Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

העשרה של Lipoproteins חיידקי והכנה של N-מסוף Lipopeptides לקביעת מבנה באמצעות ספקטרומטר מסה

Published: May 21, 2018 doi: 10.3791/56842
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Pennsylvania State University

Summary

העשרת של חיידקי lipoproteins באמצעות שלב ללא יונית חומרים פעילי שטח למחיצות בשיטת מתואר שימוש ישיר במבחני TLR או יישומים אחרים. צעדים נוספים מפורטים להתכונן lipopeptides tryptic N-מסוף אפיון מבניים באמצעות ספקטרומטר מסה.

Abstract

Lipoproteins הם המרכיבים החשובים של המעטפה תא החיידק חזק מפעילי בתרבית של מערכת החיסון המולדת. למרות חשיבות שלהם תא פיזיולוגיה ואימונולוגיה, הרבה נשאר to be גילה על הרומן ליפופרוטאין טפסים, איך הם מסונתז וכן השפעת צורות שונות על חסינות המארח. כדי לאפשר מחקרים יסודיים lipoproteins, פרוטוקול זה מתאר שיטה של ליפופרוטאין חיידקי העשרה, הכנה של lipopeptides tryptic N-מסוף קביעת מבניים על ידי לייזר בסיוע מטריקס desorption יינון-שעת הטיסה ספקטרומטר מסה (MALDI-TOF MS). הרחבה על שלב טריטון X-114 הוקמה למחיצות בשיטת החילוץ ליפופרוטאין והעשרה של קרום התא חיידקי, הפרוטוקול כוללת צעדים נוספים כדי להסיר ליפופרוטאין שאינם מזהמים, ליפופרוטאין התשואה הגדלת ו טוהר. מאז lipoproteins משמשים בדרך כלל במבחני קולטן דמוי-אגרה (TLR), זה קריטי קודם לאפיין את מבנה N-מסוף על ידי גב' MALDI-TOF שעל זה, שיטה מוצג לבודד פפטידים הידרופובי מרוכז מועשר ב- N-מסוף lipopeptides מתאימים לניתוח ישיר מאת Lipoproteins MS/גב' MALDI-TOF המופרדים על ידי נתרן Dodecyl סולפט פולי-אקרילאמיד בג'ל (מרחביות-עמוד) מועברים קרום ניטרוצלולוזה, מתעכל בחיי עיר עם טריפסין, שטף ברצף כדי להסיר פפטידים tryptic הקוטב, סוף סוף eluted עם הכלורופורם-מתנול. כאשר משולב עם MS של פפטידים trypsinized קוטבי יותר מפתרונות לשטוף, שיטה זו מספקת את היכולת לזהות את ליפופרוטאין והן לאפיין את קצה אמיני בניסוי יחיד. נתרן מכוונת adduct היווצרות יכול גם להיות מועסק ככלי לקידום ספקטרה פיצול מבנית מקיף יותר. בסופו של דבר, העשרה של lipoproteins והנחישות של מבנים N-מסוף שלהם יאפשר מחקרים מקיפים יותר על מחלקה זו בכל מקום של חלבונים חיידקיים.

Introduction

חיידקי lipoproteins מאופיינים שנשמרת N-מסוף השומנים-השתנה ציסטאין זה מעגן את התחום חלבון הכדוריים השטח קרום התא. הם אוניברסלית מופצים בחיידקים, המהווים 2-5% של כל הגנים סלולר בתוך הגנום טיפוסי1. Lipoproteins לשחק תפקידים חיוניים במגוון רחב של תהליכים תאיים, לרבות ספיגת התזונתי, אותות, הרכבה של מתחמי חלבון, ושמירה על התא מעטפת המבנית2. של חיידקים פתוגניים, lipoproteins לשמש התקפה אלימה-גורמים-3,-4. במהלך זיהום, הכרה של N-מסוף lipopeptides על ידי קולטן דמוי-אגרה (TLR) 2 מסית תגובה חיסונית מולדת להסרת פתוגנים פולשים. בהתאם למצב acylation N-מסוף, lipoproteins מזוהים בדרך כלל על ידי קומפלקסים heterodimeric TLR2 חלופי. TLR2-TLR1 מזהה lipopeptides N-acylated, בעוד TLR2-TLR6 איגודים ליפופפטיד חינם α-אמינו טרמיני (termini). פעם מאוגדים, המסלולים איתות להתכנס לזירוז הפרשת proinflammatory-ציטוקינים-3,-4.

בעבר חשבו כי lipoproteins של חיידקים גראם חיוביים היו diacylated, ואלה מתוך חיידקים גראם שליליים היו triacylated, שונות היעדרות או נוכחות של חומצת שומן מקושרים אמיד על השאריות ציסטאין שנשמרת N-מסוף. הנחה זו נתמכה על ידי חוסר רצף orthologs בתוך הגנום גראם חיוביים כדי Lnt, טרנספראז גראם שליליים N-acyl השומן צורות lipoproteins triacylated5. עם זאת, מחקרים שנעשו לאחרונה חשפו ליפופרוטאין triacylation ב Firmicutes גראם חיוביים זה חוסר lnt, וכן שלושה מבנים ליפופרוטאין N-מסוף הרומן, כינה את peptidyl, lyso ו- N -acetyl טפסים6,7 ,8. ממצאים אלה מעלים שאלות על טפסים אפשרי ובכל זאת-כדי--שיגלו ליפופרוטאין, לצד שאלות עקרוניות על איך נוצרים אלה lipoproteins הרומן, איזו מטרה פיזיולוגיים או יתרון צורות שונות להקנות. יתר על כן, הם מדגימים בבירור היכולת הנוכחית של גנומיקה לחזות המבנה ליפופרוטאין. ואכן, לאחרונה זוהו מחלקה הרומן של ליפופרוטאין N-acyl השומן transferases, שנקרא Lit, Enterococcus faecalis , Bacillus קובו שגורם lipoproteins lyso-טופס9. אפשרות זו מציינת את הצורך לאמת השפעול ליפופרוטאין מבנה, אשר יכול להיות מאתגר עקב ואופיים הידרופובי מאד מוגבלת שיטות הזמינות לאפיין את המבנה המולקולרי שלהם.

כדי להקל על מחקרים על ליפופרוטאין אינדוקציה של התגובה החיסונית מארח את, כמו גם נחישות מבניים N-מסוף, אנחנו הסתגלו מספר פרוטוקולים שתואר קודם לכן על מנת לטהר lipoproteins חיידקי ולהכין את N-מסוף tryptic lipopeptides לניתוח-MALDI-TOF MS6,10,11,12. Lipoproteins מועשרים באמצעות שלב X-114 טריטון (המכונה מעתה ואילך חומרים פעילי שטח או TX-114) הוקמה למחיצות בשיטת, עם אופטימיזציה להסיר ההרסנית הלא-lipoproteins ולהגדיל את התשואה ליפופרוטאין. Lipoproteins אלו מתאימים לשימוש ישיר במבחני TLR או לטיהור עוד יותר על ידי עמודים מרחביות. עבור MALDI-TOF MS, העברה של ליפופרוטאינים ניטרוצלולוזה ממברנה מספק לפיגום לעיכול יעיל בחיי עיר טריפסין, שטיפה, עוקבות • תנאי מהמשטח ממברנה, וכתוצאה מכך מאוד מטוהר lipopeptides N-מסוף. ניטרוצלולוזה הוכח כדי להקל על הטיפול מדגם ולשפר את רצף כיסוי מתאים מאוד הידרופובי פפטידים ממברנלי אינטגרלי חלבונים13,14, וכן lipoproteins9,10 . השיטה יש יתרון נוסף של fractionating פפטידים בהתבסס על קוטביות, כך ניתן לנתח פתרונות ביניים שטיפת לזיהוי החלבון בוודאות גבוהה בד בבד עם N-מסוף קביעת מבניים בניסוי יחיד . פרוטוקול זה ייחודי נתרן מכוונת תכונות adduct צורה כדי לקדם את האב יון פיצול לכיוון dehydroalanyl יונים במהלך MS/MS, בסיוע במשימה מבנית של המדינה - acylation N. קצה אמיני הוא שני ביותר משתנה מפתח התכונה הקשורים לזיהוי TLR של lipoproteins. יחדיו, פרוטוקול זה אפשרה מחקרים אינטנסיביים לשחזור על lipoproteins, עם השלבים בודדים של טיהור ונחישות מבניים על-ידי MS MALDI-TOF להתאים בקלות בהתאם המטרה הכוללת של הניסוי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. התא צמיחה פירוק

  1. לגדול חיידקים ציר סויה tryptic 15 mL (TSB) או מדיה עשירים דומה לשלב מעריכי מאוחר (OD600 של 1.0-1.5). קציר תאים על ידי צנטריפוגה, לשטוף פעם עם באגירה טריס תמיסת מלח/EDTA tbse (ב), להמשיך עם פרוטוקול או להקפיא עד השימוש.
    הערה: tbse ב: 20 מ מ טריס-הידרוכלוריד (HCl), pH 8.0, 130 מ מ נתרן כלורי (NaCl), חומצה ethylenediaminetetraacetic 5 מ מ (EDTA)). ליפופרוטאין ביטוי ושינוי יכול להיות מושפע על ידי תנאי הגידול (למשל חומציות, מליחות, צמיחה מדיה) ו- שלב הצמיחה15. צמיחת תאים וניתן לשנותם לפי הצורך, אבל 15-mL של תאים מומלץ תכשיר יחיד של lipoproteins כפי ביומסה עודף יכול להקטין את התשואה ליפופרוטאין. הכנה 15-mL אחת מניבה בדרך כלל מספיק דוגמת עבור טעינה אופטימלית של ~ 2-4 נתיבים על ג'ל מיני מרחביות-דף רגיל.
  2. Resuspend תאים μL 800 tbse עם 1 מ phenylmethyl sulfonyl פלואוריד (PMSF) ו ליזוזים 0.5 מ"ג/מ"ל. פתרון להעביר צינור microcentrifuge הליכי 2.0-mL עם פקקי בורג, o-ring, תקופת דגירה של 20 דקות ב 37 º C.
    הערה: מינים מסוימים אינם רגישים פירוק על ידי ליזוזים. צריך ישמש כתחליף אנזים lytic המתאים כדי לסייע פירוק.
  3. להוסיף ~ 800 μL 0.1 מ מ אסתטיים/סיליקה חרוזים הצינור, לשבש תאים ע י ניעור במהירות המרבית (7,000 סל ד) על מהמגן 5 מחזורים של 30 s כל אחד, עם 2 דקות לנוח על הקרח בין כל מחזור.
  4. צנטריפוגה מדגם ב 3000 g x עבור 5 דקות ב 4 ° C (על גלולה חרוזים ותאים רצופה). להעביר את תגובת שיקוע צינור 2.0-mL microcentrifuge ולשמור על קרח.
  5. להוסיף 200 μL tbse ב בגדר הנותרים ולחזור מהמגן מחזור נוסף. צנטריפוגה (כמפורט לעיל) ולשלב תגובת שיקוע עם תגובת שיקוע הקודם (צריך להיות הנפח הכולל של μL 800-1000).

2. העשרה של Lipoproteins מאת TX-114 שלב החלוקה למחיצות

  1. להשלים את תגובת שיקוע עם חומרים פעילי שטח TX-114 כדי ריכוז סופי של 2% (vol/כרך) על-ידי הוספת אמצעי שווה של 4% (vol/כרך) חומרים פעילי שטח ב- tbse ב קר כקרח, דגירה על קרח לשעה ערבוב על-ידי היפוך כל ~ 15 דקות.
    הערה: כאשר מקורר, תגובת שיקוע חומרים פעילי שטח יהיו miscible.
  2. להעביר את הצינור באמבט מים 37 ° C, תקופת דגירה של 10 דקות לגרום בשלב ההפרדה. Centrifuge הדגימה ב 10,000 g x 10 דקות על טמפרטורת החדר כדי לשמור על הפרדה דו-phasic.
  3. בעדינות פיפטה את השלב מימית עליון וזורקים. הוסף tbse ב קר כקרח לשלב חומרים פעילי שטח נמוכה יותר למלא את הצינור לאמצעי האחסון המקורי שלה ' ' היפוך ' כדי לערבב. דגירה על קרח למשך 10 דקות.
  4. להעביר את הצינור באמבט מים 37 ° C, תקופת דגירה של 10 דקות לגרום בשלב ההפרדה, לאחר מכן צנטריפוגה ב 10,000 g x 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  5. חזור על שלבים 2.3 2.4 פעם נוספת עבור סכום כולל של הפרדות צבע 3. להסיר את שלב מימית עליון וזורקים.
  6. הסר את צניפה של חלבונים זירז שנוצר במהלך עקירות (המופיעה בתחתית הצינורית), על ידי הוספת נפח 1 של tbse ב קר כקרח לשלב חומרים פעילי שטח. צנטריפוגה ב 4 ° C-g x 16,000 למשך 2 דקות הצניפה חלבונים לא מסיסים.
    הערה: מדגם צריכים להישאר חד-פאזי. אם שלב ההפרדה מתרחשת, מחדש להירגע מדגם, צנטריפוגה שוב. בגדר מורכב בדרך כלל של ליפופרוטאין שאינם מזהמים, אך ניתן להיעזר לצורך ניתוח נוסף.
  7. מיד להעביר את תגובת שיקוע צינור microcentrifuge 2.0-mL טריים המכילים 1250 μL של אצטון 100%. פיפטה למעלה ולמטה ביסודיות לשטוף את הדגימה מהקצה כפי שזה יהיה צמיגה. לערבב על-ידי היפוך, דגירה בין לילה ב-20 ° C, כדי לזרז את החלבון.
  8. Centrifuge המדגם-16,000 g x עבור 20 דקות בטמפרטורת החדר כדי הצניפה lipoproteins בתשומת לב הכיוון של הצינור. Lipoproteins יהוו סרט דק, לבן לאורך הקיר החיצוני של הצינור.
  9. רחץ גלולה פעמיים עם אצטון 100%. Decant אצטון ולאפשר הדגימה כדי אוויר יבש.
  10. הוסף 20-40 μL 10 מ מ טריס-HCl, pH 8.0 או תקן Laemmli מרחביות-דף לדוגמה מאגר16 ' resuspend באופן יסודי על-ידי pipetting למעלה ולמטה הקיר עם ליפופרוטאינים precipitated. לגרד את הצד של הצינור עם קצה פיפטה מכך lipoproteins.
    הערה: Lipoproteins יתמוסס לא במאגר טריס, אבל מעדיף ליצור השעיה.
    1. לאחסן lipoproteins ב-20 ° C עד השימוש.

3. מרחביות-דף Electroblotting, מכתים עם צבע מאכל פונסו S

  1. Lipoproteins שונים על ידי שימוש בשיטות הרגילות16עמודים מרחביות.
    הערה: האחוז אקרילאמיד ג'ל המתאים משתנה בהתאם את השימוש המיועד והגודל של lipoproteins. כאן, faecalis אי lipoproteins הופרדו מעל 10% ג'ל טריס-גליצין, בעוד 16.5% ג'ל טריס-tricine שימש את ליפופרוטאין e. coli קטנים ל"י/נ17.
  2. העברה ליפופרוטאינים קרום העברה ניטרוצלולוזה באמצעות הליך רגיל electroblotting.
    הערה: לבצע העברה חצי יבש באמצעות מרחביות מאגר פלוס 0.1% Bjerrum שייפר-נילסן-25 V. 1.3 אמא במשך 15 דקות18. לחלופין, ניתן להשתמש polyvinylidene difluoride (PVDF) ממברנה, אולם כפי שהוא יותר הידרופובי מאשר ניטרוצלולוזה, זה עשוי להפחית יעיל • תנאי של lipopeptides הידרופוביות של הקרום על צעדים מאוחר יותר.
  3. להעביר את הקרום ניטרוצלולוזה מיכל ולכסות עם צבע מאכל פונסו S פתרון (0.2% (w/v) צבע מאכל פונסו S בחומצה אצטית 5%). רוק בעדינות במשך 5 דקות או עד אדום-ורוד להקות גלויים.
  4. יוצקים את צבע מאכל פונסו S פתרון ולשטוף היטב את הקרום ניטרוצלולוזה עם dH2O כדי להסיר עודפי כתם.
    הערה: להקות שהוכתמו צבע מאכל פונסו destain במהירות. אם להקות נעלמים, חזור על התהליך מוכתמים.
  5. עם סכין גילוח נקי, לסלק את הלהקה הרצוי ואת העברת צינור microcentrifuge. לשטוף שלוש פעמים עם 1 מ"ל של dH2O עד destain לגמרי את הלהקה.
    הערה: הפרוטוקול אפשר לעצור כאן. חנות המקטע נכרת מכוסה מים ב-20 ° C עד השימוש.
  6. להעביר את המקטע על משטח נקי, עם סכין גילוח נקי, חותכים לקוביות רצועת ניטרוצלולוזה לחתיכות קטנות של 1 מ מ x 1 מ מ. לאסוף את השברים לתוך צינור microcentrifuge מחייב חלבון נמוכה 0.5-mL.
  7. לשטוף את החלקים פעמיים עם 0.5 מ"ל של טריות 50 מ"מ אמוניום ביקרבונט (NH4HCO3), pH 7.8 במים כיתה ביצועים גבוהים כרומטוגרפיה נוזלית (HPLC).

4. tryptic עיכול, חילוץ ליפופפטיד ניטרוצלולוזה ממברנה, התצהיר אל היעד MALDI ולאחר קירור והקפאה

  1. Resuspend חתיכות ניטרוצלולוזה ב 20 μL של פתרון μg/mL 20 של טריפסין 50 מ"מ NH4HCO3, pH 7.8 במים כיתה HPLC. מערבולת לערבב, ואז לסובב בקצרה על מנת להבטיח כי כל החלקים מכוסים באופן מלא על-ידי הפתרון טריפסין. לכסות את המכסה צינור באמצעות סרט פרפין כדי למנוע אידוי, דגירה תקציר בן לילה ב 37 º C.
  2. ספין המדגם-16,000 g x עבור 30 s והסר הנוזל על-ידי pipetting.
    הערה: פעולה זו מסירה פפטידים הידרופילית trypsinized שבדק יכול להיות מאוחר יותר על-ידי MS MALDI-TOF לזיהוי החלבון.
  3. להוסיף 50 μL של 0.5% חומצה trifluoroacetic (TFA) במים כיתה HPLC. מערבולת לערבב, ואז לסובב את הדגימה בקצרה כדי להבטיח שכל החלקים מכוסים על-ידי הפתרון. תקופת דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר. הסר את הנוזל על ידי pipetting.
    התראה: TFA מזיק אם נשאף. לטפל בזהירות ולהשתמש בשכונה fume כימי. יש להימנע ממגע עם העור.
  4. חזור על שלב 4.3 עם 50 μL של 10% acetonitrile במים כיתה HPLC.
    התראה: Acetonitrile מזיק אם נשאף. לטפל בזהירות ולהשתמש בשכונה fume כימי. יש להימנע ממגע עם העור.
  5. חזור על שלב 4.3 עם 50 μL של 20% acetonitrile במים כיתה HPLC.
    הערה: פעולה זו מסירה כל פפטידים הידרופובי בינוני באופן רופף חייב את ניטרוצלולוזה.
  6. Elute את lipopeptides בחוזקה מאוגד, להוסיף 15 μL של 10 מ"ג/מ"ל טריים α-cyano-4-hydroxycinnamic חומצה (CHCA) מטריקס מומס כלורופורם-מתנול (2:1, וי/v), תקופת דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר עם vortexing לסירוגין.
    1. לחלופין, הוסף 15 μL כלורופורם מתנול elute lipopeptides ולערבב עם מטריקס במועד מאוחר יותר. מטריצות אחרים, כגון חומצה 2, 5-dihydroxybenzoic (DHB), צריך להיבדק חלופות CHCA כמו אם תוצאות לא מספקות מתקבלים על חיבור ליפופפטיד מסוים.
      התראה: כלורופורם והן מתנול מזיקים אם נשאף. לטפל בזהירות ולהשתמש בשכונה fume כימי. יש להימנע ממגע עם העור.
    2. אופציונלי: כדי לקדם את הנתרן adduct היווצרות, מוסף את הפתרון של CHCA ב כלורופורם-מתנול עם המימית סודיום ביקרבונט (NaHCO3) ריכוז סופי של 1 מ מ.
  7. ספין המדגם בקצרה. עם פיפטה, בזהירות להעביר את הנוזל צינור microcentrifuge החדש של איגוד חלבון נמוכה. פתרון זה יכיל את עיקר lipopeptides N-מסוף.
    הערה: ניטרוצלולוזה עשוי באופן חלקי או מלא להמיס הפתרון כלורופורם-מתנול. זה לא ישפיע באופן שלילי MS תוצאות, עשוי לשמש כשיטת חלופי להגברת ליפופפטיד החזרה. ממברנה PVDF יתמוסס לא באותו אופן.
  8. להפקיד μL 1 של lipopeptides eluted עם CHCA אל מטרה MALDI פלדה מלוטשת.
    הערה: הכלורופורם-מתנול יתפוגג במהירות, משאיר מאחורי מגובשת CHCA, lipopeptides ΜL 1 שני אופציונלי aliquot ניתן להפקיד על אותה נקודה כדי להגדיל את ריכוז לדוגמה. כלורופורם-מתנול עלול להתפשט באופן משמעותי לאחר ההצהרה על המטרה, ככזה, להקפיד להימנע מדגם ערבוב על המטרה. מומלץ להפקיד ולירות כתמים מרובים של כל דגימה.
  9. מיד להמשיך ספקטרומטר מסה. סרוק בכל התחומים של המקום עבור ליפופפטיד אות, במיוחד אם המקום מכיל שתי שכבות של המדגם, כפי השכבה השנייה עשויה לדחוף את lipopeptides בטבעת החיצונית של המקום.
    הערה: עוצמת לייזר ההתחלתי המומלץ הוא 25%, אבל ייתכן צורך להגדיל בעוצמה על רכישת אות לסכם מרובים ספקטרה (סריקות 20 או יותר) כדי להשיג יחס אות לרעש נאותה. כאן, ספקטרה נרכשו על מכשיר MALDI-תוף-תוף (ראה את הטבלה של חומרים) באמצעות שיטה מוגדר-המפעל מכשיר איתור יון חיובי המשקף על פני הטווח מ/z ' 700-3500 '. המכשיר היה מכויל בתערובת פפטיד tryptic אלבומין שור (BSA).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

תיאור סכמטי של הפרוטוקול מסופק באיור1. השבר מועשרת ליפופרוטאין שחולצו מן Enterococcus faecalis בקרת האוויר 19433 על ידי TX-114 מוצג באיור2. לשם השוואה, מוצג גם התבנית סימון של השבר זירז חלבון. חלבונים מן השבר הזה שאושרו על-ידי MALDI-MS להיות מאוד שופע מזהמות חלבונים חוץ lipoproteins (טבלה 1). ספקטרום המוני באיור 3 להדגים יון tryptic פפטיד הפרופיל של ליפופרוטאין faecalis אי PnrA המתרחש עם שוטף עוקבות של PnrA ניטרוצלולוזה מכורך עם ממיסים של הגדלת קוטביות (שיא הקצאות המופיעים בטבלה 2). איור 4 מציג את N-מסוף אפיון מבניים של PnrA כפי שנקבע על-ידי MALDI-TOF MS/MS, חשיפת אבחון N- acylated dehydroalanyl פיקס בקנה אחד עם הצורה lyso-ליפופרוטאין. איור 5 ממחישה את השפעת נתרן adduct היווצרות על פיצול, עם יונים האב sodiated מעדיפים מזימות לטובת N- acylated dehydroalanyl יונים.

Figure 1
איור 1: סכימטי של הפרוטוקול. Lipoproteins מועשרים ידי TX-114 שלב החלוקה למחיצות ואת שניתן בשימוש ישירות, בדרך כלל מבחני TLR או נוסף מטוהרת על-ידי מרחביות-דף לקביעת מבנית. Lipoproteins מועברים ניטרוצלולוזה, מתעכל עם טריפסין, שטף stepwise, ולא את lipopeptides הנוצרת eluted עם הכלורופורם-מתנול עבור ניתוח מבנה על-ידי MALDI-MS. הפתרונות שטיפת טריפסין, ניטרוצלולוזה ייתכן יישמר חלבון זיהוי וניתוח MS. עם: עם; TFA: חומצה trifluoroacetic; לחצן מצוקה: acetonitrile; CHCA: חומצה α-cyano-4-hydroxycinnamic; לבחור: אופציונלי; MALDI: לייזר בסיוע מטריקס desorption יינון; MS: ספקטרומטר מסה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: פרופיל של TX-114 מועשר מהחלבונים faecalis א. ג'ל טריס-גליצין מרחביות-דף 10% מוכתם כחול () וקרום ניטרוצלולוזה המתאימים צבעונית עם צבע מאכל פונסו S (B) לחשוף את פסי צבע שונה תבנית בין השבר זירז חלבון ("PPT") וטיהר את Coomassie lipoproteins ("LP"). הלהקות שהוכתמו Coomassie המצוין טוחנות, כמו lipoproteins שאינו מזוהה MALDI-MS של פפטידים tryptic (ראה טבלה 1). PnrA היה מזוהה, נותחו על ידי הפרוטוקול כפי שיתואר בהמשך. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: שינויים בפרופיל ושפע יון עם קוטביות של ניטרוצלולוזה לשטוף פתרונות. (א) השבר טריפסין מציג מספר קטעים פפטיד פנימי המקביל ליפופרוטאין faecalis אי ש-pnra ציינו באיור2. Acetonitrile (ג) 10% (B) ו-20% לשטוף שברים הצג שינויים בעוצמת האות לבין ירידה במספר הכולל של פסגות בודדים. (ד) השבר הסופי • תנאי מאוד מועשר על ליפופפטיד N-מסוף ב m /z 997, שמצויינים בכוכבית (*). האינטנסיביות של כל ספקטרום מנורמל ( א) לשם השוואה של עוצמת האות. פסגות בגושים, רצפים שהוקצו מפורטים בטבלה 2. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

הלהקה זיהוי חלבונים ההצטרפות מס משקל מולקולרי est. ספירת פפטיד
1 גורם התארכות Tu gb | EOL37301.1 | 43,387 15
2 NADH peroxidase gb | EOL34572.1 | 49,520 9
3 פירובט דהידרוגנאז E1component, אלפא יחידה משנית gb | EOL34709.1 | 41,358 12
4 פירובט דהידרוגנאז E1 רכיב, בטא יחידה משנית gb | EOL34710.1 | 35,373 19
5 בשנות ה-30 ribosomal חלבון S2 gb | EOL33066.1 | 29,444 16
6 בשנות ה-30 ribosomal חלבון S3 gb | EOL37312.1 | 24,355 14

טבלה 1: חלבונים זירז הם ליפופרוטאין שאינם מזהמים. חלבונים זוהו על ידי תקציר tryptic ו- MALDI-MS באמצעות תקן ב ג'ל עיכול פרוטוקולים19 , מוצגים ברשימה מלמעלה למטה באותו סדר הופעתם הג'ל Coomassie באיור2. כל חלבון מזוהה עם מרווח הביטחון (מלשין) גדול מ- 95%.

שיא מסה תיאורטי תפקיד חלבונים לא. אתרי חיתוך שלא נענתה רצף פפטיד
1 631.3409 170-176 0 GVADAAK
2 675.4035 316-321 1 TKEAVK
3 826.4093 163-169 0 FQAGFEK
4 893.4839 121-128 0 NVVSATFR
5 943.5359 240-247 0 VWVIGVDR
6 1040.5047 188-197 0 YAASFADPAK
7 1200.6331 273-284 0 GVGTAVQDIANR
8 1316.6997 290-301 0 FPGGEHLVYGLK
9 1385.7827 83-94 0 FNTIFGIGYLLK
10 1432.743 149-162 0 VGFVGGEEGVVIDR
11 1568.7802 259-272 1 DGKEDNFTLTSTLK
12 1672.8289 240-254 1 VWVIGVDRDQDADGK
13 1707.8184 129-145 0 DNEAAYLAGVAAANETK
14 1724.8027 35-49 0 SFNQSSWEGLQAWGK
15 1797.9228 257-272 2 TKDGKEDNFTLTSTLK
16 1872.9854 285-301 1 ALEDKFPGGEHLVYGLK
17 1945.9613 230-247 1 DLNESGSGDKVWVIGVDR
18 2240.1345 149-169 1 VGFVGGEEGVVIDRFQAGFEK
19 2675.2543 230-254 2 DLNESGSGDKVWVIGVDRDQDADGK

בטבלה 2: נצפו גושים וגבישים פפטידים tryptic התואמת את. אין סיליקו טריפסין העיכול של faecalis אי PnrA (GenBank: EOL37280.1) היה מבוצעים על-ידי20,PeptideMass21, ומאפשר עד שניים פספס לחתוך אתרים. ההמונים תיאורטי של הפסגות מובחנים הספקטרום באיור 3 מפורטים, יחד עם הרצפים פפטיד המתאימים.

Figure 4
איור 4: MS MALDI-תוף של ליפופרוטאין אי faecalis PnrA. (א) האב MS הספקטרום של m /z 997 אזור המתאים ליפופפטיד N-מסוף של faecalis אי PnrA. (B) MS/MS השיא ליפופפטיד מגלה שזה הטופס lyso, עם אבחון N- acylated dehydroalanyl פפטיד פרגמנט יון הפסגה שמצויינים בכוכבית (*). המבנה elucidated מוצג (C). דמות זו שונתה מן הפרסום הקודם9. מהיסודות: שהבוטות היחסית אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5: נתרן adduct היווצרות מקדמת האב פיצול יון לכיוון יונים ליפופפטיד dehydroalanyl. (א) MALDI-TOF ספקטרום של פפטיד ליפופרוטאין ל"י/נ N-מסוף e. coli ללא (עקבות טורקיז) ועם (סימנים כחולים) התוספת של סודיום ביקרבונט. תוספת של סודיום ביקרבונט כדי השבר eluted הסופי גורמת עלייה Da 22 מן המסה המחושבת של ליפופפטיד האב. בהשוואה הספקטרום MS/MS של יונים protonated (B), קשת MS/MS התואם יונים sodiated (ג) מציגה פיצול מועדף משמעותית לכיוון N-acyl השומן-יון dehydroalanyl דרך נייטרלי חיסול של moiety diacylthioglyceryl, שמצויינים בכוכבית (*). המבנה של פפטיד tryptic triacylated ל"י/נ N-מסוף האב (ד) ואת N-acyl השומן-מתוארים dehydroalanyl פפטיד פרגמנט יון (E) . דמות זו שונתה מן הפרסום הקודם9. מהיסודות: שהבוטות היחסית אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקול במסמך זה מתאר שני שלבים של ליפופרוטאין אפיון: העשרה על ידי TX-114 שלב קביעת חלוקה למחיצות ומבניים על-ידי MS MALDI-TOF. במהלך החילוץ TX-114, צנטריפוגה נוספים הסרת מזהמים חלבונים לזרז במהלך תהליך זה, ואחריו אצטון משקעים להניב lipoproteins מועשר. על ידי הגבלת היקף כל הכנה 15-mL שווה של תאים, מספר דגימות יכול להיות בקלות מעובד במקביל, אם רצונך בכך, איחדו בסוף הפרוטוקול.

עבור ניתוח מבנה על-ידי MS, העברה של ליפופרוטאינים ניטרוצלולוזה מקלה על עיכול טריפסין, כביסה ו • תנאי עוקבות של הקרום. בידיים שלנו, גישה זו הוכיחה כי עדיף על בתיווך דטרגנט החילוץ של אטמי מסורתי לזיהוי ג'ל, כפי ליפופרוטאינים הקשורים עם פני השטח של קרום ניטרוצלולוזה, לא נעוץ לזיהוי. העמותה ליפופרוטאין עם המשטח ניטרוצלולוזה במידה רבה גם מונע את הבעיה הנפוצה של ספיחה ספציפי מיכל משטחים על ידי פפטידים הידרופובי. • תנאי stepwise החלקים ניטרוצלולוזה מסיר יותר הידרופיליות, פנימי tryptic פפטידים אשר ניתן לנתח אותם על-ידי MALDI-TOF MS כדי להשיג ביטחון מלא חלבונים זיהוי הקצאות, ואילו השלב הסופי • תנאי reproducibly מניב lipopeptides מרוכז בכמות קטנה היא במידה רבה ללא מלחי מפריעות, יון דיכוי מזהמים.

ניתוח מוצלח MS lipoprotein כפוף השפע שלה, בתור שכזה, הלהקות האפלים ביותר של קרום שהוכתמו S צבע מאכל פונסו נוטים לתת את התוצאות הטובות ביותר. עם זאת, ייתכן כי מספר lipoproteins עשויים לנדוד בלהקת יחיד במהלך ההפרדה דף, וכדי לסבך את הספקטרום המתקבל. לכן, מומלץ תחילה לזהות את החלבון על ידי המוני פפטיד טביעת אצבע (PMF), אשר יכול להתבצע על ידי איסוף MS ספקטרה על השבר טריפסין הכולל או לשבר לשטוף או acetonitrile ו המזינים את הפסגות שנוצר לתוך תוכנה כמו הקמע22. ברגע הרצף חלבון נקבע, חישוב המסה של ליפופפטיד N-מסוף tryptic באופן משמעותי מסייע בבחירת יון איזה קטע על-ידי MS/MS.

דוגמה נוספת הטרוגניות יכול לנבוע משתנה ליפיד אורכי שרשרת על lipoproteins בתוך אוכלוסיה והשינויים שלהם N-מסוף, שניהם בהתאם חיידקים מקור6. בעוד וריאציה אורך שרשרת עושה עבור שיא מיוחד אשכולות על האב ספקטרה, המאופיינת על ידי 14 במרווחים Da המייצגים קבוצות מתילן (- CH,2-) זה יכול לפצל את האות ליפופפטיד הכוללת ולהקטין את הרגישות. סביר גם כי הטפסים ליפופרוטאין שונים להשפיע העשרה ושברים, אבל זיהינו בהצלחה, triacylated, diacylated ו lyso-טופס lipoproteins באמצעות פרוטוקול המתואר. באופן דומה, moieties פפטיד בדרגות שונות של lipoproteins הוספת רמה נוספת של מורכבות ניתוחים, ללא קשר למבנה N-מסוף שלהם, כמו קומפוזיציה מאוד חומצות אמינו עשויה למנוע ליפופפטיד למחיצות לשלב כלורופורם אורגני באמצעות שיטות אחרות החילוץ8. העברת ליפופרוטאין ניטרוצלולוזה לסייע בלימוד כזה lipopeptides, כמו כל שברים • תנאי יכול להיות מנותח בשיטה זו.

ציור מן הספרות הקודם מעורבים triacylglycerides, פוספוליפידים23, נתרן מכוונת adduct היווצרות יכול לשמש כדי לקדם את הפיצול יותר אינפורמטיבי דרך היווצרות (N-acyl השומן)-יון פפטיד dehydroalanyl. יונים אלה אופייניים הם המפתח הקצאת מבנה, מאז המדינה acylation של קצה אמיני הוא מבודד ההחלפות ליפיד-moiety glyceryl. נתרן adduct היווצרות מספק אפשרות חלופית נוחה גופרית חמצון עם מימן על-חמצני, אשר הוכח גם לקדם N-acyl השומן-dehydroalanyl פפטיד פיצול6,8. למרות נתרן adducts עשויים הצג דיכוי הכוללת של האות יון האב, עליית פיצול לכיוון dehydroalanyl יונים ספציפיים מפצה על עוצמת יון האב מופחתת. זה עשוי להיות שווה לחקור אחר מטריצות, פיצול נוסף adducts שמעודדים ספקטרום מקיף ביותר.

פרוטוקול זה שיפור שלב ה-TX-114 מסורתי למחיצות בשיטת העשרה ליפופרוטאין, בזמן העברת דף מופרדים lipoproteins ניטרוצלולוזה ממברנה מסייע לעיכול טריפסין, • תנאי של lipopeptides. ניתוח MALDI-TOF MS בשברים tryptic או כביסה הכולל מאפשר זיהוי חלבונים במשולב עם N-מסוף קביעת מבניים על-ידי MS/MS בניסוי יחיד. נתרן אופציונלי adduct היווצרות ההבדלים מדגיש-ליפופפטיד אמיני באמצעות קידום פיצול יון יותר אינפורמטיבי. היכולת לבצע באופן שגרתי לטהר lipoproteins ולאפיין את N-טרמיני (termini) יאפשר מחקרים מקיפים על איך הרומן ליפופרוטאין טפסים מתבצעים, שלהם תפקיד פיזיולוגי בתוך המעטפה תא החיידק, איך הם מזוהים על ידי מערכת החיסון יונקים מערכת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

המחקר במעבדה מרדית נתמכה על ידי קרנות האתחול המסופקים על ידי המכללה אברלי של המדע (אוניברסיטת המדינה של פנסילבניה). אנו מודים ד ר טטיאנה Laremore על גישה לציוד פן סטייט פרוטאומיקס, מסה ספקטרומטר הליבה מתקן, אוניברסיטת פארק, פנסילבניה, בו בוצעו ניתוחים spectrometric המוני וייעוץ טכני מומחה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials
0.01 mm Zirconia/silica beads BioSpec Products 110791012
Acetic acid EMD AX0073-9
Acetone EMD AX0116-6
Acetonitrile EMD AX0142-6
Ammonium bicarbonate Fluka Analytical 09830
BioTrace NT Nitrocellulose PALL Life Sciences 66485
Bovine serum albumin (BSA) digest standard Protea PS-204-1
Chloroform Acros Organics 423550025
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Fisher Scientific BP118
HPLC Grade water EMD WX0008-1
Lysozyme Fisher Scientific BP535-1
Methanol Sigma-Aldrich 34860
Phenylmethyl sulfonyl fluoride (PMSF) Amresco 0754
Pierce trypsin protease Thermo Scientific 90057
Ponceau S Acros Organics 161470100
Protein LoBind Tube 0.5mL Eppendorf 022431064
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich 792519
Sodium chloride Macron Fine Chemicals 7581-06
Trifluoroacetic acid (TFA) Sigma-Aldrich 299537
Tris-hydrochloride (HCl) Fisher Scientific BP152
Triton X-114 Sigma-Aldrich 93422
Tryptic soy broth (TSB) BD 211822
α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (MS Grade) Sigma-Aldrich C8982
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
MagNALyser Roche
Trans-Blot Turbo Transfer System Bio-Rad
MALDI-TOF target Bruker Daltonics
Ultraflextreme MALDI-TOF-TOF Bruker Daltonics Equipped with a 355 nm frequency-tripled Nd:YAG smartbeam-II laser

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Babu, M. M., et al. A database of bacterial lipoproteins (DOLOP) with functional assignments to predicted lipoproteins. J Bacteriol. 188 (8), 2761-2773 (2006).
  2. Narita, S., Tokuda, H. Bacterial lipoproteins; biogenesis, sorting and quality control. Biochim Biophys Acta. 1862 (11), 1414-1423 (2016).
  3. Kovacs-Simon, A., Titball, R. W., Michell, S. L. Lipoproteins of bacterial pathogens. Infect Immun. 79 (2), 548-561 (2011).
  4. Nguyen, M. T., Götz, F. Lipoproteins of Gram-Positive Bacteria: Key Players in the Immune Response and Virulence. Microbiol Mol Biol Rev. 80 (3), 891-903 (2016).
  5. Nakayama, H., Kurokawa, K., Lee, B. L. Lipoproteins in bacteria: structures and biosynthetic pathways. FEBS J. 279 (23), 4247-4268 (2012).
  6. Kurokawa, K., et al. Novel bacterial lipoprotein structures conserved in low-GC content Gram-positive bacteria are recognized by Toll-like receptor 2. J Biol Chem. 287 (16), 13170-13181 (2012).
  7. Kurokawa, K., et al. The Triacylated ATP Binding Cluster Transporter Substrate-binding Lipoprotein of Staphylococcus aureus Functions as a Native Ligand for Toll-like Receptor 2. J Biol Chem. 284 (13), 8406-8411 (2009).
  8. Asanuma, M., et al. Structural evidence of α-aminoacylated lipoproteins of Staphylococcus aureus. FEBS J. 278 (5), 716-728 (2011).
  9. Armbruster, K. M., Meredith, T. C. Identification of the Lyso-Form N-Acyl Intramolecular Transferase in Low-GC Firmicutes. J Bacteriol. 199 (11), e00099-e00017 (2017).
  10. Serebryakova, M. V., Demina, I. A., Galyamina, M. A., Kondratov, I. G., Ladygina, V. G., Govorun, V. M. The acylation state of surface lipoproteins of Mollicute Acholeplasma laidlawii. J Biol Chem. 286 (26), 22769-22776 (2011).
  11. Feng, S. H., Lo, S. C. Induced mouse spleen B-cell proliferation and secretion of immunoglobulin by lipid-associated membrane proteins of Mycoplasma fermentans incognitus and Mycoplasma penetrans. Infect Immun. 62 (9), 3916-3921 (1994).
  12. Feng, S. H., Lo, S. C. Lipid extract of Mycoplasma penetrans proteinase K-digested lipid-associated membrane proteins rapidly activates NF-kappaB and activator protein 1. Infect Immun. 67 (6), 2951-2956 (1999).
  13. Luque-Garcia, J. L., Zhou, G., Spellman, D. S., Sun, T. -T., Neubert, T. A. Analysis of electroblotted proteins by mass spectrometry: protein identification after Western blotting. Mol Cell Proteomics. 7 (2), 308-314 (2008).
  14. Luque-Garcia, J. L., Zhou, G., Sun, T. -T., Neubert, T. A. Use of Nitrocellulose Membranes for Protein Characterization by Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry. Anal Chem. 78 (14), 5102-5108 (2006).
  15. Kurokawa, K., et al. Environment-mediated accumulation of diacyl lipoproteins over their triacyl counterparts in Staphylococcus aureus. J Bacteriol. 194 (13), 3299-3306 (2012).
  16. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  17. Schӓgger, H. Tricine-SDS-PAGE. Nat Protoc. 1, 16-22 (2006).
  18. Gravel, P. Protein Blotting by the Semidry Method. The Protein Protocols Handbook. , Spring Protocols. 321-334 (2002).
  19. Webster, J., Oxley, D. Protein Identification by Peptide Mass Fingerprinting using MALDI-TOF Mass Spectrometry. The Protein Protocols Handbook. , Springer Protocols. 1117-1129 (2009).
  20. Wilkins, M. R., et al. Detailed peptide characterization using PEPTIDEMASS - a World-Wide-Web-accessible tool. Electrophoresis. 18 (3-4), 403-408 (1997).
  21. Gasteiger, E., et al. Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server. The Proteomics Protocols Handbook. , Springer Protocols. 571-607 (2005).
  22. Perkins, D. N., Pappin, D. J. C., Creasy, D. M., Cottrell, J. S. Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data. Electrophoresis. 20 (18), 3551-3567 (1999).
  23. Al-Saad, K. A., Zabrouskov, V., Siems, W. F., Knowles, N. R., Hannan, R. M., Hill, H. H. Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry of lipids: ionization and prompt fragmentation patterns. Rapid Commun Mass Spectrom. 17 (1), 87-96 (2003).

Tags

ליפופפטיד ניטרוצלולוזה קולטן X-114 כמו אגרה טריטון אימונולוגיה זיהום גיליון 135 ליפופרוטאין חיידקים MALDI-תוף אמיני acylation מבנה
העשרה של Lipoproteins חיידקי והכנה של N-מסוף Lipopeptides לקביעת מבנה באמצעות ספקטרומטר מסה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Armbruster, K. M., Meredith, T. C.… More

Armbruster, K. M., Meredith, T. C. Enrichment of Bacterial Lipoproteins and Preparation of N-terminal Lipopeptides for Structural Determination by Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (135), e56842, doi:10.3791/56842 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter