Summary
Deze paper beschrijft de voorbereiding en de evaluatie van de navelstreng mesenchymale stamcellen matrix afkomstige spheroïden met een bilaterale Patellaire pees defect model in een rat. Dit model werd werd geassocieerd met een aanvaardbaar morbiditeit en gevonden voor het detecteren van de verschillen tussen onbehandelde en behandelde pezen, en tussen de twee behandelingen getest.
Abstract
Regeneratieve geneeskunde biedt nieuwe alternatieven voor voorwaarden die uitdaging van traditionele behandelingen. De prevalentie en de morbiditeit van tendinopathie over soorten, hebben gecombineerd met de beperkte helende eigenschappen van dit weefsel, gevraagd het zoeken naar cellulaire therapieën en aangedreven de ontwikkeling van experimentele modellen om te studeren van hun doeltreffendheid. Mesenchymale stamcellen, navelstreng dik, (UCM-MSC) matrix afkomstige zijn aantrekkelijke kandidaten omdat ze overvloedig, gemakkelijk te verzamelen, omzeilen de ethische bezwaren en het risico van Teratoom formatie, maar lijken op primitieve embryonale stamcellen nauwer dan volwassen weefsel afkomstige MSCs. significante belang heeft zich gericht op chitosan als een strategie ter verbetering van de eigenschappen van MSCs door sferoïde vorming. Dit papier details technieken te isoleren van de UCM-MSCs, spheroïden op chitosan film voor te bereiden en analyseren het effect van sferoïde vorming op oppervlakte marker expressie. Bijgevolg, oprichting van een bilaterale Patellaire pees letsel model bij ratten wordt beschreven voor in vivo implantatie van UCM-MSC spheroïden gevormd op chitosan film. Geen complicatie werd waargenomen in de studie met betrekking tot de morbiditeit, benadrukken stijgende effecten, of weefsel infectie. De totale functionele score van de bediende ratten op 7 dagen was lager dan dat van normale ratten, maar keerde terug naar normale binnen 28 dagen na de operatie. Histologische scores van weefsel-genezende bevestigde de aanwezigheid van een klonter in behandelde gebreken geëvalueerd op 7 dagen, afwezigheid van vreemd lichaam reactie en genezing vordert na 28 dagen. Deze bilaterale patella pees defect model was besturingselementen Inter-individuele variatie via de oprichting van een interne controle in elke rat, aanvaardbaar morbiditeit is gekoppeld en detectie van verschillen tussen onbehandelde pezen en behandelingen toegestaan.
Introduction
Pees letsel is een van de meest voorkomende oorzaken van aanzienlijke pijn en spier atrofie over soorten1. In de diergeneeskunde zijn pees en een ligament letsel speciale belangstelling voor paarden, en 82% van alle blessures bij RAS paarden impliceren het houdings-en bewegingsapparaat, 46% van die van invloed zijn op pezen en ligamenten2,3. Littekenvorming is van invloed op de biomechanische eigenschappen van genezen pezen en verklaart de bewaakte prognose voor terugkeer naar atletische gebruik na flexor pees verwondingen; Re-blessure treedt op binnen 2 jaar in maximaal 67% van de paarden behandeld conservatief4. Regeneratieve geneeskunde biedt nieuwe alternatieven voor een aandoening die traditionele behandelingen daagt. Autologe stamcel therapie heeft enkele bemoedigende resultaten5,6 , maar wordt beperkt door de morbiditeit geassocieerd met weefsel collectie, vertraagde administratie als gevolg van verwerking/herprogrammering van de cellen en de invloed van de gezondheidstoestand van de patiënt (zoals leeftijd) op de eigenschappen van de stam cellen7,8. Deze beperkingen geven een reden voor het onderzoeken van allogene cellen van de stam als alternatief off-the-shelf. Foetale adnexen-afgeleide cellen zijn aantrekkelijke kandidaten omdat ze omzeilen de ethische bezwaren en de kans op vorming van Teratoom embryonale stamcellen is gekoppeld. Onder foetale adnexen is navelstreng matrix (UCM), gelei van Wharton, ook wel genoemd overvloedig en gemakkelijk te verzamelen.
Ongeacht de bron van de cel is versterking van de stemness essentieel voor het opzetten van een cel bank voor allogene regeneratieve geneeskunde. Vanuit een functioneel oogpunt, kan stemness worden gedefinieerd als de mogelijkheden voor zelf-vernieuwing en multi lineage differentiatie9. Bewijs van stemness is afhankelijk van de proliferatie en differentiatie testen, samen met expressie van gene markeringen Nanog, Oct4en Sox2, 9. Een strategie ter verbetering van de stemness is afhankelijk van het gebruik van biomaterialen om te dienen als ongeldig vulstoffen en verbetering van de proliferatie en differentiatie van de UCM-MSCs vervoerders. Deze benadering elimineert bezorgdheid over manipulatie van transcriptionele factoren om te herprogrammeren van volwassen cellen in geïnduceerde pluripotente cellen. Onder biomaterialen beschouwd als potentiële dragers voor stamcellen, is chitosan aantrekkelijk voor de biocompatibiliteit en afbreekbaarheid10. Deze natuurlijke aminopolysaccharide wordt gevormd door de alkalische deacetylation van chitine, de tweede meest voorkomende natuurlijke polysacharide, hoofdzakelijk verkregen als een subproduct van schelpdieren10. We hebben eerder onderzocht van interacties tussen MSCs en chitosan steigers en waargenomen de vorming van spheroïden11,12,13,14,15, 16. we ook gemeld op de superioriteit van chondrogenesis op chitosan matrices12,13,14,15,16,17, 18. Meer recentelijk, twee onafhankelijke studies beschreven spheroïden formatie door vetweefsel en weefsel van de placenta afgeleid MSCs gekweekt op een chitosan film19,20. Deze formatie van spheroïden niet alleen verbeterd stemness, maar ook het behoud van stamcellen na in vivo implantatie20verbeterd.
De prevalentie en de morbiditeit van tendinopathie over soorten hebben gevraagd de ontwikkeling van experimentele modellen bestuderen de pathofysiologie van Tendinopathieën en testen van nieuwe therapieën zoals stamcel injecties. Bij paarden is collagenase-geïnduceerde tendinitis een gemeenschappelijk model aan doelmatigheid met behulp van MSCs in pees reparatie21aan te tonen. De relevantie van deze aanpak is beperkt, zoals injecties veroorzaken acute ontstekingsreactie, overwegende dat klinische Tendinopathieën meestal het gevolg van chronische overspannenheid22,23. Bovendien, chemische inductie van pees ziekte induceert een genezende reactie en het verminderde genezingsproces aanwezig in klinische gevallen22,23niet gerepliceerd. Excisie van een segment van de oppervlakkige digitale flexor pees is bestempeld als een chirurgische model van tendinitis in paarden24. Meer recentelijk, een minimaal invasieve benadering werd gebruikt om de traumatische schade beperken tot de centrale kern van de oppervlakkige digitale flexor pees25. Chirurgische modellen doen niet de vermoeidheid-mechanisme dat kan leiden tot natuurlijke pees ziekte, en de neiging om het gebrek aan reproduceerbaarheid in de omvang van schade gemaakt25simuleren. Ongeacht het model, de morbiditeit en de kosten in verband met paarden modellen van pees zijn ziekten extra beperkingen, die een belang in knaagdier modellen te als een eerste stap voor in vivo evaluatie van nieuwe therapieën rechtvaardigen.
Een van de belangrijkste voordelen van experimentele modellen bij knaagdieren bestaat uit de kosten en de mogelijkheid om controle van Inter individuele variabiliteit. Knaagdieren kunnen worden gestandaardiseerd ten opzichte van verschillende fysiologische factoren als gevolg van hun snelle groei en relatief korte levensduur, beperking van de bronnen van variatie en dus vermindering van het aantal dieren nodig voor de detectie van verschillen. Strategieën voor het opwekken van de pees ziekten bij knaagdieren hebben vertrouwd op chemische inductie, maar ook op chirurgische oprichting van gedeeltelijke pees gebreken21. Chirurgische modellen natuurlijke Tendinopathieën beter dan chemische modellen kunnen simuleren, maar kunnen leiden tot hogere morbiditeit en katastrofisch mislukking van de beschadigde pees. In dat opzicht lijken ratten betere kandidaten dan muizen voor deze modellen, aangezien hun grootte staat toe de verwezenlijking van grotere defecten, teneinde de evaluatie van de genezing van weefsel te vergemakkelijken. Sprague-Dawley ratten zijn gebruikt in experimentele studies van Tendinopathieën in vier belangrijke pees groepen: rotator cuff, musculus flexor, Achilles en patellacomponenten pezen26. Daaronder zijn de modellen waarbij de Patellaire pees vooral aantrekkelijk vanwege de grotere omvang van deze pees en het gemak van toegang tot het27. De Patellaire pees hecht de spier van de quadriceps aan de tibiale radii. Binnen dit mechanisme extensor is de knieschijf een sesambeen die regisseert de actie van de quadriceps en bakent de proximale omvang van de Patellaire pees. De aanwezigheid van bony ankers op de proximale en distale afmetingen van de Patellaire pees vergemakkelijkt biomechanische proeven. Modellen waarbij de Patellaire pees meestal rekenen op eenzijdige chirurgische gebreken, met een contralaterale intact pees een besturingselement28,29bijeenkomen. De meest voorkomende Patellaire pees defect model omvat middendoor van het centrale deel (1 mm in de breedte) van de Patellaire pees van de distale apex van de knieschijf naar het inbrengen van de tibiale radii, terwijl de contralaterale Patellaire pees intact is gelaten. Maatregelen van uitkomsten hebben opgenomen histologie, niet-destructieve biomechanische proefneming of biomechanische testen tot mislukking, echografie imaging ex vivo fluorescentie imaging, bruto observatie en functionele tests28,30 ,31. Unilaterale modellen staan geen vergelijking van een voorgestelde behandeling met conservatieve beheer van een soortgelijke schade binnen hetzelfde dier. Vergelijking tussen verschillende behandelingen vereist ook afzonderlijke dieren. Een bilaterale model zou elimineren tussen afzonderlijke varianten en verminderen van het aantal dieren dat nodig is voor een studie32. Echter bilaterale verwondingen kunnen verhogen morbiditeit en evaluatie van de behandeling kan worden belemmerd door bilaterale kreupelheid. Het gebruik van bilaterale Patellaire pees defecten in ratten maar focus verslag een paar studies kort over de effecten van behandelingen in plaats van peri-operatieve beheer en morbiditeit van de model33,,34.
Doel van deze studie op lange termijn is het ontwikkelen van een strategie ter verbetering van de stemness en in vivo overleving van de UCM-MSCs bestemd voor allogene transplantatie. Om dit te bereiken, hebben we onlangs verbeterde stemness voor UCM-MSCs door vorming van spheroïden gemeld op chitosan film en incubatie onder hypoxische milieu35. Deze eigenschappen in vitro werden geassocieerd met verbeterde biomechanische eigenschappen van Patellaire pees gebreken behandeld met geconditioneerde UCM-MSCs. op basis van deze resultaten, de rat bilaterale Patellaire pees defect model lijkt geschikt voor het testen van de kandidaat-lidstaten behandelingen voor pees verwondingen36. Het doel van de studie gemeld hier is het verschaffen van gedetailleerde protocollen voor isolatie en karakterisatie van UCM-MSCs, voorbereiding van een biologische expresbezorgingssysteem voor stamcellen, creatie en behandeling van bilaterale patella pees gebreken en postoperatieve herstel en evaluatie van weefsel genezing binnen de gebreken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van Western University of Health Sciences.
1. isolatie en uitbreiding van MSCs uit paarden navelstreng Matrix
- De placenta verkrijgen door een volwassen merrie (zwanger) na waargenomen veulenen en aseptisch isoleren de navelstreng van de moederkoek. Houd de navelstreng in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met 1% penicilline-streptomycine (P/S) bij 4 ° C tijdens de overdracht tot verwerking.
- Wassen van de navelstreng tweemaal met kamertemperatuur PBS met 1% P/S in een tube van 50 mL. Sectie de navelstreng in 2-inch lange fragmenten op 150 mm plaat en wastafel in de kamer temperatuur, PBS, met 1% P/S in een tube van 50 mL twee of drie keer, tot het grootste deel van het bloed is gespoeld.
- Snijd de navelstreng lengterichting om schepen bloot te stellen. Schepen, met inbegrip van 2 slagaders en een ader een allantoïs stengel van het koord met behulp van Tang en schaar verwijderen. Navelstreng matrix (gelei van Wharton), die de gelei-achtige matrix omliggende, op een bord van de 150 mm schepen door schrapen met een scalpel, verzamelen en de gelei in fijne stukjes gehakt.
- Plaats Wharton de gelei van 2 – 3 navelstreng fragmenten (ongeveer 12-15 g) in een tube van 50 mL met 15 mL 0,1% (g/v) collagenase type IA oplossing in PBS. Incubeer bij 37 ° C met zacht schudden voor 3-4 h tot het is opgelost.
- Centrifugeer verteerd weefsel bij 300 x g gedurende 15 minuten en supernatant gecombineerd. Resuspendeer weefsel verteerd in kamertemperatuur PBS met 1% 15 mL P/S, Meng door pipetteren Centrifugeer bij 150 x g gedurende 5 min en gecombineerd supernatant (wash). Herhaal wassen tweemaal meer.
- Resuspendeer gewassen cellen in 15 mL kamertemperatuur PBS met 1% P/S, Meng door pipetteren, stam door met 100 µm cel zeef, centrifugeer bij 150 x g gedurende 5 min, en supernatant gecombineerd.
- Bereid kweekmedium (CM) door het mengen van lage glucose Dulbecco bewerkt Eagle's Medium (LG-DMEM) met foetale runderserum (FBS) en 1% P/S. het steriliseren van het medium door filtratie.
- Resuspendeer gespannen cellen in 10 mL CM vooraf opgewarmd tot 37 ° C, Meng door pipetteren, breng in een maatkolf van 25 cm2 weefselkweek en incubeer in 5% CO2 op 90% vochtigheid en 37.0 ° C. Verandering CM om de 3 dagen totdat de cultuur tot 70-80% samenvloeiing, wanneer de cultuur zal worden gepasseerd.
- Om de passage van de cultuur, gecombineerd CM vanaf de kolf tweemaal wassen met 5 mL kamertemperatuur PBS en loskoppelen met 3 mL 0,25% trypsine/ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA) bij 37 ° C gedurende 5 minuten.
- Neutraliseren trypsine/EDTA met 6 mL CM vooraf opgewarmd tot 37.0 ° C, Meng door pipetteren, breng kwantitatief over in een tube van 15 mL, centrifugeer bij 150 x g gedurende 5 min, en supernatant gecombineerd. Resuspendeer vrijstaande cellen in CM 1 mL, Meng door pipetteren. Tellen de levensvatbare cellen met blauwe trypan en hemocytometer. Opnieuw zaad in een maatkolf van 25 cm2 weefselkweek op 5.000 cellen/cm2, en broeden in 5% CO2 op 90% vochtigheid en 37.0 ° C.
2. voorbereiding van de spheroïden met UCM-MSCs gekweekt op Chitosan Films
- Ter voorbereiding van 100 mL 1% (m/v) chitosan oplossing, 1 g chitosan in 99 mL gedestilleerd water (dH2van O) toevoegen en goed mengen met een magneetroerder.
- Voeg 670 µL ijsazijn en blijven mengen totdat chitosan oplost en viskeuze wordt. Dit duurt meestal 3-4 h.
- Voeg 500 µL van chitosan oplossing in elk putje van de plaat 12-well weefselkweek en swirl van de plaat chitosan oplossing gelijkmatig verdelen te dekken alle van het bodem-oppervlak.
- De chitosan oplossing beklede plaat onder laminaire flow kabinet zonder een cover's nachts gedurende 24 uur drogen. Eenmaal gedroogd, zal dunne film worden gevormd en nageleefd plaat.
- Chitosan film te neutraliseren door toevoeging van 1 mL natriumhydroxideoplossing 0,5 N (NaOH) in elk putje en incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur. NaOH van elk putje gecombineerd en wassen elk goed met 1 mL dH2O driemaal. Was nou eenmaal met 1 mL 70% ethanol (EtOH).
- Voeg 1 mL 70% EtOH in elk goed en incubeer te steriliseren chitosan film, 's nachts in laminaire flow kabinet. Gecombineerd resterende EtOH van elk putje in de volgende dag. Wassen elk goed met 1 mL steriele PBS driemaal. Steriliseren chitosan film met ultraviolet licht onder laminaire flow kabinet 's nachts zonder een cover.
- Formulier spheroïden van UCM-MSCs, zaad uitgebreid cellen in elk putje op 5.000 cellen/cm2gepasseerd en incubeer in 5% CO2 op 90% vochtigheid en 37.0 ° C.
Opmerking: Cellen kunnen worden geïncubeerd onder hypoxie of normoxia, afhankelijk van de onderzoeker van belang.
3. weergave van de oppervlakte Markers geanalyseerd via Stroom Cytometry
-
Voorbereiding van een schorsing van één cel
- Standaard plaat
- Medium verwijderen uit elk putje en spoel tweemaal met kamertemperatuur PBS.
- Loskoppelen cellen met 500 µL van een cel dissociatie reagens in elk putje van de plaat van een 12-well voor 5-10 minuten bij kamertemperatuur.
- Na incubatie, voeg 1 ml buffer (PBS met 0,5% BSA) kleuring in elk putje en meng door pipetteren als u wilt loskoppelen van de cellen.
- Pipetteer celsuspensie in conische tube van 15 mL en centrifugeer bij 150 x g gedurende 5 min.
- Chitosan plaat
- Verzamel alle spheroïden door zuigen medium met behulp van een precisiepipet met een 1.000 µL-tip. Verzamelde overbrengingsmedium in een conische buis 15 mL. Na het verzamelen van medium, wassen goed door toevoeging van 1 mL PBS, en breng PBS gewassen in de dezelfde conische tube van 15 mL.
- Centrifugeer spheroïden bij 150 x g gedurende 5 min en bovendrijvende vloeistof verwijderen.
- Voeg 500 µL van het cel dissociatie reagens (bijvoorbeeld, accutase) en incubeer gedurende 5-10 minuten bij kamertemperatuur. Meng pipetting via een tip van 1 mL tot spheroïden distantiëren en niet langer zichtbaar zijn.
- Voeg 1 mL kleuring buffer naar de interne celsuspensie en centrifugeer bij 150 x g gedurende 5 min.
- Standaard plaat
-
Wassen van cellen
- Verwijder de bovendrijvende vloeistof uit de conische buis en resuspendeer de cellen in 3 mL koude kleuring buffer. Cellen op ijs in de hele experiment behoeden voor deze stap.
- Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 min (wassen).
- Twee keer wassen.
-
Kleuring van cellen
- Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 minuten en verwijder de bovendrijvende vloeistof.
- Levensvatbare cellen met behulp van een trypan blauw en hemocytometer tellen. 1 x 106 cellen resuspendeer 50 µL blokkeren buffer (PBS met 10% paard serum) en incubeer gedurende 30 min op ijs.
- Voeg 10 µL fluoresceïne isothiocyanaat (FITC) geconjugeerde antilichamen (CD44, CD90, CD105, CD34, grote histocompatibility complex (MHC) klasse II of isotype controle voor elke antilichaam) en 40 µL van kleuring van buffer, dan Incubeer beschermd tegen licht gedurende 1 uur op het ijs.
- Voeg 3 mL koude kleuring buffer en meng Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 min en gecombineerd supernatant (wassen).
- Herhaal tweemaal wassen.
- Resuspendeer de pellet cel in 0,5 mL buffer kleuring
- Voeg 5 µL van 7-AAD (levensvatbaarheid kleurstof) en incubeer gedurende 30 min op ijs
- Analyseren gebeitst celsteekproeven door stroom cytometer. Uitsluiten van puin door hun kleinere WS en FSC en levensvatbare cellen identificeren met lagere opname van 7-AAD. Plot FL1 en FL2 op de y - en x-assen, respectievelijk. Isotype besturingselement gebruiken maken van een poort boven de diagonale lijn. Meet het percentage positief gekleurde cellen in het gebied. Tellen minstens 20.000 evenementen/monster (aanvullende figuur 1).
- Meet het percentage cellen door gating levensvatbare cellen en auto-fluorescentie met antilichamen gekleurd en aftrekken percentage cellen gekleurd met isotype controle.
4. bilaterale Patellaire pees Defect Model bij de Rat
- Selecteer Sprague-Dawley ratten (volwassen mannelijke, 4 – 5 maanden oud, lichaamsgewicht 350 – 375 g). Opmerking de relatief grote omvang van de ratten gebruikt voor dit model.
- Anesthetize en kunstmatige oog smeermiddel de rat met 8% Sevofluraan in 2 L/min 100% zuurstof geleverd via masker, tot verdwijning van de snuifje-teen reflex in de zaal van de inductie van toepassing.
- Een intramusculaire injectie van Meloxicam (1 mg/kg) als preventieve analgesie beheren.
- Plaats de rat tussen twee flessen van 0,5 L water gevuld met warm water en bedekt met een doek om te handhaven lichaamstemperatuur en positie, terwijl het voorkomen van letsel van de huid. Tape elke extremiteit aan de tabel. Om het risico van onderkoeling, betrekking hebben op het lichaam met noppenfolie (Figuur 1).
- Handhaven van anesthesie met continue stroom van 5% Sevofluraan in 1 L 100% zuurstof mengsel via neus kegel, met het dier op dorsale lighouding op pad het verwarmen van water.
- Om te voorkomen dat de huid trauma, de chirurgische sites niet te knippen. In plaats daarvan toepassen hair remover crème over beide verstikt. Gebruik een tong depressor te verwijderen van de crème en de haren.
- De chirurgische site met chloorhexidine digluconate scrub te schrobben en spoel met 70% ethanol 3 keer.
- Incise de huid met een steriel scalpel #15 mes in een proximaal naar DISTAAL richting, op het craniomedial aspect van het verstikken. Start de incisie ongeveer 1 cm proximaal naar het niveau van de knieschijf en breiden het distale aan de tibiale tuberculum van ongeveer 5 mm.
- Weerspiegelen de huid om de Patellaire pees door het vrijmaken van de onderliggende subcutane weefsel met een mes #15 scalpel bloot te stellen.
-
Met behulp van het #15 scalpel blad, accijnzen de centrale derde van elke Patellaire pees (1 mm) van het distale aspect van de knieschijf naar de tibiale radii.
- Hiermee lijnt u een 0.99 mm-diameter Kirschner draad tegen de pees als een sjabloon op de standaardisering van de omvang van het defect in elke ledemaat (Figuur 2).
- Maak 2 full-dikte insnijdingen aan weerskanten van de Kirschner draad met een #15 scalpel mes te isoleren van het centrale deel van de pees (Figuur 3). Resect proximally en distally het middenstuk met fijne Iris schaar (Figuur 4).
- Alvorens te sluiten de fascia van het verstikken, invoegen de klonter (gemengde celsuspensie en ACS) voor de juiste behandeling groepen zoals beschreven in 5.5. Sluit de fascia met een cruciate patroon en huid met een intradermale patroon met 5-0 polyglactin 910 hechtingen (Figuur 5).
- Herhaal de procedure voor de contralaterale verstikken.
Opmerking: Één defect is willekeurig toegewezen aan een behandeling (stamcellen geconditioneerd op chitosan of gekweekt op standaard platen). Het contralaterale defect is leeg, om te dienen als interne controle. - Na de operatie, het beheren van 4 tabletten van enrofloxacin (2 mg/tablet, mondeling, eenmaal per dag) en een tablet van meloxicam (2 mg/tablet, oraal, eenmaal per dag) gedurende 7 dagen. Deze doses werden door een laboratorium dierlijke dierenarts aanbevolen en goedgekeurd in het IACUC-protocol.
5. levering van MSCs binnen de Patellaire pees Defect
- Anesthetize een gezond rat die niet voor Patellaire pees defect creatie met 8% Sevofluraan in 2 L/min 100% zuurstof geleverd via masker, tot verdwijning van snuifje-teen reflex in de zaal van inductie gebruikt wordt.
- Verzamelen 5 mL bloed door cardiale punctie van narcose Sprague-Dawley ratten (volwassen mannelijke, 4 – 5 maanden oud, lichaamsgewicht 350 – 375 g), in een 5 mL injectiespuit met een naald van 20 G met 1 mL van zuur-citraat-dextrose (5:1 v/v).
- De rat euthanaseren na cardiale punctie en bloedinzameling, door intracardial injectie van pentobarbital (100 mg/kg), terwijl onder de dezelfde verdoving.
- Centrifugeer het monster bij 350 x g gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Breng supernatant en bewaren (elke 120 µL) aliquots bij-20 ° C tot gebruik.
- Onmiddellijk voordat in vivo implantatie, de bovenstaande hoeveelheid ontdooien en mix 20 µL met 0,5 x 106 MSCs (van 1,9 of 3.1.2.1) los van de standaard platen met behulp van trypsine/EDTA of verzamelen van chitosan platen door te spoelen (met PBS/medium).
- 6 µL van 10% calcium chloride (CaCl2) toevoegen aan de resterende 100 µL van ontdooide plasma in een put van 96-wells-plaat om te activeren het plasma en vorming van een klonter induceren (geconditioneerde plasma geactiveerd: ACS).
- Meng celsuspensie (20 µL) en ACS-landen (100 µL) vormen een klonter (Figuur 6). Plaats de klonter binnen het defect van de Patellaire pees gemaakt vóór het sluiten van de fascia van het verstikken (zie stap 4.10.3).
6. functionele uitkomst
- Volgen ratten twee keer per dag op tekenen van pijn, gebaseerd op de rat grimas schaal (RGS)37,38 en zwelling over de implantatie-sites.
Opmerking: Een scoresysteem (0-6) werd ontwikkeld om ambulante functie op basis van 3 activiteiten, met inbegrip van getimede hind-limb staande met de voorpoten ondersteund (0-3) wordt geëvalueerd, getimede zonder hulp hind-limb staande (0-2), en de mogelijkheid om te klimmen van een (17 cm kunststof kooi muur (0-1) Tabel 1). - Ratten voor de twee hind-limb staande activiteiten evalueren in de ochtend en in de avond van elk punt van de tijd voor het berekenen van een gemiddelde score.
- Evalueren van ratten voor de mogelijkheid om met succes het beklimmen van een muur van 17 cm kunststof kooi met beide hind ledematen bereiken van de top.
7. Bruto uiterlijk en histopathologisch onderzoek van de Patellaire pees
- Euthanaseren van ratten op 7 dagen (om te evalueren ontsteking) of 28 dagen (om te evalueren weefsel genezing) post behandeling door intracardial injectie van pentobarbital (100 mg/kg) onder verdoving met 8% Sevofluraan en 2 L 100% zuurstof via masker geleverd.
- Oogst patella-pees-tibia radii eenheden door scalpel en schaar na euthanasie. Zacht weefsel en de ligamenten rond de verstikken, met uitzondering van de Patellaire pees verwijderen.
- Het onderzoeken van elk monster voor bruto uiterlijk en verdikking van de pees (Figuur 7).
- Oriënteren het model door het plaatsen van een chirurg de knoop van de 5.0 Polydioxanone op het proximale en laterale aspect van de pees. Repareren van elk specimen in 10% neutraal gebufferde formaline-oplossing en transversale secties (5 µm) te verkrijgen van het midden gedeelte van elke pees.
- Vlek van de secties met haematoxyline en eosine en Masson van Trichrome kleuring na standaardprotocollen.
- Sectie voor het detecteren van de aanwezigheid van hematoom binnen het defect, evenals de pathologische veranderingen zoals ontsteking te onderzoeken.
- Evalueren de histologische scoren van secties met behulp van de eerder gepubliceerde noterend systeem, op basis van collageen rang, mate van angiogenese en kraakbeen vorming (tabel 2)39.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In de huidige studie, zijn de resultaten gepresenteerd zoals bedoel ± SD (standaarddeviatie). Cellen werden geïsoleerd uit de navelstreng koorden van 6 merries en percentage van geïsoleerde cellijnen uiting van iedere markeerdraad cel oppervlakte onder standaard of chitosan conditionering werden vergeleken met een test van Friedman, als een niet-parametrische variantie-analyse met herhaling maatregelen. Voor de pees defect model creatie, 8 ratten werden gebruikt voor 7 dagen na chirurgie beoordeling en 12 ratten werden gebruikt voor de beoordeling van de 28 dagen. Resultaten van functionele uitkomsten zoals bedoel ± SEM (standaardfout van het gemiddelde) worden gepresenteerd en vergeleken met behulp van de t-test. UCM werd geselecteerd als een cellulaire bron vanwege haar overvloed, gebruiksgemak collectie en superieure proliferatie ten opzichte van andere foetale adnexen bronnen40. Cellen van UCM gekweekt op standaard platen geïsoleerd onderhouden een fibroblast-achtige vorm in de uitbreiding. Cellen gevormd spheroïden wanneer gekweekt op chitosan plaat (Figuur 8).
De meerderheid van de cellen gekweekt onder standaardomstandigheden uitgedrukt CD44 (98,6 ± 1,62%), CD90 (88.7 ± 3.04%), en CD105 (77,9 ± 6.84%), terwijl de expressie van CD34 (0.07 ± 0,17%) en MHC II (1,33 ± 1,12%) waren zeer laag. Onder geconditioneerde cultuur, de niveaus van de expressie van CD44 (97.0 ± 2.12%) en CD34 (1.13 ± 1,58%) niet afwijken van de standaard culturen, terwijl expressie niveaus van CD90 (33.3 ± 37.1%) en CD105 (54.0 ± 19,0%) daalde en MHC II (2,84 ± 0,98 procent) toegenomen35.
Na isolatie en karakterisatie van UCM-MSCs in vitro, was de biologische werking van geconditioneerde cellen vergeleken met die van cellen gekweekt onder normale omstandigheden in een bilaterale Patellaire pees defect model bij ratten. Onbehandelde gebreken in elke rat diende als interne controles. Postoperatieve zwelling was minimaal in alle ratten en opgelost binnen 48u. Volgens de RGS weergeven geen van de ratten tekenen van pijn of leed zoals orbital aanscherping, neus/Wang afvlakking of oor/friemeltje wijzigingen. Alle ratten verbruikt een normale bereik van 3 – 4 pellets of 15 – 20 gram van diervoeders dagelijks gedurende de studie. De totale functionele score, met inbegrip van bijgestaan en zonder hulp hind-limb permanent, evenals het beklimmen van de scores was hoger in normale ratten vergeleken met dat van bediende ratten op 7 dagen (n = 8, p < 0.0001, tabel 3). Echter de functionele totaalscore keerde terug naar normaal binnen 28 dagen na de operatie (n = 12, p = 0.78). Rat bilaterale Patellaire pees defect modellen zijn daarom aangetoond effectief voor inter-individuele variatie te beperken en het terugdringen van het benodigde aantal dieren zonder significante morbiditeit (Video 1-5).
Ongeveer 37% van de pezen verzameld na 28 dagen verscheen sterk verdikt (Figuur 7). Deze verdikking was gelijkmatig verdeeld tussen leeg en behandelde gebreken. Histologische totaalscores verhoogd met tijd in onbehandelde gebreken (n = 20, p = 0.0034). Wanneer elk onderdeel van de helende score werd beoordeeld onafhankelijk van elkaar, de enige parameter wijzigen met tijd bestond uit kraakbeen formatie, die tussen 7 en 28 dagen toegenomen (n = 20, p < 0.0001). Angiogenese neiging om te verhogen met de tijd (p = 0,3), maar de vorming van collageen niet van elkaar verschillen (p = 0,69). Bij histopathologisch onderzoek, werd ontsteking waargenomen in aller de pezen weefselsecties onderzocht op 7 dagen na de operatie, ongeacht de aanwezigheid van behandeling. Een hematoom was aanwezig in alle behandelde gebreken. Histologische angiogenese scores (tabel 2, Figuur 9) varieerde van 0 tot 1, suggereren gematigde arteriole en capillaire infiltratie, terwijl collageen rang (tabel 2, Figuur 10 scoort) varieerde van 2 tot 3 overall, suggereren matige tot uitgebreide collageen vorming. Kraakbeen vorming scores (tabel 2, Figuur 11) varieerde van 0 tot 2 suggereren geen vorming van kraakbeen, om te matigen kraakbeen vorming van 25% tot 50% van de pees sectie gebied. Alle histologische cijfers zijn gericht met de linker zijde als de anterior aspect, en de bovenkant als de mediale aspect van het transversale gedeelte van het midden gedeelte van de pees.
Figuur 1: positionering van ratten en voorbereiding voor aseptische chirurgie. Elke rat werd geplaatst tussen twee 0.5 L water flessen gevuld met warm water en bedekt met een doek om te handhaven lichaamstemperatuur en positie, terwijl het voorkomen van letsel van de huid. De uiteinden van elk rat werden geplakt is aan de tabel en zijn lichaam was bedekt met noppenfolie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: chirurgische model Patellaire pees gebrek (uitlijning). Een 0.99 mm-diameter Kirschner draad wordt uitgelijnd tegen de pees als een sjabloon op de standaardisering van de omvang van het defect in elke ledemaat.
Figuur 3: chirurgische model Patellaire pees gebrek (incisies). Twee full-dikte incisies worden gemaakt aan iedere kant van de draad Kirschner te isoleren een centrale deel van de pees.
Figuur 4: chirurgische model Patellaire pees gebrek (resectie). Het middenstuk is gereseceerd proximally en distally, maken een defect overeenkomen met de grootte van de Kirschner draad. Gereseceerd gebied wordt binnen de stippellijn vak weergegeven.
Figuur 5: postoperatieve uiterlijk van bediende kniegewrichten. Fascia werd afgesloten met een cruciate patroon en huid werd afgesloten met een intradermale patroon. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6: voorbereiding van geactiveerde geconditioneerde plasma voor levering van UCM-MSCs. Stamcellen werden opgeschort in geconditioneerde plasma vóór activering. De resulterende clot was Patellaire pees gebreken ingevoegd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 7: Bruto uiterlijk van normale (C, D) en (A, B) verdikt pezen. (A, C) Posterieure opvattingen; (B, D) Laterale opvattingen; Blokpijlen identificeren het scheenbeen en dunne pijlen identificeren de pezen.
Figuur 8: morfologie van cellen gekweekt op weefselkweek plaat onder 19% zuurstofniveau (standaard groep: A) en chitosan film onder 5% zuurstofniveau (geconditioneerde groep: B). geïsoleerde cellen werden spindel vormige op standaard groep (A) en gevormd spheroïden op geconditioneerde groep (B). Schaal bar = 400 µm Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 9: vertegenwoordiger licht microfoto gebruikt voor het sorteren van de angiogenese. Na 7 dagen van genezing, ontving pezen met geen behandeling een graad van 0 (A, D), overwegende dat degenen met geconditioneerde cellen (C, F) of standaard cellen (B, E) een graad van 0,5 en 0, respectievelijk ontvangen. Na 28 dagen ontving onbehandelde pezen (G, J) een graad van 0, overwegende dat degenen met cellen (ik,L geconditioneerde) of standaard cellen (H,K) scores van 1.0 en 0,5, respectievelijk ontvangen. De pijlen identificeren bloedvaten aanwezig in het monster van de pees. De pijlen die wijzen naar de bloedvaten in 100 X vergroting komen overeen met de dezelfde pijlen die wijzen naar de bloedvaten in de 400 x vergroting. Normale pees weefsel (M, N). Masson van trichrome vlek (A, B, C, G, H, I, M); De Haematoxyline en eosine vlek (D, E, F, J, K, L, N); Schaal bar = 100 µm (A-N). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 10: vertegenwoordiger licht microfoto gebruikt voor het sorteren van de collageen. Na 7 dagen van genezing ontving pezen met geen behandeling een graad van 2.5 (A, D) Overwegende dat degenen met behandeling (B, C, E, F) een graad van 3.0 ontvangen. Na 28 dagen ontving onbehandelde pezen (G, J) een graad van 3.0, overwegende dat degenen met cellen (I, L) of standaard cellen (H, K) ontvangen scores van 1.0 en 3.0, respectievelijk geconditioneerde. De desorganisatie van de vezels van de pees kan worden gewaardeerd in 400 X inzetstukken (H, K). Normale pees weefsel (M, N). Masson van trichrome vlek (A, B, C, G, H, I, M); De Haematoxyline en eosine vlek (D, E, F, J, K, L, N); Schaal bar = 100 µm (A-N). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 11: vertegenwoordiger licht microfoto gebruikt voor het sorteren van kraakbeen. Na 7 dagen van genezing, pezen met geen behandeling (A, D), die met een geconditioneerde cellen (C, F) of standaard cellen (B, E), alle ontving een graad van 0. Na 28 dagen ontving onbehandelde pezen (G, J) een graad van 1.0, overwegende dat degenen met cellen (I, L) of standaard cellen (H, K) ontvangen scores van 0 en 2.0, respectievelijk geconditioneerde. De pijlen wijzen op chondrocyten aanwezig in het monster van de pees. De pijlen die wijzen naar de chondrocyten in 100 X vergroting komen overeen met de dezelfde pijlen die wijzen naar de chondrocyten bij de 400 X vergroting. Normale pees weefsel (M, N). Masson van trichrome vlek (A, B, C, G, H, I, M); De Haematoxyline en eosine vlek (D, E, F, J, K, L, N); Schaal bar = 100 µm (A-N). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Video 1: evaluatie van ambulante functie bij ratten. Getimede zonder hulp hind-limb staande (1 – 5 s: score 1) 4 h post-operatively werd waargenomen. Gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Video 2: evaluatie van ambulante functie bij ratten. Hind-limb staande getimed met voorpoten bijgestaan (0 – 5 s: score 0) geconstateerd 4 h post operatief. Gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Video 3: evaluatie van ambulante functie bij ratten. Getimede zonder hulp hind-limb staande (1 – 5 s: score 1), hind-limb staande getimed met voorpoten bijgestaan (5 – 10 s: score 1) geconstateerd 14 dagen post operatief. Gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Video 4: evaluatie van ambulante functie bij ratten. Hind-limb staande getimed met voorpoten bijgestaan (10 – 15 s: score 2), zonder de mogelijkheid om te klimmen van een 17 cm kunststof kooi muur (geen klimmen: score 0) 27 dagen post operatief werd opgemerkt. Gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Video 5: evaluatie van ambulante functie bij ratten. Hind-limb staande getimed met voorpoten bijgestaan (5 – 10 s: score 1), met de mogelijkheid om het beklimmen van een muur van 17 cm kunststof kooi (ja: score 1) geconstateerd 14 dagen post operatief. Gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
| Functionele Test | 0 | 1 | 2 | 3 | Score |
| Hind-limb staan geassisteerde | 0 – 5 s | > 5 – 10 s | > 10 – 15 s | > 15 s | |
| Hind-limb staan zonder hulp | 0 – 1 s | > 1 – 5 s | > 5 s | ||
| Klimvermogen | No | Ja | |||
| Totaal |
Tabel 1: Scoring systeem om te evalueren van ambulante functie bij ratten. Een scoresysteem (0-6) werd ontwikkeld om ambulante functie op basis van 3 activiteiten inclusief getimede hind-limb positie met de voorpoten ondersteund (0 – 3) wordt geëvalueerd, getimede zonder hulp hind-limb staande (0-2), en de mogelijkheid om te klimmen van een 17 cm kunststof kooi muur (0-1).
| Collageen rang | |||||
| 0 | Normale collageen georiënteerde tangentieel | ||||
| 1 | Milde veranderingen met collageenvezels, minder dan 25% ongeorganiseerd | ||||
| 2 | Matige veranderingen met collageenvezels tussen 25% en 50% ongeorganiseerd | ||||
| 3 | Gemarkeerde wijzigingen met meer dan 50% ongeorganiseerd collageen | ||||
| Mate van angiogenese | |||||
| 0 | Matige infiltratie van weefsel met arteriolen | ||||
| 1 | Aanwezigheid van haarvaten | ||||
| 2 | Geen therapieën infiltratie | ||||
| Vorming van kraakbeen | |||||
| 0 | Geen vorming van kraakbeen | ||||
| 1 | Geïsoleerde hyalien kraakbeen knobbeltjes | ||||
| 2 | Matige kraakbeen vorming van 25% tot 50% | ||||
| 3 | Uitgebreide kraakbeen vorming, meer dan 50% van het betrokken gebied | ||||
Tabel 2: Histologie scoren rangen. Histologische score van secties zijn ingedeeld op basis van collageen rang, mate van angiogenese en kraakbeen vorming (aangepast uit Rosenbaum et al. 39)
| Groep | Bedoel ± SEM |
| Normaal (n = 3) | 6.00 ± 0,48 |
| 7 dagen na de operatie (n = 8) | 2,25 ± 0,30 |
| 28 dagen na de operatie (n = 12) | 5.83 ± 0,24 |
Tabel 3: Functionele scores van normale ratten en onbehandelde ratten. Functionele scores van normale ratten en onbehandelde ratten 7 en 28 dagen werden postoperatief ingedeeld. n = aantal ratten.
Aanvullende figuur 1: Gating strategie en voorbeeld van oppervlakte marker expressie: Puin werd uitgesloten op basis van kleine FSC en SSC (A). Levende cellen werden geselecteerd op basis van negatieve kleuring met 7-AAD gedetecteerd door FL3 (B). Isotype gecompenseerde controle (C) werd gebruikt als negatieve controle voor het maken van een poort van CD44-FITC positieve cellen (D).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Paarden cellen werden geselecteerd voor dit project, omdat we uiteindelijk willen beproeven van kandidaat-benaderingen in het beheer van de natuurlijke Tendinopathieën in paarden. Inderdaad, pees blessures bij paarden zijn aantrekkelijk als natuurlijke modellen van tendinopathie in de mens vanwege de biologische gelijkenis tussen de paarden oppervlakkige digitale flexor en achillespees in mens41. De cel oppervlakte markers CD44, CD90, CD105, CD34 en MHC II werden geselecteerd voor immunophenotyping van cellen, overeenkomstig de criteria die zijn aanbevolen door de International Society for cellulaire therapie42. In een recente studie waren eqUCM-MSCs positief voor CD44 en negatief voor de CD34 en MHC II, ongeacht de cultuuromstandigheden. Cellen gekweekt onder standaardomstandigheden waren ook positief voor de CD90 en CD105, daardoor voldoen aan de criteria voor MSCs op het gebied van expressie van oppervlakte markers. Bovendien, is deze studie het eerste verslag over de vorming van spheroïden bij eqUCM-MSCs worden gekweekt op chitosan film, bevestiging van eerdere verslagen over menselijke MSCs19,20. 3D cel cultuur technieken hebben decennialang gericht op het creëren van een omgeving die lijkt op de fysiologische niche uitgebreid onderzocht. Inderdaad, deze studie toonde verbeterde stemness gen expressie niveaus van Oct4, Sox2, en Nanog, en verbeterde differentiatie potentiële, dieovereenkomt met andere verslagen19,20. Anderen rapporteerden verbeterde immunomodulerende eigenschappen43 en hyalien kraakbeen regeneratie44 met behulp van MSCs spheroïden. Onder diverse 3D cultuur technieken zoals spinner kolven, roterende cel bioreactoren, niet-aanhanger plate lijken natuurlijke en synthetische matrices, chitosan films aantrekkelijk om verschillende redenen. Deze aanpak vereist geen dure apparatuur en kosteneffectieve vergeleken met niet-aanhanger platen met synthetische matrices, omdat de chitosan is een bijproduct van de visserijsector. Kweken van cellen op chitosan films is technisch eenvoudig. Gecombineerd, zou deze voordelen op een grote schaal45klinische toepassing toestaan.
De bilaterale Patellaire pees model voorgesteld hier lijkt aanvaardbaar in termen van morbiditeit. Geen complicatie werd waargenomen in een recente studie van de studie. We waren met name bezorgd over het risico van stressvolle effecten veroorzaakt door gebreken groot genoeg om waarneembare biomechanische en histologische wijzigingen toestaan. Deze zorgen gevraagd of u de selectie van ratten over muizen voor deze studie op basis van eerdere studies met betrekking tot de grootte en de rijpheid van de pees voor preklinische letsel modellen. Een 'venster defect' of centrale-derde Patellaire pees defect is beschreven in konijnen46 en ratten30,31 te studeren pees genezing en vergroting. De Patellaire pees 'venster defect' model is gebleken voor het bestuderen van de pees reparatie bij ratten met histologie31,39, biomechanische testen30,31, en ex vivo fluorescentie reproduceerbaar Imaging31. In deze studie, de grootte van het defect was gelijk aan het centrale deel van de Patellaire pees, en werd gestandaardiseerd met een 0.99 mm-diameter Kirschner draad als een sjabloon. Deze dimensies waren voldoende om te studeren pees genezing zonder postoperatieve breuk. Vanwege hun anatomische groter ten opzichte van muizen, ratten zijn geschikt voor grotere gebreken, verbetering van de reproduceerbaarheid van letsel, behandeling levering en maatregelen van resultaat.
Het protocol van de analgesie toegediend aan de ratten in deze studie was effectief bij de bestrijding van post-operatieve pijn, zoals beoordeeld met de RGS37,38. Deze scoresysteem werd hier geselecteerd omdat het werd eerder gevalideerd als het opsporen van post-operatieve gedragsveranderingen als gevolg van pijn in ratten37,38. De RGS is gebaseerd op de borden relatief eenvoudig te herkennen, zoals orbital aanscherping, neus/Wang afvlakken en oor/friemeltje wijzigingen. Ratten onderhouden ook een normale voedselinname tijdens deze studie, die verder de werkzaamheid van dit protocol analgesie ondersteunt. Inderdaad, eerdere verslagen hebben gevonden een correlatie tussen de post-operatieve pijn en veranderingen in het lichaamsgewicht bij ratten met niet-steroïdale ontstekingsremmers, zoals meloxicam47behandeld. Deze agent was geselecteerd in deze studie en preëmptieve administratie is afkomstig uit studies bij ratten37,48 en honden49, waar de administratie van de anti-inflammatoire stoffen onmiddellijk voorafgaand aan de operatie is bevonden operatief geïnduceerde pijn verzachten. Functie werd beoordeeld als een aanvullende indicator van post-operatieve pijn, met behulp van een noterend systeem, ontworpen om het gebruik van beide bekken ledematen te evalueren. De drie activiteiten hier geselecteerd bieden een algemene evaluatie van het bereik van de beweging en de bereidheid om te dragen gewicht op het bekken ledematen. Deze scoresysteem werd afgeleid van beide studies van de statische en dynamische functionele herstel in ratten50,51 en was bedoeld om het vergelijken van het tijdsverloop van de functionele resultaten waargenomen. Scores geven aan dat de bilaterale pees defect veroorzaakt door een tijdelijke afname van de functie op 7 dagen, met een terugkeer naar normale binnen 28 dagen. De functie score verschijnt gevoeliger voor het opsporen van pijn secundaire orthopedische voorwaarden dan de RGS. Soortgelijke functionele tests hebben zijn gebruikt om te evalueren pees genezing zoals de Achilles functionele Index28, paw stride maatregelen51, of andere macroscopische scoren systemen52.
Dit model is ontworpen voor het verminderen van het aantal dieren ingeschreven in de studie, terwijl de resultaten tussen de onbehandelde pezen en twee stamcel gebaseerde behandelingen te differentiëren. De effecten van de behandelingen getest in deze studie worden besproken in een andere publicatie36. Het model gebruikt hier toegestaan detectie van verschillen in behandeling door het gebruik van een interne controle, in elke rat, gecombineerd met de niet-destructieve biomechanische testen van pezen na 28 dagen (niet hier gepresenteerde gegevens).
Geactiveerde geconditioneerde plasma werd gekozen vanwege haar vaak gebruikt als drager voor stamcellen, biocompatibiliteit, toegankelijkheid en huidige klinische toepassingen in het beheer van Tendinopathieën53,54. Het kan hebben bijgedragen aan de genezing van behandelde pezen, maar toegestaan lokale retentie van stamcellen, en het niet interfereert met de vergelijking van behandelgroepen, aangezien zowel de dezelfde hoeveelheid geactiveerde geconditioneerde plasma opgenomen. De histologische kenmerken van onbehandelde pezen zijn in overeenstemming met eerdere beschrijvingen van pees genezing, waar necrotisch weefsel en verstoorde collageen bundels zijn verwijderd door fagocytose en lytische enzymen door macrofagen tijdens de fase van de ontsteking, die duurt maximaal 10 dagen post letsel54,55,56. Tijdens de proliferatieve fase is cellulaire proliferatie en vasculariteit van de reparatie-site het grootst bij 28 dagen na pees repareren57,-58. We vonden een correlatie tussen de schijnbare verdikking van pezen, transversale gebieden en lagere elasticiteitsmodulus van specimens. Op basis van deze resultaten, lijkt de histologische score aan de wijzigingen die niet wenselijk kan zijn en niet leiden tot biomechanische kracht, zoals desorganisatie van collageenvezels, angiogenese en chondrogenesis weefsel. In de toekomst, het vermogen om van dit model te discrimineren behandelingen gebaseerd op histologische kenmerken kan worden verbeterd door de integratie van aanvullende criteria zoals de aanwezigheid van tenocytes, organisatie van de extracellulaire matrix, Proteoglycaan content, en distributie van elastine vezels52,59.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen conflict van belang om te vermelden.
Acknowledgments
De auteurs wil erkennen van Dr. Su, PhD, voor haar statistische analyse van de gegevens. De auteurs Dr. McClure, DVM, PhD DACLAM, ook bedanken voor haar advies over de narcose en pijn beheerprotocollen gebruikt in de studie. Dit project werd ondersteund door subsidies van Western University of Health Sciences Bureau van de ondervoorzitter voor onderzoek (12678v) en de USDA sectie 1433 fondsen (2090).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS 10x | Hyclone | SH30258.01 | Consumable |
| Collagenase type IA | Worthington | LS004197 | Consumable |
| DMEM low glucose | Hyclone | SH30021.FS | Consumable |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30910.03 | Consumable |
| Penicillin/Streptomycin 100x | Hyclone | SV30010 | Consumable |
| Trypsin 0.25% | Hyclone | SH30042.01 | Consumable |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | Consumable |
| Trypan blue | Hyclone | SV30084.01 | Consumable |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma | D2650 | Consumable |
| Chitosan | Sigma | C3646 | Consumable |
| Sodium Hydroxide | Sigma | S8045 | Consumable |
| Bovine Serum Albumin | Hyclone | SH30574.01 | Consumable |
| Round bottom polystyrene tube | Corning | 149591A | Consumable |
| Mouse anti-horse CD44 (FITC) | AbD serotec | MCA1082F | Consumable |
| Mouse anti-rat CD90 (FITC) | AbD serotec | MCA47FT | Consumable |
| Mouse anti-horse MHC-II (FITC) | AbD serotec | MCA1085F | Consumable |
| Mouse IgG1 (FITC) - Isotype Control | AbD serotec | MCA928F | Consumable |
| Mouse monoclonal [SN6] to CD105 (FITC) | abcam | ab11415 | Consumable |
| Mouse IgG1 (FITC) - Isotype Control | abcam | ab91356 | Consumable |
| Mouse anti-human CD34 (FITC) | BD | BDB560942 | Consumable |
| Mouse IdG1 kappa (FITC) | BD | BDB555748 | Consumable |
| 7-AAD | BD | BDB559925 | Consumable |
| BD Accuri C6 Flow Cytometer | BD | Equipment | |
| Vacutainer 5 mL | Med Vet International | RED5.0 | Consumable |
| Acid-citrate-dextrose | Sigma | C3821 | Consumable |
| Calcium Chloride | Sigma | C5670 | Consumable |
| Sevoflurane | JD Medical | 60307-320-25 | Consumable |
| Rats | Charles River | Strain code: 400 | Experimental animal |
| Rat surgical kit | Harvard apparatus | 728942 | Equipment |
| Surgical Blade #15 | MEDLINE | MDS15115 | Consumable |
| Rat MD's Baytril (2 mg/Tablet), Rimadyl (2 mg/Tablet) |
Bio Serv | F06801 | Consumable |
| Polyglactin 910, 5-0 | Ethicon | J436G | Consumable |
| Eosin alchol shandon | Thermo scientific | 6766007 | Consumable |
| Harris Hematoxylin | Thermo scientific | 143907 | Consumable |
References
- Rossdale, P. D., Hopes, R., Digby, N. J., offord, K. Epidemiological study of wastage among racehorses 1982 and 1983. Vet Rec. 116 (3), 66-69 (1982).
- Black, D. A., Tucci, M., Puckett, A., Lawyer, T., Benghuzzi, H. Strength of a new method of achilles tendon repair in the rat - biomed 2011. Biomed Sci Instrum. 47, 112-117 (2011).
- Lake, S. P., Ansorge, H. L., Soslowsky, L. J. Animal models of tendinopathy. Disabil Rehabil. 30 (20-22), 1530-1541 (2008).
- Frank, C. B. Ligament structure, physiology and function. J Musculoskelet Neuronal Interact. 4 (2), 199-201 (2004).
- Godwin, E. E., Young, N. J., Dudhia, J., Beamish, I. C., Smith, R. K. Implantation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells demonstrates improved outcome in horses with overstrain injury of the superficial digital flexor tendon. Equine Vet J. 44 (1), 25-32 (2012).
- Smith, R. K., et al. Beneficial effects of autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells in naturally occurring tendinopathy. PLoS One. 8 (9), e75697 (2013).
- Fossett, E., Khan, W. S., Longo, U. G., Smitham, P. J. Effect of age and gender on cell proliferation and cell surface characterization of synovial fat pad derived mesenchymal stem cells. J Orthop Res. 30 (7), 1013-1018 (2012).
- Zaim, M., Karaman, S., Cetin, G., Isik, S. Donor age and long-term culture affect differentiation and proliferation of human bone marrow mesenchymal stem cells. Ann Hematol. 91 (8), 1175-1186 (2012).
- Leychkis, Y., Munzer, S. R., Richardson, J. L. What is stemness? Stud Hist Philos Biol Biomed Sci. 40 (4), 312-320 (2009).
- VandeVord, P. J., et al. Evaluation of the biocompatibility of a chitosan scaffold in mice. J Biomed Mater Res. 59 (3), 585-590 (2002).
- Griffon, D. J., Abulencia, J. P., Ragetly, G. R., Fredericks, L. P., Chaieb, S. A comparative study of seeding techniques and three-dimensional matrices for mesenchymal cell attachment. J Tissue Eng Regen Med. 5 (3), 169-179 (2011).
- Schwartz, Z., Griffon, D. J., Fredericks, L. P., Lee, H. B., Weng, H. Y. Hyaluronic acid and chondrogenesis of murine bone marrow mesenchymal stem cells in chitosan sponges. Am J Vet Res. 72 (1), 42-50 (2011).
- Ragetly, G., Griffon, D. J., Chung, Y. S. The effect of type II collagen coating of chitosan fibrous scaffolds on mesenchymal stem cell adhesion and chondrogenesis. Acta Biomater. 6 (10), 3988-3997 (2010).
- Ragetly, G. R., Griffon, D. J., Lee, H. B., Chung, Y. S. Effect of collagen II coating on mesenchymal stem cell adhesion on chitosan and on reacetylated chitosan fibrous scaffolds. J Mater Sci Mater Med. 21 (8), 2479-2490 (2010).
- Ragetly, G. R., et al. Effect of chitosan scaffold microstructure on mesenchymal stem cell chondrogenesis. Acta Biomater. 6 (4), 1430-1436 (2010).
- Ragetly, G. R., Slavik, G. J., Cunningham, B. T., Schaeffer, D. J., Griffon, D. J. Cartilage tissue engineering on fibrous chitosan scaffolds produced by a replica molding technique. J Biomed Mater Res A. 93 (1), 46-55 (2010).
- Slavik, G. J., Ragetly, G., Ganesh, N., Griffon, D. J., Cunningham, B. T. A replica molding technique for producing fibrous chitosan scaffolds for cartilage engineering. Journal of Materials Chemistry. 17 (38), 4095-4101 (2007).
- Griffon, D. J., Sedighi, M. R., Schaeffer, D. V., Eurell, J. A., Johnson, A. L. Chitosan scaffolds: interconnective pore size and cartilage engineering. Acta Biomater. 2 (3), 313-320 (2006).
- Huang, G. S., Dai, L. G., Yen, B. L., Hsu, S. H. Spheroid formation of mesenchymal stem cells on chitosan and chitosan-hyaluronan membranes. Biomaterials. 32 (29), 6929-6945 (2011).
- Cheng, N. C., Wang, S., Young, T. H. The influence of spheroid formation of human adipose-derived stem cells on chitosan films on stemness and differentiation capabilities. Biomaterials. 33 (6), 1748-1758 (2012).
- Webster, R. A., Blaber, S. P., Herbert, B. R., Wilkins, M. R., Vesey, G. The role of mesenchymal stem cells in veterinary therapeutics - a review. N Z Vet J. 60 (5), 265-272 (2012).
- Khan, M. H., Li, Z., Wang, J. H. Repeated exposure of tendon to prostaglandin-E2 leads to localized tendon degeneration. Clin J Sport Med. 15 (1), 27-33 (2005).
- Sullo, A., Maffulli, N., Capasso, G., Testa, V. The effects of prolonged peritendinous administration of PGE1 to the rat Achilles tendon: a possible animal model of chronic Achilles tendinopathy. J Orthop Sci. 6 (4), 349-357 (2001).
- van Schie, H. T., et al. Monitoring of the repair process of surgically created lesions in equine superficial digital flexor tendons by use of computerized ultrasonography. Am J Vet Res. 70 (1), 37-48 (2009).
- Schramme, M., Kerekes, Z., Hunter, S., Labens, R. Mr imaging features of surgically induced core lesions in the equine superficial digital flexor tendon. Vet Radiol Ultrasound. 51 (3), 280-287 (2010).
- Hast, M. W., Zuskov, A., Soslowsky, L. J. The role of animal models in tendon research. Bone Joint Res. 3 (6), 193-202 (2014).
- Warden, S. J. Animal models for the study of tendinopathy. Br J Sports Med. 41 (4), 232-240 (2007).
- Murrell, G. A., et al. Achilles tendon injuries: a comparison of surgical repair versus no repair in a rat model. Foot Ankle. 14 (7), 400-406 (1993).
- Ozer, H., et al. Effect of glucosamine chondroitine sulphate on repaired tenotomized rat Achilles tendons. Eklem Hastalik Cerrahisi. 22 (2), 100-106 (2011).
- Chan, B. P., Fu, S. C., Qin, L., Rolf, C., Chan, K. M. Pyridinoline in relation to ultimate stress of the patellar tendon during healing: an animal study. J Orthop Res. 16 (5), 597-603 (1998).
- Ni, M., et al. Tendon-derived stem cells (TDSCs) promote tendon repair in a rat patellar tendon window defect model. J Orthop Res. 30 (4), 613-619 (2012).
- Orth, P., Zurakowski, D., Alini, M., Cucchiarini, M., Madry, H. Reduction of sample size requirements by bilateral versus unilateral research designs in animal models for cartilage tissue engineering. Tissue Eng Part C Methods. 19 (11), 885-891 (2013).
- Kajikawa, Y., et al. Platelet-rich plasma enhances the initial mobilization of circulation-derived cells for tendon healing. J Cell Physiol. 215 (3), 837-845 (2008).
- Xu, W., et al. Human iPSC-derived neural crest stem cells promote tendon repair in a rat patellar tendon window defect model. Tissue Eng Part A. 19 (21-22), 2439-2451 (2013).
- Taguchi, T., et al. Influence of hypoxia on the stemness of umbilical cord matrix-derived mesenchymal stem cells cultured on chitosan films. J Biomed Mat Res B: Appl Biomat. , (2017).
- Griffon, D. J., et al. Effects of Hypoxia and Chitosan on Equine Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells Int. , 2987140 (2016).
- Roughan, J. V., Flecknell, P. A. Evaluation of a short duration behaviour-based post-operative pain scoring system in rats. Eur J Pain. 7 (5), 397-406 (2003).
- Sotocinal, S. G., et al. The Rat Grimace Scale: a partially automated method for quantifying pain in the laboratory rat via facial expressions. Mol Pain. 7, 55 (2011).
- Rosenbaum, A. J., et al. Histologic stages of healing correlate with restoration of tensile strength in a model of experimental tendon repair. HSS J. 6 (2), 164-170 (2010).
- Vidal, M. A., Walker, N. J., Napoli, E., Borjesson, D. L. Evaluation of senescence in mesenchymal stem cells isolated from equine bone marrow, adipose tissue, and umbilical cord tissue. Stem cells and development. 21 (2), 273-283 (2011).
- Patterson-Kane, J., Becker, D., Rich, T. The pathogenesis of tendon microdamage in athletes: the horse as a natural model for basic cellular research. J Compar Pathol. 147 (2), 227-247 (2012).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Bartosh, T. J., et al. Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (31), 13724-13729 (2010).
- Zhang, K., Yan, S., Li, G., Cui, L., Yin, J. In-situ birth of MSCs multicellular spheroids in poly(L-glutamic acid)/chitosan scaffold for hyaline-like cartilage regeneration. Biomaterials. 71, 24-34 (2015).
- Montanez-Sauri, S. I., Beebe, D. J., Sung, K. E. Microscale screening systems for 3D cellular microenvironments: platforms, advances, and challenges. Cellular and molecular life sciences : CMLS. 72 (2), 237-249 (2015).
- Butler, D. L., et al. The use of mesenchymal stem cells in collagen-based scaffolds for tissue-engineered repair of tendons. Nat Protoc. 5 (5), 849-863 (2010).
- Brennan, M. P., Sinusas, A. J., Horvath, T. L., Collins, J. G., Harding, M. J. Correlation between body weight changes and postoperative pain in rats treated with meloxicam or buprenorphine. Lab Anim (NY). 38 (3), 87-93 (2009).
- Ramon-Cueto, A., Cordero, M. I., Santos-Benito, F. F., Avila, J. Functional recovery of paraplegic rats and motor axon regeneration in their spinal cords by olfactory ensheathing glia. Neuron. 25 (2), 425-435 (2000).
- Arculus, S. L. Use of meloxicam as an analgesic in canine orthopaedic surgery. Vet Rec. 155 (24), 784 (2004).
- Bervar, M. Video analysis of standing--an alternative footprint analysis to assess functional loss following injury to the rat sciatic nerve. J Neurosci Methods. 102 (2), 109-116 (2000).
- Perry, S. M., Getz, C. L., Soslowsky, L. J. Alterations in function after rotator cuff tears in an animal model. J Shoulder Elbow Surg. 18 (2), 296-304 (2009).
- Stoll, C., et al. Healing parameters in a rabbit partial tendon defect following tenocyte/biomaterial implantation. Biomaterials. 32 (21), 4806-4815 (2011).
- Hankemeier, S., et al. Bone marrow stromal cells in a liquid fibrin matrix improve the healing process of patellar tendon window defects. Tissue Eng Part A. 15 (5), 1019-1030 (2009).
- Silver, I. A., et al. A clinical and experimental study of tendon injury, healing and treatment in the horse. Equine Vet J Suppl. (1), 1-43 (1983).
- Enwemeka, C. S. Inflammation, cellularity, and fibrillogenesis in regenerating tendon: implications for tendon rehabilitation. Phys Ther. 69 (10), 816-825 (1989).
- Goldin, B., Block, W. D., Pearson, J. R. Wound healing of tendon--I. Physical, mechanical and metabolic changes. J Biomech. 13 (3), 241-256 (1980).
- Lyras, D. N., et al. The effect of platelet-rich plasma gel in the early phase of patellar tendon healing. Arch Orthop Trauma Surg. 129 (11), 1577-1582 (2009).
- Oshiro, W., Lou, J., Xing, X., Tu, Y., Manske, P. R. Flexor tendon healing in the rat: a histologic and gene expression study. J Hand Surg Am. 28 (5), 814-823 (2003).
- Visser, L. C., Arnoczky, S. P., Caballero, O., Gardner, K. L. Evaluation of the use of an autologous platelet-rich fibrin membrane to enhance tendon healing in dogs. Am J Vet Res. 72 (5), 699-705 (2011).
