable |
| Mouse anti-human CD34 (FITC) | BD | BDB560942 | Consumable |
| Mouse IdG1 kappa (FITC) | BD | BDB555748 | Consumable |
| 7-AAD | BD | BDB559925 | Consumable |
| BD Accuri C6 Flow Cytometer | BD | Equipment | |
| Vacutainer 5 mL | Med Vet International | RED5.0 | Consumable |
| Acid-citrate-dextrose | Sigma | C3821 | Consumable |
| Calcium Chloride | Sigma | C5670 | Consumable |
| Sevoflurane | JD Medical | 60307-320-25 | Consumable |
| Rats | Charles River | Strain code: 400 | Experimental animal |
| Rat surgical kit | Harvard apparatus | 728942 | Equipment |
| Surgical Blade #15 | MEDLINE | MDS15115 | Consumable |
| Rat MD's Baytril (2 mg/Tablet), Rimadyl (2 mg/Tablet) |
Bio Serv | F06801 | Consumable |
| Polyglactin 910, 5-0 | Ethicon | J436G | Consumable |
| Eosin alchol shandon | Thermo scientific | 6766007 | Consumable |
| Harris Hematoxylin | Thermo scientific | 143907 | Consumable |
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