Summary
ويرد في إثراء البكتيرية البروتينات الدهنية باستخدام مرحلة السطح غير الأيونية تقسيم الأسلوب للاستخدام المباشر في فحوصات TLR أو التطبيقات الأخرى. ترد تفاصيل اتخاذ مزيد من الخطوات لإعداد ليبوبيبتيديس تريبتيك الطرفي ن لتوصيف الهيكلية بالطيف الكتلي.
Abstract
البروتينات الدهنية هي مكونات هامة في المغلف الخلية البكتيرية والمنشطات القوية للاستجابة المناعية الفطرية الثدييات. على الرغم من أهميتها لخلية علم وظائف الأعضاء وعلم المناعة، ما زال يمكن اكتشافها حول أشكال البروتين الدهني الرواية، وكيف أنها يتم تصنيعه وتأثير مختلف أشكال على الحصانة المضيف. لتمكين دراسات مستفيضة عن البروتينات الدهنية، يصف هذا البروتوكول وسيلة للإثراء بروتين دهني البكتيرية وإعداد ليبوبيبتيديس تريبتيك الطرفي ن للتصميم الهيكلي بالليزر ساعد مصفوفة الامتزاز التأين-وقت الرحلة الطيف الكتلي (TOF استخدام MS). التوسع في مرحلة X-114 تريتون المنشأة تقسيم أسلوب لاستخراج البروتين الدهني والإثراء من غشاء الخلية البكتيرية، يتضمن البروتوكول خطوات إضافية لإزالة الملوثات غير البروتين الدهني، زيادة إنتاج البروتين الدهني و النقاء. منذ البروتينات الدهنية تستخدم عادة في فحوصات مثل عدد القتلى مستقبلات (TLR)، من المهم أولاً وصف الهيكل الطرفي ن باستخدام TOF السيدة هيرين، يقدم أسلوب عزل الببتيدات مسعور تتركز المخصب الطرفي ن تنقل إلى غشاء النيتروسليلوز ليبوبيبتيديس مناسبة للتحليل المباشر باستخدام TOF MS/السيدة "البروتينات الدهنية" التي فصلت بالصوديوم دوديسيل كبريتات بولي اكريلاميد "هلام استشراد" (الحزب الديمقراطي الصربي صفحة)، وهضمها في الموقع مع التربسين، التتابع غسلها لإزالة الببتيدات تريبتيك القطبية، وأخيراً التيد مع كلوروفورم-الميثانول. عندما يقترن مع مرض التصلب العصبي المتعدد من الببتيدات تريبسينيزيد القطبية أكثر من الحلول الغسيل، هذا الأسلوب يوفر القدرة على التعرف بروتين دهني وتميز ن نهايته في تجربة واحدة. الصوديوم المتعمد adduct تكوين يمكن أن تستخدم أيضا كأداة لتعزيز أكثر تجزئة المعلومات هيكلياً الأطياف. في نهاية المطاف، سوف تسمح الإثراء من البروتينات الدهنية وتحديد هياكلها الطرفي ن دراسات مستفيضة أكثر في هذه الفئة في كل مكان من البروتينات البكتيرية.
Introduction
البكتيرية من البروتينات الدهنية تتميز حفظت الطرفي ن تعديل المادة الدهنية سيستين أن المراسي المجال بروتين كروي على سطح غشاء الخلية. وتوزع عالمياً في البكتيريا، والتي تشكل 2 إلى 5 في المائة من جميع الجينات الخلوية داخل جينوم نموذجية1. البروتينات الدهنية تلعب أدواراً حاسمة في مجموعة واسعة من العمليات الخلوية، بما في ذلك امتصاص المغذيات، توصيل الإشارة، الجمعية من البروتين المجمعات، وفي الحفاظ على الخلية المغلف السلامة الهيكلية2. البكتيريا المسببة للأمراض، والبروتينات الدهنية بمثابة عوامل الفوعة3،4. خلال عدوى، الاعتراف ليبوبيبتيديس الطرفي ن بعدد القتلى مثل مستقبلات (TLR) 2 تحرض استجابة مناعية فطرية لإزالة مسببات الأمراض الغازية. البروتينات الدهنية اعتماداً على الطرفي ن الدولة أسيليشن، والمعترف بها عموما بالمجمعات هيتيروديميريك TLR2 البديل. تسلم TLR2-TLR1 ليبوبيبتيديس أسيلاتيد ن، بينما يربط TLR2 TLR6 ليبوبيبتيدي حرة α الأمينية تيرميني. مرة ملزمة، تتلاقى مسارات إرسال الإشارات للحث على إفراز السيتوكينات proinflammatory3،4.
أنه كان يعتقد في السابق أن البروتينات الدهنية من البكتيريا إيجابية كانت دياسيلاتيد وتلك من البكتيريا سلبية الغرام كانت ترياسيلاتيد، متباينة في غياب أو وجود حمض الدهنية مرتبطة أميد على بقايا سيستين الطرفي ن مصانة. وأيد هذا الافتراض عدم وجود تسلسل أورثولوجس في جينومات إيجابية لخاصة، ترانسفيراز اشيل ن الغرام التي تشكل البروتينات الدهنية ترياسيلاتيد5. ومع ذلك، فقد كشفت الدراسات الأخيرة ترياسيليشن البروتين الدهني في Firmicutes إيجابية أن نقص خاصة، فضلا عن ثلاثة رواية الطرفي ن بروتين دهني الهياكل، ووصف بيبتيديل و lyso ن-أسيتيل أشكال6،7 ،8. هذه الاستنتاجات تثير تساؤلات بشأن الأشكال المحتملة بعد اكتشاف بروتين دهني، جنبا إلى جنب مع أسئلة أساسية حول كيفية إجراء هذه الرواية من البروتينات الدهنية وما الغرض الفسيولوجية أو ميزة نقل الأشكال المختلفة. وعلاوة على ذلك، أنها تبين بوضوح عجز الجينوم الحالية للتنبؤ ببنية البروتين الدهني. وفي الواقع، حددنا مؤخرا فئة رواية من البروتين الدهني ن-اشيل ترانسفيراسيس، تسمى يره، من فايكاليس البرازية و العصوية الشمعية التي تجعل من النموذج lyso البروتينات الدهنية9. وهذا يشير إلى ضرورة التحقق تجريبيا من هيكل البروتين الدهني، الذي يمكن أن تكون صعبة بسبب طبيعتها الغاية مسعور ومحدودية الأساليب المتاحة لتميز بنيتها الجزيئية.
لتسهيل الدراسات على بروتين دهني تحريض الاستجابة المناعية المضيفة، فضلا عن التصميم الهيكلي الطرفي ن، أننا قد تكيفت العديد من البروتوكولات المذكورة سابقا من أجل تنقية البروتينات الدهنية البكتيرية وإعداد تريبتيك N-المحطة ليبوبيبتيديس للتحليل باستخدام TOF MS6،10،،من1112. يتم إثراء البروتينات الدهنية باستخدام مرحلة X-114 تريتون (يشار إليه من الآن فصاعدا بالفاعل أو TX-114) أنشئت تقسيم الأسلوب الأمثل إزالة تلويث غير البروتينات الدهنية وزيادة غلة بروتين دهني. هذه البروتينات الدهنية مناسبة للاستخدام المباشر في فحوصات TLR أو لتنقية المزيد من الحزب الديمقراطي الصربي صفحة. TOF استخدام مرض التصلب العصبي المتعدد، يوفر نقل البروتينات الدهنية غشاء النيتروسليلوز سقالة للكفاءة في الموقع الهضم التربسين، غسل وشطف اللاحقة من سطح الغشاء، مما أدى إلى حد كبير تنقية ليبوبيبتيديس الطرفي ن. لقد ثبت النيتروسليلوز لتسهيل معالجة العينة وتحسين التغطية تسلسل للغاية مسعور الببتيدات من الغشاء لا يتجزأ البروتينات13،14، فضلا عن البروتينات الدهنية9،10 . يحتوي الأسلوب على ميزة إضافية لتجزئة الببتيدات استناداً إلى قطبية، حيث أن الحلول المتوسطة يغسل يمكن تحليلها لتحديد ثقة عالية البروتين في نفس الوقت مع التصميم الهيكلي الطرفي ن في تجربة واحدة . هذا البروتوكول فريد ميزات المتعمد الصوديوم adduct تكوين الرامية إلى تجزئة أيون الأصل نحو ديهيدروالانيل الأيونات خلال MS/MS، تساعد في تعيين الهيكلية للدولة-أسيليشن ن. ن-المحطة هو ميزة أكثر من متغير والرئيسية المتصلة باعتراف TLR البروتينات الدهنية. أخذت معا، سمح هذا البروتوكول دراسات مكثفة واستنساخه في البروتينات الدهنية، مع المراحل الفردية لتنقية والتصميم الهيكلي قبل استخدام TOF MS بسهولة تكييفها تبعاً للهدف العام لهذه التجربة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-النمو وتحلل الخلية
- تنمو البكتيريا في 15 مل مرق الصويا تريبتيك (TSB) أو الوسائط الغنية مماثلة في أواخر المرحلة الأسية (OD600 من 1.0-1.5). حصاد الخلايا باستخدام الطرد المركزي، وتغسل مرة واحدة مع تريس مخزنة المالحة/يدتا (تبسي) وتواصل مع بروتوكول أو تجميد حتى الاستخدام.
ملاحظة: تبسي: 20 مم تريس-هيدروكلوريد (HCl)، الرقم الهيدروجيني 8.0، كلوريد الصوديوم 130 مم (كلوريد الصوديوم)، وحمض الإيثيلين 5 مم (يدتا)). بروتين دهني التعبير والتعديل يمكن أن يتأثر بظروف النمو (مثل الحموضة، والملوحة، ووسائط النمو) و مرحلة النمو15. يمكن تحجيم نمو الخلايا حسب المطلوب، ولكن 15 مل من الخلايا يوصي لإعداد واحد من البروتينات الدهنية بالكتلة الحيوية الزائدة يمكن أن انخفاض الغلة بروتين دهني. عموما غلة واحدة 15 مل إعداد عينة كافية لتحميل الأمثل ~ 2-4 حارات في جل ميني الحزب الديمقراطي الصربي صفحة قياسية. - ريسوسبيند الخلايا في ميكروليتر 800 تبسي مع فلوريد السلفونيل فينيلميثيل 1 مم (بمسف) و lysozyme 0.5 ملغ/مل. نقل الحل إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي 2.0 مل خيوط مع سداده ملولبة والدائري واحتضان لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
ملاحظة: بعض الأنواع ليست عرضه لتحلل قبل ليسوزيمي. ينبغي الاستعاضة عن إنزيم الحال مناسبة للمساعدة في تحلل. - إضافة ميكروليتر ~ 800 مم 0.1 الزركونيا/السليكا الخرز إلى الأنبوب وتعطيل الخلايا عن طريق تهتز بأقصى سرعة ممكنة (7000 دورة في الدقيقة) في الخالطون لدورات 5 من 30 ثانية، مع كل 2 دقيقة بالراحة على الجليد بين كل دورة.
- عينة للطرد المركزي في ز x 3000 لمدة 5 دقائق عند 4 درجة مئوية (بيليه الخرز والخلايا دون انقطاع). نقل المادة طافية إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي 2.0 مل جديدة والحفاظ على الجليد.
- إضافة 200 ميكروليتر تبسي لبيليه المتبقية والعودة إلى الخالطون لدورة إضافية. الطرد المركزي (على النحو الوارد أعلاه)، والجمع بين المادة طافية مع المادة السابقة طافية (يجب أن يكون الحجم الإجمالي ميكروليتر 800-1000).
2-الإثراء من البروتينات الدهنية بتقسيم المرحلة TX-114
- تكملة المادة طافية مع السطح TX-114 لتركيز نهائي 2% (المجلد/المجلد) عن طريق إضافة وحدة تخزين تساوي 4% (المجلد/المجلد) الفاعل في تبسي المثلج واحتضان على الجليد ح 1، خلط بعكس كل ~ 15 دقيقة.
ملاحظة: عندما يبرد، المادة طافية والفاعل سيكون الامتزاج. - نقل الأنبوب في حمام مائي 37 درجة مئوية، واحتضان لمدة 10 دقائق للحث على انفصال. الطرد المركزي العينة في 10,000 س ز لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة الحفاظ على فصل bi طورية.
- بلطف "الماصة؛" قبالة المرحلة المائية العليا وتجاهل. إضافة تبسي المثلج إلى مرحلة السطح السفلي لإعادة ملء الأنبوب إلى حجمه الأصلي، وعكس إلى المزيج. احتضان بالثلج لمدة 10 دقائق.
- نقل الأنبوب في حمام مائي 37 درجة مئوية واحتضان لمدة 10 دقائق للحث على انفصال، ثم الطرد المركزي في 10,000 س ز لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- كرر الخطوات من 2.3-2.4 مرة أخرى ليصبح مجموع 3 نسخ فصل الألوان. إزالة المرحلة المائية العليا وتجاهل.
- إزالة بيليه سرع البروتينات التي تشكلت أثناء عمليات الاستخراج (يكون مرئياً في الجزء السفلي من الأنبوب)، عن طريق إضافة المجلد 1 من تبسي المثلج إلى مرحلة السطح. الطرد المركزي في 4 درجات مئوية في 16,000 س ز 2 دقيقة بيليه بروتين غير قابل للذوبان.
ملاحظة: يجب أن تظل عينة مرحلة واحدة. إذا حدث انفصال، إعادة تشيل عينة والطرد المركزي مرة أخرى. بيليه تتألف عموما من الملوثات غير البروتين الدهني، ولكن يمكن الاحتفاظ بها لمزيد من التحليل. - نقل المادة طافية على الفور إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي 2.0 مل طازجة التي تحتوي على 1250 ميكروليتر من الأسيتون 100%. "الماصة؛" صعودا وهبوطاً شاملا لغسل العينة من الطرف كما أنه سوف يكون لزج. مزيج من انعكاس واحتضان بين عشية وضحاها في-20 درجة مئوية يعجل بالبروتين.
- الطرد المركزي العينة في 16,000 س ز لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة بيليه البروتينات الدهنية مع الاهتمام بالتوجه للأنبوب. وسوف تشكل البروتينات الدهنية فيلما رقيقة، وأبيض على طول الجدار الخارجي للأنبوبة.
- أغسل بيليه مرتين مع الأسيتون 100%. صب الأسيتون والسماح بعينه للهواء الجاف.
- إضافة 20-40 ميكروليتر من 10 ملم تريس-HCl، pH 8.0 أو المخزن مؤقت عينة16 لايملي الحزب الديمقراطي الصربي صفحة قياسية ودقة ريسوسبيند من بيبيتينج صعودا وهبوطاً ضد الجدار مع البروتينات الدهنية سرع. تتخلص من جانب الأنبوب مع طرف الماصة لإزاحة البروتينات الدهنية.
ملاحظة: البروتينات الدهنية سوف لا تذوب في تريس المخزن المؤقت، ولكن بدلاً من ذلك تشكيل تعليق.- تخزين البروتينات الدهنية في-20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
3-الحزب الديمقراطي الصربي صفحة، اليكتروبلوتينج، وتلطيخ مع S بونسو
- البروتينات الدهنية منفصلة باستخدام الأساليب القياسية16صفحة الحزب الديمقراطي الصربي.
ملاحظة: سيتم تختلف نسبة الاكريلاميد جل المناسبة اعتماداً على الاستخدام المقصود وحجم البروتينات الدهنية. هنا، فايكاليس هاء- البروتينات الدهنية تم فصل أكثر 10% هلام تريس-جليكاين، بينما استخدمت جل تريس تريسيني نسبة 16.5 في المائة للبروتين الدهني كولاي أصغر الطب الخاص المحدود17. - نقل البروتينات الدهنية في غشاء نقل النيتروسليلوز استخدام إجراء اليكتروبلوتينج قياسية.
ملاحظة: قد أنجز نقل شبه جاف باستخدام مخزونات النشر الاستراتيجي المخزن المؤقت بالإضافة إلى 0.1% بيرم شافر-نيلسن في 25 الخامس، 1.3 mA لمدة 15 دقيقة18. بدلاً من ذلك، يمكن استخدام غشاء ثنائي الفلوريد (PVDF) الفينيليدن، لكن كما مسعور أكثر من النيتروسليلوز، قد يقلل من كفاءة شطف من ليبوبيبتيديس مسعور من الغشاء في خطوات لاحقة. - نقل الغشاء النيتروسليلوز إلى الحاوية والغطاء مع S بونسو حل (0.2% (w/v) S بونسو في حامض الخليك 5%). روك برفق لمدة 5 دقائق، أو حتى عصابات الأحمر الوردي مرئية.
- من أجل إيقاف S بونسو حل وشطف الغشاء النيتروسليلوز مع dH وصمة عار2س لإزالة الزائدة بعناية.
ملاحظة: سوف ديستاين العصابات الملطخة Ponceau سريعاً. إذا اختفت العصابات، كرر العملية المصبوغة. - مع شفرة حلاقة نظيفة، رسوم الإنتاج على النطاق المطلوب ونقل إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي. تغسل ثلاث مرات مع 1 مل من dH2س ديستاين الفرقة تماما.
ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا. تخزين المقطع قصت مغطاة بالمياه في-20 درجة مئوية حتى الاستخدام. - نقل المقطع إلى سطح نظيف ومع شفرة حلاقة نظيفة، الزهر قطاع النيتروسليلوز إلى قطع صغيرة من حوالي 1 مم × 1 مم-جمع القطع في أنبوب ميكروسينتريفوجي ملزمة بروتين منخفض 0.5 مل.
- تغسل القطع مرتين مع 0.5 مل من بيكربونات الأمونيوم-طازج 50 مم (NH4HCO3)، الرقم الهيدروجيني 7.8 في المياه درجة عالية الأداء اللوني السائل ([هبلك]).
4-تريبتيك الهضم، استخراج ليبوبيبتيدي من الغشاء النيتروسليلوز، وترسب على استخدام المستهدفة، والحصول على البيانات
- ريسوسبيند القطع النيتروسليلوز في 20 ميكروليتر من حل 20 ميكروغرام/مل من التربسين في 50 ملم NH4HCO3، الرقم الهيدروجيني 7.8 في المياه الصف [هبلك]. دوامة المزيج، ثم تدور بإيجاز لضمان أن كل قطعة مشمولة تماما بحل التربسين. تغطي غطاء الأنبوبة باستخدام البارافين الفيلم لمنع التبخر واحتضان هضم بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
- تدور العينة في 16,000 ز x 30 ثانية وإزالة السائل من بيبيتينج.
ملاحظة: هذا يزيل الببتيدات ماء تريبسينيزيد التي يمكن دراستها في وقت لاحق باستخدام TOF مرض التصلب العصبي المتعدد لتحديد البروتين. - إضافة 50 ميكروليتر من 0.5% حامض trifluoroacetic (تفا) في المياه الصف [هبلك]. دوامة للمزيج، ثم تدور عينة بإيجاز لضمان تغطية جميع القطع بالحل. احتضان لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. إزالة السائل من بيبيتينج.
تنبيه: تفا مضر إذا استنشق. التعامل معها بحذر واستخدم في غطاء الأبخرة الكيميائية. تجنب ملامسة الجلد. - كرر الخطوة 4، 3 مع 50 ميكروليتر من الاسيتو الانيتريل 10% في المياه الصف [هبلك].
تنبيه: الاسيتو الانيتريل مضر إذا استنشق. التعامل معها بحذر واستخدم في غطاء الأبخرة الكيميائية. تجنب ملامسة الجلد. - كرر الخطوة 4، 3 مع 50 ميكروليتر من الاسيتو الانيتريل 20% في المياه الصف [هبلك].
ملاحظة: هذا يزيل أي الببتيدات اعتدال مسعور فضفاضة ملزمة النيتروسليلوز. - الوت ليبوبيبتيديس ربط محكم، وإضافة 15 ميكروليتر الطازجة 10 ملغ/مل α-سينو-4-هيدروكسيسيناميك الحمضية (شكا) مصفوفة حله في كلوروفورم-الميثانول (2:1، v/v) واحتضانها لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع فورتيكسينج متقطعة.
- بدلاً من ذلك، قم بإضافة 15 ميكروليتر كلوروفورم الميثانول الوتي ليبوبيبتيديس وتخلط مع المصفوفة في وقت لاحق. وينبغي اختبار المصفوفات الأخرى، مثل حامض 2، 5-ديهيدروكسيبينزويك (المجالس الصحية المحلية)، كبدائل لشكا إذا كان يتم الحصول على نتائج غير مرضية لتكوين ليبوبيبتيدي خاصة.
تنبيه: ضررا إذا استنشق من كلوروفورم والميثانول. التعامل معها بحذر واستخدم في غطاء الأبخرة الكيميائية. تجنب ملامسة الجلد. - الاختياري: تعزيز الصوديوم adduct تكوين، الملحق حل شكا في كلوروفورم-الميثانول مع بيكربونات الصوديوم المائية (ناكو3) بتركيز نهائي من 1 مم.
- بدلاً من ذلك، قم بإضافة 15 ميكروليتر كلوروفورم الميثانول الوتي ليبوبيبتيديس وتخلط مع المصفوفة في وقت لاحق. وينبغي اختبار المصفوفات الأخرى، مثل حامض 2، 5-ديهيدروكسيبينزويك (المجالس الصحية المحلية)، كبدائل لشكا إذا كان يتم الحصول على نتائج غير مرضية لتكوين ليبوبيبتيدي خاصة.
- تدور العينة بإيجاز. مع ماصة، بعناية نقل السائل إلى أنبوب منخفض بروتين ملزمة جديدة ميكروسينتريفوجي. هذا الحل سوف تحتوي على الجزء الأكبر ليبوبيبتيديس ن--المحطة الطرفية.
ملاحظة: النيتروسليلوز قد جزئيا أو كلياً تذوب في كلوروفورم-الميثانول الحل. وهذا لن يؤثر سلبا على نتائج مرض التصلب العصبي المتعدد، ويمكن أن تستخدم كأسلوب بديل لزيادة عودة ليبوبيبتيدي. وسوف لا تذوب الغشاء PVDF بنفس الطريقة. - إيداع 1 ميكروليتر من ليبوبيبتيديس التيد مع شكا على هدف استخدام الفولاذ مصقول.
ملاحظة: كلوروفورم-الميثانول سوف تتبخر بسرعة، تاركة وراءها تبلور شكا وليبوبيبتيديس. يمكن إيداع ميكروليتر 1 الثاني اختياري الكوة على نفس المكان لزيادة تركيز العينة. كلوروفورم-الميثانول قد ينتشر إلى حد كبير بعد ترسب على الهدف، وعلى هذا النحو، ينبغي الحرص على تجنب خلط العينة على الهدف. من المستحسن لإيداع وإطلاق النار على بقع متعددة لكل عينة. - ينتقل فورا إلى الطيف الكتلي. فحص كافة المناطق من البقعة لإشارة ليبوبيبتيدي، خاصة إذا كان الموقع يحتوي على طبقتين من عينة، كما قد دفع الطبقة الثانية في ليبوبيبتيديس إلى الحافة الخارجية للمكان.
ملاحظة: كثافة الليزر انطلاق الموصى به هو 25%، على الرغم من أنه قد يكون من الضروري على زيادة كثافة الحصول على إشارة ومجموع متعددة الأطياف (مسح 20 أو أكثر) لتحقيق نسبة الإشارة إلى الضوضاء كافية. هنا، تم اقتناء الأطياف في صك استخدام-TOF-TOF (انظر الجدول للمواد) استخدام أسلوب أداة تكوين مصنع للكشف عن أيون إيجابية عاكس على مدى نطاق m/z 700-3500. الأداة معايرة مع خليط ببتيد تريبتيك ألبومين المصل بقرى (BSA).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويرد في الشكل 1تخطيطي للبروتوكول. ويبين الشكل 2الكسر بروتين دهني عالي التخصيب المستخرج من فايكاليس البرازية ATCC 19433 بتكساس-114. للمقارنة، وربط نمط الكسر البروتين سرع يرد أيضا. وتأكدت البروتينات من هذا الكسر باستخدام--مايكروسوفت أن تكون وفرة عالية تلويث البروتينات خلاف البروتينات الدهنية (الجدول 1). الأطياف الشامل في الشكل 3 إثبات الشخصية أيون الببتيد تريبتيك للبروتين الدهني faecalis هاء- معمول التي تحدث مع يغسل اللاحقة لتأهيلها النيتروسليلوز زمنياً مع المذيبات زيادة القطبية (ذروة الإحالات الواردة في الجدول 2). ويبين الشكل 4 ن--المحطة الطرفية الوصف الهيكلي لتأهيلها كما هو محدد باستخدام TOF MS/MS، كشف التشخيص N-أسيلاتيد ديهيدروالانيل قمم تمشيا مع النموذج lyso-بروتين دهني. الشكل 5 يوضح تأثير الصوديوم adduct تكوين التجزؤ، مع أيون الأصل سودياتيد تفتيت تفضيلي صالح أيون ديهيدروالانيل-أسيلاتيد ن.
رقم 1: التخطيطي للبروتوكول. البروتينات الدهنية هي أثري إلى تقسيم المرحلة TX-114 ويمكن استخدامها مباشرة، والأكثر شيوعاً في فحوصات TLR، أو تنقية المزيد من الحزب الديمقراطي الصربي صفحة للتصميم الهيكلي. يتم نقل البروتينات الدهنية إلى النيتروسليلوز، يهضم مع التربسين، تغسل التدرجي، وليبوبيبتيديس الناتجة عن التيد مع الميثانول كلوروفورم للتحليل الهيكلي باستخدام MS. قد يتم حفظ الحلول أغسل التربسين والنيتروسليلوز لتحديد البروتين وتحليل مرض التصلب العصبي المتعدد. ث:؛ تفا: حامض trifluoroacetic؛ تزاول: الاسيتو الانيتريل؛ شكا: حمض α-سينو-4-هيدروكسيسيناميك؛ تختار: الاختياري؛ استخدام: الليزر ساعد مصفوفة الامتزاز التأين؛ مرض التصلب العصبي المتعدد: الطيف الكتلي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2: إثراء الشخصية من تكساس-114 البروتينات من هاء-فايكاليس- هلام تريس-جليكاين الحزب الديمقراطي الصربي صفحة 10% ملطخة بأخذ الأزرق (أ) والغشاء النيتروسليلوز المقابلة ملطخة بونسياو S (ب) تكشف عن النطاقات المختلفة نمط بين الكسر البروتين سرع ("باور بوينت") وفي تنقية البروتينات الدهنية (ليرة لبنانية ""). العصابات الملطخة بأخذ المشار إليها قد اقتطعت واعتبرت غير البروتينات الدهنية باستخدام--مرض التصلب العصبي المتعدد الببتيدات تريبتيك (انظر الجدول 1). حدد معمول وتحليلها بواسطة البروتوكول الموضحة هنا. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: أيون التغييرات الشخصية ووفرة مع الأقطاب النيتروسليلوز تغسل الحلول. (أ) كسر التربسين الذي يظهر عدة شظايا الببتيد الداخلية المقابلة للبروتين الدهني faecalis هاء- معمول هو مبين في الشكل 2. نسبة 10 في المائة (ب) و 20 في المائة (ج) الاسيتو الانيتريل غسل الكسور إظهار التغييرات في شدة الإشارات وانخفاضا في العدد الإجمالي للقمم الفردية. (د) الكسر شطف النهائي هو التخصيب مع ليبوبيبتيدي الطرفي ن في m/ض 997، المؤشرة بالعلامة نجمية (*). هو تطبيع كثافة كل الأطياف إلى (أ) بمقارنة لكثافة إشارة. ترد في الجدول 2الجماهير قمم وتسلسل معين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| الفرقة | معرف البروتين | رقم الانضمام | مؤسسة الوزن الجزيئي | عدد الببتيد | |
| 1 | عامل استطالة تو | جيجابايت | EOL37301.1 | | 43,387 | 15 | |
| 2 | البيروكسيديز NADH | جيجابايت | EOL34572.1 | | 49,520 | 9 | |
| 3 | بيروفات نازعة E1component، وحدة فرعية ألفا | جيجابايت | EOL34709.1 | | 41,358 | 12 | |
| 4 | بيروفات نازعة E1 المكون، وحدة فرعية بيتا | جيجابايت | EOL34710.1 | | 35,373 | 19 | |
| 5 | 30S ribosomal البروتين S2 | جيجابايت | EOL33066.1 | | 29,444 | 16 | |
| 6 | 30S ribosomal البروتين S3 | جيجابايت | EOL37312.1 | | 24,355 | 14 | |
الجدول 1: سرع البروتينات ملوثات غير بروتين دهني- وحددت البروتينات هضم تريبتيك واستخدام--مرض التصلب العصبي المتعدد باستخدام معيار في جل الهضم البروتوكولات19 وهي مدرجة من أعلى إلى أسفل بنفس الترتيب التي تظهر على جل أخذ في الشكل 2. تم تحديد كل البروتين مع "فاصل الثقة" (C.I.) أكثر من 95%.
| العدد الأقصى | النظرية الجماهيرية | موقف البروتين | لا. مواقع قطع الضائعة | الببتيد تسلسل | |
| 1 | 631.3409 | 170-176 | 0 | جفاداك | |
| 2 | 675.4035 | 316-321 | 1 | تكيفك | |
| 3 | 826.4093 | 163-169 | 0 | فقاجفيك | |
| 4 | 893.4839 | 121-128 | 0 | نففساتفر | |
| 5 | 943.5359 | 240-247 | 0 | فوفيجفدر | |
| 6 | 1040.5047 | 188-197 | 0 | ياسفادباك | |
| 7 | 1200.6331 | 273-284 | 0 | جفجتافقديانر | |
| 8 | 1316.6997 | 290-301 | 0 | فبجيهلفيجلك | |
| 9 | 1385.7827 | 83-94 | 0 | فنتيفجيجيلك | |
| 10 | 1432.743 | 149-162 | 0 | فجففجيجففيدر | |
| 11 | 1568.7802 | 259-272 | 1 | دجكيدنفتلتستلك | |
| 12 | 1672.8289 | 240-254 | 1 | فوفيجفدردقدادجك | |
| 13 | 1707.8184 | 129-145 | 0 | دنيايلاجفاانيتك | |
| 14 | 1724.8027 | 35-49 | 0 | سفنقسويجلقاوجك | |
| 15 | 1797.9228 | 257-272 | 2 | تكدجكيدنفتلتستلك | |
| 16 | 1872.9854 | 285-301 | 1 | اليدكفبجيهلفيجلك | |
| 17 | 1945.9613 | 230-247 | 1 | دلنيسجسجدكفوفيجفدر | |
| 18 | 2240.1345 | 149-169 | 1 | فجففجيجففيدرفقاجفيك | |
| 19 | 2675.2543 | 230-254 | 2 | دلنيسجسجدكفوفيجفدردقدادجك | |
الجدول 2: لاحظ الجماهير والمقابلة الببتيدات تريبتيك. في silico التربسين هضم معمول faecalis هاء (بنك الجينات: EOL37280.1) كان يؤديها باستخدام بيبتيديماس،من2021، السماح ليصل إلى اثنين وغاب قطع مواقع. يتم سرد الجماهير النظرية من قمم الاحتفال في الأطياف في الشكل 3 ، جنبا إلى جنب مع تسلسل الببتيد المقابلة.
الشكل 4: استخدام TOF MS من البروتين الدهني faecalis هاء- تأهيلها. (A) طيف مرض التصلب العصبي المتعدد الأصل م/z 997 المنطقة المقابلة ليبوبيبتيدي ن--المحطة الطرفية لتأهيلها faecalis هاء . (ب) يكشف MS/MS ذروة ليبوبيبتيدي فإن النموذج lyso، مع تشخيص N-أسيلاتيد ديهيدروالانيل الببتيد يفتت أيون ذروة المؤشرة بالعلامة نجمية (*). ويرد هيكل أوضحت (ج). وقد تم تعديل هذا الرقم من منشور سابق9. R.I.: الكثافة النسبية الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 5: الصوديوم adduct تكوين يعزز تجزئة أيون الأصل نحو أيونات ليبوبيبتيدي ديهيدروالانيل. (أ) استخدام TOF الأطياف من الببتيد بروتين دهني الطب الخاص المحدود N--المحطة الطرفية كولاي دون (آثار الفيروز) مع (آثار الزرقاء)، وإضافة بيكربونات الصوديوم. يؤدي إضافة بيكربونات الصوديوم للكسر التيد النهائية زيادة دا 22 من كتلة محسوب من ليبوبيبتيدي الأصل. بالمقارنة مع الطيف MS/MS لايون البروتونية (ب)، يظهر الطيف MS/MS لايون سودياتيد المقابلة (ج) تجزئة تفضيلية كبيرة تجاه ن-الأسيل-أيون ديهيدروالانيل عن طريق المحايدة القضاء على مجموعة دياسيلثيوجليسيريل، المؤشرة بالعلامة نجمية (*). هيكل الببتيد تريبتيك ترياسيلاتيد ن الطب الخاص المحدود--المحطة الطرفية الأصل (د) وأن ن-الأسيل-يصور ديهيدروالانيل الببتيد شظية أيون (ه) . وقد تم تعديل هذا الرقم من منشور سابق9. R.I.: الكثافة النسبية الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
البروتوكول هنا يصف اثنان مراحل متميزة لتوصيف البروتين الدهني: الإثراء بتكساس-114 المرحلة تحديد التقسيم والهيكلية باستخدام TOF مرض التصلب العصبي المتعدد. أثناء استخراج TX-114، يزيل الطرد المركزي الإضافية تلويث البروتينات التي تتسبب في أثناء هذه العملية، تليها الأسيتون هطول الأمطار لإنتاج البروتينات الدهنية التخصيب. عن طريق الحد من حجم كل إعداد بقيمة 15 مل من الخلايا، عدة عينات يمكن بسهولة معالجتها بالتوازي، وإذا رغبت في ذلك، تجمع في نهاية البروتوكول.
للحصول على التحليل الهيكلي بمرض التصلب العصبي المتعدد، يسهل نقل البروتينات الدهنية إلى النيتروسليلوز الهضم التربسين والغسيل وشطف اللاحقة من الغشاء. في أيدينا، أثبت هذا النهج أن يكون الأفضل لاستخراج مواد التنظيف بوساطة من المقابس التقليدية polyacrylamide هلام، المرتبطة بسطح الغشاء النيتروسليلوز البروتينات الدهنية وليس جزءا لا يتجزأ من بولياكريلاميدي. رابطة البروتين الدهني مع السطح النيتروسليلوز يمنع أيضا إلى حد كبير مشكلة مشتركة من الامتزاز غير محدد للأسطح الحاوية من الببتيدات مسعور. شطف التدرجي للقطع النيتروسليلوز يزيل أكثر الببتيدات تريبتيك ماء، الداخلية التي يمكن تحليلها باستخدام TOF مرض التصلب العصبي المتعدد لتحقيق ثقة عالية البروتين تحديد المهام، في حين أن الخطوة النهائية شطف تكاثر غلة ليبوبيبتيديس تتركز في وحدة تخزين صغيرة خالية إلى حد كبير من الأملاح التدخل وأيون قمع الملوثات.
تحليل مرض التصلب العصبي المتعدد ناجحة للبروتين الدهني مرهون بالوفرة، والعصابات أحلك من الغشاء الملون S بونسو على هذا النحو، من المرجح أن تعطي أفضل النتائج. ومع ذلك، من الممكن أن البروتينات الدهنية عدة قد تهاجر في عصابة واحدة خلال فصل الصفحة، تعقيد الأطياف الناتجة عن ذلك. ولذلك فإنه ينصح بشدة أولاً تحديد البروتين حسب الكتلة الببتيد البصمات (تحلان)، الذي يمكن أن ينجزه جمع مرض التصلب العصبي المتعدد الأطياف عن الكسر التربسين مجموع أو أما الكسر أغسل الاسيتو الانيتريل وإدخال قمم الناتجة إلى برامج مثل التميمة22. حساب كتلة ليبوبيبتيدي الطرفي ن تريبتيك إلى حد كبير الإيدز مرة واحدة وقد تم تحديد التسلسل البروتين، في اختيار الذي أيون إلى تجزئة قبل MS/MS.
يمكن أن يؤدي عدم تجانس عينة إضافية من اختلاف أطوال سلسلة اشيل في البروتينات الدهنية داخل عدد من سكان وتعديلاتها الطرفي ن، سواء تبعاً للبكتيريا مصدر6. بينما يجعل الاختلاف في طول السلسلة لمجموعات الذروة مميزة في أطياف الأصل، يتميز بزيادات دا 14 المقابلة لمجموعات الميثيلين (-CH2-)، ويمكن تقسيم إشارة ليبوبيبتيدي الشاملة وإنقاص حساسية. من المرجح أيضا أن أشكال مختلفة من البروتين الدهني يؤثر الإثراء والتجزؤ، على الرغم من أننا حددنا بنجاح ترياسيلاتيد، ودياسيلاتيد، والبروتينات الدهنية lyso-النموذج باستخدام بروتوكول وصف. وبالمثل، مويتيس الببتيد متفاوتة من البروتينات الدهنية إضافة مستوى آخر من التعقيد للتحليلات، بغض النظر عن هيكلها الطرفي ن، كما قد يمنع تكوين ماء جداً من الأحماض الأمينية ليبوبيبتيدي التقسيم إلى مرحلة العضوية كلوروفورم استخدام أساليب الاستخراج الأخرى8. نقل البروتين الدهني إلى النيتروسليلوز سيساعد في دراسة مثل هذه ليبوبيبتيديس، كما يمكن تحليل جميع شطف الكسور في هذا الأسلوب.
الرسم من المؤلفات السابقة التي تنطوي على ترياسيلجليسيريديس وشكلها23، الصوديوم المتعمد adduct تكوين يمكن استخدامها لتعزيز التجزئة المزيد من المعلومات عن طريق تشكيل (N-اشيل)-أيون الببتيد ديهيدروالانيل. هذه الأيونات المميزة هي المفتاح لتعيين بنية، نظراً لحالة أسيلاتيون ن-المحطة معزولة من الاستبدالات اشيل على مجموعة القناة. الصوديوم adduct تكوين يوفر خيار بديل مناسب للكبريت الأكسدة مع فوق أكسيد الهيدروجين، التي أظهرت أيضا تعزيز ن-الأسيل-ديهيدروالانيل الببتيد تجزئة6،8. على الرغم من أن أدوكتس الصوديوم قد تظهر قمع عموما إشارة أيون الأصل، زيادة محددة في تجزئة نحو أيونات ديهيدروالانيل أن يعوض عن الأصل تناقص كثافة أيون. قد يكون من المفيد استكشاف المصفوفات الأخرى، وتجزئة إضافية أدوكتس للحصول على الأطياف أكبر قدر من المعلومات.
ويحسن هذا البروتوكول المتعلق بمرحلة TX-114 التقليدية تقسيم الأسلوب لإثراء البروتين الدهني، بينما نقل صفحة فصل البروتينات الدهنية للغشاء النيتروسليلوز يسهل الهضم التربسين وشطف من ليبوبيبتيديس. ويتيح تحليل TOF استخدام مرض التصلب العصبي المتعدد في كسور تريبتيك أو غسل الكلي لتحديد البروتين بالترادف مع التصميم الهيكلي الطرفي ن قبل MS/MS في تجربة واحدة. الصوديوم اختياري adduct تكوين يسلط الضوء على الاختلافات في ليبوبيبتيدي ن تيرمينوس بتشجيع أكثر إفادة أيون التجزؤ. القدرة على تنقية البروتينات الدهنية بشكل روتيني وتميز نون-تيرميني سيمكن دراسات مستفيضة على بروتين دهني رواية كيف تصنع أشكال ودورها الفسيولوجية داخل المغلف الخلية البكتيرية، وكيف يتم الكشف عنها بالمناعة الثدييات النظام.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
وأيد البحث في مختبر ميريديث أموال بدء التشغيل المقدمة من "كلية العلوم ابيرلي" (جامعة ولاية بنسلفانيا). ونشكر الدكتور تاتيانا لاريموري على الخبراء تقديم المشورة التقنية والحصول على المعدات في بنسلفانيا الدولة البروتيوميات ووسائل قياس الطيف الكتلي الأساسية مرفق، جامعة بارك، السلطة الفلسطينية، حيث أجريت التحاليل والمطيافيه الجماعية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| 0.01 mm Zirconia/silica beads | BioSpec Products | 110791012 | |
| Acetic acid | EMD | AX0073-9 | |
| Acetone | EMD | AX0116-6 | |
| Acetonitrile | EMD | AX0142-6 | |
| Ammonium bicarbonate | Fluka Analytical | 09830 | |
| BioTrace NT Nitrocellulose | PALL Life Sciences | 66485 | |
| Bovine serum albumin (BSA) digest standard | Protea | PS-204-1 | |
| Chloroform | Acros Organics | 423550025 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | BP118 | |
| HPLC Grade water | EMD | WX0008-1 | |
| Lysozyme | Fisher Scientific | BP535-1 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| Phenylmethyl sulfonyl fluoride (PMSF) | Amresco | 0754 | |
| Pierce trypsin protease | Thermo Scientific | 90057 | |
| Ponceau S | Acros Organics | 161470100 | |
| Protein LoBind Tube 0.5mL | Eppendorf | 022431064 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 792519 | |
| Sodium chloride | Macron Fine Chemicals | 7581-06 | |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigma-Aldrich | 299537 | |
| Tris-hydrochloride (HCl) | Fisher Scientific | BP152 | |
| Triton X-114 | Sigma-Aldrich | 93422 | |
| Tryptic soy broth (TSB) | BD | 211822 | |
| α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (MS Grade) | Sigma-Aldrich | C8982 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| MagNALyser | Roche | ||
| Trans-Blot Turbo Transfer System | Bio-Rad | ||
| MALDI-TOF target | Bruker Daltonics | ||
| Ultraflextreme MALDI-TOF-TOF | Bruker Daltonics | Equipped with a 355 nm frequency-tripled Nd:YAG smartbeam-II laser |
References
- Babu, M. M., et al. A database of bacterial lipoproteins (DOLOP) with functional assignments to predicted lipoproteins. J Bacteriol. 188 (8), 2761-2773 (2006).
- Narita, S., Tokuda, H. Bacterial lipoproteins; biogenesis, sorting and quality control. Biochim Biophys Acta. 1862 (11), 1414-1423 (2016).
- Kovacs-Simon, A., Titball, R. W., Michell, S. L.
- Nguyen, M. T., Götz, F. Lipoproteins of Gram-Positive Bacteria: Key Players in the Immune Response and Virulence. Microbiol Mol Biol Rev. 80 (3), 891-903 (2016).
- Nakayama, H., Kurokawa, K., Lee, B. L. Lipoproteins in bacteria: structures and biosynthetic pathways. FEBS J. 279 (23), 4247-4268 (2012).
- Kurokawa, K., et al. Novel bacterial lipoprotein structures conserved in low-GC content Gram-positive bacteria are recognized by Toll-like receptor 2. J Biol Chem. 287 (16), 13170-13181 (2012).
- Kurokawa, K., et al. The Triacylated ATP Binding Cluster Transporter Substrate-binding Lipoprotein of Staphylococcus aureus Functions as a Native Ligand for Toll-like Receptor 2. J Biol Chem. 284 (13), 8406-8411 (2009).
- Asanuma, M., et al. Structural evidence of α-aminoacylated lipoproteins of Staphylococcus aureus. FEBS J. 278 (5), 716-728 (2011).
- Armbruster, K. M., Meredith, T. C. Identification of the Lyso-Form N-Acyl Intramolecular Transferase in Low-GC Firmicutes. J Bacteriol. 199 (11), e00099-e00017 (2017).
- Serebryakova, M. V., Demina, I. A., Galyamina, M. A., Kondratov, I. G., Ladygina, V. G., Govorun, V. M. The acylation state of surface lipoproteins of Mollicute Acholeplasma laidlawii. J Biol Chem. 286 (26), 22769-22776 (2011).
- Feng, S. H., Lo, S. C. Induced mouse spleen B-cell proliferation and secretion of immunoglobulin by lipid-associated membrane proteins of Mycoplasma fermentans incognitus and Mycoplasma penetrans. Infect Immun. 62 (9), 3916-3921 (1994).
- Feng, S. H., Lo, S. C. Lipid extract of Mycoplasma penetrans proteinase K-digested lipid-associated membrane proteins rapidly activates NF-kappaB and activator protein 1. Infect Immun. 67 (6), 2951-2956 (1999).
- Luque-Garcia, J. L., Zhou, G., Spellman, D. S., Sun, T. -T., Neubert, T. A. Analysis of electroblotted proteins by mass spectrometry: protein identification after Western blotting. Mol Cell Proteomics. 7 (2), 308-314 (2008).
- Luque-Garcia, J. L., Zhou, G., Sun, T. -T., Neubert, T. A. Use of Nitrocellulose Membranes for Protein Characterization by Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry. Anal Chem. 78 (14), 5102-5108 (2006).
- Kurokawa, K., et al. Environment-mediated accumulation of diacyl lipoproteins over their triacyl counterparts in Staphylococcus aureus. J Bacteriol. 194 (13), 3299-3306 (2012).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Schӓgger, H. Tricine-SDS-PAGE. Nat Protoc. 1, 16-22 (2006).
- Gravel, P. Protein Blotting by the Semidry Method. The Protein Protocols Handbook. , Spring Protocols. 321-334 (2002).
- Webster, J., Oxley, D. Protein Identification by Peptide Mass Fingerprinting using MALDI-TOF Mass Spectrometry. The Protein Protocols Handbook. , Springer Protocols. 1117-1129 (2009).
- Wilkins, M. R., et al. Detailed peptide characterization using PEPTIDEMASS - a World-Wide-Web-accessible tool. Electrophoresis. 18 (3-4), 403-408 (1997).
- Gasteiger, E., et al. Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server. The Proteomics Protocols Handbook. , Springer Protocols. 571-607 (2005).
- Perkins, D. N., Pappin, D. J. C., Creasy, D. M., Cottrell, J. S. Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data. Electrophoresis. 20 (18), 3551-3567 (1999).
- Al-Saad, K. A., Zabrouskov, V., Siems, W. F., Knowles, N. R., Hannan, R. M., Hill, H. H. Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry of lipids: ionization and prompt fragmentation patterns. Rapid Commun Mass Spectrom. 17 (1), 87-96 (2003).
