Summary
Anrikningen av bakteriell lipoproteiner med hjälp av en icke-jonisk tensid fas partitionering metod beskrivs för direkt användning i TLR analyser eller andra program. Ytterligare åtgärder är detaljerade för att förbereda N-terminala tryptic lipopeptides för strukturell karaktärisering av masspektrometri.
Abstract
Lipoproteiner är viktiga beståndsdelar av bakteriell cell kuvertet och potent aktivatorer av däggdjur medfödda immunsvar. Trots sin betydelse för både cellfysiologi och immunologi återstår mycket upptäckas om romanen lipoprotein formulär, hur de syntetiseras och effekten av olika former på värd immunitet. För att möjliggöra noggranna studier på lipoproteiner, det här protokollet beskriver en metod för bakteriell lipoprotein anrikning och beredning av N-terminala tryptic lipopeptides för strukturella bestämning av matrix-assisted laser desorption jonisering-tiden för flygningen masspektrometri (MALDI-TOF MS). Expanderande på en etablerad Triton X-114 fas partitionering metod för lipoprotein utvinning och berikning från bakteriell cellmembranet, protokollet innehåller ytterligare steg för att avlägsna icke-lipoprotein föroreningar, öka lipoprotein avkastning och renhet. Eftersom lipoproteiner används ofta i Toll-liknande receptorer (TLR) analyser, är det viktigt att först karakterisera den N-terminala strukturen av MALDI-TOF MS. häri, presenteras en metod för att isolera koncentrerad hydrofoba peptider berikad i N-terminal lipopeptides passar direkt analys av MALDI-TOF MS/MS. lipoproteiner som skilts av Sodium Dodecyl Sulfate Poly-akrylamid gelelektrofores (SDS-PAGE) överförs till en nitrocellulosa membran, rötas i situ med Trypsin, tvättas sekventiellt för att ta bort polar tryptic peptider och slutligen elueras med kloroform-metanol. När tillsammans med MS av de mer polar trypsinized peptiderna från tvätta lösningar, ger metoden möjlighet att både identifiera Lipoproteinen och karakterisera dess N-terminalen i ett enda experiment. Avsiktlig natrium addukt bildandet kan också användas som ett verktyg för att främja mer strukturellt informativ fragmentering spectra. Slutändan, anrikning av lipoproteiner och bestämning av N-terminala strukturerna kommer att tillåta mer omfattande studier på denna allestädes närvarande klass av bakteriella proteiner.
Introduction
Bakteriella lipoproteiner kännetecknas av ett bevarat N-terminala lipid-modifierade cystein som förankrar globulära protein domänen till cellmembran ytan. De fördelas universellt i bakterier, som utgör 2-5% av alla cellulära gener inom en typisk genomet1. Lipoproteiner spela avgörande roller i en mängd olika cellulära processer, inklusive näringsupptag, signaltransduktion, montering av proteinkomplex, och att upprätthålla cell kuvertet strukturell integritet2. I patogena bakterier tjäna lipoproteiner som virulens faktorer3,4. Under en infektion uppviglar erkännande av N-terminala lipopeptides av Toll-liknande receptorer (TLR) 2 ett medfödda immunsvar ta bort invaderande patogener. Beroende på den N-terminala acylation staten, är lipoproteiner allmänt erkända av alternativa TLR2 heterodimeriskt komplex. TLR2-TLR1 erkänner N-acylated lipopeptides, medan TLR2-TLR6 binder gratis lipopeptidsubstans α-amino termini. Bindning, konvergerar signalvägar som för att framkalla utsöndring av proinflammatoriska cytokiner3,4.
Tidigare trodde man att lipoproteiner från grampositiva bakterier var diacylated och de från gramnegativa bakterier var triacylated, skiljer sig i frånvaron eller närvaron av en fettsyra Amid-länkade på de bevarade N-terminala cysteinrest. Detta antagande stöds av bristen på sekvens orthologs i grampositiva genom att Lnt, den gramnegativa N-acyl-transferas som bildar triacylated lipoproteiner5. Men visat senare studier lipoprotein triacylation i grampositiva Firmicutes att avsaknaden lnt, samt tre nya N-terminala lipoprotein strukturer, kallas den peptidyl, lyso och N -acetyl former6,7 ,8. Dessa fynd ställa frågor om möjligt ännu-till-vara-upptäckte lipoprotein bildar, tillsammans med grundläggande frågor om hur dessa nya lipoproteiner görs och vilka fysiologiska ändamål eller fördel olika former sprida. De visar dessutom tydligt genomik nuvarande oförmåga att förutsäga lipoprotein struktur. Ja, vi har nyligen identifierat en ny klass av lipoprotein N-acyl transferaser, kallas Lit, från Enterococcus faecalis och Bacillus cereus som gör lyso-form lipoproteiner9. Detta tyder på att experimentellt verifierar lipoprotein struktur, som kan vara utmanande på grund av sin extremt hydrofoba natur och begränsad metoder tillgängliga att karakterisera deras molekylära struktur.
För att underlätta studier av lipoprotein induktion av den värd immunsvar, samt N-terminala strukturella beslutsamhet, har vi anpassat flera tidigare beskrivna protokoll för att rena bakteriell lipoproteiner och förbereda den N-terminalen tryptic lipopeptides för analys av MALDI-TOF MS6,10,11,12. Lipoproteiner är berikad med en etablerad Triton X-114 (hädanefter kallad surfaktant eller TX-114) fas partitionering metod, med optimering för att ta bort kontaminerande icke-lipoproteiner och öka lipoprotein avkastningen. Dessa lipoproteiner är lämpliga för direkt användning i TLR analyser eller för ytterligare rening av SDS-PAGE. För MALDI-TOF MS, överföring av Lipoproteinerna till nitrocellulosa membranet ger en byggnadsställning för effektiv i situ trypsin matsmältningen, tvätt och efterföljande eluering från membran yta, vilket resulterar i mycket renad N-terminala lipopeptides. Nitrocellulosa har visat sig underlätta provhantering och förbättra sekvens täckning för starkt hydrofoba peptider från integrerad membran proteiner13,14, liksom lipoproteiner9,10 . Metoden har den ytterligare fördelen att installera peptider baserat på polaritet, så att mellanliggande tvätta lösningar kan analyseras för högt förtroende protein identifiering samtidigt med N-terminala strukturella bestämning i en enda experiment . Detta protokoll unikt funktioner avsiktliga natrium addukt bildandet att främja överordnade ion fragmentering mot dehydroalanyl joner under MS/MS, medhjälp i strukturella tilldelningen av N- acylation staten. N-terminalen är både varierande och mest viktiga funktionen relaterade till TLR erkännande av lipoproteiner. Sammantaget har detta protokoll tillåtna intensiv och reproducerbara undersökningar på lipoproteiner, med de enskilda stegen i rening och strukturella bestämning av MALDI-TOF MS anpassas beroende på det övergripande målet för experimentet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. cell tillväxt och Lysis
- Odla bakterier i 15 mL tryptic soy buljong (TSB) eller liknande rika medier till sena exponentiella fasen (OD600 1,0-1,5). Skörda celler genom centrifugering, tvätta en gång med Tris-buffrad koksaltlösning/EDTA (TBSE) och fortsätta med protokoll eller frysa tills användning.
Obs: TBSE: 20 mM Tris-hydroklorid (HCl), pH 8,0, 130 mM natriumklorid (NaCl), och 5 mM etylendiamintetraättiksyrans dinatriumsalt (EDTA)). Lipoprotein uttryck och modifiering kan påverkas av tillväxt villkorar (e.g. surhetsgrad, salthalt, tillväxt medier) och tillväxt fas15. Celltillväxt kan skalas som önskat, men 15 mL av celler rekommenderas för en enda beredning av lipoproteiner som överflödigt biomassa kan minska lipoprotein avkastning. En 15 mL förberedelse generellt ger tillräckligt prov för optimal lastning av ~ 2-4 körfält på en standard SDS-PAGE mini gel. - Att resuspendera cellerna i 800 μL TBSE med 1 mM phenylmethyl sulfonyl fluor (PMSF) och 0,5 mg/mL lysozym. Överför lösningen till en 2.0 mL gängade mikrocentrifug rör med skruvlock och O-ring och Inkubera under 20 minuter vid 37 ° C.
Obs: Vissa arter är inte mottagliga för lys av lysozym. Ett lämpligt lytisk enzym bör ersättas med stöd i Lys. - Tillsätt ~ 800 μL 0,1 mm zirconia/kvarts pärlor till röret och störa celler genom skakning med maximal hastighet (7000 rpm) på en Homogenisatorer för 5 cykler av 30 s varje, med 2 min vila på isen mellan varje cykel.
- Centrifugera provet vid 3000 x g i 5 minuter vid 4 ° C (till pellet pärlor och obruten celler). Överför supernatanten till ett nytt 2.0 mL mikrocentrifug rör och hålla på is.
- Tillsätt 200 μl TBSE till återstående pelleten och återgå till homogenisatorn för en extra cykel. Centrifugera (se ovan) och kombinera supernatanten med föregående supernatanten (bör 800-1000 μL total volym).
2. berikning av lipoproteiner av TX-114 fas partitionering
- Komplettera supernatanten med TX-114 ytaktivt ämne till en slutlig koncentration på 2% (vol/vol) genom att lägga till en lika stor volym 4% (vol/vol) tensiden i iskall TBSE och inkubera på is för 1 h, blanda genom inversion varje ~ 15 min.
Obs: När kylda, av supernatanten och tensiden kommer vara blandbar. - Överföra röret till 37 ° C vattenbad och inkubera i 10 min att inducera fasseparation. Centrifugera provet vid 10 000 x g under 10 minuter vid rumstemperatur att upprätthålla bi-phasic separation.
- Försiktigt Pipettera off övre vattenfasen och kassera. Lägg till iskall TBSE till lägre tensid fasen att fylla röret till sin ursprungliga volym och Invertera om du vill blanda. Inkubera på is i 10 min.
- Överföra röret till 37 ° C vattenbad och inkubera i 10 min att inducera fasseparation, sedan Centrifugera 10 000 x g under 10 minuter vid rumstemperatur.
- Upprepa steg 2,3-2,4 gång för sammanlagt 3 separationer. Ta bort övre vattenfasen och kassera.
- Ta bort pellet av utfällda proteiner som bildas under loppet av extraktioner (visas längst ned på röret), genom att lägga till 1 volymdel iskall TBSE fasen tensid. Centrifugera vid 4 ° C vid 16 000 x g i 2 min till pellet olösligt protein.
Obs: Urvalet bör förbli en enfas. Om fasseparering inträffar, åter chill prov och centrifugera igen. Pelleten består i allmänhet av icke-lipoprotein föroreningar, men kan bibehållas för vidare analys. - Omedelbart över supernatanten till ett färskt 2.0 mL mikrocentrifug rör innehållande 1250 μl av 100% aceton. Pipettera upp och ner noggrant tvätta provet från spetsen eftersom det blir trögflytande. Blanda genom inversion och inkubera över natten vid 20 ° C till fällningen protein.
- Centrifugera provet vid 16 000 x g i 20 min i rumstemperatur till pellet lipoproteiner med hänsyn till inriktningen av röret. Lipoproteiner bildar en tunn, vit film längs ytterväggen av röret.
- Tvätta pelleten två gånger med 100% aceton. Dekantera aceton och låt provet till luft torka.
- Tillsätt 20-40 μl 10 mm Tris-HCl, pH 8,0 eller en standard Laemmli SDS-PAGE prov buffert16 och grundligt Omsuspendera genom pipettering upp och ner mot väggen med utfällda Lipoproteinerna. Skrapa på sidan av röret med pipettspetsen rubba lipoproteiner.
Obs: Lipoproteiner löses inte i Tris buffert, men hellre bilda en suspension.- Lagra lipoproteiner vid-20 ° C fram till användning.
3. SDS-PAGE, Electroblotting och färgning med Ponceau S
- Separat lipoproteiner av SDS-PAGE med standardmetoder16.
Observera: Lämplig gel akrylamid procentsatsen varierar beroende på dess avsedda användning och storlek av lipoproteiner. Här, skildes E. faecalis lipoproteiner över 10% Tris-glycin gel, medan en 16,5% Tris-tricine gel användes för den mindre E. coli Lipoproteinen Lpp17. - Överföra Lipoproteinerna till nitrocellulosa överföring membran med en standard electroblotting.
Obs: En halvtorr överföring använder Bjerrum Schafer-Nielsen buffert plus 0,1% SDS utfördes på 25 V, 1.3 mA för 15 min18. Växelvis, polyvinylidene kryptondifluorid (PVDF) membran kan användas, dock som det är mer hydrofoba än nitrocellulosa, det kan minska effektiv eluering av hydrofoba lipopeptides från membranet på senare steg. - Överföra nitrocellulosa membranet till en behållare och täck med Ponceau S lösning (0,2% (w/v) Ponceau S i 5% ättiksyra). Rock försiktigt i 5 min eller tills röd-rosa band är synliga.
- Häll av Ponceau S lösning och skölj noggrant nitrocellulosa membranet med dH2O ta bort överflödigt bets.
Obs: Nykockin-färgade band kommer att Avfärga snabbt. Om band försvinner, upprepa färgning process. - Med en ren rakblad, punktskatt den önskat band och överföring till en mikrocentrifug rör. Tvätta tre gånger med 1 mL av dH2O till helt Avfärga bandet.
Obs: Protokollet kan pausas här. Lagra avsnittet exciderad täckt med vatten vid-20 ° C fram till användning. - Flytta avsnittet till en ren yta och med en ren rakblad, tärna nitrocellulosa remsan i små bitar ca 1 mm x 1 mm. samla bitar till en 0,5 mL låg protein bindande mikrocentrifug rör.
- Tvätta delarna två gånger med 0,5 mL av nylagade 50 mM ammoniumbikarbonat (NH4HCO3), pH 7,8 i högpresterande vätskekromatografi (HPLC) vatten.
4. tryptic matsmältningen, lipopeptidsubstans utvinning från nitrocellulosa membran, nedfall på MALDI mål och datainsamling
- Återsuspendera nitrocellulosa bitar i 20 μL av en 20 μg/mL lösning av trypsin i 50 mM NH4HCO3, pH 7,8 i vatten av HPLC-kvalitet. Vortex att blanda, snurra sedan kort för att säkerställa att alla bitar täcks helt av trypsin lösningen. Täcka tube locket med paraffin filma för att förhindra avdunstning och inkubera digest över natten vid 37 ° C.
- Spin provet vid 16 000 x g för 30 s och ta bort vätskan genom pipettering.
Anmärkning: Detta tar bort trypsinized hydrofil peptider som kan undersökas senare av MALDI-TOF MS för protein identifiering. - Tillsätt 50 μl 0,5% trifluorättiksyra (TFA) i vatten av HPLC-kvalitet. Vortex att blanda, snurra sedan provet kort för att säkerställa alla bitarna täcks av lösningen. Inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur. Ta bort vätskan genom pipettering.
Varning: Transfettsyror är skadliga vid inandning. Hanteras med försiktighet och Använd i den kemiska spiskåpa. Undvik kontakt med huden. - Upprepa steg 4,3 med 50 μL 10% acetonitril i vatten av HPLC-kvalitet.
Varning: Acetonitril är skadligt vid inandning. Hanteras med försiktighet och Använd i den kemiska spiskåpa. Undvik kontakt med huden. - Upprepa steg 4,3 med 50 μl 20% acetonitril i vatten av HPLC-kvalitet.
Anmärkning: Detta tar bort alla måttligt hydrofoba peptider som löst bundna till nitrocellulosa. - Eluera de tätt-bundna lipopeptides, lägga till 15 μL av nygjorda 10 mg/mL α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) matrix löses i kloroform-metanol (2:1, v/v) och inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur med intermittent vortexa.
- Växelvis, tillsätt 15 μL kloroform-metanol att eluera lipopeptides och blanda med matrix vid ett senare tillfälle. Andra matriser, till exempel 2,5-dihydroxybenzoic syra (DHB), ska provas som alternativ till CHCA om otillfredsställande resultat för en viss lipopeptidsubstans komposition.
Varning: Både kloroform och metanol är skadligt vid inandning. Hanteras med försiktighet och Använd i den kemiska spiskåpa. Undvik kontakt med huden. - Tillval: Att främja natrium addukt bildandet, komplettera lösningen av CHCA i kloroform-metanol med aqueous natriumbikarbonat (NaHCO3) till en slutlig koncentration på 1 mM.
- Växelvis, tillsätt 15 μL kloroform-metanol att eluera lipopeptides och blanda med matrix vid ett senare tillfälle. Andra matriser, till exempel 2,5-dihydroxybenzoic syra (DHB), ska provas som alternativ till CHCA om otillfredsställande resultat för en viss lipopeptidsubstans komposition.
- Snurra provet kort. Tag med en pipett noggrant Överför vätskan till ett nytt låg protein bindande mikrocentrifug rör. Denna lösning innehåller huvuddelen av den N-terminala lipopeptides.
Obs: Nitrocellulosa kan helt eller delvis lös i kloroform-metanol lösningen. Detta påverkar inte negativt MS resultat och kan användas som en alternativ metod för att öka lipopeptidsubstans avkastning. PVDF membran löses inte på samma sätt. - Insättning 1 μL av de eluerade lipopeptides med CHCA på ett polerat stål MALDI mål.
Obs: Kloroform-metanol avdunstar snabbt, lämnar bakom kristalliserad CHCA och lipopeptides. Ett valfritt andra 1 μL alikvotens kan deponeras på samma plats för att öka provets koncentration. Kloroform-metanol kan spridas betydligt efter nedfallet på målet och som sådan, försiktighet bör iakttas för att undvika prov blandning på målet. Det rekommenderas att sätta in och skjuta flera ställen av varje prov. - Genast fortsätta till masspektrometri. Skanna alla områden av plats för lipopeptidsubstans signal, särskilt om platsen innehåller två lager av provet som det andra lagret kan driva lipopeptides till platss yttre kanten.
Obs: Rekommenderad start laser intensitet är 25%, om det kan vara nödvändigt att öka intensiteten för att förvärva signal och summera flera spektra (20 eller fler skanningar) för att uppnå tillräcklig signal-brus-förhållande. Här, spektra förvärvades ett MALDI-TOF-TOF instrument (se Tabell för material) med en metod som fabriken-konfigurerade instrument för reflektor positiva-Jon upptäckt över 700-3500 m/z intervallet. Instrumentet kalibrerades med en bovint serumalbumin (BSA) tryptic peptid blandning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En schematisk av protokollet ges i figur 1. Det lipoprotein-berikad bråk som utvinns ur Enterococcus faecalis ATCC 19433 av TX-114 visas i figur 2. Som jämförelse visas även banding mönstret av den utfällda proteinfraktion. Proteiner från denna fraktion bekräftades av MALDI-MS till vara mycket rikligt kontaminerande proteiner än lipoproteiner (tabell 1). Masspektra i figur 3 visar tryptic peptid ion profilen av de E. faecalis Lipoproteinen PnrA som uppstår med efterföljande tvättar av nitrocellulosa-bundna PnrA med lösningsmedel av ökande polaritet (peak uppdrag som anges i Tabell 2). Figur 4 visar den N-terminala strukturell karaktärisering av PnrA som bestäms av MALDI-TOF MS/MS, avslöjar diagnostiska N- acylated dehydroalanyl toppar överensstämmer med formuläret lyso-lipoprotein. Figur 5 illustrerar effekten av natrium addukt bildandet på splittring, med sodiated överordnade jonen prioriterat fragmentera till förmån för N- acylated dehydroalanyl ion.
Figur 1: Schematisk protokollet. Lipoproteiner kan berikas av TX-114 fas partitionering och användas direkt, oftast i TLR analyser eller ytterligare renats av SDS-PAGE för strukturella bestämning. Lipoproteiner överförs till nitrocellulosa, smält med trypsin, tvättade stegvis, och den resulterande lipopeptides elueras med kloroform-metanol för strukturanalys av MALDI-MS. Trypsin och nitrocellulosa tvätta lösningarna kan sparas för protein identifiering och MS analys. w /: med; TFA: trifluorättiksyra; ACN: acetonitril; CHCA: α-cyano-4-hydroxycinnamic acid; välja: valfritt. MALDI: matris-assisted laser desorption jonisering; MS: masspektrometri. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Profil av TX-114 berikad proteiner från E. faecalis. En 10% Tris-glycin SDS-PAGE gel fläckade Coomassie blå (A) och motsvarande nitrocellulosa membranet fläckade Ponceau S (B) avslöja en annan randning mönster mellan den utfällda proteinfraktion (”PPT”) och renat lipoproteiner (”LP”). De angivna Coomassie-färgade band var censurerade och identifieras som icke-lipoproteiner av MALDI-MS av tryptic peptider (se tabell 1). PnrA identifierades och analyseras av det protokoll som beskrivs häri. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Ion profil och överflöd förändringar med polariteten av nitrocellulosa tvätta lösningar. (A) den trypsin fraktionen visar flera interna peptidfragment motsvarar den E. faecalis lipoprotein PnrA anges i figur 2. De 10% (B) och 20% (C) acetonitril tvätta fraktioner visar på förändringar i signalintensitet och en minskning av det totala antalet enskilda toppar. (D) den slutliga eluering fraktionen är högt berikad med den N-terminala lipopeptidsubstans på m /z 997, anges av en asterisk (*). Intensiteten i varje spectra är normaliserat till (A) för jämförelse av signalintensitet. Toppar massorna och tilldelade sekvenser listas i tabell 2. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Band | Protein-ID | Anslutning nr. | Est. molekylvikt | Peptid Count | |
| 1 | brottöjning Tu | GB | EOL37301.1 | | 43,387 | 15 | |
| 2 | NADH peroxidas | GB | EOL34572.1 | | 49,520 | 9 | |
| 3 | pyruvat dehydrogenas E1component, alfa-subenhet | GB | EOL34709.1 | | 41,358 | 12 | |
| 4 | pyruvat dehydrogenas E1 komponent, subenhet beta | GB | EOL34710.1 | | 35,373 | 19 | |
| 5 | 30s ribosomala proteinet S2 | GB | EOL33066.1 | | 29,444 | 16 | |
| 6 | 30s ribosomala proteinet S3 | GB | EOL37312.1 | | 24,355 | 14 | |
Tabell 1: utfällda proteiner är icke-lipoprotein föroreningar. Proteiner identifierades av tryptic digest och MALDI-MS med standard i gel matsmältningen protokoll19 och listas från toppen till botten i den ordning som de visas på Coomassie gel i figur 2. Varje protein identifierades med ett konfidensintervall (CI) större än 95%.
| Höjdpunkt nummer | Teoretiska massan | Protein Position | Nej. av missade Cut platser | Peptid sekvens | |
| 1 | 631.3409 | 170-176 | 0 | GVADAAK | |
| 2 | 675.4035 | 316-321 | 1 | TKEAVK | |
| 3 | 826.4093 | 163-169 | 0 | FQAGFEK | |
| 4 | 893.4839 | 121-128 | 0 | NVVSATFR | |
| 5 | 943.5359 | 240-247 | 0 | VWVIGVDR | |
| 6 | 1040.5047 | 188-197 | 0 | YAASFADPAK | |
| 7 | 1200.6331 | 273-284 | 0 | GVGTAVQDIANR | |
| 8 | 1316.6997 | 290-301 | 0 | FPGGEHLVYGLK | |
| 9 | 1385.7827 | 83-94 | 0 | FNTIFGIGYLLK | |
| 10 | 1432.743 | 149-162 | 0 | VGFVGGEEGVVIDR | |
| 11 | 1568.7802 | 259-272 | 1 | DGKEDNFTLTSTLK | |
| 12 | 1672.8289 | 240-254 | 1 | VWVIGVDRDQDADGK | |
| 13 | 1707.8184 | 129-145 | 0 | DNEAAYLAGVAAANETK | |
| 14 | 1724.8027 | 35-49 | 0 | SFNQSSWEGLQAWGK | |
| 15 | 1797.9228 | 257-272 | 2 | TKDGKEDNFTLTSTLK | |
| 16 | 1872.9854 | 285-301 | 1 | ALEDKFPGGEHLVYGLK | |
| 17 | 1945.9613 | 230-247 | 1 | DLNESGSGDKVWVIGVDR | |
| 18 | 2240.1345 | 149-169 | 1 | VGFVGGEEGVVIDRFQAGFEK | |
| 19 | 2675.2543 | 230-254 | 2 | DLNESGSGDKVWVIGVDRDQDADGK | |
Tabell 2: observerade massorna och de motsvarande tryptic peptiderna. I silico trypsin rötning av E. faecalis PnrA (GenBank: EOL37280.1) var utförs med PeptideMass20,21, så att upp till två missade cut platser. Teoretiska massorna av de toppar som observerats på spektra i figur 3 visas, tillsammans med motsvarande peptid sekvenser.
Figur 4: MALDI-TOF MS av E. faecalis lipoprotein PnrA. (A) överordnade MS spektrum av den m /z 997 region som motsvarar den N-terminala lipopeptidsubstans av E. faecalis PnrA. (B) MS/MS lipopeptidsubstans topp avslöjar att det är formuläret lyso, med diagnostiska N- acylated dehydroalanyl peptid fragment ion topp anges av en asterisk (*). Klarlagd strukturen visas (C). Denna siffra har ändrats från en tidigare publikation9. R.I.: relativ intensitet vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 5: natrium addukt bildandet främjar överordnade ion fragmentering mot dehydroalanyl lipopeptidsubstans joner. (A) MALDI-TOF spektra av E. coli lipoprotein Lpp N-terminala peptiden utan (turkos spår) och med (blå spår) tillsats av natriumbikarbonat. Tillsats av natriumbikarbonat till den slutliga eluerade fraktionen resulterar i en 22 Da ökning från den beräkna massan av den överordnade lipopeptidsubstans. Jämfört med MS/MS spectrumen av protonerade jonen (B), MS/MS spectrumen av de motsvarande sodiated ion (C) visar betydande förmånliga fragmentering mot N-acyl-dehydroalanyl ion via neutral eliminering av den diacylthioglyceryl delen, anges av en asterisk (*). Strukturen för den överordnade triacylated Lpp N-terminala tryptic peptiden (D) och N-acyl-dehydroalanyl peptid fragment ion (E) skildras. Denna siffra har ändrats från en tidigare publikation9. R.I.: relativ intensitet vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet häri beskriver två olika faser av lipoprotein karakterisering: anrikning av TX-114 fas partitionering och strukturella bestämning av MALDI-TOF MS. Under TX-114 extraktion avlägsnar ytterligare centrifugering kontaminerande proteiner som fällningen under denna process, följt av aceton utfällning avkastning höganrikat lipoproteiner. Genom att begränsa omfattningen av varje beredning till 15 mL värt av celler, kan flera prover enkelt bearbetas parallellt, och om så önskas, poolade i slutet av protokollet.
För strukturanalys av MS underlättar överföring av Lipoproteinerna till nitrocellulosa trypsin matsmältningen, tvätt och efterföljande eluering från membranet. I våra händer, har denna metod visat sig vara att föredra att tvättmedel-medierad utvinning från traditionella Polyakrylamidgelen pluggar, som Lipoproteinerna är associerade med ytan av nitrocellulosa membranet och inte inbäddad i polyakrylamid. Lipoprotein association med nitrocellulosa ytan förhindrar också till stor del gemensamma problemet med ospecifik adsorption till behållaren ytor av hydrofoba peptider. Stegvis eluering av nitrocellulosa bitar tar bort mer hydrofil, interna tryptic peptider som kan analyseras med MALDI-TOF MS att uppnå höga förtroende protein identifiering uppdrag, medan det slutliga eluering steget reproducibly ger koncentrerad lipopeptides i en liten volym som är i stort sett fri från störande salter och ion undertrycka föroreningar.
Framgångsrika MS analys av ett lipoprotein är föremål för dess överflöd, och som sådan, de mörkaste band från den Ponceau S-färgade hinnan sannolikt kommer att ge bäst resultat. Det är dock möjligt att flera lipoproteiner kan migrera i ett enda band under sidan separation, komplicerande resulterande spektra. Därför, det rekommenderas att först identifiera proteinet av peptid massan fingeravtryck (PMF), vilket kan åstadkommas genom att samla MS spectra på det totala trypsin bråket eller antingen acetonitril tvätta bråkdel och mata de resulterande topparna i en program som maskot22. När sekvensen protein har bestämts, stöd beräkna massan av den tryptic N-terminala lipopeptidsubstans avsevärt i att välja vilka ion att fragmentera av MS/MS.
Ytterligare prov heterogenitet kan bero på varierande acyl kedja längder på lipoproteiner inom en population och N-terminala ändringar, både beroende på källa bakterier6. Medan variationerna i Kedjanslängd gör för distinkt topp kluster på överordnade spectra, kännetecknas av 14 Da steg motsvarar metylen grupper (- CH2-), kan den dela övergripande lipopeptidsubstans signalen och minska känslighet. Det är också troligt att de olika lipoprotein formerna påverkar berikning och fragmentering, även om vi har framgångsrikt identifierat triacylated, diacylated och lyso-form lipoproteiner använda protokollet beskrivs. Likaså de varierande peptid beståndsdelarna av lipoproteiner lägga till en annan nivå av komplexitet i analyser, oavsett deras N-terminala struktur, eftersom en mycket hydrofila aminosyra sammansättning kan förhindra lipopeptidsubstans partitionering i den organiska kloroformfasens använda andra utvinning metoder8. Överföring av lipoproteinen till nitrocellulosa skulle hjälpa i att studera sådana lipopeptides, som alla eluering fraktioner kan analyseras i denna metod.
Teckning från tidigare litteratur som berör triacylglycerides och fosfolipider23, avsiktlig natrium addukt bildandet kan användas för att främja mer informativ fragmentering via bildandet av den (N-acyl)-dehydroalanyl peptid ion. Dessa karakteristiska joner är nyckeln till tilldela struktur, eftersom tillståndet acylation av N-terminalen är isolerad från acyl substitutioner på den glyceryl biexponentiellt. Natrium addukt bildandet ger ett bekvämt alternativ alternativ till svavel oxidation med väteperoxid, som har visat att också främja N-acyl-dehydroalanyl peptid fragmentering6,8. Även om natrium addukter kan visa en övergripande dämpning av signalen ion förälder, specifika ökningen av fragmentering mot dehydroalanyl joner kompenserar för minskad överordnade ion intensitet. Det kan vara värt att utforska andra matriser och fragmentering av ytterligare addukter för att framkalla de mest informativa spektra.
Detta protokoll förbättrar den traditionella TX-114 fasen partitionering metod för lipoprotein berikning, medan överföring av sida-separerad lipoproteiner till nitrocellulosa membran underlättar trypsin matsmältningen och eluering av lipopeptides. MALDI-TOF MS analys på de totala tryptic eller tvätta fraktionerna möjliggör protein identifiering parallellt med N-terminala strukturella bestämning av MS/MS i en enda experiment. Valfria natrium addukt bildandet höjdpunkterna skillnader på lipopeptidsubstans N-terminalen genom att främja mer informativ ion fragmentering. Förmågan att rutinmässigt rena lipoproteiner och karaktärisera sin N-termini kommer aktivera omfattande studier på hur romanen lipoprotein former är gjorda, deras fysiologiska roll inom bakteriell cell kuvertet och hur de upptäcks av däggdjur immunförsvaret systemet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Forskning i Meredith labbet stöddes av start medel som tillhandahålls av den Eberly College of Science (Pennsylvania State University). Vi tackar Dr. Tatiana Laremore för tekniska expertråd och tillgång till utrustning vid Penn State Proteomik och Mass Spectrometry Core Facility, University Park, PA, där massa spektrometriska analyser utfördes.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| 0.01 mm Zirconia/silica beads | BioSpec Products | 110791012 | |
| Acetic acid | EMD | AX0073-9 | |
| Acetone | EMD | AX0116-6 | |
| Acetonitrile | EMD | AX0142-6 | |
| Ammonium bicarbonate | Fluka Analytical | 09830 | |
| BioTrace NT Nitrocellulose | PALL Life Sciences | 66485 | |
| Bovine serum albumin (BSA) digest standard | Protea | PS-204-1 | |
| Chloroform | Acros Organics | 423550025 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | BP118 | |
| HPLC Grade water | EMD | WX0008-1 | |
| Lysozyme | Fisher Scientific | BP535-1 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| Phenylmethyl sulfonyl fluoride (PMSF) | Amresco | 0754 | |
| Pierce trypsin protease | Thermo Scientific | 90057 | |
| Ponceau S | Acros Organics | 161470100 | |
| Protein LoBind Tube 0.5mL | Eppendorf | 022431064 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 792519 | |
| Sodium chloride | Macron Fine Chemicals | 7581-06 | |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigma-Aldrich | 299537 | |
| Tris-hydrochloride (HCl) | Fisher Scientific | BP152 | |
| Triton X-114 | Sigma-Aldrich | 93422 | |
| Tryptic soy broth (TSB) | BD | 211822 | |
| α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (MS Grade) | Sigma-Aldrich | C8982 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| MagNALyser | Roche | ||
| Trans-Blot Turbo Transfer System | Bio-Rad | ||
| MALDI-TOF target | Bruker Daltonics | ||
| Ultraflextreme MALDI-TOF-TOF | Bruker Daltonics | Equipped with a 355 nm frequency-tripled Nd:YAG smartbeam-II laser |
References
- Babu, M. M., et al. A database of bacterial lipoproteins (DOLOP) with functional assignments to predicted lipoproteins. J Bacteriol. 188 (8), 2761-2773 (2006).
- Narita, S., Tokuda, H. Bacterial lipoproteins; biogenesis, sorting and quality control. Biochim Biophys Acta. 1862 (11), 1414-1423 (2016).
- Kovacs-Simon, A., Titball, R. W., Michell, S. L.
- Nguyen, M. T., Götz, F. Lipoproteins of Gram-Positive Bacteria: Key Players in the Immune Response and Virulence. Microbiol Mol Biol Rev. 80 (3), 891-903 (2016).
- Nakayama, H., Kurokawa, K., Lee, B. L. Lipoproteins in bacteria: structures and biosynthetic pathways. FEBS J. 279 (23), 4247-4268 (2012).
- Kurokawa, K., et al. Novel bacterial lipoprotein structures conserved in low-GC content Gram-positive bacteria are recognized by Toll-like receptor 2. J Biol Chem. 287 (16), 13170-13181 (2012).
- Kurokawa, K., et al. The Triacylated ATP Binding Cluster Transporter Substrate-binding Lipoprotein of Staphylococcus aureus Functions as a Native Ligand for Toll-like Receptor 2. J Biol Chem. 284 (13), 8406-8411 (2009).
- Asanuma, M., et al. Structural evidence of α-aminoacylated lipoproteins of Staphylococcus aureus. FEBS J. 278 (5), 716-728 (2011).
- Armbruster, K. M., Meredith, T. C. Identification of the Lyso-Form N-Acyl Intramolecular Transferase in Low-GC Firmicutes. J Bacteriol. 199 (11), e00099-e00017 (2017).
- Serebryakova, M. V., Demina, I. A., Galyamina, M. A., Kondratov, I. G., Ladygina, V. G., Govorun, V. M. The acylation state of surface lipoproteins of Mollicute Acholeplasma laidlawii. J Biol Chem. 286 (26), 22769-22776 (2011).
- Feng, S. H., Lo, S. C. Induced mouse spleen B-cell proliferation and secretion of immunoglobulin by lipid-associated membrane proteins of Mycoplasma fermentans incognitus and Mycoplasma penetrans. Infect Immun. 62 (9), 3916-3921 (1994).
- Feng, S. H., Lo, S. C. Lipid extract of Mycoplasma penetrans proteinase K-digested lipid-associated membrane proteins rapidly activates NF-kappaB and activator protein 1. Infect Immun. 67 (6), 2951-2956 (1999).
- Luque-Garcia, J. L., Zhou, G., Spellman, D. S., Sun, T. -T., Neubert, T. A. Analysis of electroblotted proteins by mass spectrometry: protein identification after Western blotting. Mol Cell Proteomics. 7 (2), 308-314 (2008).
- Luque-Garcia, J. L., Zhou, G., Sun, T. -T., Neubert, T. A. Use of Nitrocellulose Membranes for Protein Characterization by Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry. Anal Chem. 78 (14), 5102-5108 (2006).
- Kurokawa, K., et al. Environment-mediated accumulation of diacyl lipoproteins over their triacyl counterparts in Staphylococcus aureus. J Bacteriol. 194 (13), 3299-3306 (2012).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Schӓgger, H. Tricine-SDS-PAGE. Nat Protoc. 1, 16-22 (2006).
- Gravel, P. Protein Blotting by the Semidry Method. The Protein Protocols Handbook. , Spring Protocols. 321-334 (2002).
- Webster, J., Oxley, D. Protein Identification by Peptide Mass Fingerprinting using MALDI-TOF Mass Spectrometry. The Protein Protocols Handbook. , Springer Protocols. 1117-1129 (2009).
- Wilkins, M. R., et al. Detailed peptide characterization using PEPTIDEMASS - a World-Wide-Web-accessible tool. Electrophoresis. 18 (3-4), 403-408 (1997).
- Gasteiger, E., et al. Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server. The Proteomics Protocols Handbook. , Springer Protocols. 571-607 (2005).
- Perkins, D. N., Pappin, D. J. C., Creasy, D. M., Cottrell, J. S. Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data. Electrophoresis. 20 (18), 3551-3567 (1999).
- Al-Saad, K. A., Zabrouskov, V., Siems, W. F., Knowles, N. R., Hannan, R. M., Hill, H. H. Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry of lipids: ionization and prompt fragmentation patterns. Rapid Commun Mass Spectrom. 17 (1), 87-96 (2003).
