Summary
Bakteriyel lipoproteinler yöntemi bölümleme bir iyonik olmayan yüzey aktif faz kullanarak zenginleştirme doğrudan TLR deneyleri kullanımda veya diğer uygulamalar için tanımlanır. Daha fazla adımlar için yapısal karakterizasyon N-terminal tryptic lipopeptides hazırlamak için kütle spektrometresi tarafından ayrıntılı olarak açıklanmıştır.
Abstract
Lipoproteinler bakteri hücre zarf önemli bileşenleri ve memeli doğuştan gelen bağışıklık yanıtının güçlü harekete geçirmek vardır. Hücre fizyolojisi ve İmmünoloji öneme rağmen çok roman lipoprotein formları, nasıl onlar sentez ve ana bilgisayar dokunulmazlık çeşitli formları etkisi hakkında keşfedilmeyi kalır. Lipoproteinler üzerinde kapsamlı çalışmalar etkinleştirmek için bu iletişim kuralını bakteriyel lipoprotein zenginleştirme için bir yöntemi açıklar ve N-terminal tryptic lipopeptides hazırlanması için lazer matris destekli yapısal kararlılık desorption iyonlaşma-uçuş süresi Kütle spektrometresi (MALDI-TOF MS). Bölümleme yöntemi lipoprotein çıkarma ve zenginleştirme bakteriyel hücre zar için kurulan bir Triton X-114 faz genişletilmesi, protokol lipoprotein verim artan lipoprotein olmayan kirletici kaldırmak için ek adımları içerir ve saflık. Lipoproteinler Toll benzeri reseptör (TLR) deneyleri içinde yaygın olarak kullanıldığından, bu ilk N-terminal yapı MALDI-TOF Bayan işbu tarafından karakterize etmek için önemlidir, bir yöntem N-terminal zenginleştirilmiş konsantre hidrofobik peptidler yalıtmak için sunulmuştur lipopeptides Sodyum Lauryl Sülfat Poly-akrilamid jel elektroforez (SDS-sayfa) tarafından ayrılmış MALDI-TOF MS/MS. lipoproteinler ile doğrudan analiz için uygun nitroselüloz membran için transfer, situ ile sindirmek tripsin, ardışık olarak kutup tryptic peptidler kaldırmak için yıkanmış ve nihayet kloroform-metanol ile eluted. Yıkama çözümlerinden daha kutup trypsinized peptidler MS ile birleştiğinde, bu yöntem hem lipoprotein tanımlamak ve onun N-terminus bir tek denemede karakterize yeteneği sağlar. Kasıtlı sodyum adduct oluşumu da bir araç olarak daha fazla yapısal olarak bilgilendirici parçalanma spectra tanıtmak için istihdam edilebilir. Sonuçta, lipoproteinler zenginlik ve N-terminal yapılarını belirlenmesi daha kapsamlı çalışmalar bakteriyel proteinlerin her yerde bu sınıf izin verir.
Introduction
Bakteriyel lipoproteinler bu hücre membran yüzey küresel protein etki alanına tutturur bir korunmuş N-terminal lipid-modified Sistein ile karakterizedir. Evrensel bir tipik genom1içinde tüm hücresel genlerin % 2-5 oluşturan bakterilerde dağıtılır. Lipoproteinler kritik hücresel süreçler, besin alımı, sinyal iletim de dahil olmak üzere çok çeşitli rollerde oynamak, derleme protein kompleksleri ve korumak hücre zarf yapısal bütünlük2. Patojen bakteriler, lipoproteinler virülans faktörleri3,4hizmet vermektedir. Enfeksiyon sırasında N-terminal lipopeptides Toll benzeri reseptör (TLR) 2 tarafından tanınması işgal patojenler kaldırmak için doğuştan gelen bir bağışıklık yanıtı kışkırtırız. N-terminal asilasyonu durumuna bağlı olarak, lipoproteinler genellikle alternatif TLR2 heterodimeric kompleksleri tarafından kabul edilmektedir. TLR2-TLR1 N-acylated lipopeptides, TLR2-TLR6 bağlar ücretsiz lipopeptide α-amino termini süre tanır. Bir kez bağlı, sinyal yolları proinflamatuar sitokinler3,4salgılanmasını ikna etmek için gidiyor.
Bu daha önce triacylated, devamsızlık veya varlığı bir Amid bağlı yağ asidi korunmuş N-terminal sistein kalıntıları üzerinde farklı olduğunu diacylated ve bu gram-negatif bakteri gram-pozitif bakterilerden lipoproteinler olduğunu düşünüldü. Bu varsayım gram-pozitif genleri ormanda, triacylated lipoproteinler5formları Ayagin Gram-negatif N-açil transferaz için sıra orthologs eksikliği ile desteklenmiştir. Ancak, son yıllarda yapılan çalışmalarda gram-pozitif Firmicutes o-sizlik çekmek- ormandalipoprotein triacylation yanı sıra peptit, lyso ve N -asetil formları6,7 olarak adlandırdığı üç roman N-terminal lipoprotein yapıları, ortaya koymuştur ,8. Bu bulgular yanı sıra çeşitli formları bu roman lipoproteinler nasıl yapılır hakkında temel soru ve ne fizyolojik amacı veya avantaj vermek mümkün henüz için-olmak-keşfedilen lipoprotein formları hakkında sorular yükseltmek. Ayrıca, onlar açıkça lipoprotein yapısı tahmin etmek genomik geçerli yetersizliği gösteriyor. Nitekim, son zamanlarda lipoprotein N-asil Transferazlar, edebiyat, Enterococcus faecalistir ve lyso-form lipoproteinler9yapan Bacillus cereus adı verilen yeni bir sınıf tanımlanan. Bu deneysel olarak onların son derece hidrofobik doğa ve moleküler yapılarını karakterize etmek sınırlı yöntemleri nedeniyle zor olabilir lipoprotein yapısını doğrulayın gerektiğini belirtir.
N-terminal yapısal kararlılık yanı sıra konak immün yanıt lipoprotein indüksiyon çalışmaları kolaylaştırmak için biz birkaç daha önce açıklanan protokol bakteriyel lipoproteinler arındırmak ve N-terminal tryptic hazırlamak için adapte olması lipopeptides MALDI-TOF MS6,10,11,12göre analiz için. Lipoproteinler bölümleme yöntem, bulaşıcı olmayan lipoproteinler kaldırmak ve lipoprotein verimi artırmak için en iyi duruma getirme ile kurulan bir Triton X-114 (bundan böyle yüzey aktif veya TX-114 olarak anılacaktır) faz kullanarak zenginleştirilmiş. Bu lipoproteinler TLR deneyleri doğrudan kullanım için veya daha fazla arıtma tarafından SDS-sayfası için uygundur. MALDI-TOF ms'ye aktarımı lipoproteinler nitroselüloz membran bir iskele verimli situ tripsin sindirim için yıkama sağlar ve son derece sonuçlanan membran yüzey sonraki elüsyon N-terminal lipopeptides saf. Nitroselüloz örnek işleme kolaylaştırmak ve integral membran proteinleri13,14yanı sıra lipoproteinler9,10 son derece hidrofobik peptidler için sıra kapsama geliştirmek için gösterilen . Yöntem böylece ara yıkama çözümleri aynı anda kararlılıkla N-terminal yapısal bir tek denemede güvenilirliği yüksek protein tanımlama için analiz edilebilir polarite üzerinde dayalı peptidler parçalanması ek avantajı vardır . Bu iletişim kuralı benzersiz özellikleri kasıtlı sodyum adduct oluşumu sırasında MS/MS, N- asilasyonu devlet yapısal tayini yardım dehydroalanyl iyonları doğru üst iyon parçalanma teşvik etmek. N-terminus lipoproteinler TLR tanınması ile ilgili her iki en değişken ve anahtar özelliğidir. Birlikte ele alındığında, bu iletişim kuralı, lipoproteinler, arıtma ve yapısal kararlılık MALDI-TOF kolayca adapte deneme genel amacı bağlı olarak MS tarafından bireysel aşamaları ile üzerinde yoğun ve tekrarlanabilir çalışmalar sağladı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. hücre büyüme ve lizis
- 15 mL tryptic soya suyu (TSB) veya benzer zengin medya bakteri geç üssel faz (OD600 1.0-1.5) büyümek. Hücreleri tarafından aralıklarla hasat, Tris arabelleğe alınmış serum/EDTA ile (TBSE) bir kez yıkamak ve iletişim kuralı ile devam veya kadar kullanmak dondur.
Not: TBSE: 20 mM Tris-hidroklorid (HCl), pH 8.0, 130 mM sodyum klorür (NaCl) ve 5 mM ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA)). Lipoprotein ifade ve değişiklik büyüme koşulları (Örneğin asitlik, tuzluluk, büyüme medya) ve büyüme aşaması15tarafından etkilenebilir. Hücre büyümesini istediğiniz gibi ama 15 mL ölçekli hücrelerinin aşırı biyokütle lipoprotein verim düşürebilir lipoproteinler tek bir hazırlık için önerilir. Bir 15 mL hazırlık genellikle ~ 2-4 şeklinde en uygun yükleme için yeterli örnek verir bir standart SDS-sayfa mini jel üzerinde şerit. - 800 μL TBSE 1 mM phenylmethyl Sülfanil florür (PMSF) ve 0,5 mg/mL lizozim hücrelerde resuspend. 37 ° C'de 20 dk için kuluçkaya ve çözüm 2.0 mL dişli microcentrifuge tüp ile vidalı kapak ve O-ring transfer
Not: Bazı tür lizis lizozim tarafından duyarlı değildir. Lizis içinde yardım etmek için uygun bir litik enzim konmasý gereken. - ~ 800 μL 0,1 mm zirkon/silika boncuk tüp ekleme ve hücreleri maksimum hızda (7000 d/d) sallayarak bir homogenizer üzerinde 30 5 devredir bozabilir her biri, 2 dk dinlenme her döngüsü arasında buzda s.
- Santrifüj örneği 4 ° C'de (cips boncuk ve kesilen hücreleri için) 5 min için 3000 x g '. Yeni bir 2.0 mL microcentrifuge tüp süpernatant aktarmak ve buz üzerinde tutun.
- 200 μL TBSE kalan Pelet eklemek ve homogenizer için ek bir döngüsü için dönmek. (Yukarıdaki gibi) santrifüj kapasitesi ve süpernatant (800-1000 μL toplam hacmi olmalıdır) önceki süpernatant ile birleştirir.
2. olarak TX-114 faz bölümleme lipoproteinler zenginlik
- Süpernatant TX-114 yüzey aktif bir son konsantrasyonu (vol/vol) % 2 ile % 4 (vol/vol) yüzey aktif buz gibi TBSE içinde eşit bir hacmi ekleyerek ek ve 1s INVERSION tarafından her ~ 15 dk karıştırma için buz üzerinde kuluçkaya.
Not: soğutulmuş zaman süpernatant ve yüzey aktif karışan olacaktır. - Tüp 37 ° C su banyosu aktarmak ve faz ayrımı ikna etmek 10 dakikadır kuluçkaya. 10.000 x g, bı phasic ayrılık korumak için oda sıcaklığında 10 dakika için de örnek santrifüj kapasitesi.
- Hafifçe üst sulu faz pipet ve atın. Buz gibi TBSE kendi özgün birime tüp dolum için alt yüzey aktif faz ekleyin ve karıştırmak için tersine çevirin. 10 dakika buz üzerinde kuluçkaya.
- Tüp 37 ° C su banyosu ve faz ayrımı ikna etmek 10 dakikadır kuluçkaya, daha sonra 10.000 x g oda sıcaklığında 10 dakika santrifüj kapasitesi.
- 2.3-2.4 bir kez daha 3 renk ayrımları toplam için yineleyin. Üst sulu faz kaldırmak ve atın.
- Pelet yüzey aktif faz 1 buz gibi TBSE hacmi ekleyerek çekimi (tüp alt kısmında görünür), ders sırasında oluşan zarlarını proteinlerin kaldırın. 16.000 x g çözünmez protein cips 2 min için de 4 ° C'de santrifüj kapasitesi.
Not: Örnek bir tek fazlı kalmalıdır. Faz ayrımı ortaya çıkarsa, örnek yeniden soğuk ve tekrar santrifüj kapasitesi. Pelet lipoprotein olmayan kirletici maddeleri genellikle oluşur ama daha ayrıntılı bir çözümleme için muhafaza edilebilir. - Hemen süpernatant % 100 aseton 1250 μL içeren bir taze 2.0 mL microcentrifuge tüp aktarın. Yukarı ve aşağı iyice viskoz olacak gibi örnek ucundan yıkamayı pipet. INVERSION tarafından mix ve gecede protein çökelti-20 ° C'de kuluçkaya.
- 16.000 x g lipoproteinler tüp yönünü dikkat ile cips için oda sıcaklığında 20 dakika için de örnek santrifüj kapasitesi. Lipoproteinler tüp dış duvar boyunca ince, beyaz bir film oluşturacak.
- Pelet % 100 aseton ile iki kez yıkayın. Aseton dikkatle boşaltmak ve örnek hava kuru izin verir.
- 20-40 μL 10 mm Tris-HCl, pH 8.0 veya bir standart Laemmli SDS-sayfa örnek arabellek16 ekleyin ve iyice yukarı ve aşağı zarlarını lipoproteinler ile duvara pipetting tarafından resuspend. Lipoproteinler çıkarmak için pipet ucu tüp tarafındaki kazı.
Not: Lipoproteinler Tris arabellekte eriyecektir değil, ancak oldukça bir süspansiyon oluştururlar.- Lipoproteinler-20 ° C'de kullanmak kadar saklamak.
3. SDS-sayfa, Electroblotting ve Ponceau S ile boyama
- Ayrı lipoproteinler SDS-sayfa standart yöntemleri16kullanarak tarafından.
Not: Uygun jel akrilamid yüzde kullanım amacı ve lipoproteinler büyüklüğüne bağlı olarak değişir. Burada, %16,5 Tris-tricine jel küçük E. coli lipoprotein Lpp17için kullanılan süre E. faecalistir lipoproteinler Tris-glisin jel, % 10 ayrı kaldık. - Lipoproteinler standart electroblotting yordamı kullanarak nitroselüloz transfer membran aktarın.
Not: 25 V, 1.3 Bjerrum Schafer-Nielsen arabellek artı % 0,1 SDS kullanarak bir yarı kuru transfer gerçekleştirildi mA 15 dk18. Bu nitroselüloz daha daha hidrofobik olduğundan, bu sonraki adımları, zar hidrofobik lipopeptides verimli elüsyon azaltabilir ancak alternatif olarak, polivinilidin difluoride (PVDF) membran kullanılabilir. - Nitroselüloz membran bir konteyner ve kapak Ponceau S çözüm (%0,2 (w/v) Ponceau S % 5 asetik asit) ile aktarın. Rock 5 min için hafifçe ya da kırmızı-pembe şeritler görünür hale gelene kadar.
- Ponceau S solüsyonu dökün ve dikkatle nitroselüloz membran2aşırı kaldırmak için O leke dH ile durulayın.
Not: Bantları Ponceau lekeli hızla destain. Bantları kaybolmuşsa, boyama işlemi yineleyin. - Temiz bir tıraş bıçağı ile istenen grubu ve bir microcentrifuge tüp transferi tüketim. Üç kez tamamen grup destain için dH2O 1 mL ile yıkayın.
Not: Protokol burada duraklatılmış. Mağaza eksize bölüm su-20 ° c kadar kullanmak kaplı. - Temiz bir yüzey ve temiz bir tıraş bıçağı ile bölüm aktarmak, nitroselüloz şerit küçük parçalara, yaklaşık 1 mm x 1 mm. toplamak 0.5 mL düşük protein bağlayıcı microcentrifuge tüp parçalara zar.
- 0.5 mL ile iki kez adet taze hazırlanan 50 mM Amonyum Bikarbonat (NH4HCO3), yıkama pH 7.8 yüksek performanslı sıvı kromatografi (HPLC) sınıf su.
4. tryptic sindirim, Lipopeptide çekme--dan nitroselüloz membran, ifade üstüne maldı hedef ve veri toplama
- Nitroselüloz adet 20 μL tripsin 50 mM NH4HCO3, pH 7.8 HPLC sınıf suda bir 20 μg/mL çözüm resuspend. Girdap karıştırmak için sonra spin kısaca taşlarını tripsin çözüm tarafından tamamen kaplıdır emin olmak için. Buharlaşma önlemek ve Özet gecede 37 ° C'de kuluçkaya parafin film kullanarak tüp kapak kapak
- Spin 16.000 x g 30 s ve Kaldır pipetting tarafından sıvı için de örnek.
Not: Bu daha sonra MALDI-TOF MS tarafından protein tanımlama için incelenebilir trypsinized hidrofilik peptidler kaldırır. - % 0.5 trifluoroacetic asit (TFA) 50 μL HPLC sınıf suya ekleyin. Girdap karıştırın sonra kısaca taşlarını çözüm tarafından karşılanmaktadır emin olmak için örnek spin için. Oda sıcaklığında 10 dakika için kuluçkaya. Sıvı pipetting tarafından kaldırın.
Uyarı: TFA Eğer inhale zararlıdır. Dikkatli bir şekilde ele ve kimyasal duman başlığı kullan. Cilt ile temasından sakının. - %4,3 10 Asetonitril HPLC sınıf suda 50 μL ile arasındaki adımları yineleyin.
Uyarı: Asetonitril Eğer inhale zararlıdır. Dikkatli bir şekilde ele ve kimyasal duman başlığı kullan. Cilt ile temasından sakının. - %4,3 20 Asetonitril HPLC sınıf suda 50 μL ile arasındaki adımları yineleyin.
Not: Bu için nitroselüloz gevşek bağlı herhangi bir orta hidrofobik peptidler kaldırır. - Sıkı bir şekilde bağlı lipopeptides elute için 15 μL kloroform-metanol (2:1, v/v) çözünmüş taze yapılmış 10 mg/mL α-cyano-4-hydroxycinnamic asit (CHCA) matris ekleyin ve aralıklı vortexing ile Oda sıcaklığında 10 dakika için kuluçkaya.
- Alternatif olarak, 15 μL kloroform metanol lipopeptides elute ve matris ile daha sonra karışımı ekleyin. Belirli lipopeptide kompozisyon için tatmin edici sonuçlar aldıysanız 2,5-dihidroksibenzoik asit (DHB), gibi diğer matrisler CHCA alternatif olarak test edilmelidir.
Uyarı: Kloroform ve metanol Eğer inhale zararlıdır. Dikkatli bir şekilde ele ve kimyasal duman başlığı kullan. Cilt ile temasından sakının. - İsteğe bağlı: Sodyum tanıtmak için oluşumu adduct, CHCA çözümünde kloroform-metanol sulu sodyum bikarbonat (NaHCO3) ile 1 mM son bir konsantrasyon için ek.
- Alternatif olarak, 15 μL kloroform metanol lipopeptides elute ve matris ile daha sonra karışımı ekleyin. Belirli lipopeptide kompozisyon için tatmin edici sonuçlar aldıysanız 2,5-dihidroksibenzoik asit (DHB), gibi diğer matrisler CHCA alternatif olarak test edilmelidir.
- Örnek kısaca spin. Bir pipet ile dikkatli bir şekilde yeni bir düşük protein bağlayıcı microcentrifuge tüp sıvı aktarın. Bu çözüm N-terminal lipopeptides toplu içerir.
Not: Nitroselüloz kısmen veya tamamen kloroform-metanol çözümde geçiyoruz. Bu MS sonuçları olumsuz etkilemez ve lipopeptide dönüş artırmak için alternatif bir yöntem kullanılabilir. PVDF membran aynı şekilde dağıtılması değil. - Parlak çelik maldı hedef üzerine CHCA ile lipopeptides eluted 1 μL Kasası.
Not: Kloroform metanol hızlı bir şekilde, kristalize CHCA ve lipopeptides geride bırakarak buharlaşır gider. Aliquot bir isteğe bağlı ikinci 1 μL örnek konsantrasyonu artırmak için aynı noktanın yatırılır. Kloroform-metanol önemli ölçüde ifade hedef üzerine sonra yayılabilir ve bu nedenle, hedef örnek karıştırma önlemek için özen gösterilmelidir. Bu para yatırma ve birden çok spot renkleri her örnek ateş önerilir. - Derhal için kütle spektrometresi gidin. Özellikle ikinci katman Spot'un dış halka lipopeptides tıkabilir miyim gibi spot örnek, iki kat varsa lipopeptide sinyal için nokta tüm alanlarını taramak.
Not: sinyal almak ve yeterli sinyal-gürültü oranı elde etmek için birden fazla spectra (20 veya daha fazla tarama) toplamak için yoğunluğu artırmak gerekli olabilir önerilen başlangıç lazer yoğunluğu % 25, olsa da. Burada, spectra MALDI-TOF-TOF araç üzerinde satın alınan ( Tablo reçetesigörmek) bir fabrika yapılandırılmış enstrüman için reflektör pozitif iyon algılama 700-3500 m/z aralığında yöntemiyle. Araç bir sığır serum albumin (BSA) tryptic peptid karışımı ile kalibre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
İletişim kuralının bir şematik resim 1' de sağlanır. Enterococcus faecalistir ATCC 19433 TX-114 tarafından çıkarılan lipoprotein zenginleştirilmiş Kesir Şekil 2' de gösterilmiştir. Karşılaştırma için zarlarını protein fraksiyonu bantlama deseni de gösterilir. Proteinler bu kesir gelen proteinler dışında lipoproteinler (Tablo 1) bulaşıcı son derece bol olması MALDI-MS tarafından teyit edildi. Şekil 3 ' te kitle spectra E. faecalistir lipoprotein oluşur PnrA tryptic peptid iyon profil nitroselüloz bağlı PnrA sonraki yıkama ile polarizasyon ( içinde listelenen en yüksek atamaları artan çözücüler ile göstermek Tablo 2). Şekil 4 gösterir N-terminal yapısal karakterizasyonu tarafından MALDI-TOF MS/tanılama N- acylated dehydroalanyl doruklarına lyso-lipoprotein formu ile tutarlı açığa MS, belirlenen PnrA. Şekil 5 sodyum etkisini göstermektedir oluşumu üzerinde parçalanma, tercihen N- acylated dehydroalanyl iyon lehine parçalanan sodiated üst iyon ile sigara.
Şekil 1: şematik Protokolü'nün. Lipoproteinler TX-114 faz bölümleme tarafından zenginleştirilmiş TLR deneyleri içinde doğrudan, en yaygın olarak kullanılan ve SDS-PAGE tarafından yapısal belirlenmesi için daha fazla saf. Lipoproteinler nitroselüloz, kademeli, yıkanmış tripsin ile sindirmek ve kloroform-metanol için yapısal analizi ile MALDI-MS tarafından eluted elde edilen lipopeptides aktarılır. Tripsin ve nitroselüloz yıkama çözümler protein tanımlama ve MS analizi için kaydedilebilir. w /: ile; TFA: trifluoroacetic asit; Afrika Kupası: Asetonitril; CHCA: α-cyano-4-hydroxycinnamic asit; tercih: isteğe bağlı; MALDI: matris yardımlı Lazer Desorpsiyon iyonlaşma; MS: kütle spektrometresi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2: Profil TX-114 zenginleştirilmiş proteinler üzerinden E. faecalistir. Lekeli mavi (A) ve ilgili nitroselüloz membran ile farklı bir bantlama deseni zarlarını protein fraksiyonu ("PPT") ve saf arasında Ponceau S (B) ortaya Coomassie ile % 10 Tris-glisin SDS-sayfa jel lekeli lipoproteinler ("LP"). Belirtilen Coomassie lekeli bantları eksize ve sigara-lipoproteinler MALDI-MS tryptic peptidler (bkz. Tablo 1) tarafından tespit edildi. PnrA tespit ve burada açıklanan protokol tarafından analiz. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: iyon profil ve bereket polarite nitroselüloz değişikliklerle yıkama çözümler. (A) PnrA Şekil 2' de belirtilen E. faecalistir lipoprotein karşılık gelen birkaç iç peptid parçaları tripsin kesir gösterir. % 10 (B) ve % 20 (C) Asetonitril yıkayın kesirler Haritayı değişiklikler sinyal şiddeti ve bireysel doruklarına genel sayısını azaltmak. (D) son elüsyon kesir son derece N-terminal lipopeptide ile zenginleştirilmiş m /z 997, yıldız işareti (*) gösterilir. Her spectra yoğunluğu (A) için sinyal şiddeti karşılaştırma için normalleştirilmiş. Tepeler kitleler ve atanan dizileri Tablo 2' de listelenmiştir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Grup | Protein kimliği | Üyelik No | EST. molekül ağırlığı | Peptid sayısı | |
| 1 | uzama faktör Tu | GB | EOL37301.1 | | 43,387 | 15 | |
| 2 | NADH peroksidaz | GB | EOL34572.1 | | 49,520 | 9 | |
| 3 | pyruvate dehidrogenaz E1component, Alfa altünitesi | GB | EOL34709.1 | | 41,358 | 12 | |
| 4 | pyruvate dehidrogenaz E1 bileşeni, alt birim beta | GB | EOL34710.1 | | 35,373 | 19 | |
| 5 | 30s ribozomal protein S2 | GB | EOL33066.1 | | 29,444 | 16 | |
| 6 | 30s ribozomal protein S3 | GB | EOL37312.1 | | 24,355 | 14 | |
Tablo 1: çöktürülmüş lipoprotein olmayan kirletici maddeleri proteinlerdir. Proteinler tryptic Özet ve MALDI-MS tarafından tespit edildi standart kullanarak sindirim protokolleri19 jel ve üstten Şekil 2' deki Coomassie jel üzerinde göründükleri aynı sırada yukarıdan aşağıya doğru listelenir. Her protein ile bir güven aralığı (CI) % 95'den büyük tespit edilmiştir.
| En sayısı | Teorik kitle | Protein pozisyon | No Cevapsız kesme siteleri | Peptit dizisi | |
| 1 | 631.3409 | 170-176 | 0 | GVADAAK | |
| 2 | 675.4035 | 316-321 | 1 | TKEAVK | |
| 3 | 826.4093 | 163-169 | 0 | FQAGFEK | |
| 4 | 893.4839 | 121-128 | 0 | NVVSATFR | |
| 5 | 943.5359 | 240-247 | 0 | VWVIGVDR | |
| 6 | 1040.5047 | 188-197 | 0 | YAASFADPAK | |
| 7 | 1200.6331 | 273-284 | 0 | GVGTAVQDIANR | |
| 8 | 1316.6997 | 290-301 | 0 | FPGGEHLVYGLK | |
| 9 | 1385.7827 | 83-94 | 0 | FNTIFGIGYLLK | |
| 10 | 1432.743 | 149-162 | 0 | VGFVGGEEGVVIDR | |
| 11 | 1568.7802 | 259-272 | 1 | DGKEDNFTLTSTLK | |
| 12 | 1672.8289 | 240-254 | 1 | VWVIGVDRDQDADGK | |
| 13 | 1707.8184 | 129-145 | 0 | DNEAAYLAGVAAANETK | |
| 14 | 1724.8027 | 35-49 | 0 | SFNQSSWEGLQAWGK | |
| 15 | 1797.9228 | 257-272 | 2 | TKDGKEDNFTLTSTLK | |
| 16 | 1872.9854 | 285-301 | 1 | ALEDKFPGGEHLVYGLK | |
| 17 | 1945.9613 | 230-247 | 1 | DLNESGSGDKVWVIGVDR | |
| 18 | 2240.1345 | 149-169 | 1 | VGFVGGEEGVVIDRFQAGFEK | |
| 19 | 2675.2543 | 230-254 | 2 | DLNESGSGDKVWVIGVDRDQDADGK | |
Tablo 2: kitleler ve karşılık gelen tryptic peptidler gözlenen. E. faecalistir PnrA silico tripsin hazım (GenBank: EOL37280.1) olduğunu PeptideMass20,21kullanılarak yapılır, iki cevapsız sağlayan siteler kesmek. Şekil 3 ' te spectra üzerinde gözlenen doruklarına teorik kitleler, karşılık gelen peptid dizileri ile birlikte listelenir.
Şekil 4: MALDI-TOF MS E. faecalistir lipoprotein PnrA. (A) üst MS spektrum m / E. faecalistir PnrA N-terminal lipopeptide karşılık gelen z 997 bölge. (B) MS/MS lipopeptide tepe lyso formla yıldız işareti (*) belirtilen tanılama N- acylated dehydroalanyl peptid parçası iyon en yüksek olduğunu ortaya koymaktadır. Aydınlatılmamıştır yapısı (C)gösterilir. Bu rakam bir önceki yayın9değiştirildi. R.I.: göreli yoğunluğunu Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: Sodyum adduct oluşumu üst iyon parçalanma dehydroalanyl lipopeptide iyonları doğru teşvik. (A) MALDI-TOF spectra E. coli lipoprotein Lpp N-terminal peptid (Turkuaz izleri) olmadan ve (mavi izleri) olan sodyum bikarbonat eklenmesi. Sodyum bikarbonat son eluted kesir için ek bir 22 hesaplanan kitle, üst lipopeptide Da artış sonuçlanır. Protonated iyon (B)MS/MS spektrum ile karşılaştırıldığında, karşılık gelen sodiated iyon (C) MS/MS spektrum Ndoğru önemli Tercihli parçalanma gösterir-asil-dehydroalanyl iyon tarafsız aracılığıyla yıldız işareti (*) belirtilen diacylthioglyceryl yan ortadan kaldırılması. Üst triacylated Lpp N-terminal tryptic peptid yapısını (D) ve N-asil-dehydroalanyl peptid parçası iyon (E) olarak adı geçen. Bu rakam bir önceki yayın9değiştirildi. R.I.: göreli yoğunluğunu Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada protokolünü lipoprotein karakterizasyonu iki ayrı aşamada açıklar: zenginleştirme TX-114 tarafından aşama MALDI-TOF MS tarafından bölümleme ve yapısal kararlılık. TX-114 emme sırasında ek Santrifüjü zenginleştirilmiş lipoproteinler vermeye aseton yağış tarafından takip bu işlem sırasında çökelti bulaşıcı proteinlerin kaldırır. Hücre her hazırlık-15 mL değer ölçeğini sınırlayarak, çeşitli örnekleri kolaylıkla paralel olarak işlenir ve istenirse, protokol sonunda havuza alınmış.
MS yapısal analiz için aktarımı lipoproteinler nitroselüloz tripsin sindirim, çamaşır ve membran gelen sonraki elüsyon kolaylaştırır. Elimizde, bu yaklaşım lipoproteinler nitroselüloz membran yüzey ile ilişkili ve polyacrylamide içinde gömülü değil gibi geleneksel polyacrylamide jel prizler, deterjan-aracılı çıkarma için tercih edilebilir kanıtlanmıştır. Lipoprotein Derneği nitroselüloz yüzeyli nonspesifik adsorpsiyon ortak sorunu için kapsayıcı yüzeyleri hidrofobik peptidler tarafından da büyük ölçüde engeller. Kademeli elüsyon nitroselüloz adet MALDI-TOF iken son elüsyon adım tekrarlanarak verimleri yüksek güven protein kimlik atamaları, elde etmek için MS tarafından analiz daha fazla hidrofilik, iç tryptic peptidler kaldırır konsantre lipopeptides sokan tuzları ve kirletici baskılayarak iyon büyük ölçüde olmadığından küçük bir hacim içinde.
Başarılı MS bir lipoprotein tabi onun bereket analizidir ve bu nedenle, en karanlık bantları Ponceau S lekeli zar en iyi sonuçları vermek olasıdır. Ancak, birkaç lipoproteinler elde edilen spectra karmaşık hale getiren sayfa ayırma sırasında tek bir grupta taşıyabilirsiniz mümkündür. Bu nedenle, ilk protein belirlemek için (PMF), parmak izi peptid kitle tarafından önerilir hangi toplam tripsin kesir veya her iki Asetonitril yıkama kesir MS spectra toplama ve elde edilen doruklarına içine giren tarafından gerçekleştirilebilir bir Maskot22gibi yazılımlar. Bir kez protein sıra belirlendikten sonra tryptic N-terminal lipopeptide kütlesi önemli ölçüde hesaplama MS/MS tarafından parçalara ayırması hangi iyon seçiminde yardımcı olur.
Ek örnek heterojenite asil zincir uzunlukları bir nüfus ve onların N-terminal değişiklikler, kaynak bakteri6bağlı olarak her ikisi içinde lipoproteinler üzerinde farklı neden olabilir. Ayırt edici en yüksek kümeleri üzerinde üst spectra, metilen gruplar için (- CH2-), karşılık gelen 14 Da artışlarla karakterize için zincir uzunluğu varyasyon yapar iken bu genel lipopeptide sinyal split ve duyarlılığı azaltmak. Biz başarıyla triacylated, diacylated ve lyso-form lipoproteinler açıklanan protokolünü kullanarak belirledik rağmen farklı lipoprotein formları etkisi zenginleştirme ve parçalanma, büyük olasılıkla da. Bir çok hidrofilik amino asit kompozisyonu lipopeptide organik kloroform aşamasında içine bölümleme engelleyebilir gibi benzer şekilde, lipoproteinler değişen peptid moieties başka bir karmaşıklık düzeyini analizleri, onların N-terminal yapısı ne olursa olsun eklemek diğer çıkarma yöntemleri8kullanarak. Tüm elüsyon kesirler Bu yöntemde analiz edilebilir gibi lipoprotein transferini nitroselüloz için böyle lipopeptides okumak yardımcı olacaktır.
Önceki edebiyat triacylglycerides ve fosfolipitler23içeren çizim, kasıtlı sodyum adduct oluşumu oluşumu ile daha bilgilendirici parçalanma tanıtmak için kullanılan (N-asil)-dehydroalanyl peptid iyon. Bu karakteristik iyonlar N-terminus asilasyonu durumunu asil oyuncu değişikliği gliserol yan üzerinde yalıtılmış olduğundan yapısı, atama anahtarıdır. Sodyum adduct oluşumu da Nyükseltmek için gösterilen hidrojen peroksit ile oksidasyon kükürt için uygun bir alternatif seçenek sağlar-asil-dehydroalanyl peptid parçalanma6,8. Her ne kadar sodyum adducts göstermek üst iyon sinyal, parçalanma dehydroalanyl iyonları doğru belirli artış genel bir bastırılması dengeler azalan üst iyon yoğunluğu için. O-ebilmek var olmak diğer matrisler keşfetmeye değer ve en bilgilendirici spectra temin için ek parçalanma adducts.
Bu protokol aktarımı lipoproteinler sayfa ayrılmış nitroselüloz membran tripsin sindirim ve lipopeptides elüsyon kolaylaştırır süre yöntemi için lipoprotein zenginleştirme, bölümleme ve geleneksel TX-114 aşamasında geliştirir. Tandem MS/MS tarafından N-terminal tek bir deney yapısal kararlılık ile protein tanımlama için toplam tryptic veya yıkama kesirler MALDI-TOF MS analiz sağlar. İsteğe bağlı sodyum adduct oluşumu olayları farklılıklar lipopeptide N-terminus, daha bilgilendirici iyon parçalanma teşvik ederek. Düzenli olarak lipoproteinler arındırmak ve onların N termini ayırdetmek yeteneği nasıl roman lipoprotein formlar yapılan kapsamlı çalışmalar, bakteri hücre zarf içerisindeki fizyolojik rolü ve nasıl onlar memeli bağışıklık tarafından algılanır olanak sağlar sistem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Meredith laboratuarında araştırma başlangıç sa¤lanan Kaynak Eberly College of Science tarafından (Pennsylvania State Üniversitesi) tarafından desteklenmiştir. Uzman teknik danışmanlık ve ekipmana Penn State proteomik ve kütle spektrometresi çekirdek tesis, University Park, PA, kitle spektrometrik Analizi yapılacağı yeri için Dr Tatiana Laremore teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| 0.01 mm Zirconia/silica beads | BioSpec Products | 110791012 | |
| Acetic acid | EMD | AX0073-9 | |
| Acetone | EMD | AX0116-6 | |
| Acetonitrile | EMD | AX0142-6 | |
| Ammonium bicarbonate | Fluka Analytical | 09830 | |
| BioTrace NT Nitrocellulose | PALL Life Sciences | 66485 | |
| Bovine serum albumin (BSA) digest standard | Protea | PS-204-1 | |
| Chloroform | Acros Organics | 423550025 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | BP118 | |
| HPLC Grade water | EMD | WX0008-1 | |
| Lysozyme | Fisher Scientific | BP535-1 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| Phenylmethyl sulfonyl fluoride (PMSF) | Amresco | 0754 | |
| Pierce trypsin protease | Thermo Scientific | 90057 | |
| Ponceau S | Acros Organics | 161470100 | |
| Protein LoBind Tube 0.5mL | Eppendorf | 022431064 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 792519 | |
| Sodium chloride | Macron Fine Chemicals | 7581-06 | |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigma-Aldrich | 299537 | |
| Tris-hydrochloride (HCl) | Fisher Scientific | BP152 | |
| Triton X-114 | Sigma-Aldrich | 93422 | |
| Tryptic soy broth (TSB) | BD | 211822 | |
| α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (MS Grade) | Sigma-Aldrich | C8982 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| MagNALyser | Roche | ||
| Trans-Blot Turbo Transfer System | Bio-Rad | ||
| MALDI-TOF target | Bruker Daltonics | ||
| Ultraflextreme MALDI-TOF-TOF | Bruker Daltonics | Equipped with a 355 nm frequency-tripled Nd:YAG smartbeam-II laser |
References
- Babu, M. M., et al. A database of bacterial lipoproteins (DOLOP) with functional assignments to predicted lipoproteins. J Bacteriol. 188 (8), 2761-2773 (2006).
- Narita, S., Tokuda, H. Bacterial lipoproteins; biogenesis, sorting and quality control. Biochim Biophys Acta. 1862 (11), 1414-1423 (2016).
- Kovacs-Simon, A., Titball, R. W., Michell, S. L. Lipoproteins of bacterial pathogens. Infect Immun. 79 (2), 548-561 (2011).
- Nguyen, M. T., Götz, F. Lipoproteins of Gram-Positive Bacteria: Key Players in the Immune Response and Virulence. Microbiol Mol Biol Rev. 80 (3), 891-903 (2016).
- Nakayama, H., Kurokawa, K., Lee, B. L. Lipoproteins in bacteria: structures and biosynthetic pathways. FEBS J. 279 (23), 4247-4268 (2012).
- Kurokawa, K., et al. Novel bacterial lipoprotein structures conserved in low-GC content Gram-positive bacteria are recognized by Toll-like receptor 2. J Biol Chem. 287 (16), 13170-13181 (2012).
- Kurokawa, K., et al. The Triacylated ATP Binding Cluster Transporter Substrate-binding Lipoprotein of Staphylococcus aureus Functions as a Native Ligand for Toll-like Receptor 2. J Biol Chem. 284 (13), 8406-8411 (2009).
- Asanuma, M., et al. Structural evidence of α-aminoacylated lipoproteins of Staphylococcus aureus. FEBS J. 278 (5), 716-728 (2011).
- Armbruster, K. M., Meredith, T. C. Identification of the Lyso-Form N-Acyl Intramolecular Transferase in Low-GC Firmicutes. J Bacteriol. 199 (11), e00099-e00017 (2017).
- Serebryakova, M. V., Demina, I. A., Galyamina, M. A., Kondratov, I. G., Ladygina, V. G., Govorun, V. M. The acylation state of surface lipoproteins of Mollicute Acholeplasma laidlawii. J Biol Chem. 286 (26), 22769-22776 (2011).
- Feng, S. H., Lo, S. C. Induced mouse spleen B-cell proliferation and secretion of immunoglobulin by lipid-associated membrane proteins of Mycoplasma fermentans incognitus and Mycoplasma penetrans. Infect Immun. 62 (9), 3916-3921 (1994).
- Feng, S. H., Lo, S. C. Lipid extract of Mycoplasma penetrans proteinase K-digested lipid-associated membrane proteins rapidly activates NF-kappaB and activator protein 1. Infect Immun. 67 (6), 2951-2956 (1999).
- Luque-Garcia, J. L., Zhou, G., Spellman, D. S., Sun, T. -T., Neubert, T. A. Analysis of electroblotted proteins by mass spectrometry: protein identification after Western blotting. Mol Cell Proteomics. 7 (2), 308-314 (2008).
- Luque-Garcia, J. L., Zhou, G., Sun, T. -T., Neubert, T. A. Use of Nitrocellulose Membranes for Protein Characterization by Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry. Anal Chem. 78 (14), 5102-5108 (2006).
- Kurokawa, K., et al. Environment-mediated accumulation of diacyl lipoproteins over their triacyl counterparts in Staphylococcus aureus. J Bacteriol. 194 (13), 3299-3306 (2012).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Schӓgger, H. Tricine-SDS-PAGE. Nat Protoc. 1, 16-22 (2006).
- Gravel, P. Protein Blotting by the Semidry Method. The Protein Protocols Handbook. , Spring Protocols. 321-334 (2002).
- Webster, J., Oxley, D. Protein Identification by Peptide Mass Fingerprinting using MALDI-TOF Mass Spectrometry. The Protein Protocols Handbook. , Springer Protocols. 1117-1129 (2009).
- Wilkins, M. R., et al. Detailed peptide characterization using PEPTIDEMASS - a World-Wide-Web-accessible tool. Electrophoresis. 18 (3-4), 403-408 (1997).
- Gasteiger, E., et al. Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server. The Proteomics Protocols Handbook. , Springer Protocols. 571-607 (2005).
- Perkins, D. N., Pappin, D. J. C., Creasy, D. M., Cottrell, J. S. Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data. Electrophoresis. 20 (18), 3551-3567 (1999).
- Al-Saad, K. A., Zabrouskov, V., Siems, W. F., Knowles, N. R., Hannan, R. M., Hill, H. H. Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry of lipids: ionization and prompt fragmentation patterns. Rapid Commun Mass Spectrom. 17 (1), 87-96 (2003).
