Summary
Berigelse af bakteriel lipoproteiner ved hjælp af en nonionisk overfladeaktivt stof fase partitionering metode er beskrevet til direkte brug i TLR assays eller andre programmer. Yderligere skridt er detaljeret at forberede N-terminale tryptic lipopeptides for strukturel karakterisering af massespektrometri.
Abstract
Lipoproteiner er vigtige bestanddele af bakteriel celle kuvert og potent aktivatorer af pattedyr medfødte immunrespons. Trods deres betydning for både celle fysiologi og Immunologi, er stadig meget at blive opdaget omkring roman lipoprotein former, hvor de er syntetiseret, og effekten af de forskellige former på vært immunitet. Hvis du vil aktivere grundige undersøgelser af lipoproteiner, denne protokol beskriver en metode for bakteriel lipoprotein berigelse og forberedelse af N-terminale tryptic lipopeptides for Strukturbestemmelse af matrix assisted laser desorption ionisering-tid af en flyvning massespektrometri (MALDI-TOF MS). Udvide en etableret Triton X-114 fase partitionering metode for lipoprotein udvinding og berigelse af den bakterielle cellemembranen, protokollen indeholder yderligere trin for at fjerne ikke-lipoprotein forureninger, øge lipoprotein udbytte og renhed. Da lipoproteiner er almindeligt anvendt i Toll-lignende receptor (TLR) assays, det er afgørende at først karakterisere den N-terminale struktur af MALDI-TOF MS. Herein, en metode er præsenteret for at isolere koncentrerede hydrofobiske peptider beriget med N-terminalen lipopeptides egnet til direkte analyse af MALDI-TOF MS/MS. lipoproteiner, der har været adskilt af Sodium Dodecyl sulfat Poly-acrylamid gelelektroforese (SDS-PAGE) overføres til en nitrocellulose membran, fordøjet i situ med Trypsin, vaskes sekventielt for at fjerne polære tryptic peptider, og endelig elueret med chloroform-methanol. Når kombineret med MS i de mere polære trypsinized peptider fra vask løsninger, giver denne metode mulighed for at identificere lipoprotein såvel karakterisere sin N-terminus i et enkelt eksperiment. Forsætlig natrium addukt dannelse kan også anvendes som et redskab til at fremme mere strukturelt informative fragmentering spektre. I sidste ende, berigelse af lipoproteiner og bestemmelse af deres N-terminale strukturer vil muliggøre mere omfattende undersøgelser på denne allestedsnærværende klasse af bakterielle proteiner.
Introduction
Bakteriel lipoproteiner er karakteriseret ved en bevaret N-terminale lipid-modificerede cystein, der forankrer kugleformede protein-domæne til celle membranen overflade. De er universelt fordelt i bakterier, der udgør 2-5% af alle cellulære gener i en typisk genom1. Lipoproteiner spiller en kritisk rolle i en bred vifte af cellulære processer, herunder næringsstof optagelse, signaltransduktion, samling af proteinkomplekser, og opretholde cellens kuvert strukturelle integritet2. I patogene bakterier tjene lipoproteiner som virulens faktorer3,4. Under en infektion tilskynder anerkendelse af N-terminale lipopeptides af Toll-lignende receptor (TLR) 2 en medfødte immunrespons fjerne invaderende patogener. Afhængigt af den N-terminale acylation stat, er lipoproteiner generelt anerkendt af alternative TLR2 heterodimerisk komplekser. TLR2-TLR1 genkender N-acylated lipopeptides, mens TLR2-TLR6 bindes gratis lipopeptid α-aminosyrer termini. En gang bundet, konvergerer signaling forløbene for at fremkalde sekretion af proinflammatoriske cytokiner3,4.
Man mente tidligere, at lipoprotein fra Gram-positive bakterier var diacylated og dem fra Gram-negative bakterier blev triacylated, kun ved fravær eller tilstedeværelse af et AMID-linked fedtsyre på den bevarede N-terminale cystein rest. Denne antagelse blev understøttet af manglen sekvens orthologs i Gram-positive genomer til Lnt, Gram-negative N-acyl-transferase, der danner triacylated lipoproteiner5. Men nyere undersøgelser har afsløret lipoprotein triacylation i Gram-positive Firmicutes at manglende lnt, samt tre nye N-terminale lipoprotein strukturer, betegnes peptidyl, lyso og N -acetyl former6,7 ,8. Disse resultater rejse spørgsmål om muligt endnu-til-være-opdagede lipoprotein former, sammen med grundlæggende spørgsmål om, hvordan disse nye lipoproteiner er lavet og hvilke fysiologiske formål eller fordel forskellige former give. Desuden, de klart viser genomforskning nuværende evne til at forudsige lipoprotein struktur. Ja, vi for nylig identificeret en roman klasse af lipoprotein N-acyl transferaser, kaldet Lit, fra Enterococcus faecalis og Bacillus cereus der gør lyso-form lipoproteiner9. Dette viser, at eksperimentelt kontrollere lipoprotein struktur, som kan blive udfordrende på grund af deres ekstremt hydrofob karakter og begrænsede metoder for at karakterisere deres molekylære struktur.
For at lette undersøgelser af lipoprotein induktion af vært immunrespons, samt N-terminale Strukturbestemmelse, har vi tilpasset flere tidligere beskrevet protokoller for at rense bakteriel lipoproteiner og forberede den N-terminale tryptic lipopeptides til analyse af MALDI-TOF MS6,10,11,12. Lipoproteiner er beriget ved hjælp en etablerede Triton X-114 (herefter benævnt overfladeaktivt stof eller TX-114) fase partitionering metode, med optimering til at fjerne forurenende ikke-lipoproteiner og øge lipoprotein udbytte. Disse lipoproteiner er egnede til direkte anvendelse i TLR assays eller til yderligere rensning af SDS-PAGE. For MALDI-TOF MS, overførsel af lipoproteiner til nitrocellulose membran giver en stillads til effektiv i situ trypsin fordøjelse, vask og efterfølgende eluering fra membranen overflade, hvilket resulterer i meget renset N-terminale lipopeptides. Nitrocellulose har vist sig at lette prøve håndtering og forbedre sekvens dækning for meget hydrofobe peptider fra integreret membran proteiner13,14, samt lipoproteiner9,10 . Metoden har den yderligere fordel, fractionating peptider baseret på polaritet, så at mellemliggende vask løsninger kan analyseres for høj genkendelsessikkerhed protein identifikation samtidig med N-terminalen Strukturbestemmelse i en enkelt eksperiment . Denne protokol entydigt funktioner forsætlig natrium addukt dannelse at fremme overordnede ion fragmentering mod dehydroalanyl ioner under MS/MS, medvirken i strukturelle tildeling af N- acylation stat. N-terminus er både variable og mest centrale funktion relateret til TLR anerkendelse af lipoproteiner. Tilsammen har denne protokol tilladt intensiv og reproducerbare studies på lipoproteiner, med de enkelte faser af rensning og Strukturbestemmelse af MALDI-TOF MS nemt tilpasses afhængig af det overordnede mål for eksperimentet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. celle vækst og Lysis
- Vokse bakterier i 15 mL tryptic soja bouillon (TSB) eller lignende rige medier til sene eksponentiel fase (OD600 1,0-1,5). Høste celler ved centrifugering, vaske en gang med Tris-bufferet saltvand/EDTA (TBSE) og fortsætte med protokol eller fryse indtil brug.
Bemærk: TBSE: 20 mM Tris-hydrochlorid (HCl), pH 8,0, 130 mM natriumchlorid (NaCl), og 5 mM ethylendiamintetra syre (EDTA)). Lipoprotein udtryk og modifikation kan være påvirket af vækstbetingelser (fx surhedsgrad, saltholdighed, vækst medier) og vækst fase15. Cellevækst kan skaleres som ønsket, men 15 mL af celler er anbefalet for et enkelt præparat af lipoproteiner, som overskydende biomasse kan falde lipoprotein udbytte. En 15 mL forberedelse generelt udbytter nok prøve for optimal lastning af ~ 2-4 baner på et standard SDS-PAGE mini gel. - Resuspend celler i 800 μL TBSE med 1 mM phenylmethyl sulfonyl fluor (PMSF) og 0,5 mg/mL lysozym. Opløsning overføres til en 2.0-mL gevind microcentrifuge tube med skruelåg og O-ring og Inkuber i 20 min ved 37 ° C.
Bemærk: Visse arter er ikke modtagelige for lysering af lysozym. En passende lytisk enzym bør erstattes af støtte i lysering. - Tilføje ~ 800 μL 0.1 mm zirconia/silica perler til røret og forstyrre celler ved omrystning ved maksimal hastighed (7,000 rpm) på en homogeniseringsapparat for 5 cyklusser af 30 s hver, med 2 min hvile på isen mellem hver cyklus.
- Centrifuge prøve på 3000 x g i 5 min. ved 4 ° C (til pellet perler og ubrudt celler). Overføre supernatanten til en ny 2,0 mL microcentrifuge tube og holde på is.
- Tilføje 200 μl TBSE til de resterende pellet og vende tilbage til homogeniseringsapparat for en yderligere cyklus. Der centrifugeres (som ovenfor) og kombinere supernatanten med tidligere supernatanten (bør 800-1000 μL samlede volumen).
2. berigelse af lipoproteiner ved TX-114 fase partitionering
- Supplere supernatanten med TX-114 overfladeaktivt stof til en slutkoncentration på 2% (vol/vol) ved at tilføje et lige saa stort volumen af 4% (vol/vol) det overfladeaktive stof i iskold TBSE og inkuberes i isbad i 1 h, blanding af inversion hver ~ 15 min.
Bemærk: Når kølet, supernatanten og overfladeaktivt stof bliver blandbar. - Overføre røret til et 37 ° C vandbad og inkuberes i 10 min. til at fremkalde faseadskillelse. Der centrifugeres prøve på 10.000 x g i 10 min. ved stuetemperatur til at opretholde bi-phasic adskillelse.
- Forsigtigt afpipetteres off den øverste vandige fase og kassér. Tilføje iskold TBSE til den lavere overfladeaktivt stof fase at genopfylde tube til sin oprindelige volumen og vend for at blande. Der inkuberes i isbad i 10 min.
- Overføre røret til et 37 ° C vandbad og inkuberes i 10 min. til at fremkalde faseadskillelse og derefter centrifugeres ved 10.000 x g i 10 min. ved stuetemperatur.
- Gentag trin 2.3-2.4 endnu for i alt 3 separationer. Fjern den øverste vandige fase og kassér.
- Fjerne pellet af bundfaldne proteiner, der dannes i løbet af ekstraktioner (synlig i bunden af røret), ved at tilføje 1 bind for iskold TBSE overfladeaktivt stof fase. Der centrifugeres ved 4 ° C på 16.000 x g i 2 min. til pellet uopløselige protein.
Bemærk: Prøven bør forblive en enkelt fase. Hvis faseadskillelse opstår, re chill udsnit og centrifugeres igen. Pellet er generelt består af ikke-lipoprotein forureninger, men kan opbevares i yderligere analyse. - Straks overføre supernatanten til en frisk 2,0 mL microcentrifuge rør indeholdende 1250 μL 100% acetone. Pipetteres op og ned grundigt for at vaske prøve fra spidsen, da det vil være tyktflydende. Mix af inversion og inkuberes natten over ved-20 ° C for at udfælde proteiner.
- Der centrifugeres prøve på 16.000 x g i 20 min. ved stuetemperatur til pellet lipoproteiner med vægt på orientering af røret. Lipoproteiner vil danne en tynd, hvid film langs den ydre mur af røret.
- Vask pellet to gange med 100% acetone. Dekanteres acetone og tillade prøven til luft tørre.
- Tilføj 20-40 μl af 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 eller en standard Laemmli SDS-PAGE prøve buffer16 og grundigt resuspend af pipettering op og ned mod væggen med de udfældede lipoproteiner. Skrab side af rør med pipette tip til at løsne lipoproteiner.
Bemærk: Lipoproteiner vil ikke opløses i Tris buffer, men snarere udgør en suspension.- Gemme lipoproteiner ved-20 ° C indtil brug.
3. SDS-PAGE, Electroblotting og farvning med Ponceau Sørensen
- Separat lipoproteiner af SDS-side ved hjælp af standardmetoderne16.
Bemærk: Passende gel acrylamid procent vil variere afhængigt af dens påtænkte anvendelse og størrelse af lipoproteiner. Her, blev E. faecalis lipoproteiner adskilt over en 10% Tris-glycin gel, mens en 16,5% Tris-tricine gel blev brugt til den mindre E. coli lipoprotein Lpp17. - Overføre lipoproteiner til en nitrocellulose overførsel membran ved hjælp af en standard electroblotting procedure.
Bemærk: En halvtør overførsel ved hjælp af Bjerrum Schafer-Nielsen buffer plus 0,1% SDS blev udført på 25 V, 1,3 mA for 15 min18. Skiftevis, polyvinylidene xenondifluorid (PVDF) membran kunne bruges, men da det er mere hydrofobe end nitrocellulose, det kan reducere effektiv eluering af hydrofobe lipopeptides fra membran på senere trin. - Overføre nitrocellulose membran til en beholder og dæk med Ponceau S løsning (0,2% (w/v) Ponceau S i 5% eddikesyre). Rock forsigtigt i 5 min eller indtil rød-pink bands er synlige.
- Hæld Ponceau S løsning og omhyggeligt skyl nitrocellulose membran med dH2O for at fjerne overskydende pletten.
Bemærk: Ponceau-farvede bands vil destain hurtigt. Hvis bands forsvinde, Gentag farvning processen. - Med en ren barberblad, punktafgifter bølgeområde og overførsel til et microcentrifuge rør. Vaskes tre gange med 1 mL af dH2O til helt destain bandet.
Bemærk: Protokollen kan pause her. Butik sektionen skåret dækket med vand ved-20 ° C indtil brug. - Overføre afsnittet til en ren overflade og med en ren barberblad, terninger nitrocellulose strip i små stykker af ca 1 mm x 1 mm. indsamle stykker i en 0,5 mL lavt proteinindhold bindende microcentrifuge rør.
- Vaske i stykker to gange med 0,5 mL af frisklavede 50 mM ammoniumbicarbonat (NH4HCO3), pH 7,8 i high-performance væskekromatografi (HPLC) vand.
4. tryptic fordøjelse, lipopeptid udtræk fra Nitrocellulose membran, Deposition på MALDI mål og dataopsamling
- Resuspend nitrocellulose stykker i 20 μL af 20 μg/mL opløsning af trypsin i 50 mM NH4HCO3, pH 7,8 i vand af HPLC-renhed. Vortex at blande, derefter spin kortvarigt for at sikre, at alle stykker dækkes fuldt ud af trypsin løsning. Dække tube låget ved hjælp af paraffin film at forhindre fordampning og inkuberes digest natten over ved 37 ° C.
- Spin prøve på 16.000 x g for 30 s og fjern væsken af pipettering.
Bemærk: Dette fjerner trypsinized hydrofile peptider, der kan blive undersøgt senere af MALDI-TOF MS for protein identifikation. - Tilsæt 50 μL af 0,5% trifluoreddikesyre (TFA) i vand af HPLC-renhed. Vortex at blande, spin derefter prøve kort at sikre alle brikker er omfattet af løsningen. Der inkuberes i 10 min. ved stuetemperatur. Fjern væsken af pipettering.
Forsigtighed: TFA er skadelige indånding. Behandles med forsigtighed og brug i den kemiske stinkskab. Undgå kontakt med huden. - Gentag trin 4.3 med 50 μl af 10% acetonitril i vand af HPLC-renhed.
Forsigtighed: Acetonitril er skadelige indånding. Behandles med forsigtighed og brug i den kemiske stinkskab. Undgå kontakt med huden. - Gentag trin 4.3 med 50 μL af 20% acetonitril i vand af HPLC-renhed.
Bemærk: Dette fjerner enhver moderat hydrofobe peptider løst bundet til nitrocellulose. - Elueres stramt bundet lipopeptides, tilsættes 15 μl af frisklavede 10 mg/mL α-cyano-4-hydroxycinnamic syre (CHCA) matrix opløst i chloroform-methanol (2:1, v/v) og inkuberes i 10 min. ved stuetemperatur med intermitterende vortexing.
- Skiftevis, tilføje 15 μl chloroform-methanol elueres lipopeptides og bland med matrix på et senere tidspunkt. Andre matrixer, såsom 2,5-dihydroxybenzoic syre (DHB), bør testes som alternativer til CHCA, hvis utilfredsstillende resultater for en bestemt lipopeptid sammensætning.
Forsigtighed: Både chloroform og methanol er skadelige indånding. Behandles med forsigtighed og brug i den kemiske stinkskab. Undgå kontakt med huden. - Valgfri: At fremme natrium addukt dannelse, supplere løsningen af CHCA i chloroform-methanol med vandig natriumbicarbonat (NaHCO3) til en endelig koncentration på 1 mM.
- Skiftevis, tilføje 15 μl chloroform-methanol elueres lipopeptides og bland med matrix på et senere tidspunkt. Andre matrixer, såsom 2,5-dihydroxybenzoic syre (DHB), bør testes som alternativer til CHCA, hvis utilfredsstillende resultater for en bestemt lipopeptid sammensætning.
- Spin prøven kort. Med en pipette, omhyggeligt væsken overføres til en ny lav protein bindende microcentrifuge tube. Denne løsning indeholder hovedparten af den N-terminale lipopeptides.
Bemærk: Nitrocellulose kan helt eller delvis opløses i opløsningen chloroform-methanol. Dette vil ikke negativt påvirke MS resultater, og kan bruges som en alternativ metode til at øge lipopeptid tilbagevenden. PVDF membran vil ikke opløses på samme måde. - Deponere 1 μl af den eluted lipopeptides med CHCA på et poleret stål MALDI mål.
Bemærk: Chloroform-methanol vil fordampe hurtigt, efterlod krystalliseret CHCA og lipopeptides. En valgfri anden 1 μL alikvot kan deponeres på det samme sted at øge prøve koncentration. Chloroform-methanol kan sprede sig betydeligt efter deposition på målet og som sådan pleje bør tages til at undgå at prøve blande på målet. Det anbefales at deponere og skyde flere steder af hver prøve. - Straks videre til massespektrometri. Scanning af alle områder på stedet for lipopeptid signal, især hvis stedet indeholder to lag af prøven, som det andet lag kan skubbe lipopeptides at spot's ydre rand.
Bemærk: Anbefalede start laser intensitet er 25%, selvom det kan være nødvendigt at øge intensiteten for at erhverve signal og opsummere flere spektre (20 eller flere scanninger) for at opnå tilstrækkelig signal / støj-forhold. Her, spectra var erhvervet på en MALDI-TOF-TOF instrument (Se Tabel af materialer) med en fabrik-konfigureret instrument metode til reflektor positive-ion påvisning over rækken 700-3500 m/z . Instrumentet blev kalibreret med en bovint serumalbumin (BSA) tryptic peptid blanding.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En skematisk af protokollen er fastsat i figur 1. Lipoprotein-beriget brøkdel udvundet af Enterococcus faecalis ATCC 19433 af TX-114 er vist i figur 2. Til sammenligning, er den banding mønster af de bundfaldne proteinfraktion også vist. Proteiner fra denne fraktion blev bekræftet af MALDI-MS til at være meget rigelige, kontaminerende proteiner end lipoproteiner (tabel 1). Massespektre i figur 3 viser tryptic peptid ion profilen af E. faecalis lipoprotein PnrA, der opstår med efterfølgende vasker af nitrocellulose-bundet PnrA med opløsningsmidler for at øge polaritet (peak tildelinger opført i Tabel 2). Figur 4 viser N-terminal strukturel karakterisering af PnrA som bestemt af MALDI-TOF MS/MS, afslørende diagnostiske N- acylated dehydroalanyl toppe i overensstemmelse med formen lyso-lipoprotein. Figur 5 illustrerer effekten af natrium addukt dannelse på fragmentering, med sodiated overordnede ion fortrinsvis fragmentering til fordel for N- acylated dehydroalanyl ion.
Figur 1: skematisk protokollens. Lipoproteiner kan er beriget med TX-114 fase partitionering og bruges direkte, mest almindeligt i TLR assays, eller yderligere renset af SDS-PAGE for Strukturbestemmelse. Lipoproteiner overføres til nitrocellulose, fordøjes med trypsin, vasket trinvis, og den resulterende lipopeptides elueret med chloroform-methanol til strukturel analyse af MALDI-MS. Trypsin og nitrocellulose vask løsninger kan gemmes til protein identifikation og MS analyse. m /: med; TFA: trifluoreddikesyre; ACN: acetonitril; CHCA: α-cyano-4-hydroxycinnamic syre; vælge: valgfri; MALDI: matrix assisted laser desorption ionisering; MS: massespektrometri. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Profil af TX-114 beriget proteiner fra E. faecalis. En 10% Tris-glycin SDS-PAGE gel farves med Coomassie blå (A) og den tilsvarende nitrocellulose membran farvet med Ponceau Sørensen (B) afslører en anden banding mønster mellem de udfældede proteinfraktion ("PPT") og den renset lipoproteiner ("LP"). De angivne Coomassie farvede bånd var skåret ud og identificeret som ikke-lipoproteiner ved MALDI-MS af tryptic peptider (Se tabel 1). PnrA blev identificeret og analyseret af protokollen beskrevet heri. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Ion profil og overflod ændringer med polariteten af nitrocellulose vaske løsninger. (A) trypsin brøkdel viser flere interne peptid fragmenter svarende til E. faecalis lipoprotein PnrA angivet i figur 2. 10% (B) og 20% (C) acetonitril vaske fraktioner Vis ændringer i signal intensitet og et fald i det samlede antal enkelte toppe. (D) den endelige eluering fraktion er stærkt beriget med den N-terminale lipopeptid på m /z 997, angivet med en stjerne (*). Intensiteten af hver spectra er normaliseret til (A) til sammenligning af signal intensitet. Toppe masserne og tildelte sekvenser er angivet i tabel 2. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Band | Protein-ID | Tiltrædelse nr. | EST. molekylvægt | Peptid Count | |
| 1 | strækningsfaktor Tu | GB | EOL37301.1 | | 43,387 | 15 | |
| 2 | NADH peroxidase | GB | EOL34572.1 | | 49,520 | 9 | |
| 3 | pyruvat dehydrogenase E1component, alpha subunit | GB | EOL34709.1 | | 41,358 | 12 | |
| 4 | pyruvat dehydrogenase E1 komponent, subunit beta | GB | EOL34710.1 | | 35,373 | 19 | |
| 5 | 30s ribosomale protein S2 | GB | EOL33066.1 | | 29,444 | 16 | |
| 6 | 30s ribosomale protein S3 | GB | EOL37312.1 | | 24,355 | 14 | |
Tabel 1: bundfaldne proteiner er ikke-lipoprotein kontaminanter. Proteiner blev identificeret ved tryptic digest og MALDI-MS ved hjælp af standard i gel fordøjelsen protokoller19 og er opført fra top til bund i den samme rækkefølge på Coomassie gel i figur 2. Hver protein blev identificeret med et konfidensinterval (kt) mere end 95%.
| Peak antallet | Teoretisk masse | Protein Position | Lol af ubesvarede Cut websteder | Peptid sekvens | |
| 1 | 631.3409 | 170-176 | 0 | GVADAAK | |
| 2 | 675.4035 | 316-321 | 1 | TKEAVK | |
| 3 | 826.4093 | 163-169 | 0 | FQAGFEK | |
| 4 | 893.4839 | 121-128 | 0 | NVVSATFR | |
| 5 | 943.5359 | 240-247 | 0 | VWVIGVDR | |
| 6 | 1040.5047 | 188-197 | 0 | YAASFADPAK | |
| 7 | 1200.6331 | 273-284 | 0 | GVGTAVQDIANR | |
| 8 | 1316.6997 | 290-301 | 0 | FPGGEHLVYGLK | |
| 9 | 1385.7827 | 83-94 | 0 | FNTIFGIGYLLK | |
| 10 | 1432.743 | 149-162 | 0 | VGFVGGEEGVVIDR | |
| 11 | 1568.7802 | 259-272 | 1 | DGKEDNFTLTSTLK | |
| 12 | 1672.8289 | 240-254 | 1 | VWVIGVDRDQDADGK | |
| 13 | 1707.8184 | 129-145 | 0 | DNEAAYLAGVAAANETK | |
| 14 | 1724.8027 | 35-49 | 0 | SFNQSSWEGLQAWGK | |
| 15 | 1797.9228 | 257-272 | 2 | TKDGKEDNFTLTSTLK | |
| 16 | 1872.9854 | 285-301 | 1 | ALEDKFPGGEHLVYGLK | |
| 17 | 1945.9613 | 230-247 | 1 | DLNESGSGDKVWVIGVDR | |
| 18 | 2240.1345 | 149-169 | 1 | VGFVGGEEGVVIDRFQAGFEK | |
| 19 | 2675.2543 | 230-254 | 2 | DLNESGSGDKVWVIGVDRDQDADGK | |
Tabel 2: observeret masserne og de tilsvarende tryptic peptider. I siliciummangan trypsin fordøjelsen af E. faecalis PnrA (GenBank: EOL37280.1) blev udført ved hjælp af PeptideMass20,21, giver mulighed for op til to savnede skære websteder. De teoretiske masserne af toppene observeret på spektre i figur 3 vises sammen med de tilsvarende peptid sekvenser.
Figur 4: MALDI-TOF MS af E. faecalis lipoprotein PnrA. (A) overordnede MS spektrum af den m /z 997 regionen svarende til den N-terminale lipopeptid af E. faecalis PnrA. (B) MS/MS af lipopeptid højeste afslører, at det er formen lyso med den diagnostiske N- acylated dehydroalanyl peptid fragment ion peak angivet med en stjerne (*). Belyst strukturen er vist (C). Dette tal er blevet ændret fra en tidligere publikation9. R.I.: relative intensitet venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: natrium addukt dannelse fremmer overordnede ion fragmentering mod dehydroalanyl lipopeptid ioner. (A) MALDI-TOF spektre af E. coli lipoprotein Lpp N-terminal peptid uden (turkis spor) og med (blå spor) tilsætning af natriumhydrogencarbonat. Tilsætning af natriumbikarbonat til de endelige elueret brøkdel medfører en 22 Da forøget fra den beregnede massen af den overordnede lipopeptid. Sammenlignet med MS/MS-spektrum af protonated ion (B), MS/MS-spektrum af den tilsvarende sodiated ion (C) viser betydelig præferentielle fragmentering mod N-acyl-dehydroalanyl ion gennem neutral eliminering af diacylthioglyceryl gruppe, angivet med en stjerne (*). Strukturen i den overordnede triacylated Lpp N-terminale tryptic peptid (D) og N-acyl-dehydroalanyl peptid fragment ion (E) er afbildet. Dette tal er blevet ændret fra en tidligere publikation9. R.I.: relative intensitet venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen heri beskriver to adskilte faser af lipoprotein karakterisering: berigelse af TX-114 fase opdeling og strukturelle fastsættelse af MALDI-TOF MS. Under TX-114 udvinding fjerner yderligere centrifugering kontaminerende proteiner, der udfældes under denne proces, efterfulgt af acetone nedbør til at give højt beriget lipoproteiner. Ved at begrænse omfanget af hvert præparat til 15 mL værd af celler, kan flere prøver let behandles parallelt, og hvis det ønskes, samles i slutningen af protokollen.
For strukturel analyse af MS letter overførslen af lipoproteiner til nitrocellulose trypsin fordøjelse, vask og efterfølgende eluering fra membranen. I vores hænder, denne tilgang har vist sig for at være at foretrække at vaskemiddel-medieret udvinding fra traditionelle Polyacrylamiden stik, som lipoproteiner er forbundet med overfladen af nitrocellulose membran og ikke indlejret i polyacrylamid. Lipoprotein association med nitrocellulose overfladen forhindrer også stort set det almindelige problem med uspecifikke adsorption til container overflader af hydrofobe peptider. Trinvis eluering af nitrocellulose stykker fjerner mere hydrofile, indre tryptic peptider, som kan analyseres ved MALDI-TOF MS til at opnå høj genkendelsessikkerhed protein identifikation tildelinger, mens det endelige eluering skridt reproducerbar udbytter koncentreret lipopeptides i en lille mængde, der er stort set fri for interfererende salte og ion undertrykke forurenende stoffer.
Vellykket MS analyse af en lipoprotein er omfattet af sin overflod, og som sådan er de mørkeste bands fra Ponceau S-farvede membranen er tilbøjelige til at give de bedste resultater. Det er imidlertid muligt, at flere lipoprotein kan migrere i en enkelt band under side adskillelse, komplicerer de resulterende spektre. Derfor er det stærkt anbefales først identificere proteinet peptid masseprocent fingeraftryk (PMF), der kan opnås ved at indsamle MS spectra på den samlede trypsin fraktion eller enten acetonitril vask brøkdel og indrykke de resulterende toppe i en software som maskot22. Når protein sekvens er blevet fastlagt, aids beregning af massen af den tryptic N-terminale lipopeptid betydeligt i at vælge hvilke ion til fragment af MS/MS.
Ekstra prøve heterogenitet kan skyldes varierende acyl kæde længder på lipoproteiner i en befolkning og deres N-terminale ændringer, både afhængig af kilde bakterier6. Mens variation i kædelængde gør for karakteristisk højdepunkt klynger på overordnede spektre, karakteriseret ved 14 Da intervaller svarende til methylen grupper (- CH2-), kan det opdele den samlede lipopeptid signal og mindske følsomheden. Det er også sandsynligt, at de forskellige lipoprotein former påvirke berigelse og fragmentering, selvom vi har med held identificeret triacylated, diacylated og lyso-form lipoproteiner ved hjælp af den beskrevne protokol. Ligeledes, de varierende peptid fraspaltning af lipoproteiner tilføje et andet niveau af kompleksitet til analyser, uanset deres N-terminale struktur, som et meget hydrofile amino syre sammensætning kan forhindre lipopeptid opdeling i økologiske chloroform fase ved hjælp af andre udvinding metoder8. Overførsel af lipoprotein til nitrocellulose vil bistå med at studere sådanne lipopeptides, som alle eluering fraktioner kan analyseres på denne metode.
Tegning fra tidligere litteratur involverer triacylglycerides og fosfolipider23, forsætlig natrium addukt dannelse kan bruges til at fremme mere informativ fragmentering via dannelsen af den (N-acyl)-dehydroalanyl peptid ion. Disse karakteristiske ioner er nøglen til at tildele struktur, da acylation af N-terminus er isoleret fra acyl udskiftninger på glyceryl gruppe. Natrium addukt dannelse giver en bekvem alternativ mulighed til svovl oxydation med hydrogenperoxid, som har vist sig at også fremme N-acyl-dehydroalanyl peptid fragmentering6,8. Selvom natrium adukter kan vise en samlet undertrykkelse af overordnede ion signal, de specifikke stigning i fragmentering mod dehydroalanyl ioner kompenserer for formindsket overordnede ion intensitet. Det kan være værd at undersøge andre matricer og fragmentering af yderligere adukter for at fremkalde de mest informative spektre.
Denne protokol forbedrer på den traditionelle TX-114 fase partitionering metode for lipoprotein berigelse, mens overførslen af side-adskilt lipoproteiner til nitrocellulose membran letter trypsin fordøjelse og eluering af lipopeptides. MALDI-TOF MS analyse på de samlede tryptic eller vask fraktioner giver mulighed for protein identifikation i tandem med N-terminalen Strukturbestemmelse af MS/MS i et enkelt eksperiment. Valgfri natrium addukt dannelse højdepunkter forskelle på lipopeptid N-terminus ved at fremme mere informativ ion fragmentering. Evnen til at rutinemæssigt rense lipoproteiner og karakterisere deres N-termini vil give omfattende undersøgelser på hvordan romanen lipoprotein former er lavet, deres fysiologiske rolle inden for den bakterielle celle kuvert, og hvordan de er opdaget af de pattedyr immun system.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Forskning i Meredith lab blev støttet af startup midler fra Eberly College of Science (Pennsylvania State University). Vi takker Dr. Tatiana Laremore for teknisk rådgivning og adgang til udstyr på Penn State Proteomics og masse massespektrometri Core facilitet, Universitetsparken, PA, hvor massespektrometrisk analyser blev udført.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| 0.01 mm Zirconia/silica beads | BioSpec Products | 110791012 | |
| Acetic acid | EMD | AX0073-9 | |
| Acetone | EMD | AX0116-6 | |
| Acetonitrile | EMD | AX0142-6 | |
| Ammonium bicarbonate | Fluka Analytical | 09830 | |
| BioTrace NT Nitrocellulose | PALL Life Sciences | 66485 | |
| Bovine serum albumin (BSA) digest standard | Protea | PS-204-1 | |
| Chloroform | Acros Organics | 423550025 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | BP118 | |
| HPLC Grade water | EMD | WX0008-1 | |
| Lysozyme | Fisher Scientific | BP535-1 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| Phenylmethyl sulfonyl fluoride (PMSF) | Amresco | 0754 | |
| Pierce trypsin protease | Thermo Scientific | 90057 | |
| Ponceau S | Acros Organics | 161470100 | |
| Protein LoBind Tube 0.5mL | Eppendorf | 022431064 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 792519 | |
| Sodium chloride | Macron Fine Chemicals | 7581-06 | |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigma-Aldrich | 299537 | |
| Tris-hydrochloride (HCl) | Fisher Scientific | BP152 | |
| Triton X-114 | Sigma-Aldrich | 93422 | |
| Tryptic soy broth (TSB) | BD | 211822 | |
| α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (MS Grade) | Sigma-Aldrich | C8982 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| MagNALyser | Roche | ||
| Trans-Blot Turbo Transfer System | Bio-Rad | ||
| MALDI-TOF target | Bruker Daltonics | ||
| Ultraflextreme MALDI-TOF-TOF | Bruker Daltonics | Equipped with a 355 nm frequency-tripled Nd:YAG smartbeam-II laser |
References
- Babu, M. M., et al. A database of bacterial lipoproteins (DOLOP) with functional assignments to predicted lipoproteins. J Bacteriol. 188 (8), 2761-2773 (2006).
- Narita, S., Tokuda, H. Bacterial lipoproteins; biogenesis, sorting and quality control. Biochim Biophys Acta. 1862 (11), 1414-1423 (2016).
- Kovacs-Simon, A., Titball, R. W., Michell, S. L.
- Nguyen, M. T., Götz, F. Lipoproteins of Gram-Positive Bacteria: Key Players in the Immune Response and Virulence. Microbiol Mol Biol Rev. 80 (3), 891-903 (2016).
- Nakayama, H., Kurokawa, K., Lee, B. L. Lipoproteins in bacteria: structures and biosynthetic pathways. FEBS J. 279 (23), 4247-4268 (2012).
- Kurokawa, K., et al. Novel bacterial lipoprotein structures conserved in low-GC content Gram-positive bacteria are recognized by Toll-like receptor 2. J Biol Chem. 287 (16), 13170-13181 (2012).
- Kurokawa, K., et al. The Triacylated ATP Binding Cluster Transporter Substrate-binding Lipoprotein of Staphylococcus aureus Functions as a Native Ligand for Toll-like Receptor 2. J Biol Chem. 284 (13), 8406-8411 (2009).
- Asanuma, M., et al. Structural evidence of α-aminoacylated lipoproteins of Staphylococcus aureus. FEBS J. 278 (5), 716-728 (2011).
- Armbruster, K. M., Meredith, T. C. Identification of the Lyso-Form N-Acyl Intramolecular Transferase in Low-GC Firmicutes. J Bacteriol. 199 (11), e00099-e00017 (2017).
- Serebryakova, M. V., Demina, I. A., Galyamina, M. A., Kondratov, I. G., Ladygina, V. G., Govorun, V. M. The acylation state of surface lipoproteins of Mollicute Acholeplasma laidlawii. J Biol Chem. 286 (26), 22769-22776 (2011).
- Feng, S. H., Lo, S. C. Induced mouse spleen B-cell proliferation and secretion of immunoglobulin by lipid-associated membrane proteins of Mycoplasma fermentans incognitus and Mycoplasma penetrans. Infect Immun. 62 (9), 3916-3921 (1994).
- Feng, S. H., Lo, S. C. Lipid extract of Mycoplasma penetrans proteinase K-digested lipid-associated membrane proteins rapidly activates NF-kappaB and activator protein 1. Infect Immun. 67 (6), 2951-2956 (1999).
- Luque-Garcia, J. L., Zhou, G., Spellman, D. S., Sun, T. -T., Neubert, T. A. Analysis of electroblotted proteins by mass spectrometry: protein identification after Western blotting. Mol Cell Proteomics. 7 (2), 308-314 (2008).
- Luque-Garcia, J. L., Zhou, G., Sun, T. -T., Neubert, T. A. Use of Nitrocellulose Membranes for Protein Characterization by Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry. Anal Chem. 78 (14), 5102-5108 (2006).
- Kurokawa, K., et al. Environment-mediated accumulation of diacyl lipoproteins over their triacyl counterparts in Staphylococcus aureus. J Bacteriol. 194 (13), 3299-3306 (2012).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Schӓgger, H. Tricine-SDS-PAGE. Nat Protoc. 1, 16-22 (2006).
- Gravel, P. Protein Blotting by the Semidry Method. The Protein Protocols Handbook. , Spring Protocols. 321-334 (2002).
- Webster, J., Oxley, D. Protein Identification by Peptide Mass Fingerprinting using MALDI-TOF Mass Spectrometry. The Protein Protocols Handbook. , Springer Protocols. 1117-1129 (2009).
- Wilkins, M. R., et al. Detailed peptide characterization using PEPTIDEMASS - a World-Wide-Web-accessible tool. Electrophoresis. 18 (3-4), 403-408 (1997).
- Gasteiger, E., et al. Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server. The Proteomics Protocols Handbook. , Springer Protocols. 571-607 (2005).
- Perkins, D. N., Pappin, D. J. C., Creasy, D. M., Cottrell, J. S. Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data. Electrophoresis. 20 (18), 3551-3567 (1999).
- Al-Saad, K. A., Zabrouskov, V., Siems, W. F., Knowles, N. R., Hannan, R. M., Hill, H. H. Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry of lipids: ionization and prompt fragmentation patterns. Rapid Commun Mass Spectrom. 17 (1), 87-96 (2003).
