Summary
Этот документ описывает подготовку и оценку сфероидов матрица производные мезенхимальных стволовых клеток пуповины с моделью дефект двусторонних коленного сухожилия в крысу. Эта модель был связан с приемлемым заболеваемости был найден для выявления различий между необработанных и обработанных сухожилий и между двумя процедурами испытания.
Abstract
Регенеративной медицины обеспечивает Роман альтернатив для условий, которые ставят под угрозу традиционные методы лечения. Распространенность и заболеваемость плеча различных видов, в сочетании с ограниченной целебные свойства этой ткани, запрос поиска для клеточной терапии и самоходные разработка экспериментальных моделей для изучения их эффективности. Матрица производные мезенхимальные стволовые клетки пуповинной (UCM-MSC) являются привлекательными кандидатами, потому что они обильные, легко собирать, обойти этические проблемы и риск формирования тератома, но более тесно напоминающие примитивные стволовые клетки чем Взрослый ткани производные MSCs. значительный интерес была сосредоточена на Хитозан как стратегию для повышения свойств MSCs через сфероида формирования. Этот документ детали методы, чтобы изолировать UCM-MSCs, подготовить сфероидов хитозана фильм и анализировать влияние сфероида формирование на поверхности маркер выражения. Следовательно для имплантации в vivo сфероидов UCM-MSC, сформированные на фильм хитозана описано создание модели двустороннего коленного сухожилия травмы в крыс. Без осложнений было отмечено в исследовании в отношении заболеваемости, подчеркнуть рост эффекты, или ткани инфекции. Общая функциональная оценка оперированных крыс на 7 дней был ниже, чем у нормальных крыс, но вернулся к нормальной в течение 28 дней после операции. Гистологические десятки заживления тканей подтвердили наличие сгусток в лечение дефектов оценивается в 7 дней, отсутствие реакции инородного тела и прогрессирует исцеления в 28 дней. Эта модель дефект двусторонних коленная чашечка сухожилие управляет между индивидуальной вариативности через создание внутреннего контроля в каждом крыса, связанные с приемлемым заболеваемости и позволить выявить различия между необработанной сухожилий и лечения.
Introduction
Сухожилия травмы является одним из наиболее распространенных причин значительные боли и мышечные атрофии различных видов1. В ветеринарной медицины сухожилия и связки травмы представляют особый интерес в лошадей, 82% всех травм в гонке лошади включать опорно-двигательного аппарата, а 46% из них влияет на сухожилий и связок,2,3. Формирование рубцовой ткани влияет на биомеханические свойства исцелил сухожилий и объясняет охраняемой прогноз для возвращения спортивная(ый) использования после сгибателей сухожилия травм; Re травм происходит в течение 2 лет в до 67% лошадей консервативному4. Регенеративной медицины обеспечивает Роман альтернативы условие, что проблемы традиционных методов лечения. Аутологичных стволовых клеток выпустила некоторые обнадеживающие результаты5,6 , но ограничивается заболеваемости, связанный с ткани коллекции, из-за обработки/перепрограммирование задержки отправления клеток и влияние состояние здоровья пациента (например, возраст) на свойства стволовых клеток,7,8. Эти ограничения обеспечивают обоснование для расследования аллогенных стволовых клеток в качестве альтернативы готовых. Плода придатков матки производные клетки являются привлекательными кандидатами, потому что они обойти этические проблемы и риск формирования тератома, связанные с эмбриональных стволовых клеток. Среди плода придатков матки пуповины матрица (ЦСМ), также названный Wharton желе, обильные и легко собрать.
Независимо от источника клеток повышения stemness необходимо создать банк клеток аллогенной восстановительной медицины. С функциональной точки зрения stemness можно определить как потенциал для самообновления и несколькими линии дифференциации9. Свидетельство о stemness опирается на пролиферации и дифференцировки анализов, а также выражение гена маркеры Oct4, Sox2 и Nanog9. Одной из стратегий повышения stemness основывается на использовании биоматериалов в качестве наполнителей и перевозчиков, повышению пролиферации и дифференцировки UCM-MSCs. Этот подход устраняет озабоченность по поводу манипуляции транскрипционный анализ факторов перепрограммировать зрелых клеток в индуцированных плюрипотентных клеток. Среди биоматериалов, рассматривать в качестве потенциальных носителей для стволовых клеток chitosan является привлекательным для его биосовместимость и разлагаемость10. Этот естественный аминополисахарид формируется щелочное дезацетилирование хитина, вторым наиболее распространенным природный полисахарид, главным образом получены как subproduct моллюсков10. Мы уже исследованы взаимодействия между MSCs и хитозана леса и наблюдали образование сфероидов11,12,13,14,15, 16. Мы также сообщали о превосходстве chondrogenesis хитозана матриц12,13,14,,1516,17, 18. Совсем недавно два независимых исследований описано формирование сфероидов жировой ткани и ткани плаценты производных MSCs, культивируемых в фильме хитозана19,20. Это образование сфероидов не только расширение stemness, но также улучшено сохранение стволовых клеток после в vivo имплантации20.
Распространенность и заболеваемость плеча различных видов побудили разработка экспериментальных моделей для изучения патофизиологии Тендинопатии и тестирования новых методов лечения, таких как инъекции стволовых клеток. В лошадей коллагеназа индуцированной тендинит — это общая модель для демонстрации эффективности с помощью MSCs в сухожилие ремонт21. Актуальность этого подхода ограничена, как инъекции вызывают острые воспалительные изменения, тогда как клинический Тендинопатии обычно являются результатом хронического перенапряжения22,23. Кроме того химической индукции сухожилия болезнь вызывает исцеления ответ и не реплицирует нарушение заживления в клинических случаев22,23. Иссечение сегмента сухожилие поверхностного цифровой сгибатели был описан как хирургические модель тендинит в лошадей24. Совсем недавно миниинвазивная подход был использован для ограничения травматических повреждений центральное ядро поверхностные цифровой сгибателей сухожилия25. Хирургическое модели не имитировать усталость механизм, который может привести к естественной сухожилия болезни и, как правило, не хватает воспроизводимость в степени повреждения, создал25. Независимо от модели, заболеваемости и затраты, связанные с лошадей модели сухожилия заболевания являются дополнительные ограничения, которые оправдывают интерес к грызунов модели в качестве первого шага в естественных условиях оценки Роман терапии.
Одно из главных достоинств экспериментальных моделей на грызунах состоит из стоимости и способность контролировать межличностная изменчивость. Грызунов может быть стандартизирована в отношении различных физиологических факторов из-за их быстрые темпы роста и относительно короткой продолжительности жизни, ограничение источников вариации и тем самым уменьшая количество животных, необходимых для выявления различий. Стратегии чтобы побудить сухожилия болезни грызунов полагались на химической индукции, но и на хирургическое создание частичных сухожилия дефекты21. Хирургическое модели могут имитировать природные Тендинопатии лучше, чем химические модели, но может привести к более высокой заболеваемости и авария поврежденные сухожилия. В этом отношении крысы, кажется лучше кандидатов, чем мышей для этих моделей, как их размер позволяет создание более крупных дефектов, способствуя тем самым оценки заживления тканей. Крысах Sprague-Dawley были использованы в экспериментальных исследованиях Тендинопатии в четырех основных сухожилий групп: манжета ротатора, сгибателей, Ахиллес и26коленного сухожилия. Среди них модели с участием коленного сухожилия являются особенно привлекательными из-за большего размера этой сухожилия и легкость доступа к нему,27. Коленного сухожилия четырехглавой мышцы придает бугристости большеберцовой кости. В рамках этой разгибателей механизм надколенника является Сесамовидные кости, которая направляет действия четырехглавой и очерчивает проксимальных степени коленного сухожилия. Присутствие костлявые якорей в проксимальном и дистальном экстентов коленного сухожилия облегчает биомеханические тесты. Модели с участием коленного сухожилия обычно полагаются на односторонний хирургический дефектов, с контралатеральной сухожилие нетронутыми служит управления28,29. Наиболее распространенная модель дефект коленного сухожилия включает в себя вырезание Центральная часть (1 мм в ширину) коленного сухожилия от дистальной верхушки надколенника для вставки бугристости большеберцовой кости, в то время как контралатеральной коленного сухожилия остается без изменений. Меры исходы включали гистологии, биомеханические Неразрушающий или биомеханические тестирования сбоя, УЗИ, ex vivo флуоресценции изображений, брутто наблюдения и функциональные тесты28,30 ,31. Одностороннее модели не позволяют сравнения предлагаемого лечения с консервативное управление подобные травмы в то же самое животное. Аналогичным образом сравнение между несколькими лечения требует отдельных животных. Двусторонние модель будет устранить различия между отдельными и уменьшить количество животных, необходимых для исследования32. Однако двусторонние травмы может привести к увеличению заболеваемости, и двусторонние хромота может препятствовать оценки лечения. Несколько исследований кратко сообщают об использовании двусторонних коленного сухожилия дефектов в крыс, но внимание на последствия лечения, вместо того, чтобы Управление периоперационную и заболеваемости модели33,34.
Долгосрочная цель этого исследования заключается в разработке стратегии для улучшения stemness и в естественных условиях выживание UCM-MSCs суждено аллогенной трансплантации. Для достижения этой цели, мы недавно сообщили более stemness путем формирования сфероидов UCM-МСК на фильм хитозана и инкубации при гипоксических окружающей среды35. Эти свойства в vitro были связаны с улучшенными биомеханическими свойствами коленного сухожилия дефектов, относились с кондиционером UCM-MSCs. на основе этих результатов, крыса двусторонних коленного сухожилия дефект модель кажется подходящим для проверки кандидата лечение травм сухожилия36. Цель исследования сообщили здесь заключается в предоставлении подробных протоколов для изоляции и характеристика UCM-MSCs, подготовка биологические системы доставки для создания, стволовые клетки и лечение двусторонних коленная чашечка сухожилие дефектов и послеоперационные восстановление и оценки исцеление в пределах дефекты ткани.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все методы, описанные здесь были одобрены институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) Западного университета медицинских наук.
1. изоляция и расширение MSCs от лошадиного пуповины матрица
- Получить через плаценту от взрослых кобылы (беременности) после того, как отмечено, рожает и асептически изолировать пуповины из плаценты. Держите пуповины в фосфатный буфер (PBS) с 1% пенициллин стрептомицином (P/S) при 4 ° C во время передачи до обработки.
- Вымойте пуповины дважды с комнатной температуре PBS с 1% P/S в 50 мл трубки. Раздел пуповины на фрагменты 2-дюймовый длиной 150 мм пластины и мыть в комнатной температуре PBS с 1% P/S в 50 мл трубки два или три раза, пока большая часть крови промыть.
- Отрежьте пуповину продольно подвергать судов. Удаление сосудов, в том числе 2 артерий, вен и allantoic стебля от шнур, с помощью щипцов и ножницы. Сбор пуповинной матрица (Wharton желе), который является желеобразной матрица окружающих судов, на 150 мм пластину, соскоб с помощью скальпеля, и фарш желе на мелкие кусочки.
- Место Уортон желе из 2 – 3 пуповины фрагментов (примерно 12-15 g) в 50-мл пробирку с 15 мл раствора 0,1% (w/v) коллагеназы типа IA в PBS. Инкубируйте при 37 ° C с нежным встряхивания в течение 3-4 ч до полного растворения.
- Центрифуга переваривается ткани на 300 x g 15 мин и удалить супернатант. Ресуспензируйте переваривается ткани в 15 мл комнатной температуры PBS с 1% P/S, смешивать, дозирование, центрифуги на 150 x g 5 мин и аспирационная супернатант (ВСГ). Повторите дважды мытье больше.
- Ресуспензируйте промывают клетки в 15 мл комнатной температуры PBS с 1% P/S, смешивать, дозирование, деформации с 100 мкм клеток сито, центрифуги на 150 x g 5 минут и аспирационная супернатант.
- Подготовка питательной среды (CM) путем смешивания низкий глюкозы Дульбекко среднего (LG-DMEM) изменение орла с плода бычьим сывороточным (ФБС) и 1% P/S. стерилизовать среды путем фильтрации.
- Ресуспензируйте напряженными клетки в 10 мл см, предварительно нагретой до 37 ° C, смешивать, дозирование, перевести в колбе культуры ткани2 25 см и инкубировать в 5% CO2 при 90% влажности и 37.0 ° C. Изменение см каждые 3 дня, до тех пор, пока культура достигает 70-80% слияния, когда культуры будет пассированные.
- Для прохода культуры, аспирационная см от колбу, мыть с 5 мл комнатной температуры PBS дважды и отсоединить с 3 мл 0,25% трипсина/Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) при 37 ° C за 5 мин.
- Нейтрализовать трипсина/ЭДТА с 6 мл см, предварительно нагретой до 37.0 ° C, смешивать, дозирование, передачи в 15 мл трубку, центрифуги на 150 x g 5 минут и аспирационная супернатант. Ресуспензируйте отдельностоящий клеток в 1 мл см, смешивать, закупорить. Количество жизнеспособных клеток, используя Трипановый синий и Горяева. Повторное заполнение в колбе культуры ткани2 25 см на 5000 клеток/см2и инкубировать в 5% CO2 при 90% влажности и 37.0 ° C.
2. Подготовка сфероидов с UCM-MSCs, культивируемых на хитозана фильмов
- Чтобы подготовить 100 мл раствора хитозана 1% (w/v), добавить 1 g хитозана в 99 мл дистиллированной воды (dH2O) и хорошо перемешать с магнитной мешалкой.
- 670 мкл уксусной кислоты кристаллизированной и продолжать перемешивание, пока хитозана растворяет и становится вязким. Обычно это занимает 3-4 ч.
- 500 мкл раствора хитозана в каждой скважине плиты 12-ну тканевые культуры, и вихрем пластины равномерно распределить раствор хитозана и охватывают все из нижней поверхности.
- Сухие пластину хитозана решения с покрытием под ламинарный кабинет без крышки на ночь за 24 ч. После высыхания тонкой пленки будет сформирована и придерживаться пластины.
- Нейтрализовать хитозана фильм, добавив 1 мл 0,5 N раствора гидроксида натрия (NaOH) в каждой скважине и проинкубируйте втечение 2 ч при комнатной температуре. Аспирационная NaOH от каждой скважины и мыть каждый хорошо с 1 мл раствора dH2O 3 раза. Мыть каждый раз хорошо с 1 мл 70% этанола (EtOH).
- Стерилизовать хитозана фильм, добавьте 1 мл 70% EtOH в каждый хорошо и инкубировать на ночь в кабинете ламинарного потока. Аспирационная оставшиеся EtOH от каждой скважины на следующий день. Мыть каждый хорошо с 1 мл стерильного PBS три раза. Стерилизуйте хитозана фильм с ультрафиолетовым светом под Ламинарный шкаф на ночь без крышки.
- Для формы сфероидов UCM-MSCs семян расширил пассированной клеток в каждой скважине на 5000 клеток/см2и инкубировать в 5% CO2 при 90% влажности и 37.0 ° C.
Примечание: Клетки могут инкубировали при гипоксии или normoxia, в зависимости от интересов следователя.
3. выражение поверхностных маркеров, проанализированы через проточной цитометрии
-
Подготовка одной ячейки подвеска
- Стандартная плита
- Удаление среднего из каждой скважины и мыть дважды с комнатной температуре PBS.
- Отсоедините клетки с 500 мкл Реагента диссоциации клеток в каждой скважине 12-ну плиты для 5-10 мин при комнатной температуре.
- После инкубации добавьте 1 ml окрашивания буфера (PBS, содержащий 0,5% BSA) в каждой скважине и смешивать, закупорить для отсоединения клетки.
- Перевести суспензию клеток в 15 мл Конические трубки и центрифуги на 150 x g 5 мин.
- Хитозан пластина
- Соберите все сфероидов аспирационных средством, с помощью пипетки с 1000 мкл кончиком. Собранные теплоносителя в 15 мл Конические трубки. После сбора среднего, мыть хорошо, добавив 1 мл PBS и передачи промывают PBS в же 15 мл Конические трубки.
- Центрифуга сфероидов на 150 g x 5 минут и удалить супернатант.
- Добавьте 500 мкл Реагента диссоциации клеток (например, accutase) и инкубировать в течение 5-10 мин при комнатной температуре. Смешать с помощью дозирования кончик 1 мл до сфероидов отмежеваться и больше не видны.
- Добавьте 1 mL окрашивание буфера в одну ячейку подвеска и центрифуги на 150 x g 5 мин.
- Стандартная плита
-
Стиральная клетки
- Удалить супернатант из конической трубки и вновь приостановить клетки в 3 мл холодного пятнать буфера. Держите клетки на льду на протяжении эксперимента от этого шага.
- Центрифуга на 300 g x 5 мин (стирка).
- Мыть дважды.
-
Пятная клетки
- Центрифуга на 300 g x 5 минут и удалить супернатант.
- Количество жизнеспособных клеток с помощью Трипановый синий и Горяева. Вновь приостановить 1 х 106 клеток в 50 мкл блокирует буфер (PBS содержащие лошадь 10% сыворотки) и Инкубируйте 30 мин на льду.
- Добавить 10 мкл флуоресцеин Изотиоцианаты (FITC) конъюгированных антител (CD44, CD90, CD105, CD34, комплекс в гистосовместимости (MHC) класса II или изотипа управления для каждого антитела) и 40 мкл пятнать буфера, а затем инкубировать защищенный от света на 1 ч на льду.
- Добавить 3 мл холодного пятнать буфера и смешивать, центрифуги на 300 x g 5 мин и аспирационная супернатант (стирка).
- Повторите дважды стирки.
- Вновь приостановить Пелле клеток в 0,5 мл окрашивания буфера
- 5 мкл 7-AAD (жизнеспособности краситель) и Инкубируйте 30 мин на льду
- Анализировать образцы окрашенные клетки проточный цитометр. Исключить мусора путем их меньше ККК и FSC и выявления жизнеспособных клеток с нижней поглощения 7-Ава. Участок значения параметров FL1 и FL2 на y-x оси и, соответственно. Использование isotype управления для создания ворот над диагональной линии. Измерьте процент положительно окрашенных клеток в этом районе. Рассчитывать по крайней мере 20 000 событий в образце (дополнительный рис. 1).
- Измерить процент клеток, с антителами запятнана стробирования жизнеспособных клеток и авто флуоресценции и вычесть процент клеток, окрашенных с изотипа управления.
4. двусторонние коленного сухожилия дефект модель в крыса
- Выберите крысах Sprague-Dawley (взрослых мужчин, 4-5 месяцев, вес тела 350 – 375 g). Обратите внимание на относительно большой размер крыс, используемый для этой модели.
- Анестезировать и смазать искусственного глаза крыс с севофлурана 8% 2 Л/мин 100% кислорода в доставлено через маску, вплоть до исчезновения Пинч мыс рефлекс в зале индукции.
- Администрировать внутримышечной инъекции мелоксикама (1 мг/кг) как вытеснением анальгезии.
- Место крысы между две бутылки 0,5 Л воды с теплой водой и покрытый тканью для поддержания температуры тела и позицию, предотвращая повреждения кожи. Лента каждой конечности в таблице. Чтобы уменьшить риск гипотермии, покрывают тело с пузырчатую пленку (рис. 1).
- Поддержание анестезии с непрерывным потоком севофлюран 5% в 1 Л 100% кислорода смеси через носовой конус, с животным на спинной recumbency на воде, грелку.
- Чтобы избежать травмы кожи, не клип хирургических сайтов. Вместо этого применять крем для удаления волос над оба душит. Для удаления волос и крем используйте депрессор языка.
- Скраб месте операции с хлоргексидина биглюконат скраб и промыть 70% этанол 3 раза.
- Надрезать кожу с лезвием стерильным скальпель #15 в проксимальнее дистальной направлении, на craniomedial аспект задушить. Запустите разреза около 1 см проксимальнее уровня надколенника и продлить его дистальнее большеберцовых бугорка примерно 5 мм.
- Отражать кожи подвергать коленного сухожилия, освобождая базовой подкожной клетчатки с лезвием скальпеля #15.
-
Использование лезвие скальпеля #15, акцизных Центральной трети каждого коленного сухожилия (1 мм) от дистальной аспект надколенника к бугристости большеберцовой кости.
- Совместите 0,99 мм в диаметре проволоки Киршнер против сухожилия как шаблон для стандартизации размер дефекта в каждой конечности (рис. 2).
- Сделайте 2 полный толщина надрезы на каждой стороне провода Kirschner с лезвием скальпеля #15 изолировать Центральная часть сухожилия (рис. 3). Иссечения центральной секции пометив проксимальный и дистальный центры с тонкой Ирис ножницы (рис. 4).
- Перед закрытием фасции задушить, вставьте сгусток (смешанные клетки подвеска и акт) для групп соответствующего лечения, как описано в 5.5. Закройте фасции с крестообразной узором и кожи с внутрикожного выкройку 5-0 полиглактин 910 швы (рис. 5).
- Повторите процедуру на контралатеральной задушить.
Примечание: Случайно один дефект назначается для лечения (стволовые клетки обусловлено хитозана или культивируемых на стандартные пластины). Контралатеральной дефект является пустым, в качестве внутреннего контроля. - После операции, администрировать 4 таблетки Энрофлоксацин (2 мг/таблетка, устно, один раз в день) и таблетки мелоксикам (2 мг/таблетка, устно, один раз в день) на 7 дней. Эти дозы были рекомендованы лаборатория животных Ветеринар и утверждены в протокол IACUC.
5. Доставка MSCs в дефект коленного сухожилия
- Анестезировать здорового крысу, которая не используется для создания дефектов коленного сухожилия с севофлурана 8% в 2 Л/мин 100% кислород доставляется через маску, вплоть до исчезновения Пинч мыс рефлекс в зале индукции.
- Соберите 5 мл крови, сердца проколам от наркотизированных крысах Sprague-Dawley (взрослых мужчин, 4-5 месяцев, вес тела 350 – 375 g), в шприц 5 мл с иглой 20 G, содержащие 1 мл кислоты цитрат декстрозы (5:1 v/v).
- Усыпить крыс после пункции сердца и сбора крови, путем инъекций intracardial Пентобарбитал (100 мг/кг), тогда как же анестезию.
- Центрифугуйте образцы на 350 g x 15 мин при комнатной температуре. Супернатант переносите и храните аликвоты (по 120 мкл) при-20 ° C до использования.
- Непосредственно перед имплантацией в естественных условиях оттепель выше Алиготе и смешать с 0,5 x 10 20 мкл6 MSCs (от 1.9 или 3.1.2.1) отделен от стандартных плит с помощью трипсина/ЭДТА или собирать из хитозана пластины, промывка (с PBS/средний).
- Добавить 6 мкл 10% хлористого кальция (2CaCl) оставшиеся 100 мкл талой плазмы в хорошо 96-луночных пластины для активации плазмы и стимулировать формирование сгустка (активирован кондиционером плазмы: акт).
- Перемешать суспензию клеток (20 мкл) и акт (100 мкл) сформировать сгусток (рис. 6). Место сгусток внутри дефект коленного сухожилия, созданные до закрытия фасции задушить (см. шаг 4.10.3).
6. функциональные результаты
- Контролировать крыс дважды в день для признаки боли, основанный на крыса гримаса шкала (RGS)37,38 и припухлость над сайтами имплантации.
Примечание: Система баллов (0-6) был разработан для оценки амбулаторного функция, основанная на 3 мероприятий, включая постоянный приурочен задние конечности с Передние конечности поддерживается (0-3), приурочен стоя без посторонней помощи задних конечностей (0-2) и возможность подняться (17 см) пластиковый каркас стены (0-1) Таблица 1). - Оцените крыс для этих двух видов деятельности постоянного задних конечностей, утром и вечером каждый момент для вычисления среднего балла.
- Оцените крыс способность успешно подняться стене пластиковые Кейдж 17 см с обеих задних конечностей, достигнув вершины.
7. Валовой внешний вид и гистопатологии коленного сухожилия
- Усыпить крыс на 7 дней (для оценки воспаление) или 28 дней (для оценки заживления тканей) после лечения путем инъекций intracardial Пентобарбитал (100 мг/кг) под наркозом с севофлурана 8% и 2 Л 100% кислород через маску.
- Урожай коленная чашечка сухожилие голени бугра единиц скальпель и ножницы после эвтаназии. Удаление мягких тканей и связки вокруг задушить, за исключением коленного сухожилия.
- Изучите каждый образец валовой внешний вид и утолщение сухожилий (рис. 7).
- Ориентирование образца, поместив хирургический узел 5.0 полидиоксанон на проксимальном и боковых аспект сухожилия. Исправления каждого образца в 10% растворе нейтрального формалина буферизации и получить поперечной секций (5 мкм) из средней части каждого сухожилия.
- Пятно на разделы, используя гематоксилином и эозином, а Masson Trichrome окрашивание следующие стандартные протоколы.
- Просмотрите раздел, чтобы определить наличие гематомы в пределах дефекта, а также патологические изменения, такие как воспаление.
- Оцените Гистологическая Оценка разделов с использованием ранее опубликованные Скоринг система, основанная на коллаген класс, степенью ангиогенеза и хряща формирования (Таблица 2)39.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В текущем исследовании результаты представлены как означает ± SD (стандартное отклонение). Клетки были изолированы от пуповины 6 кобыл, и процент изолированных клеточных линий, выражая поверхности маркер каждой ячейки под стандарт или Хитозан принадлежности были сопоставлены с тест Фридмана, как непараметрический анализ дисперсии с повторяется меры. Для создания модели дефект сухожилия 8 крыс были использованы для оценки 7 дней после операции и 12 крыс были использованы для оценки 28 дней. Результаты функциональных результатов представлены как означает ± SEM (Среднеквадратичная ошибка среднего значения) и по сравнению с использованием t теста. UCM был выбран в качестве источника сотовой из-за его изобилия, простота коллекции и Улучшенный распространения относительно других источников плода придатков матки40. Клетки изолированы от UCM, культивируемых на стандартных пластин поддерживал фибробластоподобных форму на протяжении всего расширения. Клетки образуется сфероидов когда культивированный на хитозана пластины (рис. 8).
Большинство клеток, культивируемых в стандартных условиях выразил CD44 (98,6 ± 1,62%), CD90 (88,7 ± 3,04%) и CD105 (77,9 ± 6,84%), тогда как выражение CD34 (0.07 ± 0,17%) и MHC II (1.33 ± 1,12%) были очень низкими. Под кондиционером культуры, уровни выражения CD44 (97,0% ± 2.12) и CD34 (1,13 ± 1,58%) не отличаются от стандартных культур, хотя уровни выражения CD90 (33,3 ± 37,1%) и CD105 (54.0% ± 19,0) снизился и35увеличилась MHC II (2,84 ± 0,98%).
После изоляции и характеристика UCM-MSCs в пробиркебиологическое поведение обусловлено клеток был по сравнению с клетки культивировали в стандартных условиях в модели двустороннего коленного сухожилия дефект в крыс. Неочищенные дефекты в каждом крыса, служил в качестве внутреннего контроля. Послеоперационные отеки было минимальным всех крыс и решен в течение 48 ч. Согласно RGS никто из крыс проявляют признаки боли или страданий, такие как Орбитальная ужесточения, нос/щеку уплощение, или уха/нитевидные изменения. Все крысы потребляется нормального диапазона 3-4 таблеток или 15-20 грамм корма ежедневно на протяжении всего исследования. Общая функциональная оценка, включая помощь и без посторонней помощи задних конечностей, стоя, а также восхождение оценки была выше в нормальных крыс, по сравнению с оперированных крыс на 7 дней (n = 8, p < 0,0001, Таблица 3). Однако, общая функциональная оценка вернулся к нормальной в течение 28 дней после операции (n = 12, p = 0,78). Таким образом крыса двусторонних коленного сухожилия дефект модели показали эффективными для ограничения между индивидуальной вариативности и сокращения необходимое количество животных, не вызывая значительных заболеваемости (видео 1–5).
Около 37% сухожилий, собранных на 28 дней появился значительно утолщенный (рис. 7). Это утолщение был равномерно между пустой и лечение дефектов. Общая гистологические результаты увеличилась с течением времени необработанной дефекты (n = 20, p = 0,0034). Когда каждый компонент исцеления Оценка оценивали независимо друг от друга, единственный параметр меняется с течением времени состоял из формирования хряща, который увеличил между 7 и 28 дней (n = 20, p < 0.0001). Ангиогенез, как правило, увеличить со временем (p = 0,3), но не отличаются образование коллагена (p = 0,69). При гистологическом исследовании воспаление наблюдалось во всех разделах ткани сухожилий, рассмотрены в 7 дней после операции, независимо от наличия лечения. Гематома присутствовал в всех обработанных дефектов. Результаты гистологических ангиогенез (Таблица 2, рис. 9) варьировались от 0 до 1, предлагая умеренной артериолы и капиллярного проникновения, в то время как класс коллагена ноты (Таблица 2, рис. 10) варьировались от 2 до 3 в целом, предлагая образование умеренного до обширных коллагена. Хрящ формирования оценки (Таблица 2, рис. 11) варьировались от 0 до 2, предлагая не формирование хряща, умеренные формирование хряща от 25% до 50% области раздела сухожилия. Все гистологические данные ориентированы с левой передней аспектом и сверху как медиальной аспект поперечного сечения середине часть сухожилия.
Рисунок 1: позиционирование крыс и подготовки для асептических хирургии. Каждый крыса была помещена между две бутылки 0,5 Л воды с теплой водой и покрытый тканью для поддержания температуры тела и позицию, предотвращая повреждения кожи. В концах каждого крысы были записаны на пленку в таблицу и его тело было покрыто пузырчатую пленку. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: хирургические модель коленного сухожилия дефекта (выравнивание). 0,99 мм в диаметре проволоки Kirschner выравнивается против сухожилия как шаблон для стандартизации размер дефекта в каждой конечности.
Рисунок 3: хирургические модель коленного сухожилия дефекта (разрезов). Два полностью толщина надрезы на каждой стороне провода Kirschner изолировать Центральная часть сухожилия.
Рисунок 4: хирургические модель коленного сухожилия дефекта (резекция). Центральная секция является резецируется пометив проксимальный и дистальный центры, создавая дефектом, соответствие размера проволоки Kirschner. Резекции области отображается внутри пунктирной линии.
Рисунок 5: послеоперационный вид эксплуатируемых душит. Фасции был закрыт с крестообразной узором и кожи был закрыт с внутрикожного узором. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6: подготовка активированного кондиционером плазмы для доставки в ЦСМ-MSCs. Стволовые клетки были приостановлены в кондиционированном плазмы до активации. Результате сгусток был вставлен в коленного сухожилия дефектов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 7: Валовой внешний вид нормальный (C, D) и утолщенные (A, B) сухожилий. (A, C) Задний вид; (B, D) Боковой вид; Блок стрелок определить голени и тонкие стрелки определить сухожилий.
Рисунок 8: морфология клеток, культивируемых на культуре ткани пластины под 19% уровень кислорода (стандартные группы: A) и хитозана фильм под 5% уровень кислорода (кондиционером Группа: B). изолированные клетки были шпинделя на стандартные группы (A) и формируется сфероидов кондиционером группы (B). Шкалы бар = 400 мкм пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 9: представитель свет микроскопии, используемые для классификации по ангиогенез. После 7 дней лечения сухожилий без лечения получил класс 0 (A, D), тогда как те, с кондиционером клетки (C, F) или стандартный клетки (B, E) получил ранг 0,5 и 0, соответственно. На 28 дней необработанной сухожилий (G, J) получил сорт 0, тогда как те, с кондиционером клетки (я,L) или стандартной ячейки (H,K) получили десятки 1.0 и 0,5, соответственно. Стрелки идентифицировать кровеносных сосудов в образце сухожилия. Стрелки, указывающие на кровеносные сосуды в 100 крат соответствуют же стрелки, указывающие кровеносных сосудов в 400 крат. Нормальный сухожильных тканей (M, N). Массон trichrome пятно (A, B, C, G, H, I, M); гематоксилином и эозином пятно (D, E, F, J, K, L, N); Шкалы бар = 100 мкм (A-N). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 10: представитель свет микроскопии, используемые для классификации коллаген. После 7 дней лечения сухожилий без лечения получили сорта 2,5 (A, D) те, с лечением (B, C, E, F) сорт 3.0. На 28 дней неочищенные сухожилий (G, J) получил сорт 3.0, в то время как те, с кондиционером клетки (я, L) или стандартной ячейки (H, K) получил десятки 1.0 и 3.0, соответственно. Дезорганизация сухожилия волокон могут быть оценены в 400 X вставками (H, K). Нормальный сухожильных тканей (M, N). Массон trichrome пятно (A, B, C, G, H, I, M); гематоксилином и эозином пятно (D, E, F, J, K, L, N); Шкалы бар = 100 мкм (A-N). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 11: представитель свет микроскопии, используемые для классификации хряща. После 7 дней лечения сухожилий без лечения (A, D), те с либо кондиционером ячейки (C, F) или стандартный (B, E), все получили ранг 0. На 28 дней неочищенные сухожилий (G, J) получил класс 1.0, в то время как те, с кондиционером клетки (я, L) или стандартной ячейки (H, K) получил десятки 0 и 2.0, соответственно. Стрелки указывают на хрящевые клетки присутствуют в образце сухожилия. Стрелки, указывающие на хрящевые клетки в 100 крат соответствуют же стрелки, указывающие на хрящевые клетки в 400 крат. Нормальный сухожильных тканей (M, N). Массон trichrome пятно (A, B, C, G, H, I, M); гематоксилином и эозином пятно (D, E, F, J, K, L, N); Шкалы бар = 100 мкм (A-N). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Видео 1: Оценка амбулаторного функции в крыс. Приурочен стоя без посторонней помощи задних конечностей (1 – 5 s: Оценка 1) было отмечено 4 h постоперационно. Пожалуйста нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)
Видео 2: Оценка амбулаторного функции в крысах. Приурочен задние конечности стоя с помощь Передние конечности (0 – 5 s: счетом 0) было отмечено 4 h сообщение оперативно. Пожалуйста нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)
Видео 3: Оценка амбулаторного функции в крыс. Приурочен стоя без посторонней помощи задних конечностей (1 – 5 s: Оценка 1), приурочен задние конечности стоя с помощь Передние конечности (5 – 10 s: Оценка 1) было отмечено 14 дней после оперативно. Пожалуйста нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)
Видео 4: Оценка амбулаторного функции в крысах. Приурочен задние конечности стоя с помощь Передние конечности (10 – 15 s: 2 балла), без возможности подняться стене пластиковые Кейдж 17 см (не альпинизм: оценка 0) было отмечено 27 дней после оперативно. Пожалуйста нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)
Видео 5: Оценка амбулаторного функции в крысах. Приурочен задние конечности стоя с помощь Передние конечности (s: 5-10 баллов 1), с возможностью подняться 17 см стене пластиковый каркас (да: Оценка 1) было отмечено 14 дней после оперативно. Пожалуйста нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)
| Функциональный тест | 0 | 1 | 2 | 3 | Оценка |
| Задние конечности стоят помощь | 0 – 5 s | > 5 – 10 s | > 10 – 15 s | > 15 s | |
| Задние конечности стоять без посторонней помощи | 0 – 1 s | > s 1 – 5 | > 5 s | ||
| Преодоление подъема | Нет | Да | |||
| Итого |
Таблица 1: балльной системы для оценки амбулаторного функция крыс. Система баллов (0-6) был разработан для оценки амбулаторного функция, основанная на 3 мероприятий, включая постоянный приурочен задние конечности с Передние конечности поддерживается (0-3), приурочен стоя без посторонней помощи задних конечностей (0-2) и возможность подняться 17 см стене пластиковый каркас (0 – 1).
| Коллаген класс | |||||
| 0 | Нормального коллагена, ориентированные касательной | ||||
| 1 | Мягкий изменения коллагеновых волокон менее 25% дезорганизованы | ||||
| 2 | Дезорганизованы умеренные изменения коллагеновых волокон между 25% и 50% | ||||
| 3 | Отмеченные изменения с коллагеном, более 50% дезорганизованы | ||||
| Степень по ангиогенез | |||||
| 0 | Умеренная инфильтрация ткани с артериол | ||||
| 1 | Присутствие капилляров | ||||
| 2 | Не сосудистую инфильтрации | ||||
| Формирование хряща | |||||
| 0 | Без формирования хрящей | ||||
| 1 | Изолированные гиалинового хряща конкреций | ||||
| 2 | Умеренные хряща формирования от 25% до 50% | ||||
| 3 | Формирование обширные хряща, более чем 50% участвующих поля | ||||
Таблица 2: Гистология, забив сортов. Гистологическая Оценка секций были классифицированы на основе коллагена класс, степенью ангиогенеза и формирование хряща (адаптировано из Розенбаум et al. 39)
| Группа | Означать ± SEM |
| Normal (n = 3) | 6.00 ± 0,48 |
| 7 дней после операции (n = 8) | 2,25 ± 0.30 |
| 28 дней после операции (n = 12) | 5.83 ± 0,24 |
Таблица 3: Функциональной оценки нормальных крыс и неочищенных крысы. Функциональные результаты нормальных крыс и неочищенных крысы 7 и 28 дней после операции были классифицированы. n = количество крыс.
Дополнительный рисунок 1: стробирования стратегии и пример поверхности маркер выражения: Мусор был исключен, основанный на малых FSC и ККК (A). Живые клетки были отобраны на основе негативных окрашивание с 7-AAD определяется FL3 (B). Isotype соответствием контроля (C) был использован как отрицательный контроль для создания ворота CD44 FITC позитивных клеток (D).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Лошадиный клетки были отобраны для этого проекта потому, что мы в конечном итоге намерены проверить кандидат подходы в управлении природных Тендинопатии лошадей. Сухожилия травм в лошадей действительно привлекательным, как природные модели плеча в человеке за биологическое сходство между лошадей поверхностные цифровой сгибатели и ахиллова сухожилия в людей41. Для Иммунофенотипирование клеток, в соответствии с критериями, рекомендованный международным обществом клеточной терапии42были выбраны ячейки поверхностных маркеров CD44, CD90, CD105, CD34 и MHC II. В недавнем исследовании eqUCM-MSCs были положительными для CD44 и негативные CD34 и MHC II, независимо от условий культуры. Клетки культивировали в стандартных условиях были также положительными CD90 и CD105, таким образом отвечающие критериям для MSCs с точки зрения выражение поверхностных маркеров. Кроме того это исследование является первым докладом о формировании сфероидов когда eqUCM-MSCs культивируемых на пленке Хитозан, подтверждающие предыдущие доклады человека MSCs19,20. 3D клеточные культуры технологии были широко изучены на протяжении десятилетий, стремится создать обстановку, напоминающие физиологических нишу. Действительно это исследование показало улучшение stemness уровни выражения гена Oct4, Sox2и Nanog и улучшения дифференциации потенциал, который согласуется с другими докладов19,20. Другие сообщили о более иммуномодулирующих свойств гиалинового хряща и43 регенерации44 с помощью MSCs сфероидов. Среди различных методов 3D культуры как паук колбы, вращающихся ячеек биореакторов, non сторонник пластины натуральных и синтетических матрицы, Хитозан фильмы кажутся привлекательными по нескольким причинам. Этот подход не требует дорогостоящего оборудования и является экономически эффективным по сравнению с non сторонник пластины с синтетическими матриц, поскольку chitosan является побочным продуктом рыбной промышленности. Культивирование клеток на пленках хитозана технически проста. Вместе, эти преимущества позволили бы клинического применения на больших масштабах45.
Двусторонние коленного сухожилия модель предложили здесь представляется приемлемым с точки зрения заболеваемости. Без осложнений было отмечено в недавнем исследовании исследования. Мы были особенно обеспокоены за риск стрессовых эффектов, вызванных дефектами, достаточно большой, чтобы обнаружить биомеханических и гистологические изменения. Эти опасения побудили выбор крыс над мышей для этого исследования, основанные на предыдущих исследований, связанных с размером и зрелостью сухожилия для моделей доклинических травмы. «Окно дефект» или коленного сухожилия Центральной третий дефект был описан в30,крысы и46 кролики31 учиться сухожилия исцеления и увеличение. Коленного сухожилия «окно дефекта» модель была обнаружена воспроизводимых для изучения сухожилия ремонт у крыс с гистология31,39, биомеханические тестирования30,31и ex vivo флуоресцирования визуализации31. В этом исследовании размер дефекта была эквивалентна Центральной трети коленного сухожилия и была унифицирована с проволокой Kirschner 0,99 мм в диаметре как шаблон. Эти измерения были адекватными для изучения сухожилие исцеление не вызывая послеоперационной разрыв. Из-за их больших размеров анатомические против мышей крыс может вместить более крупных дефектов, улучшение воспроизводимость травмы, лечения и мер исхода.
Протокол обезболивания вводят крыс в этом исследовании было эффективным в послеоперационного болевого, оцененной с РГС37,38. Этой системы скоринга здесь был выбран потому, что он ранее был проверен как обнаружение послеоперационные поведенческих изменений, отражающих боль в крыс37,38. РГС основан на признаки относительно простой для идентификации, например орбитальных ужесточения, уплощение носа/щеку и уха/нитевидные изменения. Крысы также поддерживал нормальной пищи на протяжении всего этого исследования, которое далее поддерживает эффективность этого протокола анальгезии. Действительно предыдущих докладах нашли взаимосвязь между послеоперационной боли и изменения веса тела у крыс, получавших нестероидные противовоспалительные средства, такие как Мелоксикам47. В этом исследовании был выбран этот агент и упреждающего управления был производным от исследования крыс37,48 и собак49, где администрация противовоспалительных агентов непосредственно перед хирургии было установлено ослабление хирургически индуцированной боли. Функция была оценили как дополнительного показателя послеоперационные боли, используя скоринг система, предназначенная для оценки использования обеих тазовых конечностей. Три мероприятия, выбранные здесь предоставляют общую оценку диапазона движения и готовность нести вес на тазовых конечностей. Эта система подсчета очков была взята из обоих исследований статических и динамических функционального восстановления в крыс50,51 и был разработан для сравнения время курс функциональных результатов наблюдается. Результаты указывают, что дефект двусторонних сухожилия индуцированной временное снижение функции в 7 дней, с возвращением к нормальной в течение 28 дней. Оценка функции появляется более чувствительны в обнаружении боли вторичных ортопедических условия чем РГС. Аналогичные функциональные тесты были использованы для оценки сухожилия исцеление как Ахиллес функционального индекса28, лапы и шага меры51, или другие макроскопические скоринга систем52.
Эта модель была разработана для уменьшения количество животных, охваченных в исследовании, при дифференциации результатов между необработанной сухожилий и два на основе стволовых клеток лечение. Эффекты лечения, протестированы в данном исследовании обсуждаются в другой публикации36. Модель, используемая здесь разрешено обнаружение лечения различия за счет использования внутреннего контроля в каждом крыса, в сочетании с биомеханической Неразрушающий сухожилий на 28 дней (данные, не представленные здесь).
Активированные кондиционером плазмы был выбран из-за его общего использования в качестве перевозчика для стволовых клеток, биосовместимость, доступность и текущих клинических приложений в управлении Тендинопатии53,54. Это может способствовали заживления обработанного сухожилий, но допускается местные хранения стволовых клеток, и это не мешает Сравнение лечения групп, поскольку оба включены такое же количество активированных кондиционером плазмы. Гистологические особенности без лечения сухожилий согласуются с предыдущего описания сухожилия исцеления, где некротических тканей и нарушается коллагеновая связки удаляются фагоцитоза и литические ферменты макрофагами во время фазы воспаления, который длится до 10 дней после травмы54,55,56. Пролиферативной стадии пролиферации и кровоснабжения участка ремонта величайших 28 дней после того, как сухожилия ремонта5857,. Мы нашли взаимосвязь между очевидным утолщение сухожилий, поперечного сечения областей и нижний модуль упругости образцов. На основе этих результатов, Гистологическая оценка, как представляется, отражают изменения ткани, которые не могут быть желательным и не приводят к биомеханической прочности, например дезорганизации коллагеновых волокон, ангиогенез и chondrogenesis. В будущем, эта модель способность различать методы лечения, основанные на гистологических характеристик может быть улучшена путем включения дополнительных критериев, как наличие tenocytes, внеклеточная матрица Организации, содержание протеогликана, и распределение эластиновых волокон52,59.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы имеют никакого конфликта интересов раскрыть.
Acknowledgments
Авторы хотели бы признать доктор Su, PhD, для ее статистического анализа данных. Авторы также поблагодарить доктора Мак-Клур, DVM, доктор DACLAM, за ее советы по анестезии и боль управления протоколы, используемые в исследовании. Этот проект был поддержан грантов от Западного университета медицинских наук канцелярии вице-президента для исследований (12678v) и USDA раздел 1433 фондов (2090).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS 10x | Hyclone | SH30258.01 | Consumable |
| Collagenase type IA | Worthington | LS004197 | Consumable |
| DMEM low glucose | Hyclone | SH30021.FS | Consumable |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30910.03 | Consumable |
| Penicillin/Streptomycin 100x | Hyclone | SV30010 | Consumable |
| Trypsin 0.25% | Hyclone | SH30042.01 | Consumable |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | Consumable |
| Trypan blue | Hyclone | SV30084.01 | Consumable |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma | D2650 | Consumable |
| Chitosan | Sigma | C3646 | Consumable |
| Sodium Hydroxide | Sigma | S8045 | Consumable |
| Bovine Serum Albumin | Hyclone | SH30574.01 | Consumable |
| Round bottom polystyrene tube | Corning | 149591A | Consumable |
| Mouse anti-horse CD44 (FITC) | AbD serotec | MCA1082F | Consumable |
| Mouse anti-rat CD90 (FITC) | AbD serotec | MCA47FT | Consumable |
| Mouse anti-horse MHC-II (FITC) | AbD serotec | MCA1085F | Consumable |
| Mouse IgG1 (FITC) - Isotype Control | AbD serotec | MCA928F | Consumable |
| Mouse monoclonal [SN6] to CD105 (FITC) | abcam | ab11415 | Consumable |
| Mouse IgG1 (FITC) - Isotype Control | abcam | ab91356 | Consumable |
| Mouse anti-human CD34 (FITC) | BD | BDB560942 | Consumable |
| Mouse IdG1 kappa (FITC) | BD | BDB555748 | Consumable |
| 7-AAD | BD | BDB559925 | Consumable |
| BD Accuri C6 Flow Cytometer | BD | Equipment | |
| Vacutainer 5 mL | Med Vet International | RED5.0 | Consumable |
| Acid-citrate-dextrose | Sigma | C3821 | Consumable |
| Calcium Chloride | Sigma | C5670 | Consumable |
| Sevoflurane | JD Medical | 60307-320-25 | Consumable |
| Rats | Charles River | Strain code: 400 | Experimental animal |
| Rat surgical kit | Harvard apparatus | 728942 | Equipment |
| Surgical Blade #15 | MEDLINE | MDS15115 | Consumable |
| Rat MD's Baytril (2 mg/Tablet), Rimadyl (2 mg/Tablet) |
Bio Serv | F06801 | Consumable |
| Polyglactin 910, 5-0 | Ethicon | J436G | Consumable |
| Eosin alchol shandon | Thermo scientific | 6766007 | Consumable |
| Harris Hematoxylin | Thermo scientific | 143907 | Consumable |
References
- Rossdale, P. D., Hopes, R., Digby, N. J., offord, K. Epidemiological study of wastage among racehorses 1982 and 1983. Vet Rec. 116 (3), 66-69 (1982).
- Black, D. A., Tucci, M., Puckett, A., Lawyer, T., Benghuzzi, H. Strength of a new method of achilles tendon repair in the rat - biomed 2011. Biomed Sci Instrum. 47, 112-117 (2011).
- Lake, S. P., Ansorge, H. L., Soslowsky, L. J. Animal models of tendinopathy. Disabil Rehabil. 30 (20-22), 1530-1541 (2008).
- Frank, C. B. Ligament structure, physiology and function. J Musculoskelet Neuronal Interact. 4 (2), 199-201 (2004).
- Godwin, E. E., Young, N. J., Dudhia, J., Beamish, I. C., Smith, R. K. Implantation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells demonstrates improved outcome in horses with overstrain injury of the superficial digital flexor tendon. Equine Vet J. 44 (1), 25-32 (2012).
- Smith, R. K., et al. Beneficial effects of autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells in naturally occurring tendinopathy. PLoS One. 8 (9), e75697 (2013).
- Fossett, E., Khan, W. S., Longo, U. G., Smitham, P. J. Effect of age and gender on cell proliferation and cell surface characterization of synovial fat pad derived mesenchymal stem cells. J Orthop Res. 30 (7), 1013-1018 (2012).
- Zaim, M., Karaman, S., Cetin, G., Isik, S. Donor age and long-term culture affect differentiation and proliferation of human bone marrow mesenchymal stem cells. Ann Hematol. 91 (8), 1175-1186 (2012).
- Leychkis, Y., Munzer, S. R., Richardson, J. L. What is stemness? Stud Hist Philos Biol Biomed Sci. 40 (4), 312-320 (2009).
- VandeVord, P. J., et al. Evaluation of the biocompatibility of a chitosan scaffold in mice. J Biomed Mater Res. 59 (3), 585-590 (2002).
- Griffon, D. J., Abulencia, J. P., Ragetly, G. R., Fredericks, L. P., Chaieb, S. A comparative study of seeding techniques and three-dimensional matrices for mesenchymal cell attachment. J Tissue Eng Regen Med. 5 (3), 169-179 (2011).
- Schwartz, Z., Griffon, D. J., Fredericks, L. P., Lee, H. B., Weng, H. Y. Hyaluronic acid and chondrogenesis of murine bone marrow mesenchymal stem cells in chitosan sponges. Am J Vet Res. 72 (1), 42-50 (2011).
- Ragetly, G., Griffon, D. J., Chung, Y. S. The effect of type II collagen coating of chitosan fibrous scaffolds on mesenchymal stem cell adhesion and chondrogenesis. Acta Biomater. 6 (10), 3988-3997 (2010).
- Ragetly, G. R., Griffon, D. J., Lee, H. B., Chung, Y. S. Effect of collagen II coating on mesenchymal stem cell adhesion on chitosan and on reacetylated chitosan fibrous scaffolds. J Mater Sci Mater Med. 21 (8), 2479-2490 (2010).
- Ragetly, G. R., et al. Effect of chitosan scaffold microstructure on mesenchymal stem cell chondrogenesis. Acta Biomater. 6 (4), 1430-1436 (2010).
- Ragetly, G. R., Slavik, G. J., Cunningham, B. T., Schaeffer, D. J., Griffon, D. J. Cartilage tissue engineering on fibrous chitosan scaffolds produced by a replica molding technique. J Biomed Mater Res A. 93 (1), 46-55 (2010).
- Slavik, G. J., Ragetly, G., Ganesh, N., Griffon, D. J., Cunningham, B. T. A replica molding technique for producing fibrous chitosan scaffolds for cartilage engineering. Journal of Materials Chemistry. 17 (38), 4095-4101 (2007).
- Griffon, D. J., Sedighi, M. R., Schaeffer, D. V., Eurell, J. A., Johnson, A. L. Chitosan scaffolds: interconnective pore size and cartilage engineering. Acta Biomater. 2 (3), 313-320 (2006).
- Huang, G. S., Dai, L. G., Yen, B. L., Hsu, S. H. Spheroid formation of mesenchymal stem cells on chitosan and chitosan-hyaluronan membranes. Biomaterials. 32 (29), 6929-6945 (2011).
- Cheng, N. C., Wang, S., Young, T. H. The influence of spheroid formation of human adipose-derived stem cells on chitosan films on stemness and differentiation capabilities. Biomaterials. 33 (6), 1748-1758 (2012).
- Webster, R. A., Blaber, S. P., Herbert, B. R., Wilkins, M. R., Vesey, G. The role of mesenchymal stem cells in veterinary therapeutics - a review. N Z Vet J. 60 (5), 265-272 (2012).
- Khan, M. H., Li, Z., Wang, J. H. Repeated exposure of tendon to prostaglandin-E2 leads to localized tendon degeneration. Clin J Sport Med. 15 (1), 27-33 (2005).
- Sullo, A., Maffulli, N., Capasso, G., Testa, V. The effects of prolonged peritendinous administration of PGE1 to the rat Achilles tendon: a possible animal model of chronic Achilles tendinopathy. J Orthop Sci. 6 (4), 349-357 (2001).
- van Schie, H. T., et al. Monitoring of the repair process of surgically created lesions in equine superficial digital flexor tendons by use of computerized ultrasonography. Am J Vet Res. 70 (1), 37-48 (2009).
- Schramme, M., Kerekes, Z., Hunter, S., Labens, R. Mr imaging features of surgically induced core lesions in the equine superficial digital flexor tendon. Vet Radiol Ultrasound. 51 (3), 280-287 (2010).
- Hast, M. W., Zuskov, A., Soslowsky, L. J. The role of animal models in tendon research. Bone Joint Res. 3 (6), 193-202 (2014).
- Warden, S. J. Animal models for the study of tendinopathy. Br J Sports Med. 41 (4), 232-240 (2007).
- Murrell, G. A., et al. Achilles tendon injuries: a comparison of surgical repair versus no repair in a rat model. Foot Ankle. 14 (7), 400-406 (1993).
- Ozer, H., et al. Effect of glucosamine chondroitine sulphate on repaired tenotomized rat Achilles tendons. Eklem Hastalik Cerrahisi. 22 (2), 100-106 (2011).
- Chan, B. P., Fu, S. C., Qin, L., Rolf, C., Chan, K. M. Pyridinoline in relation to ultimate stress of the patellar tendon during healing: an animal study. J Orthop Res. 16 (5), 597-603 (1998).
- Ni, M., et al. Tendon-derived stem cells (TDSCs) promote tendon repair in a rat patellar tendon window defect model. J Orthop Res. 30 (4), 613-619 (2012).
- Orth, P., Zurakowski, D., Alini, M., Cucchiarini, M., Madry, H. Reduction of sample size requirements by bilateral versus unilateral research designs in animal models for cartilage tissue engineering. Tissue Eng Part C Methods. 19 (11), 885-891 (2013).
- Kajikawa, Y., et al. Platelet-rich plasma enhances the initial mobilization of circulation-derived cells for tendon healing. J Cell Physiol. 215 (3), 837-845 (2008).
- Xu, W., et al. Human iPSC-derived neural crest stem cells promote tendon repair in a rat patellar tendon window defect model. Tissue Eng Part A. 19 (21-22), 2439-2451 (2013).
- Taguchi, T., et al. Influence of hypoxia on the stemness of umbilical cord matrix-derived mesenchymal stem cells cultured on chitosan films. J Biomed Mat Res B: Appl Biomat. , (2017).
- Griffon, D. J., et al. Effects of Hypoxia and Chitosan on Equine Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells Int. , 2987140 (2016).
- Roughan, J. V., Flecknell, P. A. Evaluation of a short duration behaviour-based post-operative pain scoring system in rats. Eur J Pain. 7 (5), 397-406 (2003).
- Sotocinal, S. G., et al. The Rat Grimace Scale: a partially automated method for quantifying pain in the laboratory rat via facial expressions. Mol Pain. 7, 55 (2011).
- Rosenbaum, A. J., et al. Histologic stages of healing correlate with restoration of tensile strength in a model of experimental tendon repair. HSS J. 6 (2), 164-170 (2010).
- Vidal, M. A., Walker, N. J., Napoli, E., Borjesson, D. L. Evaluation of senescence in mesenchymal stem cells isolated from equine bone marrow, adipose tissue, and umbilical cord tissue. Stem cells and development. 21 (2), 273-283 (2011).
- Patterson-Kane, J., Becker, D., Rich, T. The pathogenesis of tendon microdamage in athletes: the horse as a natural model for basic cellular research. J Compar Pathol. 147 (2), 227-247 (2012).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Bartosh, T. J., et al. Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (31), 13724-13729 (2010).
- Zhang, K., Yan, S., Li, G., Cui, L., Yin, J. In-situ birth of MSCs multicellular spheroids in poly(L-glutamic acid)/chitosan scaffold for hyaline-like cartilage regeneration. Biomaterials. 71, 24-34 (2015).
- Montanez-Sauri, S. I., Beebe, D. J., Sung, K. E. Microscale screening systems for 3D cellular microenvironments: platforms, advances, and challenges. Cellular and molecular life sciences : CMLS. 72 (2), 237-249 (2015).
- Butler, D. L., et al. The use of mesenchymal stem cells in collagen-based scaffolds for tissue-engineered repair of tendons. Nat Protoc. 5 (5), 849-863 (2010).
- Brennan, M. P., Sinusas, A. J., Horvath, T. L., Collins, J. G., Harding, M. J. Correlation between body weight changes and postoperative pain in rats treated with meloxicam or buprenorphine. Lab Anim (NY). 38 (3), 87-93 (2009).
- Ramon-Cueto, A., Cordero, M. I., Santos-Benito, F. F., Avila, J. Functional recovery of paraplegic rats and motor axon regeneration in their spinal cords by olfactory ensheathing glia. Neuron. 25 (2), 425-435 (2000).
- Arculus, S. L. Use of meloxicam as an analgesic in canine orthopaedic surgery. Vet Rec. 155 (24), 784 (2004).
- Bervar, M. Video analysis of standing--an alternative footprint analysis to assess functional loss following injury to the rat sciatic nerve. J Neurosci Methods. 102 (2), 109-116 (2000).
- Perry, S. M., Getz, C. L., Soslowsky, L. J. Alterations in function after rotator cuff tears in an animal model. J Shoulder Elbow Surg. 18 (2), 296-304 (2009).
- Stoll, C., et al. Healing parameters in a rabbit partial tendon defect following tenocyte/biomaterial implantation. Biomaterials. 32 (21), 4806-4815 (2011).
- Hankemeier, S., et al. Bone marrow stromal cells in a liquid fibrin matrix improve the healing process of patellar tendon window defects. Tissue Eng Part A. 15 (5), 1019-1030 (2009).
- Silver, I. A., et al. A clinical and experimental study of tendon injury, healing and treatment in the horse. Equine Vet J Suppl. (1), 1-43 (1983).
- Enwemeka, C. S. Inflammation, cellularity, and fibrillogenesis in regenerating tendon: implications for tendon rehabilitation. Phys Ther. 69 (10), 816-825 (1989).
- Goldin, B., Block, W. D., Pearson, J. R. Wound healing of tendon--I. Physical, mechanical and metabolic changes. J Biomech. 13 (3), 241-256 (1980).
- Lyras, D. N., et al. The effect of platelet-rich plasma gel in the early phase of patellar tendon healing. Arch Orthop Trauma Surg. 129 (11), 1577-1582 (2009).
- Oshiro, W., Lou, J., Xing, X., Tu, Y., Manske, P. R. Flexor tendon healing in the rat: a histologic and gene expression study. J Hand Surg Am. 28 (5), 814-823 (2003).
- Visser, L. C., Arnoczky, S. P., Caballero, O., Gardner, K. L. Evaluation of the use of an autologous platelet-rich fibrin membrane to enhance tendon healing in dogs. Am J Vet Res. 72 (5), 699-705 (2011).
